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Folia Microbiológica (2022) 67:555–571

https://doi.org/10.1007/s12223-022-00963-8

ANÁLISE

Corantes de DNA: toxicidade, estratégias de remediação e alternativas

Abhrajit Debroy1 · Mohini Yadav1 · Radhika Dhawan1 · Shubhankhi Dey1 · Nancy George1

Recebido: 1 de outubro de 2021 / Aceito: 8 de março de 2022 / Publicado online: 15 de março de 2022
© Instituto de Microbiologia, Academia de Ciências da República Tcheca, vvi 2022

Abstrato
A libertação de efluentes não tratados provenientes de indústrias de transformação ou de transformação e de outras instalações comerciais em
massas de água constitui uma grande ameaça ao ambiente e à saúde humana. A este respeito, os efuentes gerados em laboratórios e outras
instalações de investigação são de grande preocupação. Entre outros produtos químicos nocivos, o efuente é rico em corantes orgânicos
tóxicos, que ficam expostos ao meio ambiente e representam sérios riscos à saúde. Os corantes utilizados na análise de ácidos nucleicos,
especialmente os corantes de DNA, são conhecidos por sua teratogenicidade e potencial mutagênico, que depende principalmente do organismo
e das circunstâncias sob as quais é exposto. Entre animais e humanos, a exposição a estes corantes pode causar irritação na boca, olhos e
trato respiratório e muitos outros efeitos possíveis que ainda não foram explorados. Para superar estes problemas, os corantes presentes nos
efuentes de laboratórios devem ser degradados em formas não tóxicas. Várias estratégias têm sido propostas e investigadas para degradação
e remediação de efluentes laboratoriais contaminados. Sendo uma técnica moderna e económica, a biodegradação utilizando micróbios e
plantas é uma técnica potencialmente ecológica e sustentável para desintoxicar estes corantes. Neste artigo, discutimos e revisamos a estrutura,
propriedades e perfil de toxicidade de corantes de ácidos nucleicos proeminentes, juntamente com as estratégias de remediação de efuentes
de laboratório contaminados com esses corantes. Além disso, também discutimos a viabilidade e as limitações destas estratégias de remediação
e identificamos lacunas de investigação que podem ajudar os investigadores a explorar soluções mais eficazes para gerir esta área de grande
preocupação. Também revisamos várias alternativas menos tóxicas desses corantes comuns como opções mais seguras.

Palavras-chave Corantes alternativos de DNA · Corantes de DNA · Degradação de corantes · Corantes de ácidos nucleicos · Toxicidade

Introdução usado na análise molecular de ácido nucleico, a saber, brometo de

Com a rápida progressão da industrialização, os poluentes orgânicos
persistentes estão a aumentar no ambiente a taxas alarmantes e
tornaram-se uma questão de preocupação global.
Entre outros poluentes, os corantes orgânicos são um dos
contaminantes significativos presentes nas águas residuais. Esses
corantes são predominantemente usados nas indústrias têxtil, papel,
alimentícia, cosmética, farmacêutica, etc. e são altamente tóxicos.
Além das indústrias, esses corantes orgânicos também encontram
imensa aplicação em pesquisa e análise científica e são
frequentemente usados em instalações médicas, institutos de ensino
e laboratórios de pesquisa (Aidoo et al. 1990). Na maioria dos casos,
os efuentes laboratoriais não são tratados de forma eficaz e os
contaminantes tóxicos são liberados diretamente no meio ambiente. A este2021).
respeito, corantes orgânicos
* Nancy George
nancy.george@cumail.in
1
Instituto Universitário de Biotecnologia, Chandigarh
Universidade, Mohali, Punjab 140413, Índia
etídio (EtBr), azul brilhante de coomassie (CBB), laranja de acridina
(AO), violeta cristal (CV), azul de metileno (MB) e 4,6-diamidino-2-
fenilindol (DAPI), são corantes potencialmente perigosos e merecem
atenção. Esses corantes são usados para detectar e quantificar o
ácido desoxirribonucléico (DNA) e são comumente chamados de
corantes de DNA (Neeraja et al. 2017). A maioria dos corantes de
DNA também pode se ligar ao ácido ribonucleico (RNA) e são
amplamente denominados como corantes/colorações de ácido
nucleico. Esses corantes são usados em técnicas como monitoramento
da migração de DNA em gel durante eletroforese, monitoramento de
processos como fragmentação nuclear, fusão celular e microinjeção,
quantificação de DNA, estudos de clonagem, identificação microbiana
e análise de metagenoma (Soltaninejad et al. 2019 ; Ohno e outros
Embora os corantes de ADN sejam valiosos em termos de
investigação e desenvolvimento, são potencialmente prejudiciais e
potencialmente fatais quando ingeridos por formas vivas. Eles são
considerados de natureza potencialmente mutagênica e cancerígena
e podem até influenciar o sistema endócrino (Nandhini et al. 2019).
Na forma de géis residuais, excesso de corantes

