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Quimioterápicos de Agentes Antimicrobianos. abril de 2014; 58(4): 1977–1986. PMCID: PMC4023721

doi: 10.1128/AAC.02496-13 PMID: 24419350

Ruxolitinibe e tofacitinibe são inibidores potentes e seletivos da replicação do HIV-1

e da reativação do vírus in vitro
Christina Gavegnano , a, b Mervi Detorio , a, b Catherine Montero , a, b Alberto Bosque , c Vicente Planelles , c e
Raymond F. Schinazi a, b

ABSTRATO

A via JAK-STAT é ativada tanto em macró fagos quanto em linfó citos apó s a infecçã o pelo vírus
da imunodeficiê ncia humana tipo 1 (HIV-1) e, portanto, representa um alvo celular atraente
para alcançar a supressã o do HIV e reduzir a inflamaçã o, o que pode impactar os santuá rios
do vírus. Ruxolitinibe e tofacitinibe sã o inibidores de JAK1/2 aprovados pela FDA para artrite
reumató ide e mielofibrose, respectivamente, mas sua aplicaçã o terapê utica para tratamento da
infecçã o por HIV era inexplorada. Ambas as drogas demonstraram inibiçã o submicromolar da
infecçã o por HIV-1, HIV-2 e um vírus da imunodeficiê ncia símio-humana, RT-SHIV, em linfó citos
e macró fagos primá rios humanos ou de macaco rhesus, sem citotoxicidade significativa
aparente em 2 a 3 logs acima do concentraçã o antiviral eficaz mediana. A combinaçã o de tofac‐
itinib e ruxolitinib aumentou a eficá cia em 53 a 161 vezes versus a observada para monoter‐
apia, respetivamente, e cada medicamento aplicado isoladamente a linfó citos humanos
primá rios apresentou eficá cia semelhante contra o VIH-1 contendo vá rias substituiçõ es de
polimerase. Ambas as drogas inibiram a replicaçã o do vírus em linfó citos estimulados com fito‐
hemaglutinina (PHA) mais interleucina-2 (IL-2), mas nã o apenas PHA, e inibiram a reativaçã o
do HIV-1 latente em concentraçõ es micromolares baixas atravé s do modelo de latê ncia de
cé lulas T J-Lat e em linfó citos primá rios de memó ria central humana. Assim, a inibiçã o dire‐
cionada de JAK forneceu um mecanismo seletivo, potente e novo para inibir a replicaçã o do
HIV-1 em linfó citos e macró fagos, a replicaçã o do HIV-1 resistente a medicamentos e a
reativaçã o do HIV-1 latente e tem o potencial de redefinir o sistema imunoló gico. ambiente em
indivíduos infectados pelo HIV.

INTRODUÇÃ O

De volta ao to
Embora a terapia com agentes antirretrovirais altamente ativos (HAART) possa alcançar a su‐
pressã o do vírus da imunodeficiê ncia humana (HIV) a longo prazo, a terapia antiviral atual nã o
alcança a erradicaçã o do HIV ou uma cura funcional ( 1 , 2 ). A HAART tem vá rias deficiê ncias,
incluindo a incapacidade de fornecer concentraçõ es adequadas do medicamento a todas as cé ‐
lulas-alvo do VIH-1, incluindo santuá rios virais derivados de macró fagos (1) , selecçã o rá pida
para emergê ncia de variantes resistentes aos medicamentos/falta de eficá cia contra variantes
resistentes aos medicamentos, falta de capacidade para prevenir a reativaçã o do vírus latente e
subsequente repovoamento sistê mico com vírus, incapacidade de mitigar a
inflamaçã o/disfunçã o imunoló gica orquestrada pelo HIV que leva à infecçã o e à s malignidades,
incapacidade de reduzir ou eliminar deficiê ncias neurocognitivas associadas ao HIV causadas
pela inflamaçã o/ativaçã o de perifé ricos infectados monó citos para o trá fego para o cé rebro /
sistema nervoso central (SNC), falha na prevençã o da preparaçã o de cé lulas espectadoras nã o
infectadas para infecçã o causada pela inflamaçã o ( 1 , 2 ) e falta de impacto na proliferaçã o ho‐
meostá tica de cé lulas-tronco de memó ria (T scm ). A incapacidade de abordar todos estes facto‐
res exige a concepçã o radical e inovadora de novos tratamentos e modalidades terapê uticas.

A via do transdutor de sinal de ativaçã o da quinase Janus e do ativador da transcriçã o (JAK-

STAT) é ativada precocemente na infecçã o pelo HIV-1 em mú ltiplas cé lulas-alvo do HIV-1, in‐
cluindo macró fagos e linfó citos (3, 4), e a ativaçã o desta via orquestra um transduçã o multifa‐
cetada e em tandem de eventos que resultam na produçã o de fatores inflamató rios, hiperativa‐
çã o da cé lula infectada e disfunçã o imunoló gica global em vá rios locais, incluindo o SNC ( 5 , –
7 ). A ativaçã o da inflamaçã o induzida pelo HIV por induçã o da cascata de sinalizaçã o JAK-STAT
modula mú ltiplos eventos pró -HIV, incluindo os seguintes: aumento da produçã o de vírus em
cé lulas já infectadas, preparaçã o de cé lulas nã o infectadas para infecçã o, recrutamento de cé lu‐
las nã o infectadas para o local da infecçã o , reativaçã o de vírus de reservató rios latentes, infec‐
çã o do SNC/comprometimento neurocognitivo associado ao HIV e promoçã o de disfunçã o
imunoló gica orquestrada pelo HIV no intestino e em outros ó rgã os (3 , – 6 , 8 , 9 ) . Portanto, a
inibiçã o direcionada potente e seletiva da via JAK-STAT poderia fornecer uma modalidade atra‐
ente para conferir inibiçã o indireta da replicaçã o do HIV-1, inibindo uma sé rie complexa de
eventos imunomoduladores conduzidos pelo HIV em vá rias cé lulas. É possível que isto resulte
em contagens de CD4 + mais elevadas , níveis mais baixos de activaçã o imunitá ria e inflamaçã o
cró nica, e melhor sobrevivê ncia livre de eventos apó s uma duraçã o limitada de tratamento com
inibidor de JAK-STAT.

Dois inibidores de JAK1/2, ruxolitinibe e tofacitinibe, sã o aprovados pela FDA para mielofi‐
brose e artrite reumató ide, respectivamente. Em humanos, o ruxolitinibe inibiu vá rias citocinas
pró -inflamató rias, incluindo interleucina-6 (IL-6), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e IL-1
(10), e o uso aprovado do tofacitinibe para artrite reumató ide ressalta seu potente efeito anti-
inflamató rio in vivo . -efeitos inflamató rios. Estas citocinas sã o orquestradores causadores de
inflamaçã o cró nica, infecçã o cró nica e progressã o da doença ( 11 , -22 ), e juntas podem repre‐
sentar um obstá culo significativo que deve ser removido para alcançar uma cura funcional ou
erradicaçã o sisté mica .

Durante a nossa pesquisa de molé culas que poderiam interferir nas vias envolvidas na promo‐
çã o da replicaçã o do HIV, descobrimos que certos inibidores de JAK inibiam seletivamente o
HIV em linfó citos e macró fagos primá rios humanos infectados e de macacos rhesus. Como es‐
ses medicamentos interferem in vivo na ativaçã o da via JAK-STAT pela infecçã o pelo HIV-1 ( 3 ,
4 , 6 , 9 , 23 , 24 ) e possuem propriedades antiinflamató rias específicas, exploramos ainda
mais seu potencial como agentes antivirais para HIV.

