1 Inseminação artificial em tempo fixo em bovinos – estado da arte

2 e perspectivas
3 1-Jurandy Mauro Penitente Filho
4 Médico Veterinário, Doutorado em Zootecnia / UFV.

5 2-Fabrício Albani Oliveira

6 Médico Veterinário, Doutorado em Zootecnia / UFV.

7 3-Carolina Rodriguez Jimenez

8 Zootecnista / Universidad de Cundinamarca, Doutorado em Zootecnia / UFV.

9 4-Camila Oliveira Silveira

10 Médica Veterinária / Centro Universitário Nilton Lins, Estudante de Doutorado em Medicina
11 Veterinária / UFV.

12 5-Ciro Alexandre Alves Torres

13 Médico Veterinário / UFMG, PhD em Fisiologia e Endocrinologia Reprodutiva / University of
14 Wisconsin-Madison, Professor / UFV.

15
16 Resumo: A inseminação artificial (IA) é uma biotécnica reprodutiva que permite rápido
17 ganho genético. Com o desenvolvimento da sincronização de estros, biotecnologia
18 reprodutiva que permite manipular o ciclo estral com a utilização de hormônios, foi
19 possível o surgimento da inseminação artificial em tempos fixo (IATF), possibilitando
20 além de ganho genético, maior controle sobre o manejo reprodutivo. Os programas de
21 IATF se tornaram possíveis devido aos esforços de pesquisadores que desenvolveram
22 métodos farmacológicos de controle do ciclo estral. Os principais hormônios utilizados
23 na sincronização de estros são progestágenos, GnRH, prostaglandina F2α e seus
24 análogos sintéticos, estradiol, gonadotrofina coriônica equina. Os resultados mais
25 eficazes para sincronização de estros foram obtidos quando o estradiol foi aplicado até
26 um dia depois da inserção do implante de progesterona. Contudo, os resultados de
27 programas de IATF com sêmen sexado ainda são inconsistentes sendo comum o uso de
28 protocolos mistos, no qual se realiza a sincronização folicular sem o estímulo final à
29 ovulação levando à necessidade de observação de cio. Estratégias nutricionais e
30 hormonais visando melhorar a taxa de concepção vêm sendo utilizadas
31 concomitantemente à IATF, contudo, com resultados variados.

1
32 Palavras-chave: biotecnologia reprodutiva; eficiência reprodutiva; sincronização de
33 estros
34

35 Timed artificial insemination in cattle – state of art and

36 perspectives
37 Abstract: Artificial insemination (AI) is a reproductive biotechnology that allows rapid
38 genetic gain. With the development of estrus synchronization, reproductive
39 biotechnology to manipulate the estrous cycle with the use of hormones; it was possible
40 the emergence of timed artificial insemination (TAI), enabling genetic gain and control
41 over the reproductive management. TAI programs became possible due to the efforts of
42 researchers who developed pharmacological methods to control the estrous cycle. The
43 main hormones used in estrus synchronization are progestins, GnRH, prostaglandin F2α
44 and their synthetic analogues, estradiol, equine chorionic gonadotropin. The most
45 effective results for synchronizing estrus were obtained when estradiol was applied until
46 one day after insertion of a progesterone implant. Nevertheless, the results of TAI
47 programs using sex-sorted semen are still inconsistent, being common the use of mixed
48 protocols, in which follicular wave is synchronized without the final stimulus to
49 ovulation leading to the need for estrus detection. Hormonal and nutritional strategies to
50 improve conception rates have been used concurrently with TAI, however, with varied
51 results.
52 Keywords: estrus synchronization; reproductive biotechnology; reproductive efficiency

53
54 Introdução:
55 A inseminação artificial (IA) é uma biotécnica da reprodução que permite um
56 rápido ganho genético, sendo que durante os últimos anos observa-se um aumento na
57 utilização da IA (Figura 1). O uso da inseminação artificial em tempo fixo (IATF) tem
58 aumentado expressivamente no Brasil em decorrência das facilidades de realização dos
59 programas de IA a campo e dos resultados obtidos de taxas de gestação (ASBIA, 2012).
60 A aplicação de estratégias para eficiência reprodutiva de fêmeas bovinas com o
61 uso da IA se traduz em aperfeiçoamento da IATF, difusão do conhecimento para a
62 aceitação dos produtores, a fim de assegurar investimento em biotecnologias que
63 contribuam para o melhoramento genético e, consequente aumento de produção. Assim,

