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página inicial da revista: http://www.elsevier.com/locate/toxicon

Duração clínica da ação de diferentes tipos de toxina botulínica em humanos

a,* a
Roberto Eleopra , Sara Rinaldo a, Cesare Montecucco b , Batom Ornella b
, Grazia Devigili
a
Unidade Neurológica 1, Instituto Neurológico Carlo Besta da Fundação IRCCS, 20133, Milão, Itália
b
Departamento de Ciências Bioquímicas Universidade de Pádua, 35121, Pádua, Itália

INFORMAÇÕES DO ARTIGO ABSTRATO

Palavras-chave: A Neurotoxina Botulínica (BoNT) compreende vários sorotipos com propriedades, mecanismos de ação, sensibilidade e duração de
Neurotoxinas botulínicas efeito distintos em diferentes espécies. O sorotipo A (BoNT/A) é a neurotoxina prevalente aplicada em doenças humanas. Neste artigo,
Sorotipos de toxinas botulínicas apresentamos uma visão geral do conhecimento atual sobre a duração do efeito e o surgimento neuromuscular de diferentes sorotipos
análise de MUAPs
de BoNT em humanos. Em seguida, relatamos os resultados originais de um estudo em indivíduos saudáveis tratados com BoNT/A, B,
teste EDB
C e F usando diferentes técnicas neurofisiológicas. Doze voluntários saudáveis (7 homens, 5 mulheres) são tratados com BoNT/A, B, C
teste cMAP
e F ou placebo no músculo abdutor do dedo mínimo (ADM) da mão. Antes e depois das injeções, um extenso estudo neurofisiológico é
realizado com a variação da amplitude CMAP, análise dos potenciais de ação da unidade multimotora (MUAPs), a relação Turns/
Amplitude do padrão de interferência (IP) e determinação do jitter e da densidade da fibra (FD) em eletromiografia de fibra única
(SFEMG), na semana 2 (sem 2), 4 (sem 4), 6 (sem 6) e 8 (sem 8). Um bloqueio neuromuscular máximo é obtido em w2 para todos os
sorotipos. Posteriormente, a tendência CMAP parece semelhante para BoNT/A, B e C, enquanto BoNT/F mostra uma recuperação mais
rápida. A análise multi-MUAPs e IP detectam alterações leves na w2 para todos os sorotipos, exceto para BoNT/F que mostra uma
mudança maior desde w4. SFEMG tem mudanças mínimas em FD enquanto, Jitter aumenta em w2 com uma diminuição mais lenta ao
longo do tempo para todos os BoNTs. Em conclusão, BoNT/F tem brotação mais precoce e recuperação completa na w8. Outros
sorotipos apresentam perfil mais lento e semelhante. A EMG parece útil para estudar a recuperação funcional em humanos, e esses
resultados devem fornecer novas evidências para avaliar diferentes sorotipos. Esses achados melhoram nosso conhecimento sobre os
métodos para avaliar a duração dos efeitos e os equivalentes de dose em diferentes sorotipos, que no futuro podem mudar a estratégia
dos médicos para terapias de BoNT adaptadas à doença.

1. Introdução a duração da ação de cada sorotipo de BoNT é problemática em relação às diferenças

As espécies animais têm uma sensibilidade diferente aos vários sorotipos de
neurotoxina botulínica (BoNT) (Smith, 1988) , mas, em humanos, a suscetibilidade aos
vários BoNTs é notável devido à grande aplicação dos sorotipos A e B (Hallett et al.,
2013).
Na prática clínica, BoNT A (BoNT/A) é o sorotipo prevalente usado e é considerado
uma terapia útil para distúrbios do movimento e outras doenças não neurológicas e as
marcas comerciais de toxinas estão bem estabelecidas para serem válidas e seguras
(Hallett et al ., 2013).
Os sete sorotipos de toxina têm características distintas, sem dados de relatórios
extensos sobre a dose-resposta comparativa de BoNT em humanos e não existe
consenso científico sobre um mecanismo simples e comum responsável pela disparidade
na duração da ação (Pirazzini et al., 2017; Rossetto et al., 2014). Portanto, a comparação
do
no mecanismo de ação, potência e perfil de efeitos colaterais (Fraint et al., 2016).
Na prática clínica, quando consideramos as diferenças entre as preparações de
BoNT, a potência é considerada a principal variável, pois o mal-entendido nas dosagens
dos diferentes sorotipos pode determinar resultados indesejados. A potência da BoNT é
calculada em unidades (U) a partir de um modelo de ensaio de proteção em camundongos:
1U corresponde à toxina injetada por via intraperitoneal capaz de matar 50% (LD50) de
um grupo de camundongos e cada empresa calcula a potência de LD50 para preparar
cada frasco para uso humano. Apesar de tudo isso, diferentes excipientes e diluentes
são usados na preparação final do frasco comercial, portanto, a potência efetiva das
unidades das quatro preparações de BoNT comercialmente usadas na Europa não tem
um efeito comparável nos pacientes. OnabotulinumtoxinA (Ona), Incobotuli numtoxinA
(Inco), AbobotulinumtoxinA e
(aqueles)

* Autor correspondente.
Endereços de e-mail: roberto.eleopra@istituto-besta.it (R. Eleopra), sara.rinaldo@istituto-besta.it (S. Rinaldo), cesare.montecucco@gmail.com (C. Montecucco), ornella.rossetto@unipd.it (O.
Rossetto), grazie.devigili@istituto-besta.it (G. Devigili).

https://doi.org/10.1016/j.toxicon.2020.02.020 Recebido
em 18 de agosto de 2019; Recebido no formulário revisado em 4 de fevereiro de 2020; Aceito em 26 de fevereiro de 2020
Disponível online em 14 de março de
2020 0041-0101/© 2020 Elsevier Ltd. Todos os direitos reservados.
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R. Eleopra et al. Toxico 179 (2020) 84–91