MATERIAIS E MÉ TODOS

Isolamento e cultura de linfó citos e macró fagos. Para culturas de macró fagos, os monó citos fo‐
ram isolados de buffy coats de doadores negativos para HIV-1, vírus da hepatite B/vírus da he‐
patite C (HBV/HCV) com centrifugaçã o em gradiente de densidade acoplada com enriqueci‐
mento para monó citos CD14 + com coquetel de anticorpos Rosette Sep ( Stem Cell Technologies,
Vancouver, Colú mbia Britâ nica). Os poços foram semeados a uma densidade de 1 x 10 6
cé lulas/poço durante 1 h a 37°C e 5% de CO2 para conferir aderê ncia plá stica antes de lavagens
repetidas com 1 x soluçã o salina tamponada com fosfato (PBS). Os macró fagos foram mantidos
em meio contendo fator estimulador de colô nias de macró fagos (M-CSF) por 18 horas antes de
duas lavagens com 1x PBS (para remover M-CSF) e subsequente cultura em meio livre de M-
CSF suplementado com 20% de calor. soro fetal de bezerro inativado e penicilina-estreptomi‐
cina a 1% por mais seis dias antes dos estudos antivirais. Para todas as condiçõ es, os macró fa‐
gos foram corados com CD11b-aloficocianina (APC; Miltenyi Biotec, Auburn, CA) e submetidos
a triagem celular ativada por fluorescê ncia (FACS) para determinar uma pureza> 99%.

Cé lulas mononucleares primá rias de sangue perifé rico humano (PBM) foram isoladas de buffy
coats derivadas de doadores saudáveis ​(Lifesouth, Dunwoody, GA). Cé lulas PBM estimuladas
por fitohemaglutinina (PHA) foram mantidas em meio RPMI (HyClone, Logan, UT) contendo 6
μg/ml de fitohemaglutinina (Cape Cod Associates, East Falmouth, MA) suplementado com 20%
de soro fetal de bezerro inativado pelo calor, 1% de penicilina -estreptomicina e 2% de l -gluta‐
mina (Sigma-Aldrich, San Jose, CA) durante 72 horas antes dos estudos de
proliferaçã o/viabilidade. Cé lulas PBM estimuladas com PHA mais IL-2 foram mantidas de
forma aná loga, com exceçã o da adiçã o de IL-2 recombinante humana (HR-IL-2; 26,5
unidades/ml) (Chiron Inc., Emeryville, CA) durante 72 h antes de estudos antivirais ou de
proliferaçã o/viabilidade. Linfó citos ou macró fagos de macaco Rhesus foram isolados de san‐
gue total obtido do Yerkes National Primate Research Center (Atlanta, GA) e cultivados como
descrito acima para linfó citos e macró fagos humanos. Alé m disso, cada animal foi examinado
mensalmente pelo veteriná rio quanto a peso, sinais vitais, exame físico (esplenomegalia, linfo‐
nodomegalia, quaisquer sinais de hematomas, exame bucal, temperatura, etc.), hemograma, he‐
mató crito, etc., quando coletadas amostras de sangue. Foram tomadas. Os animais que apre‐
sentavam quaisquer feridas, infecçã o e/ou diarreia receberam medicaçã o e cuidados apropria‐
dos. O Centro Yerkes é totalmente credenciado pela Associaçã o para Avaliaçã o e Credencia‐
mento de Cuidados com Animais de Laborató rio (AAALAC), e todos os procedimentos operaci‐
onais padrã o sã o revisados ​periodicamente por representantes da AAALAC e do Departa‐
mento de Agricultura dos EUA (USDA). A equipe veteriná ria do Yerkes Primate Research Center
segue e/ou excede as diretrizes para o cuidado humano de todos os animais do Primate
Center.

Estudos antivirais. A potê ncia antiviral é relatada como a concentraçã o eficaz de 50% (EC 50 )
ou concentraçã o eficaz mediana. Os macró fagos foram cultivados como descrito acima durante
7 dias. Para todos os estudos antivirais, foi utilizada uma multiplicidade de infecçã o (MOI) de
0,1. Antes da infecçã o, os macró fagos foram privados de soro por 8 horas antes da infecçã o e
cultivados por 2 horas em meio com vá rias concentraçõ es de tofacitinibe (Selleck Chemicals,
Boston, MA, EUA), ruxolitinibe (Selleck Chemicals, Boston, MA, EUA) ou 3'-azido-3'-desoxitimi‐
dina (AZT; controle) (ST Pharma Co., Ltd., Seul, Coreia do Sul) antes da remoçã o do meio con‐
tendo o medicamento e infecçã o de 4 horas com HIV-1 BaL (humano ) ou um vírus da imuno‐
deficiê ncia símio-humana, RT-SHIV (macaco rhesus), com um MOI de 0,1 na ausê ncia de medi‐
camento. Depois, o vírus foi removido e o meio contendo o fá rmaco foi devolvido a cada cul‐
tura. O RT-SHIV foi escolhido para estudos com macacos pelas seguintes razõ es: (i) permite fle‐
xibilidade de futuros estudos de combinaçã o usando inibidores da transcriptase reversa nã o
nucleó sidos (NNRTI) aprovados pela FDA, uma vez que o RT-SHIV conté m uma transcriptase
reversa humana, tornando este vírus adequado para antivirais estudos que possam utilizar
NNRTI; (ii) permite que estes dados sejam aplicáveis ​para estudos futuros num modelo RT-
SHIV em que ruxolitinib e tofacitinib seriam utilizados com HAART; e (iii) é aná logo ao vírus da
imunodeficiê ncia símia (SIV), tornando este vírus també m adequado para comparaçã o com in‐
fecçõ es tradicionais por SIV. Os sobrenadantes foram recolhidos no dia 7 apó s a infecçã o e os
níveis de p24 ou p27 do HIV-1 foram medidos por ensaio imunoenzimá tico (ELISA) (Zeptome‐
trix Corp., Buffalo, NY). A concentraçã o eficaz mediana (CE 50 ) e a concentraçã o eficaz de 90%
(CE 90 ) foram determinadas utilizando o software CalcuSyn (BioSoft Corporation, Cambridge,
Reino Unido).

Para os linfó citos, o teste foi realizado utilizando pelo menos trê s ensaios independentes reali‐
zados em duplicado. As cé lulas foram incubadas em meio RPMI (HyClone, Logan, UT) contendo
HR-IL-2 (26,5 unidades/ml) (Chiron, Inc., Emeryville, CA) e 20% de soro fetal de vitelo inacti‐
vado pelo calor. As infecçõ es foram realizadas adicionando HIV-1 LAI ou vírus clonados infecci‐
osos moleculares contendo a substituiçã o K65R (HIV-1 K65R ), HIV-1 M184V , HIV-1 L74V , ou HIV-
1 A62V/V75I/F77L/F116Y/Q151M ou HIV-1 com quatro mutaçõ es específicas do AZT [HIV-1 4AZT
(D67N/K70R/T215Y/K219Q)], seguido por uma incubaçã o adicional a 37°C em 5% de CO 2 , 1
h antes da adiçã o de drogas a 0,001, 0,01, 0,1, 1,0, 10 e 100 M. Os ensaios foram realizados em
placas de 24 poços (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Um mililitro de sobrenadante foi reco‐
lhido apó s 5 dias em cultura e depois centrifugado a 12.000 rpm durante 2 h a 4°C num Jouan
Br43i (Thermo Electron Corp., Marietta, OH). O produto do ensaio de RT foi quantificado utili‐
zando um coletor Packard e um contador beta direto, e os dados foram analisados ​conforme
descrito anteriormente ( 25 ). Estudos semelhantes foram realizados utilizando HIV-2 pROD10 e
HIV-1 BAL (descritos acima).

