Atividade quitinolítica em extratos protéicos de insetos

carnívoros – Possível relação entre enzima e hábito

alimentar de insetos

Jefferson S. Oliveira1,*, Alysson L. Angelim2, Francisco Clark N. Barros1.

1
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Ceará – Ceará,

Brasil; 2Departamento de Biologia, Universidade Federal do Ceará – Ceará, Brasil.

*(e-mail: jefferson.oliveira@gmail.com)

Os artrópodes são organismos heterotróficos que obtém energia através da

alimentação para utilização em seu metabolismo. Uma importante fonte de

energia para os animais são os carboidratos, que em sua maioria são

encontrados na forma de polissacarídeos. A quitina é um polissacarídeo

estrutural insolúvel formado por polímeros de N-acetilglucosamina encontrada

em abundância no exoesqueleto e no canal alimentar de artrópodes. Extração

protéica foi realizada a partir do macerado de libélulas e louva deus, utilizando

tampão fosfato de potássio 50 mM pH 6,0, e avaliada quanto à presença de

enzimas com atividade quitinásica através de método colorimétrico. O resultado

positivo para atividade quitinolítica no extrato de odonata e no de louva deus

sugere que a presença dessa enzima possa estar relacionada ao hábito

alimentar destes insetos.

Palavras chave: odonata; mantódea; quitinase

Introdução

Os animais são organismos heterotróficos que necessitam alimentar-se

para obter energia para realização dos processos metabólicos, utilizando

plantas ou outros organismos vivos como fonte de alimento. Todos os animais

precisam de vitaminas, elementos minerais essenciais, bem como moléculas

orgânicas básicas às quais não podem sintetizar por si mesmos, mas que são

necessárias para a construção de suas próprias moléculas orgânicas

complexas, como proteínas, lipídios e carboidratos. Entretanto, a natureza

química da fonte de energia deve ser compatível com os mecanismos

digestivos que o animal dispõe (Purves et al., 2002; Schimidt-Nielsen, 2002).

Os carboidratos são uma importante fonte de energia para os animais e

são encontrados principalmente na forma de polissacarídeos. Para que estes

polissacarídeos possam ser aproveitados como fonte de energia, é necessária

a presença de enzimas específicas que promovam a hidrólise da molécula e

permitam a utilização de seus subprodutos na geração de energia para o

animal.

Artrópodes são animais que habitam os mais diversos ecossistemas e

apresentam uma grande diversidade de hábitos alimentares. Membros das

ordens Odonata e Mantodea apresentam semelhanças quanto ao hábito

alimentar, sendo ambos animais carnívoros que se alimentam de outros

artrópodes.

As libélulas são insetos com fase larval aquática e fase adulta aérea.

Possuem ciclo de vida longo, com fase larval podendo alcaçar até dois anos

(Corbet, 1980 apud Ferreira-Peruquetti & Fonseca-Gessner, 2003), portanto

estando sujeitas às alterações ambientais. São consideradas potenciais

indicadoras da qualidade do habitat e, apesar de serem menos sensíveis que

outros insetos aquáticos, são conspícuas, facilitando os diagnósticos rápidos

da qualidade da água (Ferreira-Peruquetti & De Marco Jr., 2002 apud Ferreira-

Peruquetti & Fonseca-Gessner, 2003).

Os indivíduos do taxa Mantodea são ávidos predadores generalistas.

Eles têm dieta extraordinariamente ampla, com consumo de presa determinado

largamente pelo tamanho da presa mais que pela sua taxonomia (Fagan et al.,

2002). Mantodea é formado por um grupo de insetos predadores que habitam

florestas tropicais densas distribuídas ao longo do Equador, além de florestas

áridas e desertos. Mantodea apresenta considerável diversificação em

morfologia, estratégia de caça e especialização de habitat. Além de mimetizar

formigas e flores, Mantodea pode também se assemelhar a folhas, ramos,

cascas de árvores ou capim (Svenson & Whiting, 2004).