RimabotulinumtoxinB) (Rima), são restritos para cada empresa e na prática importante distinguir quais medidas de duração são usadas antes de
nenhuma regra é capaz de prever com certeza a dose de uma marca é comparar os sorotipos BoNT.
necessária para induzir resultados semelhantes em paciente já injetado com Em humanos, temos duas opções principais para avaliar a duração do
outro produto. Uma estimativa geral é considerar 1 U de Ona em 1 U de efeito clínico após injeções de diferentes sorotipos: um estudo de
Inco, em 3–5 U de Abo e em 50–100 U de Rima, mas diferentes condições comparação clínica (na prática clínica realmente possível apenas para
clínicas podem alterar a equivalência na dosagem. BoNT/A ou BoNT/B) ou técnicas eletrofisiológicas através da variação ao
Principalmente, a duração da resposta clínica é considerada um longo do tempo da amplitude do potencial de ação motora composto (CMAP).
parâmetro útil para definir a duração da ação de cada BoNT, mesmo que Além disso, outra questão a ser considerada é que a duração da ação
outras abordagens sejam usadas para avaliar esse parâmetro, como a dos BoNTs é consideravelmente maior nos terminais sudomotores do que
duração do pico de benefício (Jankovic et al., 1990), o último momento após na junção neuromuscular. A razão ainda não está clara, mas diferenças nos
o tratamento em que é possível detectar uma diferença significativa no sorotipos BoNT/A ou BoNT/B para doenças de distúrbios do movimento,
alongamento muscular (Eames et al., 1999), no tempo entre as injeções bem como para distúrbios autonômicos, foram demonstradas em vários
(Brashear et al., 2000) e no teste EDB para avaliar o bloqueio neuromuscular ensaios clínicos randomizados (RCT). Existem vários estudos de Classe 1
induzido (Hamjian e Walker, 1994). Obviamente, esses vários métodos e 2 indicando que BoNT/A e BoNT/B são altamente eficazes em doenças
resultam em diferentes estimativas da duração de ação de uma determinada preparação,
motoras portanto,
e autonômicas,
é embora nenhuma comparação direta esteja disponível

Tabela
1 Duração do efeito de diferentes sorotipos em humanos.

sorotipo ou local de ação/alvo N métodos para Duração Nadir Dose/ou Doença autor, ano
comparação efeito de detecção (semanas) (semanas) proporção média
entre sorotipos

BoNT/A versus BoNT/B

Músculo BoNT/A vs BoNT/B NMJ/EDB 10 teste EDB 11 (BoNT/B) 2 Várias dosagens Sujeitos Sloop et al.,
57 (BoNT/A) de 1:16–1:48 saudáveis 1997
BoNT/A vs BoNT/B NMJ/músculos cervicais 139 (BoNT/A ¼ Clínico 14 (BoNT/A) 4 Dose máxima CD Comella et al.,
74; BoNT/B ¼ 65) (escala TWSTRS) 12.1 (BoNT/B) BoNT/A 250U 2005
BoNT B
10.000U
Ona/A x Rima/B função sudomotora 18 ninidrina 41 (Rima/B) 3 1:29 Sujeitos Kranz e outros,
teste de suor 54 (Próprio/A) saudáveis 2011
(NST)
Abo/A vs. Rima/B Função secretora/ 27 inscritos, 14 clínica 10 (Abo/A) 4 250U ABO/A Sialorréia em Guidobaldi,
glândulas concluídos 12 (Rima/B) 2500 Rimas/B ELA e DP 2011
parótidas e submandibulares (ns)
Ona/A x Rima/B função sudomotora 24 Clínico e amido- >20 sem 3 1:30 hiperidrose An, 2015
iodo diferenças 50U On/A axilar
teste 1500 Em rima/B
BoNT/C
BoNT/C vs BoNT/ NMJ/EDB 12 teste EDB Semelhante > 12 2 10U Sujeitos Eleopra et al.,
A saudáveis 1997b
BoNT/C vs BoNT/ NMJ do abdutor mínimo 5 (injetado variação cMAP BoNT/C semelhante 2 15U Sujeitos Eleopra et al.,
A do dedo bilateralmente) (ADM) a BoNT/A saudáveis 2004
>8
BoNT/C NMJ 4 clínico 13 5 10–20 Eleopra et al.,
hemispasmo facial 1997b
BSP
BoNT/C SNM/músculos cervicais 14 clínico 8 4 15–150 BSP Eleopra et al.,
CD 2006
BoNT/D
BoNT/D NMJ 10 EDB teste EDB – – 3 U–10 U Sujeitos Eleopra et al.,
saudáveis 2013
BoNT/A vs BoNT/ função sudomotora 4 Clínico e amido- 12 (BonT/D) 5 (BoNT 1:2 Sujeitos Dressler et al.,
D iodo 14 (BoNT/A) D) 4–32U BoNT/D saudáveis 2019
teste 7 (BoNT 2–16 U BoNT/
A) A
BoNT/E
BoNT/E vs BoNT/A NMJ 11 teste EDB 4 (BonT/E) 1 3U Sujeitos Eleopra et al.,
>12 (BoNT/A) saudáveis 1998
BoNT/F
BoNT/F vs BoNT/A NMJ 9 (injetado Clínica BoNT/F < 2 10–20 U por BSP Mezaki et al.,
Músculos orbiculares bilateralmente) (classificação BoNT/A lado 1995
dos olhos subjetiva)
BoNT/F NMJ 15 clínica 4.7 (BoNT/F) nd 200–500 U distonia focal Greene e
Músculos cervicais 12 (BoNT/A) Fan (1993)
BoNT/F vs BoNT/A NMJ 54 clínico BoNT/F < 4 10U (BoNT/F þ BSP Mezaki et al.,
Músculos orbiculares BoNT/A þ F < BoNT/A) 1999
dos olhos BoNT/A 10U (BoNT-F)
10
BoNT/F vs BoNT/A NMJ abdutor digital 5 (injetado teste cMAP 6 (BoNT/F) 2 15U Sujeitos Eleopra et al.,
mínimo bilateralmente) variação >12 (BoNT/A) saudáveis 2004
(ADM)

Tabela 1. Resumiu algumas das principais evidências sobre a duração dos efeitos de diferentes sorotipos em humanos. Abreviaturas: TWSTRS: Toronto Western Spasmodic
Torcicollis Rating Scale; EDB: músculo extensor curto dos dedos; ADM: abdutor do dedo mínimo; DC: Distonia cervical; BSP: blefaroespasmo; MNJ: junção neuromuscular; ELA:
Esclerose lateral amiotrófica; DP: Doença de Parkinson.

