Tecnologia na hematologia

MV MSc PhD Samantha Ive Miyashiro

 Tópicos a serem discutidos
Obrigada, Ricardo!

Métodos de contagem Tecnologias empregadas

celular na hematologia
▪ Manual ▪ Evolução
▪ Automatizada ▪ Benefícios
▪ Semi-automatizada ▪ Recomendações

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 Contagem celular
manual

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 Microhematócrito e hemoglobina

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 Avaliação de lâmina
• Contagem diferencial de leucócitos
• Avaliação morfológica celular

https://www.wikiwand.com/en/Blood_film
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 Hemograma manual
▪ Componentes mensurados:
▪ Série vermelha
▪ Contagem de Hemácias
▪ Hematócrito ou Volume Globular
▪ Concentração de Hemoglobina
▪ Contagem de reticulócitos (%)

▪ Série Branca
▪ Contagem total de leucócitos
▪ Contagem diferencial de leucócitos (%)

▪ Plaquetas
▪ Contagem de plaquetas

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 Hemograma manual
▪ Componentes calculados:
▪ Série vermelha
▪ Índices hematimétricos – VCM, HCM, CHCM
▪ Reticulócitos absolutos
▪ Índices de correção de reticulócitos

▪ Série Branca
▪ Valores absolutos de cada leucócito
▪ Correção de leucócitos totais se tiver eritroblastos na amostra

▪ Microscopia
▪ Avaliação morfológica celular
▪ Validação dos valores mensurados

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 O que compõe um hemograma manual
▪ Dados numéricos
▪ Mensurados
▪ Calculados
▪ Avaliação microscópica do esfregaço sanguíneo

▪ Demanda
▪ Tempo de execução
▪ Expertise

▪ Limitação
▪ Capacidade de processamento
▪ Erros inerentes ao método

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 Tecnologia aplicada ao hemograma

▪ Impedância elétrica (princípio de Coulter)

▪ Radiofrequência (condutividade)
▪ Laser
▪ Citoquímica
▪ Fluorescência

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 Tecnologia aplicada ao hemograma -
Leucograma

3 partes 5 partes 7 partes

Diferenciação dos Diferenciação dos Diferenciação dos
leucócitos em 3 leucócitos em 5 leucócitos em 5
categorias: categorias: categorias +:
1. Granulócitos 1. Neutrófilos 6. Eritroblastos
2. Linfócitos 2. Eosinófilos 7. Células anormais e
atípicas e imaturas
3 Monócitos e outros 3. Basófilos
4. Linfócitos
5. Monócitos

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 Avanço tecnológico no hemograma

https://www.technologynetworks.com/diagnostics/articles/optimizing-optical-technology-for-automated-hematology-analyzers-322252

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 Precisão e acurácia
Precisão Acurácia

▪ Resultados similares ao valor ▪ É quão perto do valor verdadeiro

médio – congruência de uma mensuração está
resultados
▪ Reprodutibilidade e confiabilidade Toda mensuração,
tem algum erro
▪ Não é necessariamente acurado

Os resultados
devem ser
consistentes e
próximos do
valor aceitável
http://msclantonsphysicalscienc
epage.weebly.com/accuracy-
versus-precision-lab-activity-
page-two.html
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 Precisão e acurácia

Fonte: Harvey, 2002

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 Princípio de Coulter
▪ A céls sanguíneas, que têm baixa
condutividade, são suspendidas em
um diluente condutor
▪ A suspensão passa por um campo
elétrico criado entre 2 eletrodos em
uma pequena abertura (“zona de
detecção”)
▪ A passagem de cada partícula pela
abertura aumenta momentaneamente
a impedância (resistência) da
corrente elétrica entre os eletrodos
▪ O aumento da impedância cria um
pulso que é convertido em número
▪ Número de pulsos = contagem
celular
▪ A amplitude do pulso = Volume da https://en.wikipedia.org/wiki/Hematology_analyzer
célula

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 Impedância

https://www.sysmex.co.jp/en/rd/history_awards/history/history01_2.html

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 https://www.sysmex.co.jp/en/rd/history_awards/history/history04_2.html

https://oncohemakey.com/automated-cell-counting-instrumentation/

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 Impedância
Contagem de hemácias e plaquetas

# RBC WBC

PLT

RDW
PDW
fL

VPM MCV
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 Gato
He Normal Deslocamento
do gráfico de
histograma
Esquerda: Microcitose ( VCM)
Direita: Macrocitose (↑ VCM)

Dois picos: Duas populações de

Gato hemácias
Microcitose Base larga: Anisocitose (RDW)

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 RDW

https://eclinpath.com/hematology/tests/red-blood-cell-distribution-width/rdw/
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 RDW

