ESCOLA SUPERIOR DO INSTITUTO BUTANTAN

Curso de Especialização em Vacinas e Biofármacos

Aline Da Silva Rodrigues Sobrinho, Bianca Natasha Oliveira de Moraes,

Fernanda Da Rocha Silva, Maria Eduarda Sousa Helfstein, Mirelle Santos
de Paula e Monique Maria Carvalho Gomes

VACINA ANTITETÂNICA

São Paulo
2022
 Aline Da Silva Rodrigues Sobrinho, Bianca Natasha de Oliveira Moraes,
Fernanda Da Rocha Silva, Maria Eduarda Sousa Helfstein, Mirelle Santos
de Paula e Monique Maria Carvalho Gomes

VACINA ANTITETÂNICA

São Paulo
2022
Desenvolvimento do projeto(Elaboração do desenho esquemático da
produção de um biofármaco) com o tema de produção da vacina contra o
Tétano da matéria de Bioprocessos da Escola Superior do Instituto Butantan.

Aline Da Silva Rodrigues Sobrinho

Bianca Natasha de Oliveira Moraes

Fernanda Da Rocha Silva

Maria Eduarda Sousa Helfstein

Mirelle Santos de Paula

Monique Maria Carvalho Gomes

 1. INTRODUÇÃO

O tétano é uma uma doença infecciosa aguda e grave, não contagiosa

e muitas vezes fatal, causada pela neurotoxina tetânica conhecida como
tetanospasmina que é produzida pela bactéria Clostridium tetani (MS, 2019).
A tetanospasmina ataca principalmente o sistema nervoso central
causando, inicialmente, rigidez de mandíbula e pescoço que pode evoluir
para a forma generalizada. A neurotoxina pode, ainda, causar convulsões,
espasmos do músculo esquelético e contração dos músculos respiratórios,
ocasionando risco à vida (MS, 2019).
Apesar do primeiro registro clínico do tétano ter sido realizado no
século V a.C por Hipócrates, somente no ano de 1889, Kitasato Shibasaburo,
conseguiu isolar o microrganismo e demonstrou que o C. tetani era
responsável pela doença. Kitasato relatou ainda neste mesmo ano que
anticorpos específicos poderiam neutralizar a toxina tetânica (CDC, 2011).
Subsequentemente, em 1897, Edmond Nocard, demonstrou o efeito protetor
obtido pela antitoxina tetânica e a imunização passiva foi usada para
profilaxia e tratamento do tétano durante a Primeira Guerra Mundial (CDC,
2011).
Em 1920 foi desenvolvido o método de inativação da toxina tetânica
utilizando-se formaldeído (técnica utilizada até os dias atuais) levando deste
modo a produção do toxóide tetânico. E em 1924, a produção de vacina
antitetânica que foi amplamente utilizada durante a Segunda Guerra Mundial
(CDC, 2011).
A biotecnologia sempre esteve ligada a essas novas descobertas e
produções de vacinas. Processos biotecnológicos que envolvem a utilização
de microorganismo são denominados bioprocessos e os produtos obtidos nos
bioprocessos podem ser definidos como bioprodutos, resultantes dos
processos de fermentação. Portanto, os bioprodutos podem ser encontrados
sendo utilizados para produção de antibióticos, vacinas e imunobiológicos
pela indústria farmacêutica, usados para produção de corantes, flavorizantes
pela indústria alimentícia e usados na produção de etanol e pesticidas, pela
indústria química (ASSIS, 2014).
 Vale destacar que todo bioprocesso pode ser dividido em dois:
upstream e downstream. No processo de upstream é preparado o meio de
cultura, ocorre a expansão, multiplicação dos microorganismos de forma
escalonada, utilizando fermentadores. Após a obtenção do produto de
interesse na etapa de upstream, evolui-se para o processo de downstream,
no qual a biomolécula de interesse é separada, concentrada, purificada,
formulada e envasada garantindo que o produto final esteja pronto para ser
comercializado (ASSIS, 2014).

Desenho esquemático da produção de um biofármaco

2. UPSTREAM

O upstream compreende todas as etapas necessárias para a

preparação do inóculo: preparação do meio, cultura celular, isolamento e
colheita de células (ESI, 2022).