Vol.:(0123456789) 1 3
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e resíduos de lavagem, esses corantes são lançados em efluentes
laboratoriais e chegam ao meio ambiente. Pequenos organismos
aquáticos são facilmente expostos a estes corantes e quando estes, por
sua vez, são consumidos como alimento pelos seus predadores, os
resíduos de corantes podem atingir o próximo nível trófico. Através da
transferência trófica, podem atingir organismos superiores, incluindo
humanos, e prejudicar a sua saúde (Lellis et al. 2019).
Os corantes de DNA têm alta capacidade de dissolução de água, o que
de alguma forma torna muito difícil seu tratamento ou remoção pelos
métodos usuais. Esses corantes também contêm agentes corantes que
impedem a difusão da luz na água, o que por sua vez diminui o nível de
oxigênio dissolvido e afeta a atividade fotossintética de diferentes formas
de vida aquática (Lin et al. 2014). Assim, torna-se necessário o tratamento
adequado dos efluentes contendo corantes antes de seu lançamento na
natureza. Estratégias precisam ser empregadas para que esses corantes
nocivos sejam completamente degradados ou convertidos em formas
menos tóxicas, antes de chegarem ao meio ambiente (Ohno et al. 2021).
Diferentes métodos foram investigados e relatados para a remoção
de corantes orgânicos comuns de águas residuais geradas em diversas
indústrias; entretanto, estudos relativos à degradação de corantes de
DNA e sua remediação são limitados. Estratégias baseadas em micróbios
e plantas podem ser empregadas com sucesso para mineralizar esses
corantes.
Esses métodos também são econômicos e ecológicos. Uma variedade
de plantas e microrganismos aquáticos e terrestres, incluindo bactérias,
algas e fungos, foi identificada por seu possível papel na biorremediação
de vários contaminantes (Debroy et al. 2021) e também pode ser
empregada na degradação desses corantes. Além disso, o tratamento
fotocatalítico associado à nanotecnologia também provou ser uma técnica
eficiente para o mesmo (Ledakowicz e Pazdzior 2021). No entanto, cada
um destes métodos tem as suas próprias viabilidades e limitações e
chama a atenção de
pesquisadores. Apesar de algumas desvantagens, a biorremediação é
essencialmente uma abordagem futurista e esta estratégia pode ser
progressivamente melhorada por técnicas biotecnológicas modernas
que estão relacionadas com o desenvolvimento de organismos modificados
com melhores capacidades de degradação (Lellis et al. 2019).
Embora existam vários estudos e revisões referentes a corantes
liberados de vários processos comerciais, revisões sobre corantes de
DNA não estão disponíveis. Através deste artigo, pretendemos analisar
diferentes estratégias de degradação de corantes de DNA e resumir
relatórios recentes sobre as mesmas. Os corantes comumente usados
em estudos relacionados a ácidos nucleicos, seu potencial efeito prejudicial
e corantes alternativos menos tóxicos foram discutidos em detalhes. Além
disso, são identificadas lacunas na investigação e são previstas futuras
direcções de investigação neste campo para a redução destes corantes
através de abordagens ecológicas.
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Corantes usados como corante de ácido nucleico
A visualização e análise de ácidos nucleicos através de coloração é um
procedimento comum empregado em laboratórios de biologia molecular,
pois eles interagem com o DNA/RNA para torná-los visíveis. Corantes de
ácido nucleico têm sido usados para determinar o tamanho do fragmento,
bem como a quantidade e qualidade do DNA em qualquer amostra (Aidoo
et al. 1990). Estes podem ser amplamente caracterizados como corantes
intercalantes e de ligação de sulcos menores. Corantes intercalantes são
aqueles que se adicionam em bases planares de ácido nucleico
desoxirribose. A interação ou intercalação ocorre quando corantes
policíclicos, aromáticos e planares se fixam entre as bases do DNA
(Haines et al. 2015). Brometo de etídio, iodeto de propídio e verde SYBR
I são alguns dos corantes intercalantes. Os ligantes do sulco menor têm
o formato de uma lua crescente que se ligam de forma não covalente ao
sulco menor do DNA. Uma mistura de ligações de hidrogênio controladas
às bordas dos pares de bases é comumente usada para se ligar a
sequências específicas de DNA. 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e
corantes Hoechst são exemplos de corantes de ligação a sulcos menores
(Haines et al. 2015). Além disso, esses corantes também podem ser
categorizados como corantes fluorescentes e não fluorescentes.
O brometo de etídio e o laranja de acridina são os corantes fuorescentes
mais comuns na análise de ácidos nucleicos (Aidoo et al. 1990). Além
disso, corantes como isotiocianato de fuoresceína, 4,6-diamidino-2-
fenilindol (DAPI) e 7 amino-actinomicina-D são outros corantes
fuorescentes utilizados para este fim. Embora considerados como
potenciais mutagênicos, os corantes fluorescentes são extremamente
sensíveis, permitindo a visualização de pequenas quantidades de DNA
(Singer et al. 1999). Os corantes de ácidos nucleicos não fluorescentes
são comparativamente baratos, menos tóxicos e não requerem
equipamento especial para visualização. Corantes, a saber, azul brilhante
de coomassie, azul de metileno, violeta cristal, sulfato de azul do Nilo e
tetrametilrodamina-5-(e 6)-isotiocianato, são exemplos de corantes não
fluorescentes (Haines et al. 2015) . A estrutura (Fig. 1), propriedades e
aplicação de alguns dos corantes de DNA mais comuns são discutidas
aqui em detalhes.
Brometo de etídio
O brometo de etídio é uma fração heterocíclica junto com um núcleo de
grupo aromático conhecido como fenantridina e é, portanto, conhecido
como brometo de 3,8-diamino-5-etil-6-fenilfenantridínio (Galindo et al.
2021). Inicialmente, o brometo de etídio foi utilizado na veterinária como
medicamento tripanocida para o tratamento da tripanossomíase em
bovinos (Stevenson et al. 1995). Também tem sido usado na proliferação
de células para diminuir o número de cópias de DNA das mitocôndrias
(Diaz et al. 2002). Por ter menor custo, conveniência de uso e capacidade
de detectar DNA em níveis submicrogramas, é geralmente usado em
eletroforese em gel para coloração de ácidos nucleicos.
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Fig. 1 Estrutura química de corantes
importantes utilizados em estudos de
ácidos nucleicos
Para coloração de ácido nucleico, o brometo de etídio oferece ótimas
características intercalantes e fuorescentes (Bourzac et al.
2003). Este corante, quando ligado ao RNA e DNA de fita dupla,
causa um aumento na fuorescência de até 21 a 25 vezes quando
comparado com a forma não ligada. Como esse corante tem baixa
fluorescência em seu estado não ligado, apenas uma breve
descoloração dos géis é usada para ver claramente as bandas de
ácidos nucleicos (Bourzac et al. 2003).
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Laranja de acridina
O laranja de acridina, o derivado tetra-N-metil da profa-vina, utilizado
como coloração histológica por uma década, revela a presença de
ácidos nucléicos. É uma mancha básica com estrutura plana derivada
do antraceno. A laranja de acridina é amplamente utilizada em
citoquímica para monitorar citometria de fluxo, fragmentação nuclear,
gradientes de pH em membranas celulares, etc.
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É um composto monomérico, intercalando seu anel de acridina entre os
anéis inferior e superior de pirimidina e purina de cada terceiro par de
bases (Erenpreisa et al. 2018). Tem forte afinidade com ácidos nucleicos
e intercala-se em fitas duplas ou liga-se eletrostaticamente a fitas simples,
exibindo fuorescência verde e vermelha em 530 e 640 nm, respectivamente,
quando exposto à luz UV (Lauretti et al. 2003; Erenpreisa et al. 2018 ). ).
A fuorescência de agentes intercalantes como este corante é aumentada
após a ligação em solução aquosa a ácidos nucleicos (Lauretti et al. 2003).
acoplado a três aminas formam o cristal violeta, uma molécula química
simples (Nunez et al. 2019). O corante também é utilizado como
desinfetante externo da pele em humanos e como intensificador de
impressões digitais, uma vez que as proteínas são compostas por diversas
combinações de aminoácidos que são facilmente coradas por esse corante
(Mani e Bharagava 2016). Violeta cristal é um corante de DNA que pode
ser usado para detectar ácidos nucléicos em eletroforese em gel.
Normalmente, este corante tem sensibilidade para até 16 ng de DNA e se
um contra-corante como o laranja de metila for usado, ele pode ser
melhorado para 8 ng (Mittal et al. 2010).

4,6ÿdiamidinoÿ2ÿfenilindol
Azul de metileno
4,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) é um corante azul fuorescente de DNA
O azul de metileno, também conhecido como azul suíço ou cloreto de
que mostra um aumento de cerca de 20 vezes após a ligação às regiões
metiltionínio, é um corante básico usado principalmente para coloração
adenina-timina do DNA de fita dupla (ds DNA) (Bourzac et al. 2003). Devido
laboratorial de componentes celulares com carga negativa. Conhecido
à sua alta afinidade pelo DNA, esse corante é frequentemente usado para
como um corante bacteriológico importante, o azul de metileno em contacto
enumerar células, avaliar apoptose, classificar células com base no
com álcool ou água resulta numa coloração azul profunda e é, portanto,
conteúdo de DNA e como ferramenta de segmentação nuclear na análise
utilizado como indicador (Wainwright e Crossley 2002). Derivados de azul
de imagens de alto conteúdo (Estandarte et al. 2016 ). Demonstrou-se que
de metileno podem ser usados para clivar a estrutura do DNA em locais
ácidos desoxirribonucleicos de cadeia dupla naturais e numerosos
específicos, ligando-se como um ligante carregado positivamente ao DNA
análogos sintéticos de conteúdo e sequência de bases variados formam
polianiônico (Cwalinski et al. 2020). A nível molecular, este corante afeta
complexos fuorescentes com DAPI. Como os aglomerados AT e AU têm
criando alterações na via cíclica do monofosfato de guanosina (cGMP),
seletividade de fluorescência, este corante é útil em uma variedade de
causando inibição da enzima guanilato ciclase. Este corante é capaz de
investigações citoquímicas, incluindo pesquisas de bandas cromossômicas.
se empilhar com os pares de bases do DNA e também pode se acomodar
Como pode passar através de uma membrana celular intacta, pode ser
entre as ranhuras do DNA (Rohs e Sklenar 2001).
usado para corar células vivas e fixas; no entanto, ele viaja através da
membrana com menos facilidade nas células vivas e, portanto, serve
como um sinal para a viabilidade da membrana (Estandarte et al. 2016).
Mostra fuorescência violeta em 405 nm. Este corante é usado para Coomassie azul brilhante
diversas aplicações, como teste de DNA em solução, diagnóstico de
infecção por micoplasma em cultura celular, medição de concentração
O azul brilhante Coomassie pertence à categoria de corantes não azo e
nuclear e classificação de cromossomos em citometria de fluxo (Estandarte
foi criado com a intenção de ser utilizado como corante ácido para lã.
et al. 2016). Também é usado em métodos de imunofuorescência e
É um composto difenil-metilado dissulfonado que pode interagir com ácidos
hibridização in situ, detecção de núcleos e DNA organelar. Em géis de
nucleicos criando ligações fracas com porções hidrofóbicas e aromáticas
agarose, o brometo de etídio está sendo substituído por esse corante à
de DNA ou RNA e para mostrar esta ligação o ensaio de Bradford foi
medida que sua fluorescência aumenta quando ele se liga ao DNA ds,
realizado utilizando DNA genômico de salmão, bovino, camarão e kiwi
tornando-o mais sensível que o brometo de etídio (Bourzac et al. 2003).
fruta. Assim, os resultados mostram rendimentos de cor de DNA puro de
0,0017 mgÿ1 cmÿ1 (Wenrich et al.
2012). No entanto, atualmente é usado principalmente como um reagente
importante na química de proteínas e para análise de impressão digital
Violeta cristal
pelo ensaio de Bradford, pois tem como alvo os aminoácidos contendo
grupos aromáticos e cadeias laterais básicas (Jadeja et al. 2014).
O corante catiônico cristal violeta, comumente conhecido como violeta de
genciana (forma impura), possui em cada anel fenil a presença de um
único grupo dimetilamino. É um composto trifenilmetano que se liga ao ds
DNA e também é usado como corante histoquímico. Também é utilizado Toxicidade e impactos negativos dos corantes de DNA
como agente mutagênico e como agente para impedir o crescimento de
bactérias em soluções médicas, bem como ingrediente antimicrobiano na Embora os corantes de ácido nucleico sejam comumente usados em
ração de galinhas para inibir o crescimento de fungos (Mittal et al. 2010). laboratórios, sua natureza perigosa exige um descarte cuidadoso. A
O cristal violeta mostra um modo de associação não intercalado e também descarga não monitorizada destes corantes nos efuentes pode ter efeitos
prefere o DNA ao RNA. Três anéis de benzeno ligados a longo prazo na saúde e no ambiente, conforme mencionado abaixo.