Estudos de citotoxicidade. A citotoxicidade dos compostos é relatada como concentraçã o inibi‐

tó ria de 50% (IC50 ) , ou concentraçã o inibitó ria mediana. A IC50 foi determinada por colora‐
çã o com iodeto de propídio (Invitrogen, Eugene, OR) de acordo com o protocolo do fabricante
(citometria de fluxo). Para todos os ensaios, as cé lulas foram cultivadas como descrito acima e
mantidas em vá rias concentraçõ es de meio contendo fá rmaco durante 6 dias antes da avalia‐
çã o da toxicidade. A citotoxicidade foi considerada quando as concentraçõ es dos compostos de
teste por si só inibiram o crescimento em 50%.

Para estudos de iodeto de propídio, cé lulas PBM estimuladas com PHA mais IL-2 foram expos‐
tas a vá rias concentraçõ es de ruxolitinib ou tofacitinib durante 6 dias antes da avaliaçã o da via‐
bilidade utilizando iodeto de propídio (citometria de fluxo). A estraté gia de gating baseada em
dispersã o direta (FSC) e dispersã o lateral (SSC) foi estabelecida e usada uniformemente em to‐
das as amostras (Figura 1A). As cé lulas incubadas na ausê ncia de fá rmaco foram 92,8% viá ‐
veis, e as cé lulas expostas durante 1 min a 95°C foram 2,8% viáveis.Figura 1B). A exposiçã o ao
calor de 95°C por 1 min é um controle positivo usado para citometria de fluxo para garantir
que as cé lulas mortas se espalhem no portã o apropriado. O gating foi estabelecido com base
em cé lulas viáveis ​cultivadas na ausê ncia de droga (Figura 1B). Um controle negativo adicional,
o AZT, que é conhecido por nã o ser tó xico para os linfó citos, foi incubado com cé lulas em vá ‐
rias concentraçõ es e nã o foi tó xico em nenhuma concentraçã o testada.Figura 1C). Como con‐
trole positivo adicional, as cé lulas expostas a vá rias concentraçõ es de cicloheximida demons‐
traram uma toxicidade dose-resposta (Figura 1C). O gating foi estabelecido com base em cé lu‐
las viáveis ​cultivadas na ausê ncia de droga (Figura 1B).

FIGURA 1

Viabilidade de linfó citos humanos primários expostos a várias concentraçõ es de ruxolitinibe ou tofacitinibe.
Linfó citos humanos primários estimulados com PHA mais IL-2 foram expostos a várias concentraçõ es de ru‐
xolitinib ou tofacitinib durante 5 dias antes da avaliação da viabilidade utilizando iodeto de propídio (citome‐
tria de fluxo) (A). Uma estratégia de gating baseada em dispersão direta (FSC) e dispersão lateral (SSC) foi es‐
tabelecida em células viáveis ​cultivadas na ausência de droga e usadas uniformemente em todas as amostras
(B). As células incubadas na ausência de fármaco eram 92,8% viáveis ​(controlo negativo, esquerda) e as célu‐
las de controlo positivo expostas a 1 min a 95°C eram 2,8% viáveis ​(direita). O AZT, que é conhecido por não
ser tó xico para os linfó citos, foi incubado como um controlo negativo adicional com células em várias con‐
centraçõ es e não foi tó xico em nenhuma concentração testada (C). Como controle positivo adicional, as célu‐
las foram expostas a várias concentraçõ es de cicloheximida, o que demonstrou uma toxicidade dose-resposta
(D). O ruxolitinibe não reduziu significativamente a viabilidade versus controles sem medicamento para
qualquer concentração testada, com exceção de 50 μM ( P <0,05) (E). O tofacitinibe não reduziu significativa‐
mente a viabilidade versus controles sem medicamento para qualquer concentração testada. Histogramas e
gráficos de dispersão são dados representativos de pelo menos três experimentos independentes conduzidos
com células agrupadas de oito doadores. *, Cmax e concentraçõ es no estado estacionário em humanos.
Ensaios de viabilidade e proliferaçã o em linfó citos. A viabilidade e a proliferaçã o (contagem de
cé lulas) foram medidas utilizando um sistema azul de tripano Vi-Cell. Os linfó citos estimulados
com PHA ou PHA mais IL-2 foram mantidos como descrito acima durante 72 h antes do pla‐
queamento das cé lulas em placas de 24 poços (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, EUA) a uma con‐
centraçã o de 1 x 10 6 cé lulas / poço em 1 ml de meio por poço. Tofacitinib ou ruxolitinib foram
mantidos em vá rias concentraçõ es (0,1, 1,0, 10 ou 100 μM) durante 5 dias em poços duplica‐
dos. A viabilidade e o nú mero total de cé lulas foram determinados utilizando o sistema Vi-Cell
e relatados como percentagem de cé lulas viáveis ​em cada poço e nú mero total de cé lulas por
poço. Os nú meros foram normalizados para poços contendo meio e cé lulas sem medicamento.
Os dados relatados foram mé dias e desvios padrã o para pelo menos trê s experimentos inde‐
pendentes conduzidos com pelo menos quatro doadores reunidos e duplicatas dentro de cada
experimento. A contagem mé dia de cé lulas e a viabilidade de cé lulas mantidas em meio livre de
drogas sã o mostradas emFigura 2(linhas pontilhadas).

FIGURA 2

Efeito dos inibidores de JAK na proliferação e viabilidade de linfó citos humanos primários estimulados com
PHA ou PHA mais IL-2 (A e C). Para os linfó citos estimulados por PHA, a viabilidade e a proliferação não fo‐
ram significativamente diferentes daquelas das células expostas apenas ao meio para todas as concentraçõ es
de ruxolitinib ou tofacitinib (B). Para linfó citos estimulados com PHA mais IL-2, a viabilidade não foi signifi‐
cativamente diferente daquela das células expostas apenas ao meio para todas as concentraçõ es de ruxolitinib
(linha pontilhada com quadrados) ou tofacitinib (linha cinzenta clara com losangos) (D). No entanto, a proli‐
feração foi significativamente inibida por 1 μM de ruxolitinib ou tofacitinib. Para todas as experiências, as cé‐
lulas foram incubadas apenas com meio ou meio contendo fármaco durante 5 dias antes da avaliação da con‐
tagem e viabilidade celular. O controle positivo da cicloheximida (linha contínua, losangos) foi tó xico de ma‐
neira dependente da dose, como esperado. Os dados são médias e desvios padrão para pelo menos três expe‐
rimentos independentes conduzidos com pelo menos quatro doadores reunidos e duplicatas dentro de cada
experimento. As barras pontilhadas representam a contagem média de células ou a viabilidade de células
mantidas em meio livre de drogas.
Estudos de combinaçã o avaliando a potência antiviral. Para avaliar se a combinaçã o de tofaciti‐
nibe mais ruxolitinibe era siné rgica, aditiva ou antagô nica, medicamentos na proporçã o de seus
respectivos EC 50 s, que foi determinado como 1:4, foram adicionados em vá rias concentraçõ es
aos linfó citos, e infecçõ es e potê ncia antiviral foram determinados conforme descrito acima. As
interaçõ es medicamentosas e os índices de combinaçã o (IC) foram analisados ​utilizando
CalcuSyn (Biosoft, Ferguson, MO, EUA), que permite simulaçã o automatizada de sinergismo ou
antagonismo. Valores de IC <1, 1 e >1 indicam sinergismo, aditividade e antagonismo,
respectivamente.