2.1. O organismo
 A Clostridium tetani é uma bactéria bacilar gram-positiva estritamente
anaeróbia encontrada no solo. Capaz de formar esporos, ela tem preferência
por locais quentes e úmidos, incluindo objetos e dejetos (Garrigues et al.,
2022). Devido a tais características, é possível relacionar sua distribuição
geográfica com os locais onde o tétano se mostra mais frequente, tendo como
exemplo regiões como África ocidental e central, sudeste da Ásia, Índia, ilhas
do pacífico e sul dos EUA. Em regiões mais frias do globo (e.g., Canadá,
Suécia, Noruega, Inglaterra, entre outros) a incidência do tétano é baixa,
contudo, é possível afirmar que C. tetani ocorre em todo mundo, visto que o
tétano é uma doença que acomete pessoas no mundo todo (Popoff, 2020).
O tétano é causado quando esporos de C. tetani adentram em
ferimentos cujas condições são ideais para a sua germinação, no caso,
tecidos danificados e não irrigados. Após o período de incubação — que leva
de três a vinte e um dias —, as bactérias permanecem na ferida necrosada,
secretando a neurotoxina TeNT (Tetanospasmina) e a hemolisina
(Tetanolisina) (Garrigues et al., 2022; Popoff, 2020).

2.1.1. Linhagem

A cepa E88, pertencente à família Harvard, foi escolhida para o

processo por ser tida como referência atualmente. Mesmo a cepa CN655,
também da família Harvard, ser utilizada por laboratórios, a preferência pela
E88 prevaleceu pela usualidade. Além disso, as cepas de C. tetani que são
usadas para experimentos pertencerem ao mesmo subgrupo genômico
(família Harvard, clado 1A) e possuem genes codificadores de reguladores
transcricionais de toxina e toxina idênticos. Todas as cepas de Harvard
carreadoras do plasmídeo do tétano, possuem 99,3-99,4% de identidade
entre as sequências dos genes que codificam a toxina.
As cepas de Clostridium tetani são divididas em dois grupos: as cepas
de Harvard derivadas da cepa ancestral de Harvard (clado 1A) e as cepas do
tipo selvagem isoladas de casos clínicos (Clades 1B–H e 2). A cepa ancestral
de Harvard foi isolada no final da Primeira Guerra Mundial e posteriormente
distribuída para laboratórios e fabricantes de vacinas nas décadas de 1920 a
1950. Com isso, as cepas da família Harvard foram sendo desenvolvidas.
Elas têm como característica baixa esporulação e alta produção de toxinas,
sendo adequadas para a produção de vacinas. (Garrigues et al., 2022).

2.1.2. Condições de cultivo

A C. tetani possui temperatura ótima de crescimento em torno de

37ºC, atingindo crescimento moderado em 30ºC. Incubação feita a 25°C ou
45°C induz muito pouco ou nenhum crescimento.
No solo, a germinação e crescimento ocorrem preferencialmente em
meios neutros ou alcalinos com temperaturas acima de 20°C e umidade de
pelo menos 15% (Popoff, 2020).

2.2. Meio de cultivo

Para o meio de cultivo foi escolhido o meio Massachusetts proposto

por Letham et al. (1968), por ser o mais utilizado no cultivo de C. tetani para a
produção industrial de toxinas ainda nos dias de hoje. Esse meio de cultivo
possibilita o alto desempenho na produção de toxinas (70 a 120 Lf/mL) e
também é livre de infusão de coração bovino ou qualquer outro produto de
origem animal (Tabela 1) (Garrigues et al., 2022).
De acordo com o levantamento e comparações feito por Garrigues et
al. (2022), o modo de cultivo contínuo seria a melhor escolha, visto que
células são constantemente mantidas em fase exponencial de crescimento
podendo gerar a concentração de até 120 Lf/mL no meio Massachusetts.

TABELA 1. Composição do meio de cultivo Massachusetts proposto por

Letham et. al. (1968).

Digestão de caseína 25g

Glicose 8g

NaCl 2,5g

MgSO4 0,1g

Cistina 0,125g

Pantotenato de cálcio 1,0 mg

 Uracilo 1,25 mg

Ácido nicotínico 0,25 mg

Tiamina 0,25 mg

Riboflavina 0,25 mg

Piridoxina 0,25 mg

Biotina 2,5 μg

Vitamina B12 0,05 μg

FeCl3. 6 H2O 32 mg

Ajuste de pH (antes da autoclave) 7.0 ± 0.2

O trabalho de Zacharias e Bjorklund (1968) demonstrou a capacidade

de se produzir a TeNT a partir de pH entre 6,2 a 8,8, sendo considerado pH
ótimo o valor de 7,8. Apesar disso, foi recomendado o cultivo em pH 7,4, visto
que um valor mais elevado leva à precipitação de ferro, gerando uma cor
preta que interfere na determinação da biomassa. Em valores de pH que
saem do espectro citado anteriormente, não houve nenhuma degradação de
toxina.