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Toxicidade ambiental
A poluição da água é o mais perigoso dos vários tipos de poluição
ambiental, sendo os efuentes de instalações comerciais à base de
corantes a principal causa de contaminação. Esses contaminantes são
resistentes ao tratamento padrão.
técnicas de desenvolvimento e, portanto, permanecem por mais tempo na
natureza (Upadhyay 2002). O cristal violeta, comumente usado em
estudos de ácidos nucléicos, dura muito tempo na natureza e é prejudicial
aos organismos aquáticos e terrestres. De acordo com estudos in vitro,
funciona como uma toxina mitótica, um poderoso agente causador de
câncer, um potente clastogênio e estimula a formação de tumores em
diversas espécies aquáticas (Mani e Bharagava 2016). O cristal violeta
tem um impacto substancial na atividade fotossintética das plantas
aquáticas devido à penetração limitada da luz solar e também pode ser
prejudicial a outras espécies aquáticas (Gill et al. 2002; Roy Chowdhary
et al.
2010). Diminui o teor de oxigênio dissolvido na água e limita a germinação
das sementes e o crescimento das plantas em solo agrícola. Parshetti et
al. (2011) descobriram que o corante cristal violeta não degradado inibiu
50, 70, 100 e 60% da germinação de sementes em Sorghum bicolor,
Vigna radiata, Lens culinaris e Triticum aestivum, respectivamente, bem
como foi relatada redução significativa do comprimento da parte aérea e
da raiz. Além disso, quando o cristal violeta é liberado na atmosfera a
uma pressão de vapor de 1,0× 10ÿ13 mm Hg e uma temperatura de 25
°C, ele reside na fase particulada (Ajao et al. 2011).
Da mesma forma, a descarga não monitorizada de corante azul de
metileno e brometo de etídio nos cursos de água causa sérios danos ao
ambiente circundante, aumentando a procura química de oxigénio da
água (Moradi et al. 2014; Singh e Singh 2018). O azul de metileno tem
uma taxa de degradação comparativamente mais baixa do que a maioria
dos outros corantes utilizados em laboratório, o que o torna persistente e
tóxico para o mundo aquático e a fauna (Zhu et al. 2018). A água contendo
corante azul de metileno, quando misturada no ecossistema, resulta na
redução da penetração da luz e, portanto, diminui a atividade fotossintética
das plantas aquáticas (Utsev et al. 2020). Da mesma forma, os resíduos
de brometo de etídio podem penetrar em cursos de água subterrâneos
que são utilizados para irrigação, lavagem ou até mesmo para beber. A
contaminação da água potável por elementos não radioativos como o
brometo de etídio tornou-se
uma das questões mais importantes no ambiente aquático, especialmente
nas regiões urbanas (Singh e Singh 2018).
Toxicidade no corpo humano
Os corantes de ácido nucleico são potencialmente tóxicos para os seres
humanos, produzindo irritação grave no trato digestivo, náuseas, vômitos,
inflamação da pele, danos renais e hepáticos, todos possíveis efeitos
colaterais. Diz-se que o corante violeta cristal produz leve irritação nos
olhos e sensibilidade desconfortável à luz, bem como danos permanentes
à córnea e à conjuntiva.
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Se absorvido em quantidades perigosas através da pele, é muito venenoso
para as células dos mamíferos e pode induzir irritação no sistema digestivo
e inflamação da pele. Severamente, esse corante pode potencialmente
levar à insuficiência respiratória e renal (Mani e Bharagava 2016). Da
mesma forma, o azul de metileno pode causar anomalias graves nos
sistemas reprodutivos, fígado, rins e sistema nervoso central. Os primeiros
sintomas incluem náuseas, distúrbios do trato gastrointestinal, irritação
nos olhos, confusão e náuseas (Utsev et al. 2020).
A inalação acidental do corante azul brilhante coomassie pode causar
irritação na pele e nos olhos, falta de ar, vômitos e diarréia (Daneshvar et
al. 2007). Além disso, foi relatado que esses corantes têm efeitos
citotóxicos, mutagênicos e carcinogênicos, que serão discutidos abaixo.
Toxicidade citogênica
Borah et al. (2018) relataram efeito citotóxico do corante laranja de
acridina em Oryza sativa L. e Allium cepa L. Eles mencionaram maior
frequência de anormalidade mitótica como fragmentação cromossômica,
desintegração nuclear, cromossomo atrasado, divergência cromossômica
e distorção do pólo na anáfase, induzida pela laranja de acridina (Borah
et al. 2018).
A toxicidade citogenética do cristal violeta em células de óvulos de hamster
chinês foi testada e descobriu-se que culturas tratadas ou com dosagem
mais alta (10 g/mL) por mais tempo (8 h) tiveram um acúmulo significativo
de metáfases aberrantes (Mani e Bharagava 2016 ). Como resultado,
poderia ser uma toxina mitótica.
Este corante induz danos citogenéticos graves em linhagens celulares
cultivadas, de acordo com estes achados (veneno mitótico e também
clastogênio). No tecido de granulação de coelho, observou-se que o cristal
violeta produz uma diminuição na síntese de RNA e proteínas, bem como
uma diminuição no consumo de oxigênio (Mani e Bharagava 2016). A 50
g/mL, o DAPI é citogênico (causa dano cromossômico) aos leucócitos
humanos, o que é comparativamente maior que o dano produzido por
manchas como brometo de etídio e azul de metileno (Bourzac et al. 2003).
Okamoto et al. (2010) examinaram os efeitos nocivos a longo prazo do
azul brilhante de coomassie adicionado ao meio de cultura
em Drosophila melanogaster. Embora este estudo comprove a baixa
toxicidade do azul brilhante de coomassie quando empregado em baixas
quantidades, D. melanogaster mostrou algumas alterações após um longo
período de exposição. Após dez gerações, o tempo entre a pré-cópula e
a cópula foi maior no grupo experimental do que no grupo controle. Os
resultados mostram que o azul brilhante de coomassie apresenta baixa
toxicidade em exposição única ou contínua (Okamoto et al. 2010). Em
outro estudo, a produtividade de D. melanogaster foi avaliada durante um
período de 15 dias para investigar o efeito da exposição ao brometo de
etídio. Os grupos que foram expostos a 1 e 5 µM de brometo de etídio
exibiram um perfil diversificado, principalmente tergitos e as asas foram
afetadas pelas mudanças nos padrões morfológicos normais. Outras
anormalidades,
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incluindo a ausência de uma pata e alteração da coloração do corpo,
também foram descobertos. Devido às suas qualidades citotóxicas, o
corante pode causar efeitos tóxicos em D. melanogaster em termos de
eficiência, parâmetros estruturais e metabólicos, mesmo em baixas
concentrações (Ouchi et al. 2007).
Outro estudo foi realizado para analisar se o brometo de etídio mata
os tripanossomas agindo no DNA do cinetoplasto (kDNA) e, em caso
afirmativo, qual mecanismo ele usa para matá-los.
A maneira mais eficaz do corante matar os tripanossomas é impedi-los de
iniciar a replicação livre do minicírculo. A terapia com brometo de etídio
teve um efeito colateral inesperado de causar super torção profunda de
minicírculos livres. Embora o corante parecesse funcionar amplamente no
kDNA em testes de citotoxicidade, sugeriu alguma influência na replicação
do DNA nuclear. Em concentrações baixas (0,02 g/mL de brometo de
etídio), o efeito foi menor, mas em concentrações mais altas (2 g/mL de
brometo de etídio), a inibição da replicação nuclear torna-se considerável
(Roy Chowdhury et al. 2010). Assim, este estudo indica o efeito prejudicial
dos corantes de DNA no funcionamento e na toxicidade celular.
Toxicidade crônica e carcinogenicidade
Alguns dos corantes de ácido nucleico podem atuar como um potencial
carcinógeno. Para avaliar a toxicidade crônica e a propriedade
carcinogênica do cristal violeta, foi realizado um estudo no qual foi
realizada uma pesquisa de dosagem ao longo da vida em 720 machos e