Fonte: Caporal, 2013

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22 © 2016 IDEXX Laboratories, Inc. All rights reserved.
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 Impedância
Contagem diferencial de leucócitos

Fonte: Kottke-Marchant, 2012

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 • Composição nuclear
Radiofrequência • Densidade citoplasmática
• Outras estruturas internas
• Diferencial de 5 partes

https://www.sysmex.co.jp/en/rd/history_awards/history/history04_2.html

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Radiofrequência

Contagem diferencial
de leucócitos 5 partes

https://oncohemakey.com/automated-cell-counting-instrumentation/
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 Erros do método
▪ Interferentes e fontes de erros:

▪ Recirculação
▪ Sobreposição de células
▪ Agregados plaquetários
▪ Macroplaquetas

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 Impedância + citometria de fluxo
▪ Fluxo laminar (focagem hidrodinâmica)
para impedância

▪ Melhor alinhamento das células a

serem analisadas - individualização
▪ Permite contagens celulares rápidas,
precisas e acuradas

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 Equipamentos por impedância

In-House

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 Sasha - Impedância
Sasha

Normal

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 Com base no histograma de He/Plaq da
Sasha, vc sente confiança nos resultados do
eritrograma?
1. Sim
2. Não

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 Sasha - Impedância

Sasha

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 Sasha – resultados de impedância
▪ Eritrograma
▪ Resultados confiáveis

▪ Plaquetograma
▪ Resultados confiáveis

▪ Leucograma
▪ Diferencial não confiável
▪ Revisão do histograma é essencial para entendimento do leucograma
▪ A revisão de lâmina é crucial neste caso

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 Tecnologia de impedância

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Impedância + citometria de fluxo + laser
▪ Fluxo laminar:
▪ Enfileiramento das células

▪ Laser:
▪ Mensura o tamanho da células
(maior precisão)
▪ Avalia complexidade de núcleos
celulares

▪ Cuidados:
▪ Rede elétrica
▪ Temperatura ambiente

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Impedância + citometria de fluxo + laser

LS: Volume celular

MS: Informação
nuclear
HS: Informação nuclear e citoplasmática

▪ Diferencial de 4 partes e reação para BASO

▪ Low angle signal (about 1° to 5°) represents the cell volume information
▪ Middle angle signal (about 7° to 20°) represents the cell nucleus information
▪ High angle signal (about 90°) represents the cell nucleus and cytoplasm information.

https://boule.com/knowledge-center/clinical-performance-of-swelab-lumi-hematology-analyzer/
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Impedância + citometria de fluxo + laser

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IDEXX LaserCyte
LaserCyte

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 Cell Dyn - Abbott

Mindray 5800
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Impedância + citometria de fluxo + laser +
óptica/citoquímica
▪ Citometria de fluxo:
▪ Enfileiramento das células

▪ Laser:
▪ Mensura o tamanho da células
(maior precisão)
▪ Avalia complexidade de núcleos
celulares

▪ Corante:
▪ Citoquímica - mieloperoxidase
▪ Fluorescência
▪ Tamanho celular, complexidade
interna, segmentação nuclear,
granulosidade citoplasmática
▪ Diferencial de 5 partes
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 Impedância + • Fluorescência óptica
citometria de fluxo + • Contagem de reticulócitos
• Contagem óptica de plaquetas
laser +
• Especificidade adicional para a
óptica/citoquímica identificação de leucócitos

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 Contagem total de leucócitos

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▪ Fonte: Harvey, 2002
Contagem diferencial de leucócitos
Manual x Automatizado

Qto menor a qtdd do tipo

leucocitário na amostra (%), p.ex.
BASO, maior o CV → para
diminuir o CV, deveria-se contar
mais células

Fonte: Harvey, 2002

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 Dot Blot: Leucócitos
Advia 2120i
XT 2000 Citoquímica (Perox)
Fluorescência
Qtdd de RNA (Fluorescência)

MON
O

LYM

BASO

EOS

NEU
Granulosidade (Dispersão lateral)

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 CBC: WBC Dot Plot – IDEXX ProCyte Dx
Canine Feline Equine

In-House

Bovine Ferret

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 Opções para Hematologia

Laboratórios de
referência

Sysmex

http://veterinarycalendar.dvm360.com/hematology- Siemens
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analyzers-demystified-proceedings
 Opções para Hematologia
Fluorescência para contagem diferencial

Sysmex XT 2000

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 Sysmex
Padrão de gráfico DotPlot - Leucograma
Canino Normal Felino Normal

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 Opções para Hematologia

Advia 2120i - Siemens

Citoquímica para contagem diferencial

▪ Peroxidase ▪ Peroxidase
Positivo Negativo
▪ Neutrófilos ▪ Linfócitos
▪ Monócitos ▪ Basófilos
▪ Eosinófilo