2.3. A toxina tetânica

A neurotoxina tetânica (TeNT) é responsável pelas manifestações

clínicas do tétano, sendo uma das toxinas mais potentes conhecidas, com
dose mínima letal de aproximadamente 2,5 nanogramas por quilograma de
peso corporal (FRATELLI, 2007; CDC, 2011;).
O TeNT é uma proteína de cadeia simples que possui peso de 150
kDa, essa toxina ativada pela ação das proteases. O TeNT ativo é constituído
por uma cadeia leve de aproximadamente 50 kDa e uma cadeia pesada de
aproximadamente 100 kDa e as cadeias são unidas por pontes dissulfeto.
Esta toxina, mesmo após a desintoxicação através da ação do formaldeído,
as propriedades antigênicas e imunogênicas permanecem, e ela passa a ter
a denominação toxóide tetânico não tóxico. Essa detoxificação induzida por
formaldeído, é o que determina em grande parte a qualidade e as
características dos componentes da vacina. O processo ocorre por meio de
uma modificação da estrutura sem que ocorra destruição dos sítios
antigênicos da proteína que assim serão capazes de induzir a produção de
anticorpos (FRATELLI, 2007; CDC, 2011; THAYSEN-ANDERSEN, 2007;
SARTORI, 2019).

2.4. Biorreator

A Clostridium tetani, como já descrita anteriormente, é classificada

como uma bactéria anaeróbica, ou seja, não tem afinidade por oxigênio pois
impede o seu crescimento. Devido a isso, é necessário que nas primeiras
fases haja condições que diminuam ao máximo a oxigenação do meio
(BRASIL. Luciana M. Monaco;).
Após serem realizadas as etapas iniciais, é necessário o uso de um
biorreator, um equipamento capaz de transformar matéria prima em produtos
utilizando agentes biológicos e/ou aumento da produção desses agentes,
como por exemplo microrganismos e outras células.
Para o cultivo de C. tetani optamos pelo uso do equipamento Biorreator
Biostat® RM Rocking Motion da fabricante Sartorius devido às características
do organismo C. tetani, como por exemplo: a mistura é realizada no biorreator
é feita através de ondas o que auxilia no desenvolvimento do organismo,
comparado com outros biorreatores não poderia haver muita agitação devido
a C. tetani ser anaeróbica e poder haver aeração indesejada que
comprometeria o desenvolvimento bacteriano. Outro ponto a ser destacado é
o seu formato single-use, tornando mais fácil o processo de limpeza por
eliminar os procedimentos demorados de higienização. Essa característica se
torna importante por C. tetani ser uma bactéria capaz de produzir esporos.
Além disso, esse biorreator pode trabalhar com bandejas de 2L a 20L e
as bolsas single-use de 100ml à 100L e é de uma linha projetada que pode
facilmente ser escalonada desde biorreatores de bancada até a escala de
produção industrial. E para finalizar, apresenta um sistema que pode modular
os parâmetros mantendo um controle preciso do processo e sensores
single-use (Sartorius, acesso em 21 de maio de 2022).
 2.5. Detoxificação da toxina tetânica

A detoxificação é realizada com formaldeído 0,8%, no último dia de

cultivo tanto no fermentador ou no biorreator se é adicionado o formaldeído,
após 28 dias e em uma temperatura de 37°C, a toxina tetânica é convertida
toxóide tetânico não tóxico (CHUNG et al. 2016).

3. DOWNSTREAM

O processo de downstream é caracterizado por uma série de

produções unitárias após a finalização da fermentação, da expansão e
crescimento celular (ASSIS, 2014).
Desta forma, o processo de downstream é realizado com o objetivo de
isolar, purificar e concentrar o produto de interesse; para isso devem ser
consideradas as características físico-químicas do produto de interesse. Tais
características podem ser : peso molecular, solubilidade, carga eletrostática,
entre outros (ASSIS, 2014).
Vale ressaltar ainda que é de extrema importância o conhecimento da
fisiologia e da citologia do micro-organismo ou célula hospedeira, pois dessa
forma é possível obter a localização do produto de interesse (ASSIS, 2014).
Portanto,o produto final pode ser encontrado no meio intracelular ou
extracelular (ASSIS, 2014). Para microorganismo, o produto final é gerado
dentro do corpúsculo de inclusão, necessitando assim, de ser realizada a
“lise” celular para que seja liberado o produto final. Deve-se então,conhecer a
característica da biomolécula para que o rompimento celular ocorra de forma
adequada e não danifique a biomolécula de interesse (ASSIS, 2014).