fêmeas de camundongos B6C3F1 (C57BL/6 C3H) em concentrações de
dose de 0, 100, 300 e 600 ppm após 12, 18 e 24 meses de dosagem
contínua. Não houve efeito no consumo alimentar ou no peso; no entanto,
houve um efeito da dosagem nas taxas de mortalidade, sendo 64 e 23%
maior em mulheres e homens que receberam doses altas, respectivamente.
Nenhum efeito foi observado em termos de carcinogenicidade (Mani e
Bharagava 2016). Foi demonstrado que os corantes de acridina causam
efeitos cancerígenos em bactérias, levantando preocupações quanto à
segurança dos corantes nas pessoas. A segurança da laranja de acridina
foi demonstrada anteriormente em várias investigações em humanos. No
entanto, Byvaltsev et al. (2019) publicaram os resultados de um ensaio
piloto incluindo oito pacientes com neoplasias malignas avançadas que
foram tratados com administração intravenosa de corante de acridina a
0,5 ou 1 mg/kg e menor dose de radiação. Os resultados desta
investigação não apoiaram crenças anteriores sobre a toxicidade do
corante. Ainda faltam evidências sólidas sobre a segurança a longo prazo
e o potencial cancerígeno da laranja de acridina (Byvaltsev et al. 2019).
Mutagenicidade
Já foi relatado que o brometo de etídio previne a replicação em uma
variedade de organismos, interferindo no DNA.
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e síntese de RNA, além de causar mutações de frameshift em bactérias.
Acredita-se que esses efeitos sejam causados pela presença de produtos
metabólicos ou fotoativados covalentemente ligados da molécula do
corante parental no DNA genômico, que poderiam intercalar e causar
erros de replicação (Singer et al. 1999). A mutagenicidade do brometo
de etídio foi verificada usando ensaios de mutação reversa de Salmonella/
microssomas de mamíferos (teste de Ames). O método de exposição por
incorporação em placa foi utilizado para o ensaio de Ames usando cepas
testadoras de Salmonella typhimurium . Somente na presença de extratos
de fígado de rato, o brometo de etídio revelou grandes frequências
revertentes em numerosas cepas indicadoras de frameshift, em média 68
vezes maiores que os controles do veículo em TA98, 80 vezes maiores
em TA1538, 15 vezes maiores em TA1537 e 4,4 vezes maior em TA97a
(Singer et al. 1999).
A mutagenicidade do cristal violeta no teste de microssoma de
mamíferos de Salmonella typh-imurium foi investigada usando duas cepas
de teste, TA97 e TA104 e duas cepas de células de ovário de hamster
chinês (CHO), CHO-K1-BH4 e CHO-AS52 (Aidoo et al. 1990 ). Os
resultados mostram que o cristal violeta é um mutagênico no experimento
de reversão de S. typhimurium , porém apenas nas cepas TA97 e, em
menor grau, na cepa TA104 exibem respostas robustas.
Em duas cepas de células CHO, a mutagenicidade do corante foi muito
mais difícil de demonstrar do que em Salmonella.
Nas células CHO-K 1-BH4, não causou mutações no gene da hipoxantina-
guanina fosforibosil transferase (hprt). Apenas em doses elevadas as
células AS52 mostraram um aumento na frequência de mutação. As
descobertas mostram que o cristal violeta é um mutagênico pontual em
bactérias; no entanto, os mesmos níveis de exposição mostraram
actividade mutagénica modesta em células de mamíferos, sugerindo que
o corante poderia ser cancerígeno devido à sua actividade clastogénica
(Aidoo et al. 1990).
Estratégias para degradação de corantes de
DNA e remediação de efluentes laboratoriais
contaminados
Os corantes de ácido nucleico são potencialmente tóxicos e são
considerados um grave perigo ambiental. As águas residuais
contaminadas com corante devem ser processadas adequadamente
antes de serem descartadas. Existem alguns métodos convencionais para
remoção de corantes de águas residuais, a saber, osmose reversa,
nanofiltração ou ultrafiltração, coagulação ou floculação; entretanto, a
biorremediação de efluentes contaminados com corantes usando
micróbios e plantas é uma abordagem atraente e ecologicamente correta.
Além disso, técnicas como fotocatálise, ozonólise e nanotecnologia são
algumas outras abordagens nesse sentido. Diferentes estratégias para
degradação de corantes de DNA (Fig. 2) e relatórios recentes sobre as
mesmas foram resumidos abaixo.
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Folia Microbiológica (2022) 67:555–571
Fig. 2 Abordagens ecológicas para
remediação de efluentes de laboratório
contaminados com corantes
Degradação microbiana
Os métodos microbianos de remediação são considerados
eficaz e ambientalmente seguro (George et al. 2021).
Microrganismos isolados de vários ambientes estão sendo explorados por
suas excelentes habilidades na realização de biorremediação de metais
pesados e compostos tóxicos, a saber, corantes azo e dicloroanilina (Qing
et al. 2007). A biodegradação de corantes de DNA também pode ser
alcançada por vários microrganismos (Tabela 1). A biodegradação destes
corantes geralmente ocorre através de três etapas: pequenas alterações
estruturais na molécula orgânica, fragmentação da molécula orgânica
complexa e depois mineralização completa. Isto é conseguido pela
secreção de enzimas extracelulares, a saber, lacase, aminopirina Af-
desmetilase (Parshetti et al. 2011) e peroxidação de lignina (Alam et al.
2009). Na maioria das vezes a mineralização completa não é alcançada e
são formados produtos intermediários que são mais tóxicos que o
composto original. Portanto, a exploração de micróbios capazes de realizar
mineralização completa é o campo onde a pesquisa precisa ser focada.
Agrobacterium radiobacter MTCC 8161 é um exemplo de bactéria que
pode realizar a descoloração completa do cristal violeta em 8 horas (10
mg/L) em condições anóxicas estáticas (Parshetti et al. 2011). Embora
atividades celulares como replicação, transcrição e alterações estruturais
nesses micróbios também possam ser inibidas por meio desses corantes,
ainda assim os pesquisadores isolaram micróbios que podem tolerar esses
corantes e realizar a degradação (Patil e Berde 2015).
561
Bactérias
Alguns micróbios como Bacillus thuringiensis, Neisseria sub-fava,
Neisseria canis, Pseudomonas putida, Neisseria maca-cae, Pseudomonas
chlororaphis e Aeromonas hydrophila
isolados de locais poluídos com brometo de etídio foram relatados por sua
capacidade de degradar o brometo de etídio (Sukhumungoon et al. 2013;
Patil e Berde 2015). Estes microrganismos apresentaram resultados
apreciáveis quando cultivados em placa de ágar suplementada com
brometo de etídio. O crescimento das bactérias permaneceu inalterado na
presença de brometo de etídio, mostrando a sua resistência ao corante.
Para avaliar a tolerância e degradação do brometo de etídio, foi realizado
um experimento de cromatografia em camada delgada (TLC) utilizando
sobrenadante livre de células com brometo de etídio (30 µg/mL). O
esgotamento do corante foi monitorado qualitativamente para demonstrar
claramente a degradação por 3 espécies bacterianas (Bacillus thuringiensis,
Neisseria canis e Neisseria subfava), das quais o sobrenadante livre de
células de Bacillus thuringiensis não mostrou fluorescência (que é uma
propriedade de degradação). Seu potencial na degradação do corante,
enquanto outros isolados como Neisseria canis e Neisseria subfava
mostraram degradação lenta em experimentos baseados em TLC
(Sukhumungoon et al.
2013). Além disso, Sukhumungoon et al. (2013) mencionaram que a
cultura de 18 horas de B. thuringiensis PSU9 e grupos controle foram
colocadas em sílica gel TLC e a degradação do brometo de etídio foi
monitorada usando luz UV. Os resultados indicaram que na presença de
PSU9, a maior parte do brometo de etídio desapareceu, mas o controle
abiótico exibiu claramente uma quantidade substancial de brometo de
etídio (Sukhumungoon
13
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562 Folia Microbiológica (2022) 67:555–571