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R. Eleopra et al.
(Naumann e outros, 2008; Simpson e outros, 2008).
Na primeira parte deste artigo, revisamos brevemente a duração de diferentes
sorotipos em humanos considerando também as evidências clínicas ou
eletrofisiológicas enquanto, na segunda parte avaliamos o brotamento muscular
após a injeção de diferentes sorotipos de BoNT em indivíduos saudáveis
voluntários em um experimento contexto. O objetivo é entender se a duração do
efeito durante a recuperação do bloqueio neuromuscular induzido por ele poderia
estar correlacionada a um padrão distinto de reinervação.
2. Duração da ação após injeções de diferentes sorotipos de BoNT em
humanos
Vários sorotipos de BoNT têm duração de ação variável em humanos e apenas
a resposta clínica das preparações comerciais de BoNT/A é amplamente relatada
na literatura durante o tratamento crônico em grandes populações (Tabela 1). No
geral, uma representação muito positiva do uso a longo prazo de BoNT/A na
distonia focal ou outros distúrbios do movimento é evidente com benefícios
sustentados e efeitos colaterais mínimos
(Albanese et al., 2015a, 2015b).
Em uma revisão sistemática da literatura para Distonia Cervical (DC), Han et
al. sugerem que Abo/A, Ona/A e Inco/A foram todos eficazes em comparação com
placebo quando avaliados pela escala de classificação de torcicolo modic Toronto
Western Spas (TWSTRS) com um nadir do efeito na semana quatro e sem
qualquer diferença significativa entre os comerciais produtos.
Kollewe et ai. (2015) compararam as diferentes preparações comerciais de
BoNT (Ona, Inco ou Abo) em uma grande população de indivíduos afetados por
blefaroespasmo (288 pacientes) durante injeções crônicas (até 21 anos) e
tratamento repetitivo. A duração do efeito terapêutico para todos os pacientes foi
de 10,2 ± 3,5 semanas. Para o grupo Ona foi de 10,8 ÿ 3,3 semanas, para o grupo
Abo 10,2 ÿ 3,2 semanas e para o grupo Inco 9,8 ÿ 4,1 semanas. Nenhuma dessas
diferenças foi estatisticamente significativa.
A Melhora Clínica Global (GCI) para todos os pacientes e para os três subgrupos
não foi estatisticamente significativa.
Portanto, BoNT/A continua sendo o sorotipo mais eficaz e seguro para tratar
indivíduos com distúrbios do movimento, mesmo que alguns estudos descrevam
um abandono significativo do paciente durante injeções crônicas, geralmente
devido a critérios de seleção de pacientes, tratamento agendado ou estratégia de
injeções repetitivas ( Jinnah e outros, 2018).
Dentre os sorotipos comerciais disponíveis, o BoNT/B foi inicialmente avaliado
em humanos comparando a duração dos efeitos usando uma curva dose-resposta
de BoNT/A e BoNT/B pelo teste EDB (Sloop et al., 1997) no qual ficou evidente
que doses mais altas de Rima/B eram necessárias para obter um efeito comparável
ao Ona/A. O bloqueio neuromuscular induzido por Rima/B teve uma recuperação
mais precoce após as injeções (11 semanas) quando comparado à paresia
induzida por Ona (até 50 semanas).
Posteriormente, em vários estudos clínicos, a BoNT/B foi comparada à BoNT/
A. Em um estudo randomizado de DC com injeções de BoNT/A ou BoNT/B, uma
melhora no escore total TWSTRS foi evidente após 4 semanas para ambos os
sorotipos (Comella et al., 2005; Pappert e Germanson, 2008), mesmo com uma
significativa maior duração do efeito para Ona (>2 semanas) e mais efeitos
colaterais autonômicos para BoNT/B (disfagia, boca seca e às vezes constipação).
Esses estudos demonstraram que, a curto prazo, a BoNT/B é eficaz na melhora
da DC, mas com maior risco de mais efeitos colaterais autonômicos, confirmado
na experiência da prática clínica.
Em consideração a esses relatórios, Bentivoglio et al. (2015) fizeram uma
revisão sistemática completa para avaliar a utilidade de BoNT/B em distúrbios
autonômicos, sugerindo que a razão de equivalência clínica de BoNT/A/BoNT/B
para distúrbios secretores é bastante diferente da proporção para distúrbios
musculares. Em 2011, Kranz et al. (2011) publicaram um estudo comparativo em
indivíduos normais da área de anidrose da pele após injeções de Ona/A ou B/
Rima em uma taxa de conversão de 1:75, em diferentes diluições. Um pico de
efeito foi detectado na semana 3 para ambos os sorotipos, mesmo com maiores
áreas anidróticas e maior taxa de declínio para BoNT/B em comparação com
BoNT/A. Esses autores detectaram também algumas diferenças
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gênero (menos eficaz em mulheres) para cada sorotipo e concluiu que a relação
BoNT/A/BoNT/B poderia ser considerada 1:29 (Kranz et al., 2011).
No entanto, grandes ensaios clínicos comparativos de longo prazo para avaliar os
efeitos desses diferentes sorotipos nas fibras autonômicas ainda não estão
disponíveis (Naumann, 2015).
A afinidade da BoNT/B pelos terminais autonômicos colinérgicos também
sugeriu uma possível indicação prevalente para pacientes acometidos por
distúrbios secretores, em particular a sialorréia, na qual a relação de equipotência
clínica parecia ser bem diferente daquela encontrada para doenças neuromusculares.
Em 2015, Petracca et al. (2015) revisaram a literatura sobre sialor rhea e
injeções de BoNT detectando uma grande quantidade de dados e uma ampla
gama de doses de Ona/A, Abo/A e Rima/B que pareceram ser eficazes também
no acompanhamento a longo prazo e todos os sorotipos deram o mesmo espectro
de efeitos colaterais.