3.1.Clarificação

Esta etapa é realizada logo após a fermentação. A clarificação consiste

na separação das células suspensas e fragmentos das células do meio de
cultura. Geralmente, são utilizados métodos de centrifugação ou filtração
(ASSIS, 2014).
Para este trabalho, decidimos utilizar a técnica de microfiltração pois a
células serão retidas na membrana permitindo apenas a difusão da toxina
pela membrana, havendo assim a separação celular da toxina (SANTIAGO,
2011). Para isso, será utilizada membrana do tipo cassete, formato de tela
suspensa, de porosidade 0,2 µm para que seja garantida a retenção dos
agregados celulares (SANTIAGO, 2011).

3.2. Filtração de Profundidade

Com a filtragem de profundidade, uma mistura é bombeada através de

uma membrana ou outra interface para separar os detritos do produto em
suspensão líquida (Toledo, Mettler). Os filtros de profundidade são
constituídos por uma rede aleatória de microfibras de granulometria bem
pequena, a ponto de reter partículas microscópicas. Essa característica é que
garante que a filtragem não ocorrerá somente na superfície, mas em
profundidade através de todo o elemento filtrante. Caso o filtro de
profundidade não tenha capacidade suficiente, a Filtração de Fluxo
Tangencial (TFF), entretanto, para este trabalho foi escolhido apenas o uso do
filtro de profundidade pela praticidade e rapidez do processo.

3.3. Pré-filtração e redução de bioburden (carga microbiana)

Essa etapa tem como objetivo proteger as etapas de cromatografia que

virão a seguir, bloqueando a passagem de qualquer bactéria ou outro
microrganismo indesejado que ainda possa estar presente no processo. Os
pré-filtros podem ser combinados ou substituídos por filtros de redução de
carga microbianas (bioburden reduction filters).
A membrana escolhida para essa etapa foi a Millipore Express® da
Merck por possuir uma dupla camada de poros de 0.5 e 0.2 µm, bloqueando
a passagem de bactérias bem diminutas.

3.4. Primeira cromatografia

A primeira cromatografia vem com o intuito de purificar a proteína de

interesse (URH, 2009). A cromatografia a ser utilizada neste processo será a
cromatografia de troca iônica (ASSIS, 2014). Esse tipo de método é o um dos
mais utilizados para separação de biomoléculas, além disso, garante alto
rendimento na recuperação do produto de interesse (ASSIS, 2014). Essa
técnica se baseia na diferença de sinais e magnitudes de cargas elétricas das
proteínas em um determinado pH (ASSIS, 2014). A fase estacionária pode ter
característica aniônica (trocadores catiônicos) ou catiônica (trocadores
aniônicos) e a fase móvel deverá ter característica catiônica ou aniônica,
respectivamente (ASSIS, 2014). Sendo assim, a fase móvel terá carga
contrária a fase estacionária, permitindo a retenção dessas moléculas à
coluna, enquanto íons de mesma carga eluem mais rapidamente
(MEDEIROS, 2008). Vale ressaltar ainda que a adsorção do composto retido
é um processo reversível e os íons retidos serão eluídos por uma outra fase
móvel que possua maior afinidade pela a fase estacionária (MEDEIROS,
2008).

3.5. Ajuste de pH e Diafiltração

O pH precisa sempre ser reajustado para condições de solução ótimas.

É preciso que isso ocorra antes e depois das etapas de cromatografia e
durante a regeneração/limpeza ou armazenamento das resinas ou dos
cassetes de TFF (MERCK, 2022).
A diafiltração é um processo de membrana única capaz de separar
dois ou mais solutos em uma solução e aumentar a concentração de
moléculas mais densas e diminuir a concentração de moléculas com menor
densidade (JELEMENSKÝ; SHARMA; PAULEN; FIKAR, 2015), deixando o
produto de interesse na condição adequada para a próxima cromatografia
(MERCK, 2022).