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 ▪ Peroxidase
Positivo
▪ Neutrófilos
▪ Monócitos
▪ Eosinófilo

▪ Peroxidase
Negativo
▪ Linfócitos
▪ Basófilos

Fonte: Kottke-Marchant, 2012

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 Sysmex
Padrão de gráfico DotPlot – He
Canino Normal Felino Normal

Felinos:
Anisocitose
fisiológica

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 Série eritróide - ADVIA

52 © 2016 IDEXX Laboratories, Inc. All rights reserved. Fonte: Schalm, 2010
ADVIA

Fonte: Schalm, 2010

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 Reticulócitos – Contagem automática
▪ Principais vantagens:
▪ Reprodutibilidade
▪ Acurácia
▪ Rapidez

▪ Método:
▪ Corantes supra vitais
▪ Fluorescência

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 Reticulócitos
• Emprego de fluorescência para maior precisão na identificação
dos reticulócitos

RETIC = 19 K/µL RETIC = 202 K/µL

Tamanho
Tamanho

Canino Canino

Fluorescência Fluorescência

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58 © 2016 IDEXX Laboratories, Inc. All rights reserved.
 Reticulócitos - Advia Corante supra vital

Immature
Reticulocyte
Fraction (IRF)

Fonte: Kottke-Marchant, 2012

Fonte: Schalm, 2010

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 Plaquetas

Fonte: Harvey, 2002

60 © 2016 IDEXX Laboratories, Inc. All rights reserved.

 Fonte: Kottke-Marchant, 2012

MPV

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PLAQUETAS

ADVIA SYSMEX XE

Immature
Platelet
Fraction

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Fonte: Kottke-Marchant, 2012
 Contagem de plaquetas Canine

Size
• Impedância e fluxo laminar
• Contagens e tamanho das
células acuradas para a
maioria das espécies
Fluorescence

• Fluorescência óptica
Feline
• Contagem acurada de

Size
plaquetas de gatos

Fluorescence
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 Padrão de gráfico DotPlot – Plaq
Canino Normal Felino Normal

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 Plaquetas
• Confirmação da contagem Contagem plaq normal
• Averiguação qto à presença de
agregados
• Avaliação de morfologia

Agregado plaquetário em borda de esfregaço

Trombocitopenia

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 Mensuração
▪ Mensuração direta: ▪ Parâmetros calculados:
▪ Hemácias ▪ Hct
▪ Concentração de Hemoglobina ▪ CHCM
▪ VCM ▪ HCM
▪ RDW
▪ (Reticulócitos) ▪ Flags
▪ Leucócitos totais
▪ (Contagem diferencial de
leucócitos)
▪ Plaquetas
▪ MPV
▪ (PDW)
▪ (P-LCR) – Ratio of large
platelets

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 No gráfico com diferencial por citoquímica
Advia 2120i - Siemens

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 Diferença entre os métodos
MANUAL AUTOMÁTICO
VCM = Hct (mensurado) / Hemácia Hct = Hemácias (Contagem) / VCM
(contagem) (mensurado)
HCM = Hgb (mensurado) / Hemácia HCM = Hb (mensurado) / Hemácia
(contagem) (contagem
CHCM = Hgb (mensurado) / Hct CHCM = Hgb / (Hemácia X VCM)
(mensurado)
Anisocitose He: Visualizado no RDW = Distribuição dos tamanhos
esfregaço sanguíneo das Hemácias individualmente
Anisocitose Plaq PDW = Distribuição dos tamanhos de
plaquetas
MPV = Volume plaquetário médio

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 O que compõe um hemograma
▪ Dados numéricos
▪ Mensurados
▪ Calculados

▪ Células – avaliação microscópica do esfregaço

sanguíneo

▪ Gráficos e Dots – representação gráfica da

performance do analisador

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 Equipamento Leitura lâmina
VCM Distribuição irregular
HCM Rouleaux
RDW Aglutinação
Tamanho e cor (He) Policromasia (Ret)
Dimorfismo

Ref: International Journal of laboratory Hematology

The Official Journal of the International Society for Laboratory

Hematology

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Condições para realizar a leitura da lâmina

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Fonte: Kottke-Marchant, 2012
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Fonte: Kottke-Marchant, 2012
 Qual a tecnologia do meu equipamento?