Na literatura, poucos dados estão disponíveis em humanos a respeito da
injeções de outros sorotipos BoNT.
Estudos pré-clínicos (Aoki, 1999) e clínicos (Mezaki et al., 1995) detectaram
uma menor duração de ação da BoNT sorotipo F (BoNT/F) quando comparada à
BoNT/A. Inicialmente, a BoNT/F foi injetada em poucos indivíduos com distonia
focal (dois com torcicolo, um com distônia oromandibular e um com gagueira)
resistentes à BoNT/A em relação aos anticorpos contra o sorotipo A com evidência
de resposta clínica de curto prazo .
(Greene e Fahn, 1993; Ludlow et al., 1992).
Portanto, Greene e Fahn, (1993) sugeriram que BoNT/F poderia ser adequado
em algumas condições clínicas onde um efeito curto é necessário, por exemplo,
quando os médicos desejam avaliar se uma denervação muscular seletiva
resultará em melhor melhora funcional antes da cirurgia ortopédica para
espasticidade.
Posteriormente, ficou evidente que as injeções de BoNT/F em pacientes
melhoram os sintomas por um período mais curto e que seu efeito clínico parece
relevante apenas se injetado em doses mais altas em comparação com BoNT/A
(Greene e Fahn, 1996; Houser et al. , 1998 ; Sheean e Lees, 1995); (Chen et al.,
1998).
Uma solução de mistura de BoNT/F e BoNT/A, em comparação com BoNT/A
sozinha, em indivíduos com blefaroespasmo foi feita por Mezaki et col. Em 1999
(Mezaki et al., 1999) com a evidência de maior duração de ação da mistura do
que o BoNT/F sozinho, mas mais curto do que o BoNT/A.
Portanto, uma dosagem mais alta de BoNT/F foi injetada em poucos pacientes
para obter uma resposta melhor e mais longa, embora a questão da imunidade de
BoNT/F após tratamento repetitivo de longo prazo permaneça sem solução.
O efeito da injeção de BoNT/C foi avaliado preliminarmente em músculos
humanos em comparação com BoNT/A usando um teste eletrofisiológico (variação
EDB CMAP) em 1997 (Eleopra et al., 1997b) com evidência de um perfil de
bloqueio neuromuscular semelhante ao sorotipo A.
Posteriormente, três indivíduos foram tratados com BoNT/C (dois com hemispasmo
facial idiopático e um com blefaroespasmo) obtendo uma resposta clínica inicial 2–
3 dias após as injeções, com pico do efeito na semana 5 e estendido por até 12–
13 semanas, sem nenhum efeito colateral significativo (Eleopra et al., 1997b).
Portanto, a técnica de Estimação do Número de Unidade Motora (MUNE) foi
aplicada em humanos (Eleopra et al., 2002) para verificar a segurança da BoNT/C
(ausência de diminuição do neurônio motor após intoxicação em diferentes
dosagens) e o Extensor Digitorum Brevis ( O teste EDB) CMAP (variação
percentual da amplitude ao longo do tempo) foi usado para comparar o perfil
temporal de diferentes sorotipos BoNT (Eleopra et al., 2006).
Analisamos os resultados eletrofisiológicos em humanos com injeções de
baixa dosagem nos músculos EDB de BoNT/C em comparação com BoNT/A
(Eleopra et al. 1997a, 1997b) e, então, repetimos um experimento semelhante em
voluntários no Abductor Digiti Minimi músculo (ADM) da mão (Eleopra et al., 2006),
mostrando o efeito semelhante ao BoNT/A.
Com base nesses dados, poucos indivíduos com distonia focal e nunca
tratados antes com qualquer tipo de BoNTs foram tratados com BoNT/C com boa
resposta clínica. Quatro pacientes com blefaroespasmo e dez indivíduos com
torcicolo foram submetidos a injeções de BoNT/C com resultado clínico
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R. Eleopra et al.
melhora semelhante à BoNT/A (Eleopra et al. 1997a, 1997b; (Eleopra et al., 2002).
Em conclusão, a BoNT/C é segura e pode ser considerada uma alternativa válida à BoNT/
A porque tem um perfil temporal de efeito semelhante. Obviamente, um estudo prospectivo
duplo-cego randomizado controlado por placebo mais amplo é necessário para validar seu
possível uso em humanos.
A suscetibilidade à BoNT/D permanece incerta em humanos, com relatos contrastantes
porque parece ter um efeito dose-dependente mínimo nas fibras colinérgicas autônomas de
humanos, mesmo que de duração mais curta quando comparada à BoNT/A (Dressler et al.,
2019 ) , enquanto nenhum efeito clínico significativo é detectado no bloqueio neuromuscular
se a administração intramuscular
injetado (Eleopra et al., 2013).
Estudo pré-clínico em humanos avaliou a duração do efeito de BoNT/E em comparação
com BoNT/A em dois lados diferentes do corpo (músculos EDB dos pés) do mesmo sujeito e
ficou evidente que BoNT/E se recupera muito mais rápido que BoNT/ A (Eleopra et al., 1998).
Assim, a utilização clínica deste sorotipo poderia ser proposta apenas quando um efeito mais
curto no bloqueio neuromuscular é necessário.
Finalmente, nenhum estudo clínico relatou uma utilização clínica de BoNT/G em humanos.
3. Duração e reinervação de diferentes sorotipos BoNT
A contribuição dos brotos neurais para a recuperação funcional após a injeção de
diferentes sorotipos de BoNT em humanos ainda não está clara. Em 1999, dePaiva et al. (de
Paiva et al., 1999) forneceram evidências em camundongos de uma recuperação funcional em
2 etapas: o reaparecimento de vesículas na terminação nervosa terminal, dependente de
exocitose neuronal, com um brotamento nervoso precoce responsável por uma contração
muscular inicial e posterior estágio de recuperação funcional relacionado ao volume de
negócios das vesículas nas placas terminais juncionais originais com uma regressão
subsequente dos brotos.
Portanto, brotos terminais, brotos colaterais e brotos nodais podem justificar a recuperação