Tabela 1 Lista de microrganismos com Referências

Sl sem corante Microrganismos
capacidade de degradar corantes
envolvidos em estudos de ácidos nucleicos 1 Brometo de etídio Aeromonas hidrofila Patil e Berde (2015)
2 Neisseria macacae Patil e Berde (2015)
3 Neisseria canis Patil e Berde (2015)
4 Neisseria subfava Patil e Berde (2015)
5 Pseudomonas putida Patil e Berde (2015)
6 Pseudomonas clororaphis Patil e Berde (2015)
7 Bacillus thuringiensis Sukhumungoon et al. (2013)
8 Clorela vulgar de Almeida e cols. (2020)
9 Desmodesmo subspicatus de Almeida e cols. (2020)
10 Raphidocelis subcapitata de Almeida e cols. (2020)
11 Coomassie azul brilhante Aspergillus spp. Jadeja et al. (2014)
12 Rhodococcus spp. Tokiran et al. (2016)
13 Laranja de acridina Arthrobacter globiformis Itoh et al. (1998)
14 Azul de metileno Pleurotus eryngii Maas et al. (2018)
15 Pleurotus ostreatus Maas et al. (2018)
16 Galactomyces geotrichum Contreras et al. (2019)
17 Pseudomonas aeruginosa Eslami et al. (2017)
18 Alcaligenes faecalis Bharti et al. (2019)
19 Acinetobacter pittii Ogunlaja et al. (2020)
20 Ralstonia eutropha Habibi e Mehrabi (2017)
21 Bacillus cereus Maria et al. (2020)
22 Cristal violeta Enterobacter sp. Roy et al. (2018)
23 Agrobacterium radiobacter Parshetti et al. (2011)
24 Bacillus subtilis Ayed et al. (2009), Shah et al. (2013)
25 Phanerochaete chrysosporium Bumpus e Brock (1988)
26 Nocardia corallina Yatome et al. (1993)
27 Burkholderia vietnamiensis Gan et al. (2014)
28 Pseudomonas putida Chen et al. (2007)
29 Fusarium solani AI-Jawhari (2015)
30 Penicillium funiculosum AI-Jawhari (2015)
31 Aspergillus spp. AI-Jawhari (2015)
32 Pleurotus ostreatus Yan et al. (2009)
33 Rhizopus stolonifer AI-Jawhari (2015)
34 Aeromonas hidrofila Bharagava et al. (2018), Pan et al. (2013)
35 Trichoderma asperellum Shanmugam et al. (2017)
36 Pleurotus ostreatus Kunjadia et al. (2012)

e outros. 2013). Em outro estudo, Kumar et al. (2017a) relataram
degradação do brometo de etídio por isolados coletados de amostras
de água contaminada com corante. Os estudos de crescimento e
degradação dessas bactérias foram feitos utilizando ágar nutriente
suplementado com brometo de etídio (30 µg/mL) e o isolado BR3
mostra uma zona não fluorescente sob UV trans, o que indicou sua
degradação do corante pelo micróbio.
Pseudomonas aeruginosa é uma das bactérias dominantes
utilizadas para a biodegradação do corante azul de metileno,
comumente utilizado em análises relacionadas ao DNA. Em um estudo
feito por Eslami e colaboradores em 2017, foi analisada a eficiência
de P. aerugi-nosa na degradação do corante azul de metileno.
Eles observaram que com um aumento no azul de metileno
concentração de 50 para 200 mg/L, a eficácia de depuração das
bactérias aumentou de 82,25 para 97,82%.
Entretanto, quando a concentração do corante foi aumentada de 200
para 1.000 mg/L, a eficiência de remoção foi reduzida para 43,08%.
Os dados mostraram que as bactérias usavam azul de metileno como
fonte adicional de carbono na presença de glicose. Assim, P. aeruginosa
parece ser uma escolha adequada para a remoção do azul de
metileno do meio ambiente. A degradação do azul de metileno por
algumas outras bactérias também foi relatada em alguns estudos
anteriores, incluindo espécies como Alcaligenes faecalis, Acinetobacter
pit-tii, Ralstonia eutropha e Bacillus cereus (Bharti et al.
2019; Ogunlaja et al. 2020; Habibi e Mehrabi 2017 e