2
64 este trabalho visa revisar os principais protocolos utilizados na IATF e as pesquisas que
65 visam aumentar a eficiência desta técnica, bem como discorrer sobre os desafios atuais e
66 as perspectivas na utilização da IATF em rebanhos bovinos.
67
68 Ciclo estral:
69 O ciclo estral em bovinos apresenta duração média de 21 dias e é regulado por
70 interações endocrinológicas de hormônios secretados pelo hipotálamo, hipófise, ovários
71 e útero. Esse período pode ser dividido em duas fases distintas quais sejam: folicular ou
72 estrogênica, que se estende do pró-estro ao estro, culminando com a ovulação; e fase
73 luteínica ou progesterônica (metaestro e o diestro) fase de maior secreção de
74 progesterona, que termina com a luteólise.
75 O crescimento dos folículos ovarianos nas fêmeas bovinas se dá em ondas,
76 geralmente duas ou três por ciclo. Cada onda pode ser dividida em três fases: 1)
77 Recrutamento, quando vários folículos primários passam a se desenvolver
78 concomitantemente. Esta fase é dependente do FSH (Hormônio Folículo Estimulante).
79 2) Seleção e dominância: na qual um folículo cresce mais que os outros, tornando-se
80 dominante e inibindo o crescimento dos demais (subordinados). Esta fase é dependente
81 também do LH (Hormônio Luteinizante). 3) Ovulação ou atresia: O folículo dominante
82 (FD) ovula após um pico de liberação de LH. No entanto, se houver um corpo lúteo
83 ativo, os níveis de progesterona estarão altos inibindo a liberação de LH (feedback
84 negativo) e, então, o FD entra em atresia e uma nova onda de crescimento folicular se
85 inicia. A última onda folicular de cada ciclo culmina com a regressão do corpo lúteo
86 induzida pela prostaglandina F2α liberada no útero. Com a diminuição dos níveis de
87 progesterona, cessa-se a inibição sobre o LH, que é liberado em pulsos e induz o
88 crescimento final do folículo, a ovulação e posterior luteinização na formação do novo
89 corpo lúteo (Gonçalves et al., 2001).
90 Um dos mecanismos essenciais para a divergência folicular, início da maior
91 diferença nas taxas de crescimento entre os dois maiores folículos da onda, é a
92 diminuição da concentração de FSH plasmático (Ginther et al., 1999). A capacidade do
93 FD de continuar o crescimento após o declínio da concentração de FSH pode ser
94 decorrente do aumento da biodisponibilidade do fator de crescimento semelhante à
95 insulina do tipo 1 (IGF-1) no folículo, da expressão de RNA mensageiro do receptor de
96 LH e da expressão de receptores de LH nas células da granulosa, que conferem maior
97 responsividade ao LH em relação aos folículos menores (Crowe, 1999).