funcional inicial, com os estágios posteriores de recuperação mediados pelo restabelecimento
dos mesmos terminais originais (Lebeda et al., 2010) .
O objetivo do nosso estudo é avaliar em indivíduos saudáveis voluntários se a recuperação
diferente no bloqueio neuromuscular induzido pela injeção de diferentes sorotipos de BoNT
está relacionada a um diferente brotamento nervoso.
4. Materiais e métodos
4.1. Design de estudo
Em uma população de indivíduos saudáveis voluntários, conduzimos um estudo
monocêntrico prospectivo randomizado duplo-cego controlado por placebo para avaliar a
reinervação neuromuscular através de uma análise EMG após injeções de diferentes sorotipos
de BoNT versus placebo.
Todos os indivíduos voluntários inscritos entraram no estudo e deram seu consentimento
voluntário por escrito. Os objetivos do estudo e possíveis efeitos colaterais foram discutidos
com todos os participantes. O protocolo experimental foi aprovado pelo nosso Comitê de Ética.
4.2. Participantes do estudo
Doze voluntários saudáveis (7 homens, 5 mulheres; idade variando de 34 a 51 anos)
foram reunidos entre os membros de nossos laboratórios, incluindo alguns dos autores do
presente artigo. Nenhum dos indivíduos havia recebido anteriormente qualquer tipo de BoNTs
antes deste estudo. Baixas doses de diferentes BoNTs (BoNT/A,/B,/C e/F) ou placebo (solução
salina) foram injetadas na parte central do músculo Abductor Digiti Minimi (ADM) da mão em
volumes de diluição fixos (0,3 ml ). O ADM foi escolhido porque é um músculo fácil de detectar
em todos os indivíduos, a EMG e as técnicas neurofisiológicas relacionadas são confiáveis e
fáceis de executar neste músculo e se um bloqueio neuromuscular completo for alcançado, o
déficit funcional é bem tolerado.
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4.3. Preparação de toxinas
BoNT/A usado foi Ona (Allergan©), BoNT/B foi Rima (Elan©), enquanto BoNT/C e BoNT/
F foram obtidos da WAKO (Japão), purificados e preparados conforme descrito anteriormente
(Eleopra et al. , 2006). Anteriormente, sua toxicidade foi avaliada em camundongos BALB/C
e a dose testada com as preparações isoladas de hemidiafragmas de camundongos.
Injetamos em cinco ADMs 15 U de BoNT/A (Ona), em cinco ADMs 15 U de BoNT/C, em
cinco ADMs 15 U de BoNT/F, em cinco ADMs 1500 U de BoNT/ B (Rima) e em cinco ADMs
0,3 ml de solução salina (placebo) isoladamente.
4.4. Estudo eletrofisiológico
Antes e depois das injeções de BoNT, na semana 2 (sem 2), 4 (sem 4), 6 (sem 6) e 8
(sem 8), avaliamos em cada sujeito:
a. A amplitude máxima de CMAP do músculo ADM, provocada por estimulação elétrica
supramáxima do nervo ulnar no punho. A variação percentual da amplitude CMAP (pico a
pico) foi então calculada em diferentes períodos de controle. b. A análise EMG Multi-
MUAPs, coletada no músculo ADM usando uma
agulha concêntrica e um dispositivo Keypoint (Medtronic®). Foram considerados os
seguintes parâmetros dos MUAPs: amplitude média, duração média, área média e
percentual médio dos potenciais polifásicos. c. A análise do padrão de interferência EMG
(Han et al.) (Han et al.), coletada no músculo ADM usando uma agulha concêntrica e um
dispositivo
Keypoint (Medtronic®). O valor médio de Voltas/Amplitude foi considerado para IP. d. A
análise Single Fiber EMG (SF-EMG), coletada no músculo ADM usando uma agulha
concêntrica e um dispositivo Keypoint (Medtronic®). Os seguintes parâmetros SF-EMG
foram considerados:
Jitter médio e Densidade média de fibra (DF).
4.5. Protocolo de estudo (intervenções)
Os indivíduos foram designados aleatoriamente de acordo com um plano randomizado e
cada paciente era cego para o protocolo para o tipo de BoNT ou placebo administrado.
Injetamos BoNT/A versus BoNT/B em 2 indivíduos, BoNT/F versus BoNT/C em 2 indivíduos,
BoNT/B versus BoNT/F em 1 indivíduo, BoNT/ B versus BoNT/C em 1 indivíduo, BoNT/A
versus BoNT/F em 1 indivíduo e BoNT/A versus BoNT/C em 1 indivíduo. Em 4 indivíduos,
cada sorotipo BoNT (A, B, C ou F) foi injetado versus placebo.
No total, cinco músculos ADM foram tratados com BoNT/A, cinco com BoNT/B, cinco com
BoNT/C, cinco com BoNT/F e quatro com placebo. Todas as injeções foram realizadas com
um volume fixo em um único local, no ventre do músculo ADM.
Para randomizar cada sujeito, um plano com software de PC artesanal dedicado foi
aplicado por um neurologista. Os mesmos médicos não cegos, nunca envolvidos na avaliação
clínica dos sujeitos ou estudo eletrofisiológico, prepararam a solução (droga ou placebo).
Outro neurologista, especialista em neurofisiologia e cego, examinou os sujeitos, aplicou as
injeções e fez o estudo eletrofisiológico antes e após o tratamento na 2ª, 4ª, 6ª e 8ª semanas.
Apenas o neurologista que preparou a solução sabia que tipo de substância foi injetada: BoNT/
A,/B,/C,/F ou Placebo (salina) enquanto o outro investigador (cego) coletava os dados clínicos
(CRF) e os efeitos colaterais adversos das injeções.
A maioria dos conjuntos de dados contínuos foram tratados como dados ordinais por não
testes paramétricos. Os dados são apresentados como média ÿ desvio padrão.
5. Resultados
Nenhum efeito colateral geral foi relatado por nenhum dos indivíduos, embora todos os
indivíduos tratados com BoNTs tenham mostrado uma fraqueza mínima na 2ª e 4ª semanas
após o exame clínico, sem diferenças entre eles.
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R. Eleopra et al. Toxico 179 (2020) 84–91