Reativaçã o do HIV-1 latente em linfó citos humanos primá rios. Cé lulas T de memória central ( TCM ) culti‐
vadas com infecçã o latente foram preparadas a partir de cé lulas virgens primá rias, e a reativa‐
çã o da infecçã o latente por HIV-1, como descrito anteriormente ( 26 ), foi entã o desencadeada
por coestimulaçã o CD3/CD28 mediada por anticorpos na presença de 0,1, 1 , 10 e 100 μM de
tofacitinibe, ruxolitinibe ou lamivudina (3TC; controle negativo). A produçã o de HIV-1 foi moni‐
torizada por p24 intracelular por citometria de fluxo e comparada com cé lulas reactivadas na
ausê ncia de fá rmaco.

Alé m disso, embora a via JAK-STAT nã o module diretamente o TNF-α, os inibidores de JAK exi‐
bem uma inibiçã o potente do TNF-α em humanos ( 10 ), fornecendo uma justificativa para a
avaliaçã o da capacidade dos inibidores de JAK de inibir a ativaçã o desencadeada pelo TNF-α.
da latê ncia do HIV. A linhagem de cé lulas T infectadas latentemente J-Lat foi cultivada como
descrito anteriormente ( 27 ) e entã o desencadeada para reativaçã o em 24 horas de exposiçã o
à estimulaçã o de TNF-α (10 ng/ml) na presença de 0,1, 1, 10 ou 100 μM de tofacitinibe, ruxoli‐
tinibe ou lamivudina (3TC). O 3TC foi escolhido como controle negativo porque o 3TC é um ini‐
bidor nucleosídeo da transcriptase reversa (NRTI) e, portanto, nã o se espera que tenha im‐
pacto na produçã o de proteína fluorescente verde (GFP) no sistema J-Lat, onde nã o há trans‐
criçã o reversa ativa. O vírus reativado foi monitorado pela produçã o intracelular de GFP (cito‐
metria de fluxo).

Métodos estatísticos. Mé dias, desvios padrã o e comparaçõ es estatísticas usando um teste t de

Student nã o pareado foram realizadas usando as rotinas estatísticas do Microsoft Excel 2007.
Um valor de P <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

RESULTADOS

Potência antiviral e citotoxicidade de ruxolitinibe e tofacitinibe em linfó citos e macró fagos

humanos primá rios. As potê ncias antivirais do ruxolitinib e do tofacitinib contra o LAI do VIH-1
em linfó citos humanos primá rios foram de 0,1 a 0,8 μM (EC 50 ) e 4,7 a 15,1 μM (EC 90 ), res‐
pectivamente. As potê ncias antivirais de ruxolitinib e tofacitinib contra HIV-2 pROD10 em linfó ci‐
tos humanos primá rios foram de 0,02 a 0,07 μM (EC 50 ) e 0,4 a 1,8 μM (EC 90 ), respectiva‐
mente. As potê ncias antivirais de ruxolitinib e tofacitinib contra HIV-1 BaL em macró fagos hu‐
manos primá rios foram de 0,3 μM (EC 50 ) e 3,0 μM (EC 90 ), respectivamente. Como esperado,
o AZT, utilizado como controlo positivo, demonstrou elevada potê ncia antiviral contra HIV-1 LAI
, HIV-2 e HIV-1 BaL . Os ensaios de citotoxicidade utilizando iodeto de propídio (linfó citos huma‐
nos primá rios) nã o demonstraram toxicidade significativa (IC 50 de >50 μM). O índice terapê u‐
tico (relaçã o entre toxicidade e potê ncia) foi >100 em linfó citos e macró fagos para HIV-1 e HIV-
2 (HIV-1/2) e RT-SHIV (tabela 1).
 TABELA 1
primários
Potência antiviral e toxicidade de ruxolitinibe e tofacitinibe em linfó citos e macró fagos humanos

Atividade anti-
Atividade anti- Atividade anti- Atividade anti- Atividade anti- RT-SHIV em
HIV-1 em HIV-2 em RT-SHIV em HIV-1 em Mϕ macaco Mϕ I
hPBMC (μM) hPBMC (μM) mPBMC (μM) humano (μM) (μM) h

P
Composto CE 50 CE 90 CE 50 CE 90 CE 50 CE 90 CE 50 CE 90 CE 50 CE 90 2

Ruxolitinibe 0,1 ± 4,7±0,07 0,02 ± 0,4 ± 0,09 ± 1,3±0,8 0,3 ± 3,1 ± 0,4 ± 4,2 ± >
0,02 (11) 0,01 0,2 0,1 (38) 0,1 1,8 0,2 1,3
(>100) (>100) (>100) (>100) (>100) (48) (>100) (12)

Tofacitinibe 0,8 ± 17,1 ± 0,07 ± 1,8 ± 0,3 ± 2,9±0,5 0,2 ± 2,9 ± 0,3 ± 3,1 ± >
0,3 15,1 (3) 0,006 1,1 0,1 (17) 0,08 1,4 0,2 0,9
(62) (>100) (28) (>100) (>100) (17) (>100) (16)

AZT 0,02 ± 0,13 ± 0,001 0,01 ± 0,002 0,03 ± 0,01 ± 0,07 ± 0,08 ± 0,9±0,7 >
0,008 0,03 ± 0,01 ± 0,02 0,02 0,12 0,1 (>100)
(>100) (>100) 0,0008 (>100) 0,001 (>100) (>100) (>100) (>100)
(>100) (>100)

aA
actividade foi determinada em células infectadas de forma aguda. Os dados são médias e desvios padrão
calculados a partir de pelo menos quatro experimentos independentes, com células agrupadas de oito
doadores e duplicatas em cada experimento. Os parênteses indicam o índice terapêutico (relação entre
toxicidade e potência). hPBMC, células mononucleares do sangue periférico humano; mPBMC, células
mononucleares do sangue periférico de macaco; Mϕ, macró fagos.

Potência antiviral de ruxolitinibe e tofacitinibe em linfó citos e macró fagos primá rios de macaco
rhesus. As potê ncias antivirais foram de aproximadamente 0,4 μM (EC 50 ) e 4,0 μM (EC 90 )
tanto para ruxolitinib como para tofacitinib em macró fagos primá rios de macaco rhesus activa‐
dos. As potê ncias antivirais do ruxolitinib e do tofacitinib variaram entre 0,09 e 0,3 μM (EC 50 )
e entre 1,3 e 2,9 μM (EC 90 ) em linfó citos primá rios de macaco rhesus. Como esperado, o AZT
utilizado como controlo positivo demonstrou potê ncia antiviral selectiva. Os dados apresenta‐
dos sã o as mé dias e desvios padrã o de pelo menos trê s experimentos independentes (tabela 1
).