3
 98
99 Sincronização de estros:
100 A diferença entre sincronização e indução de estros é que a sincronização consiste
101 em encurtar ou prolongar o ciclo estral pela utilização de hormônios ou associações
102 hormonais que induzam a luteólise ou prolonguem a vida do corpo lúteo, ao passo que,
103 a indução consiste em induzir o estro em fêmeas que estejam em anestro, por meio
104 também, do emprego de hormônios ou práticas de manejo. Assim, são processos
105 distintos e aplicáveis a diferentes categorias animais (Gonçalves et al., 2001).
106 Vários protocolos de sincronização de estro são descritos na literatura, os quais
107 apresentam resultados variáveis, dependendo da condição sanitária e nutricional das
108 fêmeas (Gonçalves et al., 2001).
109
110 Principais hormônios utilizados em programas de IATF:
111 Prostaglandina F2α:
112 As prostaglandinas são substâncias derivadas do ácido araquidônico, ocorrem
113 naturalmente em muitos tecidos e estão envolvidas em várias atividades fisiológicas e
114 farmacológicas no organismo (Abayasekara e Wathes, 1999).
115 A PGF2α e seus análogos sintéticos são utilizados na sincronização do ciclo estral
116 das fêmeas domésticas devido à sua ação luteolítica, promovendo vasoconstrição
117 seguida de uma cascata apoptótica (Weems et al., 2006).
118 Após a lise do corpo lúteo, o estro aparece a intervalos de cinco ou mais dias, o
119 que torna impraticáveis os programas de IATF (Bó e Baruselli, 2002). Esta variação no
120 intervalo da aplicação da PGF2α ao estro e ovulação é decorrente do estado de
121 desenvolvimento dos folículos no momento do tratamento. Dessa forma, se o tratamento
122 for realizado quando o FD está na fase final do seu crescimento, ou no início da sua fase
123 estática, a ovulação ocorrerá dentro de dois a três dias. Por outro lado, se a PGF2α for
124 aplicada quando o FD estiver no meio ou final da sua fase estática, a ovulação ocorrerá
125 cinco a sete dias mais tarde, após o crescimento do FD da próxima onda folicular
126 (Kastelic e Ginther, 1991).
127 As grandes variações no intervalo do tratamento à ovulação, além do manejo da
128 detecção de estro, reforçam a necessidade de protocolos destinados a controlar tanto a
129 fase luteal quanto o crescimento folicular e a ovulação.
130
131 Progestágenos:

4
132 A progesterona (P4) é o progestágeno natural mais importante secretado pelas
133 células luteínicas. Grande número de progestágenos sintéticos tem sido utilizado na
134 prática, como acetato de medroxiprogesterona, acetato de clormadinona, acetato de
135 melengestrol e acetato de flurogesterona, bastante eficazes como sincronizadores de
136 estro.
137 A P4 e suas associações com outros hormônios são amplamente utilizadas no
138 tratamento do anestro pós-parto em bovinos, com resultados variáveis na indução de
139 estro. Os resultados variam de acordo com o tipo de P4 que é utilizada e com o tempo
140 de tratamento (Perry et al., 2002; Stevenson et al., 2003).
141 A administração contínua de P4 por 5 a 9 dias inibe a liberação de LH e, quando
142 há a interrupção de seu fornecimento, é desencadeada uma onda de LH capaz de induzir
143 o crescimento final do folículo pré-ovulatório, culminando com a ovulação (Gonçalves
144 et al., 2001), e a administração de estradiol aumenta a resposta da expressão de estro
145 (McDougall, 1994). Assim, o tratamento com P4 aparentemente sensibiliza vacas em
146 anestro em resposta ao nível folicular de estradiol. A utilização de P4 no tratamento do
147 anestro pós-parto tem proporcionado resultados superiores aos obtidos com MGA,
148 principalmente por diminuir a ocorrência de corpos lúteos de curta duração após o
149 tratamento de indução de estro (Perry et al., 2004).
150
151 Estrógenos:
152 Vários estrógenos são secretados pelos ovários dos mamíferos: 17β-estradiol (E2),
153 estrona, estriol e outros. O LH estimula as células tecais do folículo a secretarem
154 testosterona, que é convertida em estradiol nas células da granulosa por ação da enzima
155 aromatase, que por sua vez tem sua síntese estimulada pelo FSH.
156 A utilização do E2 em programas de sincronização de estro está relacionada com
157 sua habilidade em induzir o surgimento da onda pré-ovulatória de LH, luteólise durante
158 a fase folicular e atresia folicular (Bó et al., 1993; Lammoglia et al., 1998).
159 A aplicação de estrógenos causa, inicialmente, supressão da secreção tanto de
160 FSH quanto de LH (Martinez et al., 2003), levando a atresia dos folículos. Segue-se a
161 liberação de um pico de FSH e, consequentemente, o recrutamento de uma nova onda.
162 O intervalo da aplicação do estrógeno e do recrutamento da nova onda depende da dose
163 administrada do estrógeno, variando em torno de 36 a 72 horas (Martinez et al., 2005).
164 O desenvolvimento de uma nova onda folicular ocorre em torno de quatro dias após a
165 aplicação do E2 e depende do reaparecimento do pico de FSH (Bó et al., 1993). Na