sorotipo.
0,43 (0,1)
0,55 (0,1) 0,48 (0,2)
0,69 (0,2)
0,43 (0,1)
Em todos os músculos injetados com placebo, não observamos nenhuma variação
estatística significativa para todos os parâmetros eletrofisiológicos considerados
(amplitude CMAP, MUAPs, IP e SF-EMG) durante todo o intervalo de tempo considerado. 8w
6w 0,48 (0,2)
0,68 0,6 (0,2) (0,2)
0,73 (0,3)
0,41 (0,2)

Em todos os ADMs injetados com BoNT (ver Tabela 2), um bloqueio neuromuscular
máximo foi obtido em w2 (valor médio de CMAP: 5,7 mV para BoNT/A, 6,1 mV para 1,14*
0,77*
0,96*
0,72*
(0,1)
(0,2)
(0,2) (0,3)
0,44 (0,2)

BoNT/B, 5,7 mV para BoNT/C e 5,2 mV para BoNT/ F), sem diferenças estatísticas
entre os sorotipos. Posteriormente, o perfil da curva do bloqueio neuromuscular foi (0,2)
(0,1)
0,64
0,6 0,6 (0,2)
0,67 (0,3)
0,46 (0,2)

semelhante para BoNT/A, BoNT/B e BoNT/C, enquanto o BoNT/F apresentou uma

recuperação mais rápida do CMAP, parecendo semelhante ao valor basal na 8ª e
estatisticamente diferente dos demais sorotipos (ver Fig. 1A). basal
4ss
2s 0,41 (0,2)
0,43 (0,1) 0,42 (0,1)
0,43 (0,1)
0,42 (0,1)

Os valores médios e SD do EMG concêntrico (Multi-MUAPs e análise de IP) e amplitude

Média
Giro/
SD)
(2,5
IP 8w (24)
(20)
(17)
38*
26*
22*
20* (10)
1,8 (1.1)

SFEMG na ADM estão resumidos na Tabela 3 e na Figura 1B/F.

6w (12)
(15)
35*
22*
16*
18*
(8) 1.6
(7) (1.2)
Nas w2 e w4, em todos os músculos injetados com BoNTs, observamos uma
diminuição estatisticamente significativa nos parâmetros médios de amplitude, duração
e área dos MUAP em comparação com a linha de base, para todos os sorotipos 4w *(12)
*(11)
12
*(5)
14
12 31
* 1,5
(9) (1.3)

considerados. No entanto, após w6 apenas para BoNT/F revelaram uma recuperação

mais rápida nos parâmetros MUAPs (amplitude, duração e área), sem qualquer
6,5*
7,7*
(6)
(6)
8*
(2)
4* 1.9
(7) (1.1)

diferença estatística em comparação com a linha de base na w8. Por outro lado, os
outros sorotipos mostraram uma recuperação mais lenta dos MUAPs e não recuperação
completa mesmo na s8 e estatisticamente diferente da linha de base. DP) MUAP
Média
(2,5 polifásico
[%] basal
2w 1,5
(1)
1,6
(1) 1.6 (0,9)
1,6 (0,7)
1,6 (0,9)

Em relação à porcentagem de MUAPs polifásicos, detectamos apenas um leve

aumento do valor médio na 2ª sem significância estatística para todos os sorotipos
8w (2,1)
(2,3)
8,1
9 8.8 (1.4)
10 9,9
(2) (0,7)

considerados, exceto para BoNT/F, que parece ter um aumento mais rápido na 4ª, 6ª
e 8ª semanas em comparação com o outros sorotipos.
O Padrão de Interferência revela um leve aumento no valor médio de Turns/ 6w (1,4)
7,7*
7,8*
(2) 8.5 (2)
8 (1.7)
10.8 (0,6)

Amplitude para todos os sorotipos considerados de w2 a w8, com um nadir em w4.

Dentre todos os sorotipos, BoNT/B e BoNT/F parecem ter prevalência discreta, mas 4w (1,8)
(1,2)
7,6*
7* 8.3 (1)
7* (2)
10 (0,9)

sem diferenças estatisticamente significativas.

Para todos os BoNTs, os parâmetros SF-EMG FD apresentam um valor de aumento
mínimo em w2, não confirmado nas etapas seguintes, enquanto o valor de Jitter 5,5*
(0,7)
(2,2)
5,1*
(1,2)
7,1*
6,6* (0,6)
11 (0,8)

aumenta estatisticamente em w2 com uma diminuição mais lenta ao longo do tempo.

O aumento dos valores de jitter é mais evidente para BoNT/B em todas as etapas DP) Duração
Média
(2,5 MUAP
[ms] basal
2w (0,5)
(0,7)
10
10 9.8 (0,6)
9,9 (0,7)
10 (0,6)

consideradas, mesmo que não seja estatisticamente significativo.

Em E, a análise do padrão de interferência com determinação da relação giro/
amplitude. Em F, o jitter na fibra única –EMG. BoNT/F mostrou um aumento precoce 8w *(148)
561
*(120)
(150)
799
615
654 (132)
815 (102)

de MUAPs polifásicos (D) e aumento dos valores de jitter em w2 (F).

6w (130)
(136)
(104)
709*
619*
616*
720 (77)
942 (121)

6. Discussão
4w (109)
(198)
512*
425*
493*
375*
(65) (117)
821 (95)

Na prática clínica, a duração do efeito da BoNT depende da dose administrada, do

volume de diluição e do local das injeções e os resultados clínicos também mudam em
(171)
(135)
382*
550*
568*
330*
(92) (82)
902 (110)
relação ao mecanismo farmacológico do sorotipo utilizado que na prática clínica é
comumente o BoNT/A (Hallett, 2000; Pirazzini et al., 2017; Rossetto et al., 2014).
DP) Amplitude
Média
(2,5 MUAP
[mV] basal
2w 811 (103)
(107)
807 801 (101)
810 (105)
809 (107)

Durante o tratamento crônico com BoNT/A, o benefício clínico geralmente é

detectado em um período de 3 a 4 meses, com benefício máximo após 4 a 6 semanas.
(3)
As injeções podem ser repetidas por um longo período de tempo e esta terapia parece
8w 7,8*
(1,4)
13,3
(1,3)
(1,3)
7,2*
8,6* 17,6
(3)

útil para várias doenças neurológicas e não neurológicas. Os efeitos colaterais são
raros, sempre transitórios e apenas em alguns casos são descritos efeitos colaterais 6w (0,7)
(1,1)
(0,7)
5,4*
8,4*
7,7*
9,4 (2.9)
17.8 (2.5)

sistêmicos e não significativos (Hallett et al., 2013).