Potência antiviral de ruxolitinibe e tofacitinibe contra vá rias cepas de HIV-1 resistentes a NRTI em
linfó citos humanos primá rios. O efavirenz (EFV) foi igualmente potente em todas as estirpes re‐
sistentes aos INTR, tal como previsto. Os dados apresentados sã o mé dias e desvios padrã o cal‐
culados a partir de pelo menos quatro experimentos independentes, com cé lulas agrupadas de
oito doadores e duplicatas em cada experimento. As potê ncias antivirais de ruxolitinibe e tofa‐
citinibe nã o foram marcadamente diferentes para HIV-1 de tipo selvagem xxLAI e HIV-1 con‐
tendo substituiçõ es K65R, M184V, L74V, A62V/V75I/F77L/F116Y/Q151M, ou 4×AZT
(D67N/K70R/ T215Y/K219Q) (mesa 2). Os controles de AZT, emtricitabina [(-) −FTC], 3TC, es‐
tavudina (d4T), 2′,3′-didesoxiinosina (ddI), efavirenz (EFV) e tenofovir disoproxil fumarato
(TDF) demonstraram sensibilidade ou resistê ncia conforme previsto (mesa 2). Todos os dados
emmesa 2sã o relatados como valores EC 50 /EC 90 .

MESA 2

Potência antiviral de ruxolitinib e tofacitinib contra várias estirpes de VIH-1 resistentes a NRTI em linfó citos
humanos primários

a
Potência antiviral (EC 50 /EC 90 )

Cepa de HIV ou vírus mutante AZT (-)−FTC 3TC Tofacitinib

xxLAI 0,03±0,007/0,1±0,08 0,09±0,02/0,8±0,4 0,8 ± 0,4/3,1 ± 2,6±1,3/28

1,2

M184V 0,01±0,02/0,02±0,01 10,1±7,3/41,3±29,3 >10/>10 1,6±0,7/27

K65R 0,04±0,02/0,3±0,1 0,5±0,4/2,4±1,4 2,5 ± 3,0/6,0 ± 1,8±0,8/81

5,3

L74V 0,02 ± 0,02/0,2 ± 0,1 0,2 ± 0,2/1,3 ± 1,0 0,6±0,8/2,9±2,9 0,9±1,0/47

A62V/V75I/F77L/F116Y/Q151M 4,6±7,7/41,2±50,2 0,4±0,3/2,1±1,6 0,5±0,7/2,7±1,7 0,2 ± 0,2/8,

4×AZT 0,1±0,1/53,3±66,1 0,2 ± 0,1/1,2 ± 0,1 0,7±0,8/3,4±1,1 0,3±0,2/17

(D67N/K70R/T215Y/K219Q)

a Os
dados são médias e desvios padrão calculados a partir de pelo menos quatro experimentos
independentes, com células agrupadas de oito doadores e duplicatas em cada experimento.

Viabilidade de linfó citos humanos primá rios expostos a vá rias concentraçõ es de ruxolitinibe ou
tofacitinibe. O ruxolitinibe nã o reduziu significativamente a viabilidade versus controles sem
medicamento para qualquer concentraçã o testada, com exceçã o de 50 μM ( P <0,05) (
Figura 1D). O tofacitinibe nã o reduziu significativamente a viabilidade versus controles sem
medicamento para qualquer concentraçã o testada (Figura 1E). Histogramas e grá ficos de dis‐
persã o sã o dados representativos de pelo menos trê s experimentos independentes conduzi‐
dos com cé lulas agrupadas de oito doadores. O co-tratamento com ruxolitinib e tofacitinib
numa proporçã o de 1:4 (linfó citos) ou 1:1 (macró fagos) nã o conferiu qualquer aumento signi‐
ficativo na toxicidade versus o observado para cada medicamento administrado isoladamente
(dados nã o mostrados).

Efeito de vá rios inibidores de JAK na proliferaçã o e viabilidade de linfó citos humanos primá rios
estimulados com PHA ou PHA mais IL-2. Para os linfó citos estimulados por PHA, a viabilidade e
a proliferaçã o nã o foram significativamente diferentes daquelas das cé lulas expostas apenas ao
meio para todas as concentraçõ es de ruxolitinib ou tofacitinib (Figura 2AeC). ​ Da mesma forma,
para linfó citos estimulados com PHA mais IL-2, a viabilidade nã o foi significativamente dife‐
rente daquela das cé lulas expostas apenas ao meio para todas as concentraçõ es de ruxolitinib
ou tofacitinib (Figura 2B); no entanto, a proliferaçã o celular foi inibida por 1 μM de ruxolitinibe
ou tofacitinibe (Figura 2D).

Inibiçã o da reativaçã o do HIV-1 latente em linfó citos por ruxolitinibe e tofacitinibe. Tofacitinibe e
ruxolitinibe inibiram a reativaçã o do HIV-1 latente em um modelo primá rio de latê ncia de cé lu‐
las T baseado em cé lulas de memó ria central (Figura 3A) e no sistema de cé lulas T de latê ncia
J-Lat, onde os dois inibidores de JAK foram pré -incubados com cé lulas por 30 min antes da adi‐
çã o de TNF-α (J-Lat) ou CD3/CD28 (modelo primá rio de cé lulas T) na presença de droga por
24 horas para conferir reativaçã o (Figura 3B). O ruxolitinibe foi o inibidor mais eficaz em am‐
bos os sistemas e inibiu ≥50% da reativaçã o nas concentraçõ es no estado estacioná rio ou na
concentraçã o má xima ( Cmax ) in vivo (Figura 3, caixas sombreadas) ( 28 , 29 ).

FIGURA 3

Tofacitinibe e ruxolitinibe inibem a reativação do HIV-1 latente. Tofacitinibe (linha pontilhada/losangos) e ru‐
xolitinibe (linha só lida/quadrados) inibem a reativação do HIV-1 latente em um modelo primário de latência
de células T baseado na memó ria central (A) e no sistema de células T de latência J-Lat (B). O ruxolitinibe foi
o inibidor mais potente em ambos os sistemas e inibiu ~50% da reativação em concentraçõ es no estado esta‐
cionário ou Cmax in vivo (caixas sombreadas) . Os dados são médias e desvios padrão para pelo menos três
experimentos independentes conduzidos com pelo menos quatro doadores reunidos e duplicatas dentro de
cada experimento.

Potência antiviral sinérgica para coadministraçã o de ruxolitinibe e tofacitinibe em linfó citos e

macró fagos humanos primá rios. Para cotratamento com ruxolitinibe e tofacitinibe na propor‐
çã o de 1:4 (linfó citos) ou 1:1 (macró fagos) (Figura 4AeB,
​ respectivamente), a CE 50 diminuiu
modestamente em 2 vezes para o ruxolitinib e o tofacitinib isoladamente versus a combinaçã o.
A CE 90 diminuiu 53 vezes (tofacitinib) e 161 vezes (ruxolitinib) (Figura 4, linhas pontilhadas).
A CE 50 e a CE 90 estavam marcadamente diminuídas nos macró fagos (Figura 4B). O valor do IC
para a EC 90 nos linfó citos foi de 0,07 ± 0,02, confirmando o sinergismo. Da mesma forma, os
valores de IC para CE 50 e CE 90 em macró fagos foram <0,1, confirmando interaçõ es antivirais
siné rgicas.
 FIGURA 4

Potência antiviral sinérgica para coadministração de ruxolitinibe e tofacitinibe em linfó citos humanos primá‐
rios (A) e macró fagos (B). O co-tratamento de ruxolitinib e tofacitinib numa proporção de 1:4 (linfó citos) ou
1:1 (macró fagos) demonstrou potência antiviral sinérgica, conforme calculado por CalcuSyn (Biosoft, Inc.,
Cambridge, Grã-Bretanha). Linha/triângulos só lidos pretos, tofacitinibe sozinho; linha/quadrados pontilha‐
dos, apenas ruxolitinibe; linha/círculos só lidos cinza, ruxolitinibe mais tofacitinibe. Os dados são médias e
desvios padrão para pelo menos três experimentos independentes conduzidos com pelo menos quatro doado‐
res reunidos e duplicatas dentro de cada experimento. Os valores numéricos nos eixos y esquerdos represen‐
tam a percentagem de inibição versus controlos sem fármaco. Os valores numéricos nos eixos y à direita re‐
presentam cpm −1 /μl (valores RT) ou pg −1 /ml p24 para linfó citos e macró fagos, respectivamente.