5
166 ausência de P4, o E2 induz liberação de GnRH e LH e ovulação do FD em 36 a 72
167 horas, dependendo do éster de E2 utilizado (Moenter et al., 1990).
168 Diferentes ésteres de E2 vêm sendo utilizados para a sincronização do estro. A
169 maioria é utilizada como solução injetável, como o valerato de estradiol (VE), benzoato
170 de estradiol (BE) e cipionato de estradiol (CE) (Bó et al., 1994; Murray et al., 1998). A
171 maior diferença entre esses compostos é a meia-vida após a administração. A duração
172 da meia-vida é maior em ordem crescente: E2, BE, VE e CE. A administração de uma
173 única injeção de VE (5 mg) resulta na elevação da concentração plasmática de estradiol
174 por um período de cinco a sete dias (Bó et al., 1993), sendo que uma única injeção de E2
175 (5 mg) resulta na elevação plasmática de estradiol por apenas 42 horas (Bó et al., 1994).
176 Estas diferenças promovem mudanças referentes ao protocolo de sincronização
177 estabelecido (Lopez, 2005). Os estrógenos de longa duração promovem o surgimento de
178 uma onda folicular muito variável, e ainda estão ativos no momento de induzir a
179 ovulação durante o protocolo de IATF, por isso o éster de E2 mais utilizado é o BE.
180 Colazo et al. (2003) ao procederem à análise comparativa do CE com o E2 e BE,
181 observaram que o CE foi menos eficaz em sincronizar a emergência da onda e ovulação.
182
183 Associação de progestágenos e estradiol:
184 A função principal do E2 é de induzir a regressão dos folículos antrais em
185 crescimento. Os resultados mais eficazes foram obtidos quando o E2 foi aplicado até um
186 dia depois da inserção do implante de P4.
187 O mecanismo pelo qual o estradiol causa regressão folicular envolve a inibição do
188 FSH, até que o E2 seja metabolizado. A partir de então, o FSH volta a aumentar seus
189 níveis e uma nova onda folicular é recrutada. Os ajustes nos protocolos são
190 controversos, mas tem-se notado maior sincronização da emergência folicular quando o
191 BE é aplicado no D0 (Dia 0) juntamente com 50 mg de P4 (Moreira et al., 2001).
192 Tríbulo et al., (2000) sugerem a inserção do dispositivo de liberação lenta de P4
193 combinado com 2 mg de BE no dia 0, e uma aplicação de PGF2α no dia 7, ou seja, no
194 momento da retirada do dispositivo, e mais uma dose de 1mg de BE no D9, sendo que o
195 D10 foi considerado o dia do estro (Figura 2).
196 Protocolos de sincronização que não necessitam de detecção de estro foram um
197 grande avanço para a IATF, visto que a detecção do estro é o principal fator que
198 influencia a eficiência de programas de IA em bovinos. As perdas de cio aumentam o