Em humanos, a eficácia e a segurança de Ona, Inco, Abo e Rima no tratamento
de longo prazo estão bem estabelecidas, independente de cada uma das marcas de
4w (1,49
(1,2)
(0,1)
5,5*
5,2*
7,1*
6,9* (0,5)
15,2 (3)

BoNTs utilizadas (Fraint et al., 2016) . No entanto, a determinação das doses

equivalentes da unidade de BoNT's utilizadas entre as várias marcas comerciais 5,7*
(1,2)
(0,9)
(0,9)
3,2*
4,7*
6,1* (0,7)
15 (3)
continua a ser difícil de igualar tendo em conta a variabilidade dos estudos publicados,
as diferentes escalas clínicas adoptadas e a progressão das várias doenças, que
DP) Amplitude
CMAP
[mV] 16,7
16,2
(3)
(2) 16.6 15,7
(5) (1.5) (2)
influenciaram claramente os desfechos clínicos.
Média
(2,5 basal
2w

Além disso, se quisermos comparar diferentes sorotipos de BoNT em humanos, A B C F

BoNT/ BoNT/ BoNT/ BoNT/ Plaebo
16.2
precisamos considerar também os diferentes mecanismos de ação, potência e perfil de Tabela
2 A
2 MUAP
razão
análise
(IP).
resume
Tabela
cMAP
dados
ADM- são
área
EMG
com
da
da
do
os
e e de
dos
do
teste
de
da
e ede
na
giro
Ose8.
6,
4,
2,estatisticamente
apresentados
significativas
mostradas
Diferenças
neurofisiológicos
interferência
detectados
semanas
padrão.
relatados
quantitativa
ÿdesvio
amplitude
polifásicos
média
amplitude,
dados
(basal)
como
avaliação
MUAPs,
duração,
padrão
dados
análise
base com
são
são
linha
nas
Os (*).

efeitos colaterais.

88
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R. Eleopra et al. Toxico 179 (2020) 84–91

Fig. 1. Duração da paralisia muscular decorrente de diferentes sorotipos de BoNTs (A–F). Em A, a recuperação da amplitude do cMAP detectada pela estimulação do nervo ulnar no punho e
registrada no músculo ADM. A recuperação inicial foi mais precoce com BoNT/F em comparação com os outros sorotipos. Em BD a análise multi-MUAP: em B a variação da amplitude dos
MUAPs, em C a duração dos MUAPs, e em D o MUAP polifásico expresso em média. Após seis semanas, apenas o BoNT/F apresentou uma recuperação mais rápida nos parâmetros MUAPs
(amplitude, duração).

Tabela 3

Densidade média da fibra SFEMG JITTER (MSD)

SFEMG (2,5 SD) Média (2,5 DP)

basal 2w 4w 6w 8w basal 2w 4w 6w 8w

BoNT/A 1,8 (0,2) 2,4 (0,7) 2,2 (0,4) 2 (0,4) 1,9 (0,3) 25,5 (13) 89 (35) 72,5 (25) 67 (19) 52 (22)
BoNT/B 1,6 (0,2) 2,2 (0,6) 2 (0,5) 2,1 (0,5) 1,9 (0,6) 25,5 (11) 78 (38) 69 (18) 71 (22) 63 (28)
BoNT/C 1,8 (0,1) 2,3 (0,7) 2 (0,7) 2,3 (0,5) 2,1 (0,4) 24,5 (12) 80 (30) 69 (26) 65 (27) 55 (18)
BoNT/F 1,7 (0,1) 2,6 (0,4) 2,1 (0,5) 2 (0,4) 2 (0,5) 25 (12) 108 (25) 90 (30) 84 (29) 51 (20)
Placebo 1,8 (0,2) 1,7 (0,3) 1,9 (0,4) 1,7 (0,3) 1,7 (0,3) 26 (13) 28 (14) 30 (11) 24 (15) 27 (13)

Dados neurofisiológicos de eletromiografia de fibra única (SF-EMG). Os dados são apresentados como média ÿ desvio padrão.
Os dados são detectados e relatados na linha de base (basal) e nas semanas 2, 4, 6, 8; Os dados são apresentados como média ÿ desvio padrão.