DISCUSSÃ O

A HAART pode alcançar a supressã o viral a longo prazo com certas limitaçõ es, incluindo a inca‐
pacidade de curar ou tratar a inflamaçã o causada pelo VIH, necessitando da concepçã o de no‐
vas terapê uticas com alvos. Está bem estabelecido que a via JAK-STAT é ativada precocemente
na infecçã o pelo HIV-1 em mú ltiplas cé lulas-alvo do HIV-1, incluindo macró fagos e linfó citos ( 3
, 4 , 6 , 9 , 23 ), e esta via orquestra uma transduçã o multifacetada e em tandem de eventos, re‐
sultando na produçã o de fatores inflamató rios, hiperativaçã o da cé lula infectada, induçã o de
proliferaçã o homeostá tica por IL-7 e IL-15 de cé lulas T de memó ria central (TCM) e cé lulas T
de memó ria transicional (TTM ) ( 30 ), o que contribui para a manutençã o/nova propagaçã o
do reservató rio e para a disfunçã o imunoló gica global em vá rios locais, incluindo o intestino, o
SNC, o cé rebro e a periferia sistê mica (3 , 4 , 6 , 9 , 11 , – 15 , 17 , 19 , 23 , 31 ) . A ativaçã o da in‐
flamaçã o induzida pelo HIV pela induçã o da cascata de sinalizaçã o JAK-STAT modula mú ltiplos
eventos pró -HIV impulsionados pela inflamaçã o que favorecem a replicaçã o do vírus, a manu‐
tençã o de reservató rios virais e a infecçã o crô nica em vá rios locais sistemicamente.

Citocinas específicas, incluindo IL-6, TNF-α e IL-1α/β, tê m sido implicadas como fatores-chave
na progressã o da doença e na manutençã o da replicaçã o e infecçã o (11 , – 13 , 15 , 19 , 22 ) .
Os níveis de IL-6 circulante correlacionam-se com a viremia residual e sã o um marcador de
disfunçã o imunoló gica e translocaçã o microbiana ( 18 , 21 ). Alé m disso, vá rios relató rios de‐
monstram que os níveis de IL-6 permanecem elevados em pacientes com viremia bem contro‐
lada ( 15 , 18 , 31 ) e correlacionam esta elevaçã o à viremia persistente de baixo nível que pode
semear reservató rios e contribuir para uma incapacidade de erradicar o vírus mesmo quando
a maior parte da replicaçã o é controlada. Outros relató rios confirmam que a activaçã o imunitá ‐
ria é um forte preditor da progressã o da doença ( 17 , 20 , 21 , 32 ) e afirmam que a activaçã o
imunitá ria no início do tratamento determina a extensã o da reconstituiçã o imunitá ria que é
possível depois ( 16 ), sublinhando a importâ ncia de controlar a inflamaçã o em todos os indiví‐
duos, independentemente da carga viral ou do estado da doença. De acordo com o papel esta‐
belecido da inflamaçã o na persistê ncia do VIH, muitos relató rios correlacionam a activaçã o da
via JAK-STAT com mú ltiplos eventos pró -VIH, incluindo apoptose de monó citos em pessoas in‐
fectadas pelo VIH (23), aumento contínuo orquestrado pelo VIH nas respostas inflamató rias
que impulsionam a migraçã o de cé lulas infectadas atravé s da barreira hematoencefá lica (BHE)
( 6 ), e a perpetuaçã o mediada por JAK-STAT de um fenó tipo pró -inflamató rio em cé lulas da li‐
nhagem mieloide ( 9 ).

A inibiçã o direcionada seletiva e eficaz da via JAK-STAT poderia fornecer um mecanismo multi‐
facetado para inibir diretamente a via JAK-STAT, inibindo assim uma via que modula muitos
eventos pró -HIV e para reduzir significativamente a inflamaçã o sistê mica que impulsiona a pro‐
gressã o da doença e mú ltiplas pró -HIV. -Eventos de HIV. Em suma, os inibidores de JAK1/2 re‐
presentam uma modalidade atractiva para conferir inibiçã o indirecta da replicaçã o do VIH-1,
inibindo uma sé rie complexa de eventos imunomoduladores provocados pelo VIH atravé s de
linfó citos e macró fagos. Os inibidores de JAK1/2 foram escolhidos para este estudo porque os
inibidores de JAK3 apresentam toxicidade fora do alvo, incluindo depleçã o de cé lulas NK ( 33 ),
o que pode mitigar a capacidade das cé lulas NK de modular a imunidade antiviral, resultando
em um aumento transitó rio nas cargas virais, como foi observado em um estudo recente com
macacos rhesus infectados pelo SIV ( 33 ). Curiosamente, este relató rio descreve uma falta de
declínio nas cé lulas T CD4, apesar dos aumentos transitó rios nas cargas virais. Esta contagem
sustentada de cé lulas T CD4 na presença de cargas virais mais elevadas é provavelmente confe‐
rida pelos efeitos antivirais e anti-inflamató rios do inibidor de JAK que foi administrado. O uso
de um inibidor de JAK1/2 pode conferir benefícios antivirais e antiinflamató rios sem a toxici‐
dade fora do alvo da depleçã o de cé lulas NK que aparece com um inibidor de JAK3.

Aqui, relatamos pela primeira vez que dois inibidores de JAK aprovados pela FDA, ruxolitinibe
e tofacitinibe, sã o inibidores submicromolares eficazes da replicaçã o do HIV em linfó citos e
macró fagos. As infecçõ es foram realizadas como infecçã o aguda, onde as cé lulas nã o infectadas
foram expostas ao fá rmaco antes da infecçã o com HIV-1, e a quantificaçã o viral foi realizada 5
a 7 dias apó s a infecçã o. Este desenho experimental permite avaliar o impacto do tofacitinib e
do ruxolitinib no estabelecimento da primeira ronda de replicaçã o viral em cé lulas nã o infecta‐
das, bem como em mú ltiplas rondas de infecçã o a partir de entã o. Alé m disso, à medida que os
dados sã o recolhidos de cé lulas nã o infectadas expostas ao vírus durante 5 a 7 dias, a reduçã o
do vírus observada neste momento tardio, que é uma funçã o tanto da inibiçã o da infecçã o de
novo como da subsequente disseminaçã o para novas cé lulas, implica que a inibiçã o da replica‐
çã o viral está acontecendo. A determinaçã o do impacto dos inibidores de JAK em outros parâ ‐
metros, como a reduçã o do DNA viral integrado, tamanho e meia-vida dos reservató rios virais,
será relatada em outro lugar.