A monofilia de Mantodea é bem apoiada pela presença de patas

dianteiras raptoriais, e um bem definido postclypeus. Estratégias de caça

variam entre os indivíduos deste grupo e o estilo de caça empregado pode

depender da seleção do habitat, localização geográfica e filogenia (Svenson &

Whiting, 2004). Eles têm dieta extraordinariamente ampla, com consumo de

presa determinado pelo tamanho da presa mais que pela sua taxonomia

(Fagan et al., 2002). A maioria dos Mantodea arbóreos são predadores de

emboscada (Matsura & Inoue, 1999 apud Svenson & Whiting, 2004).

Os artrópodes apresentam quitina, um polissacarídeo estrutural insolúvel

formado por polímeros de N-acetilglucosamina, em abundância no

exoesqueleto e no intestino de insetos (Kramer et al., 1985 apud A/Banat et al.,

1999).

Estudos desenvolvidos com o intuito de promover uma melhor

compreensão dos eventos fisiológicos de insetos devem ser considerados de

importante relevância científica. Estudar os processos fisiológicos de insetos,

utilizando-se de técnicas bioquímicas auxilia a compreensão da incrível

diversidade de hábitos que estes animais apresentam.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a presença de enzimas capazes de

hidrolisar quitina em extratos de Odonata e Mantodea e propor uma relação

entre a presença da atividade quitinolítica e o habito alimentar desses animais.

Materiais e Métodos

Coleta dos Animais

A coleta dos animais foi realizada durante todo o mês de agosto de 2008

nas proximidades do Açude Santo Anastácio, Campus do Pici, na Universidade

Federal do Ceará, com auxílio de uma rede de malha fina confeccionada

artesanalmente.

A metodologia de coleta dos representantes das ordens Odonata

(libélula) e Mantodea (louva deus) consistiu em três capturas semanais e

diurnas na circunvizinhança do açude. Os indivíduos foram cuidadosamente

armazenados em recipientes plásticos para preservar a integridade física dos

animais. No laboratório os animais foram sacrificados por congelamento em

freezer a -18 ºC onde foram conservados até posterior uso.

Identificação dos Animais

Os animais foram identificados segundo a ordem taxonômica aos quais

estão inseridos.

Extração de Proteínas

Apêndices locomotores e asas dos insetos foram removidos e toda

região compreendendo cabeça, tórax e abdômen foram macerados em

nitrogênio líquido com o auxílio de pistilo e almofariz. A farinha obtida foi

suspensa em tampão fosfato de potássio 50 mM, pH 6,0 e em seguida

centrifugada a 10.000 x g, 4 ºC, por 10 minutos em centrífuga de Ependorff

Centrifugue 5417R. O sobrenadante obtido foi recuperado e utilizado nos

ensaios.

Dosagem de Proteínas

A amostra submetida à análise foi estimada quanto ao teor protéico pelo

método colorimétrico descrito por Bradford (1976). Alíquotas de 100 L das

amostras foram transferidas para tubos de ensaio contendo 2,5 mL do reagente

de BRADFORD. As misturas foram gentilmente agitadas e após 10 minutos

foram realizadas as leituras das absorbâncias a 595 nm. (FEMTO –

Espectrofotômetro 600 Plus) A quantidade de proteínas foi determinada

utilizando-se albumina sérica bovina como referência padrão na curva de

calibração.
Determinação da Atividade Quitinolítica

A atividade quitinolítica foi medida segundo o método colorimétrico

descrito por Boller (1993), tendo como parâmetro a liberação de N-acetil-D-

glucosamina (NAG) a partir da ação hidrolítica da enzima sobre a quitina

coloidal.