89
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R. Eleopra et al.
As diferenças de potência entre a preparação de BoNT/A e/B foram bem documentadas
na prática clínica (Bentivoglio et al., 2015; Fraint et al., 2016), embora apenas alguns
estudos tenham avaliado os efeitos a longo prazo da BoNT/B, em particularmente em
comparação com BoNT/A. No que diz respeito às doenças neuromusculares, a BoNT/B
parece ser eficaz em doses mais altas (unidades), com mais imunogenicidade em
consideração à maior carga de proteína e dose cumulativa total injetada para uma
resposta clínica (Fraint et al., 2016 ) .
Diferentes estudos clínicos confirmam que a dose clínica eficaz de
Rima para o tratamento da distonia cervical é superior à dosagem de Ona (Brashear et al.,
1999; Brin et al., 1999), da mesma forma quando os clínicos desejam tratar distúrbios
autonômicos, mesmo que em menor proporção (Nau mann , 2015; Petracca et al., 2015).
Desde as primeiras experiências com BoNT/B, os investigadores observaram
consistentemente efeitos autonômicos mais frequentes com BoNT/B do que com BoNT/A.
Estes incluíram disfagia, xerostomia e outros efeitos colaterais anticolinérgicos (isto é,
constipação) (Bentivoglio et al., 2015).
Nas desordens secretoras, as BoNT/B parecem eficazes e geralmente injetadas em
doses menores quando comparadas às doenças neuromusculares, mesmo que com
relação de dose diferente de outras doenças autonômicas.
No entanto, efeito equivalente de BoNT/A é relatado no sistema autonômico, sem qualquer
vantagem clínica importante para os pacientes após injeções de BoNT/B (Bentivoglio et
al., 2015; (Naumann, 2015). Mais ensaios clínicos são necessários para melhor esclarecer
o papel dos diferentes sorotipos BoNT em diferentes indicações clínicas autonômicas.
Para os outros serotipos diferentes não temos quaisquer dados clínicos significativos
porque apenas alguns tratamentos off-label são relatados (Greene e Fahn, 1993; Ludlow
et al., 1992); (Greene e Fahn, 1996; Houser et al., 1998; Sheean e Lees, 1995); (Chen et
al., 1998; Eleopra et al., 1997a; Mezaki et al., 1999) e temos apenas a evidência do perfil
temporal na resposta usando dados eletrofisiológicos em voluntários normais (Sloop et al.,
1997) ; (Dressler e Eleopra, 2006; Eleopra et al., 1996, 1997a, 1997b, 1998, 2002, 2004,
2006, 2013, 2018; Mezaki et al., 1995).
Diferentes durações de ação usando outros sorotipos de BoNT podem ser importantes
para os médicos, porque as preparações de BoNT de ação curta (como BoNT/F ou BoNT/
E) podem ser úteis para doenças humanas nas quais é necessário um benefício terapêutico
mais rápido e curto. Caso contrário, um efeito de ação prolongada pode ser sugerido para
pacientes com doença estável e crônica, quando injeções mais frequentes se traduzem
em visitas extras ao médico e custos de tratamento mais altos por ano. Um maior número
de injeções também contribuirá para a carga cumulativa de proteína dos pacientes, que,
como mencionado anteriormente, foi associada à resistência imunológica clínica (Dressler
e Bigalke, 2017; Jankovic e Schwartz, 1995).
Entre as diversas variáveis que afetam a duração clínica de diferentes sorotipos de
BoNT, algumas delas podem estar relacionadas ao brotamento de uma terminação nervosa
diferente após um período prolongado de neurotransmissão inibida ( Angaut-Petit et al.,
1990). De fato, a contribuição desses brotos para a recuperação funcional após a injeção
de BoNT não é clara em humanos.
Os resultados do nosso estudo em indivíduos saudáveis voluntários mostraram uma
diminuição significativa na amplitude do CMAP na w2 para todos os sorotipos injetados
em comparação ao placebo, com uma recuperação mais precoce e rápida do bloqueio
neuromuscular evidente para BoNT/F, que foi após a w6 , de acordo com nossos dados
publicados anteriormente (Eleopra et al., 2006).
Portanto, uma alteração precoce prevalente e significativa nos parâmetros de MUAPs
(aumento de MUAPs polifásicos com baixa amplitude e curta duração) foi observada
apenas para BoNT/F que associou a um maior aumento nos valores de jitter em w2,
mesmo que não estatisticamente significativo quando em comparação com os outros
sorotipos, confirmando que as alterações EMG precoces são expressão de reinervação
funcional mais rápida, porque terminal da placa terminal precoce ou brotamento colateral
(reinervação transitória precoce) está associado a alterações de jitter mais proeminentes.
Todos os BoNTs não revelaram aumento significativo da FD durante todo o período
considerado, confirmando a ausência de qualquer alteração nas junções neuromusculares
durante a fase de brotação (funcional
90
Toxico 179 (2020) 84–91
reinervação). Pela primeira vez em indivíduos saudáveis, nossas observações demonstram
que a recuperação inicial da contração muscular em humanos é revelada pelo estudo
CMAP e EMG, de acordo com o reaparecimento da renovação vesicular.
Em nosso estudo experimental, o surgimento eletrofisiológico precoce de BoNT/F
detectado e a recuperação mais rápida na tendência CMAP sugerem que, para esse
sorotipo específico, os terminais nervosos tiveram sinapse totalmente funcional recuperada
na 8ª s. Para os outros sorotipos, as alterações eletrofisiológicas de MUAPs e CMAPs
revelam apenas uma recuperação funcional mais lenta e progressiva, mas apenas em
um estágio posterior, quando o turnover vesical retornou aos terminais originais
acompanhado de uma regressão do brotamento nervoso.
Assim, uma avaliação EMG prognóstica dos brotos terminais pode ser indicativa de
uma diferente recuperação funcional da BoNT em humanos, semelhante às observações
originais de dePaiva et al. (de Paiva et al., 1999). Isso pode ser útil para os clínicos,
quando uma resposta clínica diferente precisa ser verificada na prática clínica.
7. Conclusões
A BoNT/A tem sido usada terapeuticamente por muitos anos e para uso clínico, mas
é importante considerar como as diferenças entre os sorotipos influenciarão a duração da
resposta clínica. À medida que mais dados são publicados, a justificativa para a escolha
de diferentes sorotipos de BoNT torna-se interessante para os médicos. Conforme
demonstrado em estudos pré-clínicos e clínicos, as diferenças de BoNT resultam em uma
combinação única de eficácia, duração de ação, segurança e potencial antigênico para
cada preparação.
Estudos eletrofisiológicos (parâmetros CMAP ou EMG) permitirão aos médicos tomar
decisões baseadas em dados sobre o melhor tratamento com toxina botulínica para seus
pacientes e avaliar a estratégia no tratamento a longo prazo ou selecionar o melhor
sorotipo para cada paciente.
Declaração Ética para Iônicos de Estado Sólido
Por meio desta, eu Roberto Eleopra conscientemente asseguro que para o manuscrito
“Duração clínica da ação de diferentes tipos de toxina em humanos“ é cumprido o seguinte:
1) Este material é trabalho original dos autores, que não foi publicado anteriormente em
outro lugar.
2) O artigo não está sendo considerado para publicação no momento
em outro lugar.
3) O artigo reflete a própria pesquisa e análise dos autores de forma verdadeira e completa.
4) O artigo credita adequadamente as contribuições significativas dos co-autores e co-
pesquisadores.
5) Os resultados são adequadamente colocados no contexto de estudos anteriores e
pesquisas existentes.
6) Todas as fontes utilizadas são devidamente divulgadas (citação correta). A cópia literal
do texto deve ser indicada como tal usando aspas e dando a devida referência.
7) Todos os autores estiveram pessoal e ativamente envolvidos no trabalho substancial
que levou ao artigo e assumirão a responsabilidade pública por sua
contente.
A violação das regras da Declaração Ética pode resultar em graves
consequências.
Concordo com as declarações acima e declaro que este envio segue as políticas da
Solid State Ionics, conforme descrito no Guia para Autores e na Declaração Ética.
Declaração de interesse concorrente
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes conhecidos ou
relacionamentos pessoais que possam parecer influenciar o trabalho relatado neste artigo.
Machine Translated by Google
R. Eleopra et al.
Declaração de contribuição de autoria do CRediT
Roberto Eleopra: Conceituação, Curadoria de dados, Análise formal, Metodologia,
Supervisão, Validação, Redação - rascunho original, Redação - revisão e edição. Sara Rinaldo:
Curadoria de dados, Análise formal, Validação, Redação - rascunho original, Redação -
revisão e edição.
Cesare Montecucco: Metodologia, Supervisão, Validação, Redação - rascunho original.
Ornella Rossetto: Metodologia, Supervisão, Validação, Redação - rascunho original, Redação
- revisão e edição. Grazia Devigili: Conceituação, Curadoria de dados, Metodologia,
Supervisão, Validação, Redação - rascunho original, Redação - revisão e edição.
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