6
199 número de dias improdutivos dos animais, o intervalo de partos, e diminuem o número
200 de bezerros nascidos e produção leiteira. (Carrijo Junior e Lander, 2006).
201
202 Gonadotrofina coriônica equina:
203 O hormônio gonadotrofina coriônica equina (eCG), também denominada
204 gonadotrofina do soro de égua gestante (PMSG), é uma glicoproteína produzida pelos
205 cálices endometriais de éguas, entre os 40 e 120 dias de gestação (Ginther, 1979). Em
206 relação a outros hormônios gonadotróficos, o eCG apresenta a singularidade de possuir
207 atividade folículo estimulante e luteinizante na mesma molécula (Papkoff, 1974).
208 A eficácia da inclusão da eCG em protocolos de sincronização de estro é devida
209 ao seu efeito folículo estimulante. Experimentos comprovaram que a administração 300
210 a 500 UI de eCG, em protocolos de IATF, estimula o crescimento folicular até o estágio
211 pré-ovulatório, aumenta a taxa de ovulação e, consequentemente, as taxas de prenhez
212 nos programas (Aleixo et al., 1995, Bó et al., 2003). Entretanto, o eCG é uma proteína
213 de alto peso molecular, extraído do soro de éguas prenhes, passível de provocar reações
214 imunológicas quando utilizado repetidamente. Neste caso, os anticorpos se ligam ao
215 eCG, anulando seu efeito.
216 Chupin e Saumande (1979), avaliando tratamentos com eCG para o controle do
217 ciclo estral, observaram que o implante de P4 por nove dias, com aplicação de 5 mg de
218 VE no início do protocolo e 0,5 mg de análogo de PGF2α dois dias antes da remoção do
219 implante, associados à aplicação de 500 UI de eCG dois dias antes (n = 61 vacas) ou na
220 remoção do implante (n = 62 vacas) propiciaram altos e similares índices de prenhez
221 (67,2 e 67,7%, respectivamente), com maior percentagem de gêmeos no grupo que
222 recebeu eCG dois dias antes da remoção do progestágeno. Além disso, o efeito do dia
223 da aplicação de PGF2α relativo ao do eCG demonstrou que a eficiência da aplicação do
224 eCG dependeu da duração do estímulo. Os mesmos autores também observaram que o
225 tratamento com eCG e PGF2α em vacas da raça Normanda lactantes, em que o eCG (600
226 UI) e a PGF2α foram aplicados juntos, maiores taxas de ovulação ocorreram quando os
227 hormônios foram aplicados dois dias antes do que na remoção do implante de P4.
228
229 Hormônio liberador de gonadotrofinas:
230 O hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) é um decapeptídeo produzido no
231 hipotálamo. Esse hormônio hipotalâmico é liberado de modo pulsátil e, na fêmea, a sua
232 frequência e amplitude variam durante os estágios reprodutivos nas diferentes espécies.

7
233 Há ainda alguma dúvida sobre se o GnRH controla LH e FSH, porque a síntese e
234 liberação do LH são muito mais responsivas ao GnRH do que a síntese e liberação do
235 FSH (Valle, 1991).
236 A administração de GnRH eleva a concentração de LH na circulação periférica
237 dentro de 2 às 4h (Twagiramungu et al., 1995). O GnRH promove a ovulação ou a
238 luteinização do FD se este estiver em sua fase de crescimento ou no início de sua fase
239 estática (Martinez et al., 1997). A resposta folicular frente ao tratamento com GnRH
240 deve-se a liberação de LH.
241 Protocolos de sincronização de estro que utilizam GnRH para iniciar uma nova
242 onda de crescimento folicular ou promover a ovulação de um FD no momento da IA,
243 têm sido desenvolvidos para gado de corte e leite. Quando administrado em estágios
244 aleatórios do ciclo estral, o GnRH determina a ovulação do FD com mais de 9 mm ou
245 sua atresia, e induz a emergência de uma nova onda de crescimento folicular dentro de 2
246 a 3 e 1 a 2 dias em vacas e novilhas, respectivamente (Bragança, 2007). A aplicação de
247 GnRH (100µg) promove a ovulação em cerca de 85-90% das vacas e 56% das novilhas
248 (Pursley et al., 1995).
249
250 Sêmen sexado:
251 A separação dos espermatozoides X e Y através da citometria de fluxo é
252 relativamente lenta e causa lesões às células espermáticas, assim, a concentração
253 utilizada nas palhetas é menor do que quando se utiliza o sêmen convencional. Contudo,
254 alguns touros geram a mesma taxa de concepção quando da inseminação com sêmen
255 sexado ou convencional (Borchersen e Peacock, 2009), visto que existem diferenças
256 entre os bovinos quanto às características do cromossomo Y (Garner, 2006).
257 A taxa de concepção após observação de cio e IA com sêmen sexado é de cerca de
258 70 a 90% da taxa atingida após o uso de sêmen convencional sendo que os resultados
259 dependem das condições de manejo das propriedades (Seidel Jr et al., 1999).
260 Uma alternativa para uso do sêmen sexado em programas de IATF é o uso de
261 protocolos mistos, no qual se realiza a sincronização folicular, porém sem o estímulo
262 final à ovulação. Os animais que não apresentarem estro até 54 horas após a retirada do
263 dispositivo podem ser inseminados em tempo fixo com sêmen convencional (Tecnopec,
264 2010).
265 O efeito da administração de GnRH no momento da detecção do estro apresenta
266 resultados inconsistentes (Tecnopec, 2010; Sá Filho et al., 2010). Contudo, a IATF com