Atividade Endoquitinásica:

Para determinação da atividade endoquitinolítica, 250 L dos extratos

dos animais foram, inicialmente, incubados com 250 L de quitina coloidal (na

concentração de 10mg/mL), a 37 ºC, durante 60 minutos. A reação enzimática

foi interrompida através de fervura em banho maria, à temperatura de 100 ºC,

por 10 minutos. Após resfriamento, as amostras foram centrifugadas a 10.000 x

g, 25 ºC, por 20 minutos, em centrífuga de Ependorff Centrifugue 5417R. A

seguir, 10 L de uma solução diluída de enzima glucoronidase (EPC 3.2.1.31,

Sigma) foram adicionados a 300 L de cada sobrenadante resultante da

primeira mistura reacional e feita incubação, novamente, a 37 ºC, por 60

minutos. Esta segunda etapa enzimática foi interrompida por meio de fervura

em banho maria à temperatura de 100 ºC, durante 10 minutos. Para

determinação da quantidade de NAG liberada a partir da quitina coloidal sob

ação de enzimas quitinolíticas, 310 L do hidrolizado foram acrescidos de 190

L de tampão fosfato de potássio, 50 mM, pH 6,0 e de 100 L de tetraborato de

sódio e potássio 0,6M. A mistura reacional foi aquecida em banho maria a 100

ºC, por 5 minutos. Após resfriamento, 1 mL da solução de -

dimetilaminobenzaldeido (DMAB) (100 mg/mL), foi adicionado à mistura

reacional e incubado em banho maria a 37 ºC por 20 minutos. As leituras de

absorbância foram feitas no comprimento de onda de 585 nm (FEMTO –

Espectrofotômetro 600 Plus).

Atividade Exoquitinásica:

Para determinação da atividade exoquitinolítica, 250 L dos extratos dos

animais foram, inicialmente, incubados com 250 L de quitina coloidal (na

concentração de 10mg/mL), a 37 ºC, durante 60 minutos. A reação enzimática

foi interrompida através de fervura em banho maria, a 100 ºC, por 10 minutos.

Após resfriamento, as amostras foram centrifugadas a 10.000 x g, 25 ºC, por

20 minutos, em centrífuga de Ependorff Centrifugue 5417R. Para determinação

da quantidade de NAG liberada a partir da quitina coloidal sob ação de enzimas

quitinolíticas, 300 L do hidrolizado foram acrescidos de 200 L de tampão

fosfato de potássio, 50 mM, pH 6,0 e de 100 L de tetraborato de sódio e

potássio 0,6M. A mistura reacional foi aquecida em banho maria à temperatura

de 100 °C, por 5 minutos. Após resfriamento, 1 mL da solução de -

dimetilaminobenzaldeido (DMAB) (100 mg/mL), foi adicionado à mistura

reacional e incubado em banho maria a 37 ºC por 20 minutos. As leituras de

absorbância foram feitas no comprimento de onda de 585 nm (FEMTO –

Espectrofotômetro 600 Plus).

Para ambos ensaios, o cálculo da quantidade de NAG liberado na

reação, uma curva padrão construída a partir de concentrações conhecidas de

NAG, variando de 100 a 500 M foi utilizada (Reissig et al., 1955). A atividade
quitinásica foi expressa em nanokatal (nkat) por mg de proteína, onde 1 nkat

corresponde a liberação de 1 M de NAG por mililitro por minuto.

A quitina coloidal usada como substrato para determinação da atividade

quitinolítica foi preparada segundo a metodologia descrita por Boller (1993), a

partir de quitosana, com algumas modificações.

A solução de glucoronidase usada no ensaio foi diluída 10 vezes em

água grau Milli-Q a partir do preparado bruto de Helix pomatia (Sigma Chemical

Co-Type HP- 2.132.000 unidades / mL) e dialisada exaustivamente contra água

grau Milli-Q, sendo armazenada em freezer (cerca de -20 ºC).

A solução de -dimetilaminobenzaldeido (DMAB), foi preparada pela

dissolução de 10 g de DMAB em 100 mL de ácido acético glacial contendo

12,5% (v/v) de ácido clorídrico 11,5 M.

Resultados e Discussão

Vários estudos para detecção de enzimas com atividade quitinásica em

insetos foram realizados (A/Banat et al., 1999; Filho et al., 2002.). Segundo

Kramer, (1997), quitinases são encontradas na sua forma ativa em pH variando

de 4.0 a 8.0. Neste trabalho foi utilizado tampão fosfato de potássio 50 mM pH

6,0 como solução de extração das proteínas solúveis do macerado obtido a

partir dos insetos.