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Maria et al. 2020). Em um dos estudos, Mary et al. (2020) confirmaram a
degradação biológica do corante azul de metileno por Bacillus cereus
WGB1, usando espectroscopia UV-visível e espectro FTIR. Devido à
conversão completa em compostos minerais não tóxicos, esta técnica de
biodegradação proporcionou benefícios tecnológicos sobre o mecanismo
de biossorção (Mary et al. 2020). Há muito poucos estudos relatados
sobre a degradação bacteriana do corante laranja de acridina altamente
tóxico. Itoh et al. (1998) mencionaram em seu relatório de pesquisa sobre
a biodegradação da laranja de acridina por Arthrobacter globiformis IFO
12.137 e a via de degradação que envolveu N-desmetilação. Eles também
mencionaram alterações espectrais deste corante em meio contendo o
corante. A cultura foi incubada em agitação a 30 ° C e extraída com 1-
butanol e os espectros foram medidos na região visível. A detecção dos
produtos foi feita sob luz UV e analisada por espectrometria MS, HPLC e
TLC. A presença da mancha incolor na TLC deu a confirmação sobre a
degradação microbiana do esqueleto da acridina (Itoh et al. 1998).
Doze cepas de Rhodococcus foram relatadas para descoloração do
azul brilhante de Coomassie. Não foi observado crescimento dessas
cepas nos primeiros 14 dias de incubação em meio contendo azul
brilhante de coomassie, após isso foi observada a formação de zona
clara que indicava sua resistência.
tendência em direção ao azul brilhante coomassie. De todas as cepas
testadas, os melhores resultados foram apresentados pela cepa
Rhodococcus UCC 0009 ao formar o maior diâmetro de 7,6±0,1 cm
(Tokiran et al. 2016).
Parshetti et al. (2011) relataram o uso de Agrobacterium radiobacter
MTCC 8161 para degradação completa do corante cristal violeta em
condições anóxicas estáticas. Seu estudo sugere a formação de cinco
intermediários, a saber, N,N,N,N- tetrametilpararosanilina, [N,N-
dimetilaminofenil]
[N-metilaminofenil] benzofenona, 4-metil aminofenol, N,N-
dimetilaminobenzaldeído e fenol (Parshetti et al. 2011). Ayed e
colaboradores isolaram Bacil-lus sp., do efuente da estação de tratamento
de uma indústria têxtil e de tinturaria da Tunísia e descoloraram 500 ppm
de cristal violeta em 2,5 horas a 30 °C, pH 7 sob agitação (Ayed et al.
.2009 ). Em outro estudo, Gan e colaboradores isolaram uma nova cepa
chamada Burkholderia vietnami-ensis C09V do lodo ativado e usaram
esse microrganismo para a biodegradação do corante violeta cristal (Gan
et al. 2014). Existem mais algumas bactérias que são capazes de
degradar o cristal violeta, a saber, Enterobacter sp., Phan-erochaete
chrysosporium, Nocardia corallina, Pseudomonas putida, Aeromonas
hydrophila, Trichoderma asperellum e Pleurotus ostreatus (Kunjadia et
al. 2012; Pan et al. 2013; Shanmugam e outros 2017; Bharagava e outros
2018). Além disso, com base na nossa pesquisa até o momento, não há
relatos relativos à biodegradação do corante DAPI e é uma área que
busca intervenção de pesquisa.
563
Assim, a exploração de novas cepas bacterianas com capacidade de
degradar esses corantes tóxicos pode ser altamente promissora para a
remediação de efuentes laboratoriais contaminados. Menos se sabe sobre
os intermediários formados durante a degradação e seus possíveis
perigos. Assim, a análise aprofundada dos produtos de degradação e o
uso de culturas mistas que trazem mineralização completa podem
melhorar a aplicabilidade de tais técnicas.
Fungos
Além das bactérias, várias espécies de fungos como Aspergil-lus spp. e
Pleurotus spp. já foram relatados para a biodegradação de corantes de
DNA perigosos. Cepas de Pleu-rotus sp. (Pleurotus eryngii e Pleurotus
ostreatus) apresentam maior potencial de recuperação de ambiente
contaminado por produzirem grande quantidade de massa micelial. Esta
massa é considerada um bom biossorvente devido à sua composição de
parede celular e diferentes mecanismos para apresentar resistência aos
estresses ambientais (Kresinová et al. 2018).
Maas et al. (2018) analisaram a aplicabilidade de Pleurotus sp. para
degradação do corante azul de metileno. A análise da biomassa fúngica
revelou que cepas de Pleurotus sp. foram capazes de crescer em diversas
concentrações de azul de metileno sob condições atípicas. Após o
término do período de incubação, foram observadas reduções significativas
nos valores de absorbância.
A descoloração do meio PDA suplementado com corante azul de
metileno foi alcançada com cerca de 80% de redução na absorção (Maas
et al. 2018). Uma cepa de levedura, Galactomyces geotrichum KL20A,
foi usada para remover o corante azul de metileno em várias
concentrações, a saber, 50, 100 e 200 ppm. A concentração inicial foi de
3,2×107 células/mL para um tempo de reação de 48 horas a 25, 30 e 35
°C. Os resultados indicaram um efeito positivo na remoção do corante e
na concentração de 50 ppm e temperatura de 35 °C, foi observada a
maior remoção de 76,6%. O estudo cinético produziu uma constante de
taxa de 2,2× 10ÿ2 hÿ1 e meio tempo de 31,2 h para biotransformação
(Contreras et al. 2019). Aspergillus sp. foi estudado para degradação do
corante azul brilhante coomassie. Em um dos estudos, quando este fungo
foi inoculado no meio contendo 0,1% (P/V) de corante azul brilhante
coomassie, apresentou descoloração que foi confirmada pela primeira
mudança de cor (de azul para amarelo) e depois desaparecimento da cor
em as placas de Petri (Jadeja et al. 2014). O mecanismo básico de
descoloração é a adsorção dos corantes na superfície das células
microbianas. A adsorção de corantes pelo micélio fúngico também foi
observada no estudo de Aditee et al. (2014), e obtiveram a confirmação
pela mudança na cor do micélio fúngico em corantes testados como o
azul brilhante de Coomassie. Cepas de fungos como Aspergillus geram
enzimas extracelulares como a lacase. O estudo relatado revelou a
descoloração e também a degradação do corante testado por Aspergillus
spp. parecia ser para o extracelular
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564
produção de enzimas por este fungo no meio contendo corante. Eles
ficaram claros que a mudança de cor poderia ser devida às reações
bioquímicas (metabólicas) da cepa fúngica (Aditee et al. 2014).
A degradação biológica do cristal violeta com a ajuda de fungos
também foi relatada anteriormente por muitos autores. AI-Jawhari (2015)
avaliou cinco fungos (Penicillium funiculo-sum, Fusarium solani,
Aspergillus niger, Aspergillus fumi-gates e Rhizopus stolonifer) em seu
estudo e todos foram pouco capazes de descolorir o cristal violeta. Além
disso, mencionaram que os resultados podem ser devidos à toxicidade
para as células microbianas em crescimento e que, ao mesmo tempo, o
cristal violeta foi fracamente metabolizado pelos microrganismos e,
consequentemente, tem vida longa numa variedade de ambientes (AI-
Jawhari 2015 ).
Embora a micorremediação seja de fato uma estratégia promissora
para a biodegradação desses corantes de DNA, ainda há poucos relatos.
A inibição de cepas de fungos devido a corantes tóxicos pode ser uma
razão para o mesmo e as técnicas de engenharia genética podem ser
úteis na resolução dessas preocupações.
Algas
Muito poucas espécies de algas foram ainda relatadas para degradação
de corantes de DNA. Algumas das espécies de microalgas, como
Raphidocelis subcapitata, Desmodesmus subspicatus e Chlorella vulgaris,
foram pesquisadas por suas capacidades de degradação do brometo de
etídio (de Almeida et al. 2020).
Cada uma dessas espécies foi cultivada e bem mantida em incubadora
sob parâmetros controlados (temperatura e fotoperíodo). A remoção do
brometo de etídio de todas as três espécies de algas e da mistura
(contendo todas as espécies na proporção de 1:1:1) foi avaliada e todas
as espécies mostraram a capacidade de degradar o brometo de etídio. D.
subspicatus apresentou melhores resultados após 1 h de exposição ao
brometo de etídio; portanto, pode ser usado por períodos de tratamento
mais longos, enquanto C. vulgaris pode ser usado para tratamento por
um período mais curto. Mesmo com grande potencial no tratamento de
águas residuais, o cultivo e aplicação de microalgas não são muito viáveis.
As águas residuais contaminadas podem afectar a reprodutibilidade