8
267 sêmen sexado realizada 60 horas após a retirada do implante de P4 (10-12 horas antes
268 da ovulação) vem demostrando ser uma opção para obtenção de boas taxas de gestação
269 (Souza et al., 2008; Baruselli et al., 2011).
270
271 Estratégias para incrementar a taxa de concepção na IATF:
272 Algumas estratégias visam melhorar a taxa de concepção e podem ser utilizadas
273 concomitantemente à IATF. A aplicação de análogo de GnRH, 12 dias após a IA induz
274 a ovulação do FD da 1ª onda folicular subsequente gerando um corpo lúteo acessório e
275 aumentando a produção de P4, podendo melhorar as taxas de prenhez, por diminuir os
276 índices de perda embrionária (López-Gatius et al., 2006). A ingestão de ácidos graxos
277 Ômega-3, durante o período reprodutivo, podem melhorar a taxa de concepção na IA,
278 diminuindo o índice de perda embrionária motivada pela regressão precoce do corpo
279 lúteo. Os ácidos graxos Ômega-3 mudam a cadeia de degradação do ácido araquidônico,
280 resultando em prostaglandinas do tipo E que não são ativas na lise do corpo lúteo (Petit
281 et al., 2002; Gregory et al. 2009). A administração de rbST (Somatotropina
282 recombinante bovina) eleva as concentrações plasmáticas de IGF-I e insulina,
283 exercendo efeito sobre maturação dos ovócitos por efeito direto ou pela estimulação das
284 células da granulosa, além de agir nos estádios iniciais do desenvolvimento embrionário
285 (Pavlok et al., 1996; Prado et al., 2003). A utilização de flunixin meglumine durante o
286 reconhecimento materno da gestação pode inibir a ciclo-oxigenase e, portanto, impedir
287 a conversão do ácido araquidônico em PGF2α (Binelli et al., 2001), mas com resultados
288 inconsistentes com relação às taxas de gestação.
289
290 Conclusões:
291 Qualquer programa eficaz de controle do ciclo estral deve proporcionar uma
292 frequência alta e previsível de estros e resposta ovulatória durante um período de 12 a
293 24 horas, seguida de uma alta taxa de prenhez a uma única IA pré-programada.
294 A adequação do momento da IA em relação ao início do estro pode melhorar as
295 taxas de concepção em fêmeas inseminadas com sêmen sexado. Em programas de
296 IATF, melhores resultados são obtidos quando as IAs são realizadas entre 10 e 12 horas
297 antes da ovulação. Contudo, mais experimentos são necessários para melhor
298 compreender os fatores que afetam a fertilidade do sêmen sexado em fêmeas bovinas.
299 Os métodos para incrementar as taxas de gestação em programas de IATF ainda
300 são foco de extensa pesquisa. Contudo, é importante salientar que os métodos

9
301 farmacológicos de manipulação do ciclo estral nunca devem ser considerados como
302 substituto do manejo nutricional adequado e do manejo adequado dos reprodutores.
303
304
305
306 Referências:
307 ABAYASEKARA, D.R.E.; WATHES, D.C. Effects of altering dietary fatty acid
308 composition on prostaglandin synthesis and fertility. Prostaglandins, Leukotrienes
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311 ASBIA – Importação, exportação e comercialização de sêmen. 2012, 19p.
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318 Theriogenology. v.36, n.2, p.169-183, 1993.
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10
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444 Figura 2 – Protocolo de sincronização de estro utilizando associação de progestágeno e estradiol.

14