Dosagens e percentual de proteínas obtidas são apresentados na

Tabela 1. A dosagem do conteúdo protéico do extrato de Odonata realizada a

partir de 147,0 mg de massa fresca foi de 4,797 mg de proteínas por mL de

extrato. No extrato de Mantodea a dosagem protéica encerrou 1,167 mg de

proteína por mL a partir de 24,0 mg de massa fresca do animal. Estas

quantidades de proteína mensuradas pelo ensaio de Bradford mostraram que o

Mantodea apresentou um maior percentual protéico (4,8%) que a Odonata

(3,26%) em relação à massa fresca. Estes resultados mostram que o tampão

fosfato de potássio pH 6,0 foi eficiente no processo de extração de proteínas.

Tabela 1. Rendimento protéico dos extratos de Odonata e Mantodea.

Odonata Mantodea

(Libélula) (Louva deus)

Massa fresca (g) 1,33 0,12

Volume de tampão (ml) 9 5

Concentração do Extrato (mg/ml)

147 24
(massa fresca / volume de tampão)

[proteínas] (mg/ml)
4,797 1,167
(Método de Bradford, 1976)

% proteína 3,26 4,8

Com o intuito de avaliar a presença de proteínas com atividade

quitinolítica, dois métodos fotocolorimétricos foram utilizados. No primeiro

método, os extratos dos insetos foram verificados quanto à presença de

endoquitinase e no segundo, de exoquitinase. No ensaio de endoquitinase, o

extrato total de Odonata e Mantodea apresentaram atividade endoquitinásica

de 0,77 e 0,76 nkat por miligrama de proteína, respectivamente. Em ambos os

extratos foram detectados valores equivalentes de atividade endoquitinásica

(Figura 1). Estes resultados sugerem que as quantidades de enzimas

endoquitinolíticas são equivalentes nos diferentes insetos estudados, contudo,

esta hipótese não pode ser afirmada, visto que o método mensura o produto da

ação enzimática e não a concentração de enzima na amostra.

No ensaio para avaliar a presença de atividade exoquitinásica, o extrato

de Odonata apresentou 1,12 nkat por mg de proteína enquanto no Mantodea

foi encontrado 2,05 nkat por mg de proteína. O extrato de Mantodea

apresentou aproximadamente o dobro de atividade exoquitinolítica em relação

à atividade encontrada em Odonata (Figura 1). O resultado obtido não indica

que esta enzima encontra-se em maior quantidade no extrato Mantodea

comparado ao de Odonata, pois como mencionado anteriormente, o ensaio

determina a concentração do produto da ação enzimática.

Figura 1. Ensaio de atividade quitinolítica em extratos de Odonata (libélula) e

Mantodea (louva deus).

O resultado positivo para atividade quitinolítica nos extratos analisados

sugere que a presença dessa enzima possa estar relacionada ao hábito

alimentar carnívoro de odonatas e mantodeas. Esses animais predam insetos,

que apresentam polímeros de quitina como constituinte estrutural do

exoesqueleto e do canal alimentar (Kramer et al., 1985 apud A/Banat et al.,

1999). Estudos mostraram que a ocorrência de diferentes enzimas digestivas

no trato digestório de insetos é frequentemente mostrado depender

principalmente da composição química da dieta do animal (Wigglesworth, 1972

apud Terra & Ferreira, 1994). Os resultados aqui obtidos para atividade

quitinolítica em extrato de insetos corroboram com os dados observados em

ensaios realizados com intestino delgado de vários insetos, que mostraram

existir uma correlação entre a presença de quitinases e uma dieta rica em

quitina (Vonk e Western, 1984 apud Terra & Ferreira, 1994; Kramer & Koga,

1986 apud Terra & Ferreira, 1994). Entretanto, a presença de quitinases em

insetos pode também estar associada a outros eventos fisiológicos, como o

ciclo ecdisial, que vem sendo estudado e demonstrado agir sinergicamente

degradação cuticular da quitina (Kramer & Koga, 1986 apud Terra & Ferreira,

1994; Royer et al., 2002).