3.6. Cromatografia de polimento

A cromatografia de polimento tem como objetivo retirar restos de

impureza e obter o maior grau de pureza possível da molécula alvo (CYTIVA,
2022).
Para essa etapa foi escolhida a Cromatografia de Interação Hidrofóbica
(HIC) pelas características bioquímicas da toxina do tétano. A TTn (toxina do
tétano) é uma glicoproteína heterodimérica composta de uma cadeias
pesadas (100 kDa) e leves (50 kDa) interligadas por ligações dissulfeto. Em
sua conformação nativa, a cadeia pesada de TTn forma uma área de
superfície hidrofóbica, implicando a possibilidade de purificação da toxina por
HIC por alta especificidade. Outro motivo para a escolha da HIC é o pouco
impacto que a amostra sofreria no processo de preparação (STOJIćEVIć;
DIMITRIJEVIć; DOVEZENSKI; ŝIVKOVIć; PETRUŁIć; MARINKOVIć;
INIć-KANADA; STOJANOVIć, 2011).

3.7. Ultrafiltração

A ultrafiltração é utilizada com frequência nos bioprocessamentos das

etapas de downstream, que serve para concentrar um fluxo de produto
diluído. A etapa de ultrafiltração consiste na separação das moléculas em
uma solução com base no tamanho dos poros da membrana ou pelo corte do
peso molecular. No processo de ultrafiltração normalmente se utiliza as
técnicas de Filtragem de Fluxo Tangencial (TFF), onde a alimentação do fluxo
flui paralela à superfície da membrana, ao invés de fluir perpendicularmente à
superfície. Quando utilizada junta com a técnica de diafiltração, é conhecida
como técnica de Buffer. A concentração final do produto geralmente é
analisada através da forma de espectroscopia de UV. (Toledo, Mettler,
Processamento Downstream em Biofármacos, acesso em 22 de maio de
2022)
Aqui, utilizamos este processo para obter a proteína tetânica, uma vez
concluído o processo de eliminação dos restos de bactérias resultantes da
lise celular na cultura. É o primeiro passo para a purificação, na qual o meio
de cultura é substituído por uma solução tampão estéril. (SANTIAGO, 2011)

3.8. Filtração de esterilização

A filtração esterilizante é utilizada para produtos injetáveis, pois

garante e assegura sua qualidade. Para esse processo, fazemos o teste do
desafio bacteriológico, onde utilizamos a bactéria Brevundimonas Diminuta
para desafiar o filtro de 0,22µm, onde se deve usar pelo menos 107
microorganismos por cm² e garantir a produção de um efluente estéril sem
alterar as características finais do produto (Revista meio filtrante, acesso 22
de Maio de 2022).
Para o processo de filtração de esterilização por filtração, o meio de
cultura deve ser preparado em um tanque auxiliar, e deve ser pressurizado
para a filtração, através de cartuchos clarificantes e esterilizantes, os
cartuchos utilizados nesse processo, são os da Millipore. O meio de cultura
deverá então ser recolhido no tanque do fermentador, que já foi previamente
esterilizado, esta esterilização ocorre por vapor, e após este processo dá-se
início a semeadura (Fratelli et al, 1993).

4. CONTROLE DE QUALIDADE

Após todo o processo de produção da vacina é necessário ser

realizado o controle de qualidade. O controle de qualidade tem como objetivo
garantir a segurança e eficácia da vacina, para isso são separadas amostras
para serem realizados testes após algumas etapas da produção (Fiocruz,
Acesso 21 de maio de 2022).
Para serem realizados esses testes é necessário seguir a resolução da
diretoria colegiada da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) -
RDC Nº 73, DE 21 DE OUTUBRO DE 2008 que apresenta o regulamento
Técnico para procedimento de liberação de lotes de vacinas e soros
hiperimunes heterólogos para consumo no Brasil e também para exportação.
Neste Regulamento, podemos optar por dois meios de análise, neste caso
optamos pela análise do protocolo resumido de produção e controle de
qualidade e análise laboratorial. Em todas as etapas de produção da vacina
deve haver seus respectivos controles de qualidade para que caso haja algo
inconforme possamos detectar com maior facilidade o erro, isso inclui desde o
ingrediente biologicamente ativo até o produto finalizado (Legisweb, Acesso
21 de maio de 2022).
Tabela com as nossas etapas de produção e nossas sugestões de
análises:

Etapas da produção Sugestões de análises

Meio de Cultura Plaqueamento do meio de cultura

 Detoxificação Teste in vivo (animais)

Clarificação Determinação da D.O. por espectrofotômetro

Filtração de Profundidade Floculação

Pré-filtração e redução de Floculação

bioburden

Primeira cromatografia Determinação da concentração da proteína

em Qubit

Ajuste de pH e Diafiltração Para pH: pHmetro

Diafiltração: determinação da D.O
por espectrofotômetro

Cromatografia de polimento Determinação da concentração da proteína

em Qubit

Ultrafiltração Floculação

Filtração de esterilização Floculação

 REFERÊNCIAS

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