Complementarmente a estes dados, ambos os inibidores demonstraram potê ncias semelhantes

contra a infecçã o por HIV-2 em linfó citos humanos e contra a infecçã o por RT-SHIV em linfó ci‐
tos e macró fagos de macaco rhesus.tabela 1). Estes dados foram obtidos com cé lulas PBM esti‐
muladas com PHA e IL-2 antes da infecçã o para facilitar uma ativaçã o em conjunto das cé lulas
tanto por PHA (um mecanismo nã o específico) como por IL-2 (mecanismo específico) para ga‐
rantir que as cé lulas sejam ativadas, proliferando, e, portanto, permissivo à infecçã o por HIV-1,
HIV-2 ou SHIV. A combinaçã o de PHA mais IL-2 é tradicionalmente utilizada para preparar cé ‐
lulas PBM primá rias para infecçã o e foi, portanto, també m utilizada para estes ensaios. Alé m
disso, a utilizaçã o de um mitogé nio, para conferir activaçã o inespecífica precoce, em conjunto
com IL-2, para conferir activaçã o e proliferaçã o específicas mediadas por receptor, pretende
criar um ambiente que seja semelhante ao observado in vivo, onde a presença de vírus em um
indivíduo infectado provoca um estado crô nico de ativaçã o e preparaçã o de cé lulas nã o infec‐
tadas para infecçã o. Ruxolitinib em doses clinicamente aprovadas demonstrou uma reduçã o
superior a 50% na IL-6, TNF-α e antagonista do receptor de IL-1 (IL-1Ra) (10), e a principal in‐
dicaçã o para o uso de tofacitinib é a artrite reumató ide, indicando a sua forte capacidade anti-
inflamató ria in vivo . Como a combinaçã o de PHA mais IL-2 foi usada como mitó geno antes da
infecçã o e induz um estado hiperativado e proliferativo na populaçã o celular em conjunto com
a infecçã o por HIV-1, HIV-2 ou RT-SHIV, é plausível que a potê ncia antiviral observada com ru‐
xolitinibe e tofacitinibe é uma funçã o da modulaçã o de citocinas pró -inflamató rias, que por sua
vez altera o estado de ativaçã o das cé lulas PBM, conferindo um estado de ativaçã o regulado
negativamente. A inibiçã o estabelecida da inflamaçã o por estes fá rmacos proporciona uma
base para uma inibiçã o indirecta do ciclo de replicaçã o viral atravé s da interferê ncia com facto‐
res inflamató rios que promovem a replicaçã o viral produtiva. A potê ncia antiviral observada
com ruxolitinib e tofacitinib em macró fagos sugere que a inibiçã o eficaz da replicaçã o viral
atravé s de reservató rios virais derivados de mieloides sentinela é possível in vivo , sublinhando
a capacidade destes inibidores para abordar a replicaçã o contínua atravé s de compartimentos
celulares, onde a terapia antirretroviral atual é administrada em concentraçõ es subterapê uti‐
cas ( 1 ). A ativaçã o de STATs pela via JAK-STAT está associada ao aumento da inflamaçã o e à
transmigraçã o de leucó citos atravé s da BBB ( 6 ), ressaltando o papel sentinela da ativaçã o de
JAK-STAT na inflamaçã o e na ativaçã o imunoló gica, que rege os eventos pró -HIV sistê micos. Alé m
disso, o perfil anti-inflamatório destes compostos poderia mitigar o trá fego de monócitos CD14 + / CD16 + infectados e

activados na periferia atravé s da BBB e no SNC ( 6 , 7 , 12 , 13). Este bloqueio mediado pelo ini‐
bidor de JAK poderia reduzir significativamente a disfunçã o neurocognitiva associada ao HIV,
que é frequentemente conferida por eventos provocados pela inflamaçã o nos compartimentos
do SNC ( 6 , 7 , 12 , 13 , 17 , 22 ).

O perfil antiinflamató rio estabelecido de ruxolitinibe e tofacitinibe sugere que esses compostos
podem ser inibidores eficazes da proliferaçã o homeostá tica e manutençã o de reservató rios de
cé lulas T CM , T TM ou T SCM , que é impulsionada por IL-7 e IL-15, dois pró -inflamató rios citoci‐
nas ( 30 , 34 ). Ao mesmo tempo, é possível que uma reduçã o na inflamaçã o e activaçã o sisté ‐
mica possa levar à reduçã o da expressã o do co-receptor do VIH-1, incluindo o CCR5, uma vez
que a sua expressã o está positivamente correlacionada com o estado de activaçã o ( 35 , 36 ).
Este mecanismo poderia reduzir a entrada mediada pelo HIV em cé lulas permissivas atravé s de
uma reduçã o indireta, induzida pelo estado de ativaçã o, na expressã o de CCR5. Segue-se que a
diminuiçã o da ativaçã o celular poderia resultar em menos eventos de transmissã o de novo do
HIV cé lula a cé lula, o que de outra forma teria ocorrido atravé s da transmissã o independente
da TARV do vírus a partir de cé lulas T ativadas. Isto sugere que os inibidores de JAK conferi‐
riam assim menos eventos de estabelecimento de latê ncia. A capacidade do ruxolitinibe e do
tofacitinibe de inibir IL-6 e TNF-α in vivo ( 10 ) sugere que a inibiçã o dessas citocinas pelo ru‐
xolitinibe e tofacitinibe, que estimula a replicaçã o do HIV-1 por meio da induçã o da transcriçã o
do gene viral ( 15 , 19 ), poderia resultar em uma diminuiçã o na replicaçã o viral. Embora a via
JAK-STAT nã o seja diretamente ativada pelo TNF-α, a inibiçã o in vivo da sinalizaçã o JAK-STAT
pelo ruxolitinib diminui significativamente os níveis perifé ricos de TNF-α ( 10 ), definindo clara‐
mente uma ligaçã o entre a administraçã o de ruxolitinib e os níveis de TNF-α. Alé m disso, a ini‐
biçã o direta de citocinas pró -inflamató rias pelos inibidores de JAK poderia, por sua vez, resul‐
tar em uma regulaçã o negativa geral da ativaçã o nas populaçõ es celulares, impactando indire‐
tamente a produçã o autó crina e pará crina de citocinas nã o controladas diretamente pela via
JAK-STAT, como o TNF-α . Juntos, estes mecanismos multifacetados e independentes poderiam
resultar num efeito anti-HIV em conjunto e simultâ neo. Alguns eventos podem inibir direta‐
mente a transcriçã o do gene viral atravé s da inibiçã o da IL-6 e do TNF-α, que estã o associados
à induçã o da transcriçã o do gene viral ( 15 , 19 ). Outros eventos poderiam conferir um estado
de ativaçã o geral reduzido e diminuiçã o da permissividade das cé lulas-alvo do HIV-1 pela inibi‐
çã o da ativaçã o da via JAK-STAT induzida pelo HIV e inibiçã o indireta de eventos de citocinas
pró -inflamató rias pará crinas e autó crinas.

O grau em que o ruxolitinib e o tofacitinib inibem JAK1, JAK2, JAK3 ou Tyk2 e os efeitos a ju‐
sante desta inibiçã o podem ser significativamente alterados em funçã o da inibiçã o diferencial
de JAK. Portanto, conclui-se que dois inibidores diferentes, embora da mesma classe de medi‐
camentos, poderiam conferir efeitos antivirais siné rgicos devido a diferenças relativas aos per‐
fis de inibiçã o de JAK. Assim, a co-administraçã o de ruxolitinib e tofacitinib em proporçõ es dos
seus respectivos valores de EC 50 (1:1 em macró fagos e 1:4 em linfó citos) demonstrou potê n‐
cia antiviral siné rgica tanto em linfó citos como em macró fagos e diminuiu significativamente a
concentraçã o de cada fá rmaco necessá ria para inibir a replicaçã o viral (Figura 4). Embora o
mecanismo exato para o sinergismo nã o esteja definido, segue-se que a inibiçã o diferencial de
JAK1, JAK2, JAK3 e Tyk2 por cada medicamento cria mú ltiplos alvos dentro da via JAK-STAT a
partir dos quais confere inibiçã o de citocinas pró -inflamató rias, tornando assim possível para
ocorra sinergismo.