Conclusão
 A presença de atividade quitinolítica nos extratos dos animais estudados

sugere que esta enzima pode estar relacionada ao hábito alimentar carnívoro

desses insetos. Uma outra hipótese seria a biossíntese destas enzimas para

atuar na ecdise do animal. Estudos posteriores devem ser realizados com o

objetivo de elucidar os processos fisiológicos aos quais as quitinases estão

envolvidas em membros da ordem Odonata e Mantodea.

Agradecimentos

As agencias financiadoras (CNPq, FUNCAP) e aos Professores Dr.

Marcio Viana Ramos, Dra. Ana Lucia, Dra. Vânia Maria Maciel Melo, Dr. José

Tadeu Abreu de Oliveira, Dr. Ana de Fátima Fontenele Urano de Carvalho, Me.

Silvio César Gomes de Lima e ao estudante Célio Moura Neto.

Referências

A/Banat, B. M. A., Kameyama, Y., Yoshioka, T., Koga, D. Purification and

characterization of a 54 kDa chitinase from Bombyx mori. Insect Biochemistry

and Molecular Biology 29: 537–547 (1999).

Boller, T. Biochemical analysis of chitinases na - 1,3 – glucanases. In:

Molecular Plant Pathology, S. J. Gurr, M. J. Mc Pherson, and D. J. Bowles, eds.

IRL Press New York, p. 23-29 (1993).

Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram

quantities of porteins utilizing the principle of protein dye binding. Anal.

Biochem. 72: 248–254 (1976).

Fagan, W. F., Moran, M. D., Rango, J. J., Hurd, L. E. Community effects of

praying mantids: A meta-analysis of the influences of species identity and

experimental design. Ecological Entomology. 27: 385-395 (2002).

Filho, B. P. D., Lemos F. J. A., Secundino, N. F. c., Páscoa, V., Pereira, S. T.,

Pimenta, P. F. P. Presence of chitinase and beta-N-acetylglucosaminidase in

the Aedes aegypti A chitinolytic system involving peritrophic matrix formation

and degradation. Insect Biochemistry and Molecular Biology 32: 1723–1729

(2002).

Ferreira-Peruquetti, P. S., Fonseca-Gessner, A. A. Comunidade de odonata

(Insecta) em áreas naturais do cerrado e monocultura no nordeste do Estado

de São Paulo, Brasil: Relação entre o uso do solo e a riqueza faunística.

Revista Brasileira de Zoologia 20 (2): 219-224 (2003).

Kramer, K. J. Insect Chitinases: Moleculer Biology and Potential Use as

Biopesticides. Insect Biochem. Molec. Biol. 27: 887-990 (1997).

Purves, W. K. Sadava, D. Orians, g. H. Heller, H. Craig. Vida: A Ciência da

Biologia. 6ª ed. Artmed Editora. pp. 886 (2002).

Reissing, J. L., Strominger, J. L., Le Loir, L. F. A. A modified colorimetric

method for the estimation of N- acetil-aminos sugars. Journal of Biological

Chemistry. 217: 959-966 (1995).

Royer, V., Fraichard, S., Bouhin, H. A Novel putative insect chitinase with ultiple

catalytic domains: hormonal regulation during metamorphosis. Biochemical

Journal. 366: 921-928 (2002).

Schimidt-Nielsen, K. Fisiologia Animal. Adaptação e Meio Ambiente. 5ª ed.

Santos Livraria Editora: São Paulo. pp. 594 (2002).

Svenson, G. J. & Whiting, M. F. Phylogeny of Mantodea based on molecular

data: evolution of a charismatic predator. Systematic Entomology. 29: 359-370

(2004).

Terra, W. R. & Ferreira, C. Insect digetive ezymes: porpriets,

compartimentalization na function. Review. Comp. Biochem. Physiol. 109 B:

1-62 (1994).