das microalgas e a contaminação bacteriana pode dificultar o seu
crescimento. Portanto, mais pesquisas são necessárias para desenvolver
um sistema eficaz de cultivo de microalgas, que possa ser aplicável para
degradação de corantes e remediação de águas residuais.
Fitorremediação
A fitorremediação é uma estratégia de desintoxicação in situ
ecologicamente correta, útil na extração e degradação de contaminantes
(Bharathiraja et al. 2018). Amirijavid et al. (2014) examinaram o uso de
plantas de alfafa e tomate na degradação do brometo de etídio. Estas
plantas apresentaram resultados tremendos quando inoculadas com
brometo de etídio em diferentes
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concentrações, ou seja, 4,4, 42, 64, 113 e 154 mg/mL. No entanto,
quando colhidas após o décimo e décimo sétimo dia, foram observadas
diversas alterações morfológicas nestas plantas em termos de cor,
comprimento do caule e raiz, número de pêlos radiculares e folhas
danificadas. Os resultados mostraram que até o dia 10 as raízes das
plantas de alfafa continuaram crescendo, depois disso o crescimento das
plantas parou e também foi observada diminuição no comprimento das raízes.
Padrões de crescimento semelhantes foram observados em plantas de tomateiro e
as folhas apresentaram amarelecimento após o 10º dia em todas as concentrações.
Eles sugeriram que as plantas absorvessem e concentrassem os corantes
remediados em diferentes partes da planta, especificamente nas raízes.
Algumas plantas aquáticas como Lemna minor e Azolla pinnata são
capazes de degradar o corante azul de metileno. Na concentração inicial
de 25 mg/L, 90% da eficiência máxima de degradação do corante azul de
metileno foi alcançada por A. pinnata por 5 dias.
A lentilha-d'água (L. minor) também apresentou remoção significativa do
azul de metileno com diminuição da absorbância de 3,27±0,08
para 0,64±0,02 Å em 24 horas. Além disso, o aumento do tempo de
exposição levou a um aumento da descoloração (Imron et al. 2019). Mais
pesquisas sobre a fitorremediação desses corantes são necessárias para
melhor compreensão do mecanismo envolvido e para melhorar a
eficiência da remediação.
Degradação fotocatalítica
A degradação fotocatalítica é uma forma muito eficaz para o tratamento de corantes. É
um processo obtido como resultado da interação entre o fotocatalisador e a luz irradiada
que fornece um radical excessivamente reativo que pode ser Oÿ
2, H2O2, OHÿ, O2, HO2 e HOÿ que reage com 2
composto reagente e provocar sua degradação (Sudhaik et al. 2018;
Sharma et al. 2019). A fotocatálise tem se mostrado de grande interesse
devido à sua eficácia na degradação de compostos orgânicos
recalcitrantes. Nesse sentido, os fotocatalisadores semicondutores
proporcionam ótimos resultados sob irradiação ultravioleta a baixo custo.
O TiO2 tem recebido grande importância entre esses semicondutores
devido à sua durabilidade, natureza econômica, baixo nível de toxicidade
e superhidrofilia (Nosaka et al. 2003; Jaÿczyk et al. 2006). A desvantagem
da fotocatálise do TiO2 é a rápida recombinação do elétron fotogerado
que leva à redução da eficiência fotocatalítica. Portanto, para superar
esses obstáculos, foram empregados trabalhos recentes sobre
imobilização e estabilização de TiO2 como filmes finos (Wang et al. 2019).
El-Ella et al. (2020) propuseram a degradação fotocatalítica do
brometo de etídio utilizando TiO2 depositado com Au. Foi notado que ele
ajusta as propriedades eletrônicas do TiO2, o que resulta ainda em uma
utilização de espectro muito mais amplo da radiação solar e, por sua
vez, aumenta a fotocatálise do TiO2, levando à degradação completa da
solução de brometo de etídio dentro de 120 minutos de exposição. à luz
solar.
Da mesma forma, Swami e Pandit (2013) relataram degradação
fotocatalítica da laranja de acridina sob luz visível por
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utilizando TiO2. Eles relataram decomposição efetiva do corante na
concentração inicial de 3,8 × 10-5 mol/dm3 em pH 9. Sob luz UV, a
degradação fotocatalítica do cristal violeta foi relatada usando TiO2
dopado com íons de prata para torná-lo sedimentável. A irradiação
UV do corante na presença de TiO2 dopado com Ag e oxigênio
causou a degradação do corante em até 99% em 105 min e a
mineralização em até 85% (Sahoo et al. 2005).
A degradação fotocatalítica do azul brilhante de coomassie pode
ser alcançada tratando-o com H2O2, mineral argiloso, tungstato de
bismuto e por mecanismo híbrido de oxidação foto-Fenton
juntamente com absorção. Almeida e cols. (2016) relataram
degradação do azul brilhante de coomassie usando dióxido de
titânio incorporado em paligorsquita (mineral argiloso) usado como
fotocatalisador. A concentração de 1,0× 10ÿ4 mol/L de corante em
0,5 g/L de material fotoativo quando submetido à luz UV por um
período de 120 min causou a diminuição da concentração inicial do
corante para metade, o que confirmou sua degradação. Canteli et
al. (2015) também documentaram uma técnica usando foto-Fenton
combinada com processo de absorção para remoção ou degradação
eficiente do azul brilhante de coomassie (Canteli et al. 2015).
Chen et al. (2002) relataram que a degradação oxidativa
fotocatalítica do laranja de acridina sob condições de irradiação com
NSL (luz solar natural), ITL (lâmpada de iodo-tungstênio) e HPML
(lâmpada de mercúrio de alta pressão) foi investigada na presença
de M polimérico [meso-tetra ( 4,40-bifenibissulfona) fenil-porfirina]
(PMTBPBSOPP, M=Co, Mn, Cu, Zn, Fe).
Os resultados mostraram que o PCoTBPBSOPP teve efeito
significativo na fotodegradação da laranja de acridina irradiada com
NSL (Chen et al. 2002). Chen et al. (2009) demonstraram que o
processo Fen-ton parece ter a capacidade de descolorir totalmente
e mineralizar parcialmente o corante laranja de acridina em solução
aquosa em curto tempo de reação. Eles observaram efeito direto do
pH inicial na descoloração do laranja de acridina e, em pH 3,
obtiveram a melhor eficiência. Eficiência de descoloração melhorada
com o aumento das concentrações de H2O2 e Fe2+ a uma
concentração constante de laranja de acridina (0,2 mM). Mais de
95,8% da eficiência de descoloração foi alcançada em 10 minutos
de reação sob condições de reação específicas (Chen et al. 2009).
A degradação fotocatalítica do corante laranja de acridina também
foi tentada usando catalisadores, viz., ZnO (Pare et al.
2008), NaBiO3 (Lu et al. 2013), óxidos metálicos Al-Sr (Khan et al. 2019)
e BaCrO4 (Pare et al. 2008). Assim, o processo Fenton parece ter a
capacidade de descolorir completamente e mineralizar parcialmente os
corantes de DNA em solução aquosa num curto tempo de reação.
Outras estratégias
Nanopartículas (NP) têm sido recentemente utilizadas na degradação
redutiva de corantes tóxicos e prejudiciais porque possuem
propriedades físicas e químicas únicas que não podem ser
encontradas em materiais a granel (Jyoti e Singh 2016). Vários
565
nanopartículas como Ag (prata), Au (ouro), Zn (zinco) e sílica foram
sintetizadas a partir de fontes biológicas e estão sendo utilizadas
em diversos campos (Nandhini et al. 2019).
A fotocatálise acoplada a nanopartículas pode ser muito eficaz
no tratamento de efuentes de laboratório. Lavand e Malghe (2016)
investigaram a fotocatálise de luz visível de nanopartículas de TiO2
dopadas com carbono para degradação efetiva de brometo de
etídio e descobriram que a atividade de fotocatálise de
nanopartículas de TiO2 dopadas com C para degradação de
brometo de etídio é maior do que TiO2 em seu estado puro.
Eles descobriram que a co-dopagem com C-Fe é uma forma
produtiva de estreitar o intervalo de bandas do TiO2, o que aumenta
a fotocatálise na degradação do brometo de etídio. Em outro estudo,
nanoestruturas de tungstato de bismuto (Bi2WO6) , juntamente com
um iniciador H2O2 , foram consideradas uma forma eficaz de
degradação do azul brilhante coomas-sie do meio ambiente (Shad
et al. 2017).
Para extrair laranja de acridina da água, nanopartículas de CuS
foram sintetizadas por Siddique et al. (2018) e a eficiência
fotocatalítica foi estudada. Com a exposição à luz UV, não foi
observada degradação da laranja de acridina. Quando a
nanopartícula de CuS foi introduzida, a degradação sob luz UV
atingiu um nível elevado (45%) em 180 min. Na luz ambiente, o