Em relaçã o à modulaçã o da ativaçã o, em funçã o da inibiçã o da via JAK-STAT, a hiperativaçã o

confere ativaçã o da via JAK-STAT, e a adiçã o de um inibidor de JAK reduz esta hiperativaçã o.
Como o ruxolitinib e o tofacitinib sã o bem tolerados clinicamente e tê m aprovaçã o para uso
cró nico a longo prazo em humanos, é evidente que estes medicamentos nã o conferem inibiçã o
sisté mica e aná loga de toda a sinalizaçã o JAK-STAT, o que conferiria toxicidade precoce signifi‐
cativa. Estes factores implicam que os inibidores de JAK podem inibir selectivamente a activa‐
çã o de cé lulas que demonstram hiperactivaçã o da via JAK-STAT, como seria o caso de pessoas
com mielofibrose, artrite reumató ide ou, potencialmente, com VIH. Para testar esta hipó tese,
avaliamos a capacidade do ruxolitinibe e do tofacitinibe em inibir a proliferaçã o de linfó citos
humanos primá rios estimulados com PHA ou PHA mais IL-2. A adiçã o de ruxolitinibe ou tofaci‐
tinibe nã o reduziu a viabilidade em nenhum dos estados de ativaçã o celular para todas as con‐
centraçõ es testadas (Figura 2AeB) ​ e nã o alterou a proliferaçã o estimulada por PHA (Figura 2C
). Ambas as drogas demonstraram inibiçã o eficaz da proliferaçã o estimulada por PHA mais IL-
2, mas nã o apenas por PHA de uma forma dependente da dose (Figura 2D), implicando que o
ruxolitinibe e o tofacitinibe inibem seletivamente a proliferaçã o em populaçõ es de cé lulas hipe‐
rativadas. Todos os estudos de viabilidade/proliferaçã o foram realizados com cé lulas PBM hu‐
manas expostas a PHA ou PHA mais IL-2 durante 6 dias. Em contraste, todos os estudos antivi‐
rais foram realizados com PHA mais IL-2, e o ruxolitinib e o tofacitinib inibiram a replicaçã o vi‐
ral nestas cé lulas. O ponto temporal de 5 dias foi escolhido para avaliar o impacto do ruxoliti‐
nib e do tofacitinib sob condiçõ es in vitro semelhantes à s que podem ocorrer in vivo , onde a
activaçã o é conferida durante momentos anteriores pela activaçã o inicial mediada por citoci‐
nas, mas onde eventos pará crinos e autó crinos subsequentes ocorrerá apó s o pico inicial de
ativaçã o e persistirá depois disso. Como está bem documentado que a via JAK-STAT é ativada
em cé lulas infectadas pelo HIV ( 3 , 4 , 6 , 8 , 23 ), segue-se que o mecanismo de açã o antiviral
do ruxolitinib e do tofacitinib pode, em parte, estar relacionado com inibiçã o específica da sina‐
lizaçã o mediada por JAK-STAT em cé lulas infectadas pelo HIV, que abrigam níveis mais elevados
de ativaçã o de JAK-STAT do que cé lulas nã o infectadas ( 3 , 4 , 9 ). Alé m disso, relató rios de‐
monstraram que existem vá rios locais de ligaçã o de STAT nas longas repetiçõ es terminais de
vá rios subtipos de HIV-1 ( 37 ) e que a ativaçã o de STAT5 induzida por citocinas aumenta a
produçã o de HIV-1 em cé lulas T CD4 + primá rias ( 24 ). Esses achados dã o credibilidade à hipó ‐
tese de que o bloqueio da ativaçã o de STAT mediado por ruxolitinibe e tofacitinibe confere po‐
tê ncia antiviral, independentemente de a ativaçã o de STAT específica da cé lula ser conferida
por citocinas pró -HIV ou diretamente pelo HIV-1/2. Essas descobertas també m fornecem uma
base para uma hipó tese baseada no potencial de inibiçã o da replicaçã o viral baseada em fato‐
res celulares pelos inibidores de JAK. Como nã o fomos capazes de selecionar vírus resistentes
mesmo apó s 18 passagens semanais, o co-tratamento de cé lulas infectadas com um inibidor de
JAK mais a HAART tradicional poderia aumentar o tempo para o desenvolvimento da resistê n‐
cia à TAR tradicional ou potencialmente modular o padrã o de resistê ncia que emerge.

Curiosamente, as concentraçõ es de ruxolitinib ou tofacitinib que conferiram inibiçã o da reacti‐

vaçã o, tanto para a reactivaçã o mediada por TNF-α como para CD3/CD28, sã o 1 a 2 logs supe‐
riores à s que conferem potê ncia antiviral em todos os tipos de cé lulas testados, demonstrando
que o mecanismo que confere inibiçã o da reativaçã o pode ser independente daquela que con‐
fere atividade antiviral. Embora a via JAK-STAT nã o seja diretamente ativada pelo TNF-α, um
modelo de latê ncia baseado em TNF-α foi escolhido especificamente pelas seguintes razõ es: (i)
a inibiçã o in vivo da sinalizaçã o JAK-STAT pelo ruxolitinib diminui significativamente o TNF-α
perifé rico níveis ( 10 ), definindo claramente uma ligaçã o entre a administraçã o de ruxolitinibe
e o TNF-α; (ii) a inibiçã o direta de citocinas pró -inflamató rias por inibidores de JAK poderia,
por sua vez, resultar em uma regulaçã o negativa geral da ativaçã o nas populaçõ es celulares,
impactando indiretamente a produçã o autó crina e pará crina de citocinas nã o controladas dire‐
tamente pela via JAK-STAT, como TNF- α; e (iii) o mecanismo direto pelo qual o ruxolitinib con‐
fere uma reduçã o significativa in vivo no TNF-α é desconhecido, e o(s) mecanismo(s)
responsável(eis) por esta conversa cruzada també m poderiam modular a reativaçã o do HIV-1
latente, que també m é regulado por complexos conversa cruzada envolvendo citocinas e even‐
tos de sinalizaçã o celular.

Juntos, estes dados demonstram que a inibiçã o direcionada da via JAK-STAT pela inibiçã o de
JAK fornece um mecanismo seletivo, eficaz e novo para inibir a replicaçã o do HIV-1 em linfó ci‐
tos e macró fagos, a replicaçã o do HIV-1 resistente a medicamentos e a reativaçã o de HIV-1 la‐
tente. A inibiçã o da via JAK-STAT usando agentes aprovados pela FDA, como ruxolitinib e tofaci‐
tinib, proporciona a primeira oportunidade de ter um impacto significativo nesta inflamaçã o e
pode redefinir o ambiente imunoló gico. Essas descobertas apresentam uma justificativa con‐
vincente para trabalhos futuros destinados a elucidar a potencial relevâ ncia clínica dessas dro‐
gas em um modelo de macaco e, eventualmente, em humanos, em uma dose segura e eficaz.

AGRADECIMENTOS

Este trabalho foi apoiado em parte pelas bolsas do NIH 8R01-OD011094 ; (para RFS), 5P30-AI-
50409 (para RFS) (Centro de Pesquisa sobre AIDS), R01-MH100999 ; (para RFS) e 5-R01-
AI087508 (para VP) e pelo Departamento de Assuntos de Veteranos (para RFS).

NOTAS DE RODAPÉ

Publicado antes da impressão em 13 de janeiro de 2014

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