▪ Por método:
▪ Centrifugação - Análise quantitativa da capa leucocitária
▪ Impedância
▪ Laser

▪ Por quantidade de parâmetros no hemograma e leucograma (ex)

▪ Leucograma com contagem diferencial em 2 partes
▪ Leucograma com contagem diferencial em 3 partes
▪ Leucograma com contagem diferencial em 5 partes
▪ Parâmetros eritrocitários
▪ Parâmetros plaquetários

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 Tecnologia aplicada ao hemograma
▪ Impedância elétrica (princípio de Coulter)
▪ Mensuração do volume unidimensional
▪ Citoquímica
▪ Reagentes específicos enfatizam ou eliminam características celulares para
fazer a disitinção entre os diferentes tipos celulares
▪ Fluorescência
▪ Corantes fluorescentes para a coloração de núcleos e conteúdo celular
como o RNA
▪ Radiofrequência (condutividade)
▪ Mensura as propriedades intracelulares como a rel N/C, densidade nuclear
e granulosidade
▪ Laser
▪ Mensura as propriedades intracelulares como a rel N/C, densidade nuclear
e granulosidade, tamanho, etc

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 Considerações e adequações para
instalação e funcionamento
▪ Rede elétrica – limpa
▪ Bancada livre de trepidação
▪ Temperatura ambiente
▪ Descarte de diluentes

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 • Diferentes apresentações
de resultados
• Limitações

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 Automated In-Clinic Hematology
Instruments for Small Animal
Practitioners: What is Available,
What Can They Really Do, and
How Do I Make a Choice?

Vet Clin Small Anim 42 (2012)

1–9
doi:10.1016/j.cvsm.2011.09.003

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 O que compõe um hemograma
▪ Dados numéricos
▪ Células – avaliação microscópica do esfregaço sanguíneo
▪ Gráficos e Dots – representação gráfica da performance do
analisador

▪ CUIDADOS OPERACIONAIS
▪ Equipamentos quase sempre soltam números! Cabe ao
operador avaliar os valores apresentados

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 ▪ CHr
▪ Medida da qtdd total de hemoglobina em um reticulócito (pg)
▪ Reflete a hemoglobinização nos precursors eritróides em maturação
▪ Informa o status do ferro funcional disponível para a eritropoiese nos
últimos 3-4 dias
▪ Indicador sensível da eritropoiese deficiente de ferro → pode sugerir
fortemente uma anemia ferropriva

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80 © 2016 IDEXX Laboratories, Inc. All rights reserved.
 Qualidade dos resultados laboratoriais
“O resultado laboratorial é tão bom qto a amostra enviada para
análise”

▪ Depende de fatores:

Qualidade da amostra Fator pré-analítico

Qualidade da análise Fator analítico
Qualidade das anotações e Fator pós-analítico
forma de apresentação

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 Etapas do exame
laboratorial

▪ Fase pré-analítica
▪ Fatores prévios à análise que podem influenciar os resultados
▪ Procedimentos adequados garantem qualidade da amostra e
confiabilidade do exame
▪ Fase analítica
▪ Fase pós-analítica

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83 © 2016 IDEXX Laboratories, Inc. All rights reserved.
 Etapas do exame laboratorial
▪ Fase pré-analítica
▪ Fase analítica
▪ Realização dos testes
▪ Definição dos métodos
• Critérios de confiabilidade e
praticidade
▪ Interpretação
▪ Fase pós- analítica

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Etapas do exame laboratorial

▪ Fase pré-analítica
▪ Fase analítica
▪ Fase pós- analítica
▪ Etapas pós análise
▪ Cálculos e consistência dos resultados
▪ Liberação dos laudos
▪ Armazenamento das amostras
▪ Transmissão e arquivamento de
resultados
▪ Consultoria técnica

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 PROBLEMAS NOS RESULTADOS
▪ Efeitos pré analiticos
▪ Conservação
▪ Proporção sangue/aditivo
▪ EDTA X Citrato X Heparina
▪ Tempo de processamento
▪ Dificuldade na coleta
▪ Conservação do material
▪ Particularidades de raças
▪ Limitação dos equipamentos
▪ Poiquilocitose e Anisocariose
▪ Eritroblastos
▪ Interferentes

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87 © 2016 IDEXX Laboratories, Inc. All rights reserved.
Análise quantitativa da capa
leucocitária

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Fonte: Schalm, 2010
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 FUTURO PRÓXIMO
▪ Escaneamento da lâmina
▪ Classificação pelo software usando alguns parâmetros
▪ Pré classificação de 17 tipos de leucócitos
▪ Pré classificação de 21 características morfológicas de Hemácias
▪ Número estimado de plaquetas
▪ Leitura da lâmina a distância

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HEMÁCIAS

91 © 2016 IDEXX Laboratories, Inc. All rights reserved.

 LEUCÓCITOS

FONTE: www.cellavision.com /
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 laboratoriobr@idexx.com

Obrigada!

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