efeito do H2O2 junto com as nanopartículas de CuS leva à
degradação de 100% em 3 h (Siddique et al. 2018). Em outro
estudo, Kumar et al. (2017b) produziu silicato de titânio poroso NP-Fe3O4
fotocatalisador híbrido que apresentou melhor fotodegradação do
corante azul de metileno quando exposto à luz UV. Da mesma
forma, fotocatalisadores magnéticos como nanopartículas de
Fe3O4@TiO2 e nanopartículas de Fe3O4@SiO2 foram usados para
degradação do corante azul de metileno. Fe3O4@SiO2 apresentou
eficiência de degradação de 97% sob irradiação solar enquanto
Fe3O4@TiO2 apresentou eficiência de degradação de 56% nas mesmas condiçõe
O desempenho fotocatalítico aprimorado de Fe3O4@SiO2
Os NPs podem ser atribuídos ao aumento da área superficial, ao
aumento da absorção óptica e à geração efetiva de excitons no
núcleo de Fe3O4 (Dagher et al. 2018). Assim, estratégias baseadas
em nanopartículas podem ser mais exploradas para aplicação na
remoção de corantes de efuentes de laboratório.
A ozonização é outro método amplamente utilizado para
remediação de águas residuais (Adelin et al. 2020). Foi relatado que
a ozonização degrada o corante azul de metileno em N- (4-nitro
fenil butanamida), que é então finalmente convertido em 1-nitro-
ciclohexano. Este composto final é comparativamente muito mais
seguro do que o próprio corante (Adelin et al. 2020). No entanto,
esta estratégia utiliza ozono com vida útil curta, que se decompõe
em 20 minutos – exigindo um fornecimento contínuo de ozono, cuja
realização é muito dispendiosa (Shah 2019). Outra estratégia que
pode ser utilizada para a degradação tanto do brometo de etídio
como do azul de metileno é a filtração em carvão que é realizada
com carvão ativado. Soluções aquosas de brometo de etídio são
filtradas em leito de carvão ativado para removê-lo dos efluentes.
Em um dos estudos, ativado
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O carvão obtido da jaca foi utilizado na remoção do corante azul de
metileno devido à sua excelente capacidade de adsorção.
A capacidade percentual de remoção deste carvão ativado aumentou
com o aumento do tempo de duração. Após cerca de 25 min, foi
observada remoção de 99% do corante azul de metileno da solução
aquosa (Nardekar e Kale 2017).
Limitações das estratégias de remediação e
perspectivas futuras
Várias estratégias de remediação foram investigadas e relatadas para
tratar efuentes de laboratório contendo corantes de ácidos nucleicos e
torná-los seguros. Entre todas, a degradação microbiana é uma
abordagem bastante promissora neste aspecto, uma vez que não
envolve a utilização de produtos químicos nocivos e também é rentável.
Além disso, a disponibilidade de micróbios é muito mais viável do que
arranjar moduladores físicos e químicos robustos (Singh e Arora 2011).
No entanto, há evidências que mostram que as atividades biológicas,
como replicação, transcrição e alterações estruturais em muitos
micróbios, foram inibidas por esses poluentes tóxicos (Tomchick e
Mandel 1964; Ames e McCann 1975). Assim, muito poucos micróbios
foram explorados para a degradação destes corantes e os estudos são
limitados principalmente ao uso de uma única cepa. Uma das principais
limitações da remediação baseada em micróbios são os produtos
intermediários formados durante a degradação, que são potencialmente
mais tóxicos do que o composto original (Patel et al. 2021). Portanto, mais
pesquisas devem ser focadas no desenvolvimento de processos baseados
em culturas mistas que possam trazer a mineralização completa desses
corantes. Além disso, estudos precisam ser realizados para avaliar a
toxicidade dos produtos de degradação devido à ação microbiana, antes
de qualquer aplicação comercial. A fitorremediação, que envolve o uso
de plantas para a remoção de compostos específicos, é outra abordagem
ecologicamente correta. Isto é altamente viável porque aqui são utilizadas
plantas naturais para remediação, o que preserva o meio ambiente sem
a introdução de mais produtos químicos. No entanto, a maior parte da
remediação baseada em plantas está limitada a estudos laboratoriais e a
execução comercial é rara. O custo da fitorremediação é altamente
variável e existe uma alta correlação entre o custo do fitotratamento, a
concentração de contaminantes, os tipos e propriedades do solo e da
água e as circunstâncias do local (Farraji et al. 2016). A fitormediação é
viável em locais onde há contaminantes superficiais e não pode ser
realizada em cantos mais profundos.
Além disso, requer investimento a longo prazo tanto de mão-de-obra
como de capital em massa no início. Estudos em locais reais de
contaminação de efluentes e investigações para abordagem combinatória
(planta-micróbio ou planta-planta) encontram mais caminhos de pesquisa
neste campo para o gerenciamento eficaz de contaminantes. Outra
limitação da fitorremediação é que as plantas geralmente removem os
poluentes absorvendo-os em si mesmas e também há necessidade de
destruí-los
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por meio de métodos químicos (Uera et al. 2007). A fotocatálise é outro
método amplamente estudado para degradação de corantes e a
facilidade de disponibilidade dos fotocatalisadores o torna um método
de degradação preferido. Através da fotocatálise, a degradação é
realizada em velocidade comparativamente alta, baixo custo e não gera
subprodutos policíclicos. A aplicação da fotocatálise requer que muitos
fatores técnicos sejam considerados. A degradação fotocatalítica
depende do pH, alterações de band gap, concentração de corante, tipo
de corante usado e outros fatores definidores específicos do corante
(Muhd et al. 2014). Portanto, a viabilidade técnica e econômica dos
métodos de tratamento precisa ser estudada criticamente para sua
aplicação bem-sucedida.
No entanto, utilizar microrganismos ou enzimas microbianas, ou
combiná-los com uma abordagem físico-química, produz um resultado
superior com maior viabilidade econômica. Os micróbios não só
garantem uma abordagem não tóxica, como também podem descolorir
até mesmo os corantes mais complicados.
Abordagens biotecnológicas avançadas, incluindo engenharia genética,
utilização de biofilmes modificados e mineração de genomas, são áreas
de investigação bastante promissoras neste campo. Há espaço para
pesquisas sobre a ampliação de testes laboratoriais bem-sucedidos com
bactérias recém-descobertas para futura implementação industrial.
Experimentos devem ser realizados para determinar os níveis de
toxicidade no efuente tratado, bem como a taxa de descoloração.
Utilizando os resultados laboratoriais bem sucedidos como base, devem
ser empreendidos esforços para ampliar e aplicar procedimentos de
descoloração bacteriana a efuentes industriais do mundo real.
Corantes alternativos menos tóxicos
Considerando o impacto negativo dos corantes de DNA usados
convencionalmente, alguns novos corantes foram lançados
comercialmente como corantes alternativos menos tóxicos. Uma
comparação de corantes alternativos proeminentes é fornecida na Tabela 2 e discutida a
Corantes SYBR
O SYBR pertence à família dos corantes de cianina, que foram
desenvolvidos há cerca de 10 anos e são utilizados para detecção de
ácidos nucléicos em eletroforese em gel, bem como em soluções em
laboratórios de biologia molecular (Tuma et al. 1999). O uso de SYBR
em vez de brometo de etídio ou marcação com 32P para coloração de
ácido nucleico provou ser mais eficiente (Tuma et al. 1999; McKee e
Thomson 2004). São corantes altamente sensíveis, capazes de detectar
DNA em até 25 pg.
Vários grupos de pesquisa testaram o nível de segurança deste corante
em comparação com o brometo de etídio em um teste de Ames, e os
estudos revelaram que o SYBR verde II e o SYBR ouro não são
mutagênicos, enquanto o SYBR verde I é um mutagênico ligeiramente
fraco em comparação com o brometo de etídio. (Marcos et al. 1981;
Singer et al. 1999; Kirsanov et al. 2010).
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Tabela 2 Corantes alternativos de
Nome da tintura
DNA e seu limite de detecção
Ouro SYBR
SYBR verde I
SYBR verde II
Nancy-520
Gel Vermelho
GelVerde
EvaGreen
Nancyÿ520
Nancy-520, um corante fluorescente para ds DNA (DNA de fita dupla) em
géis de eletroforese de agarose, tem sensibilidade maior que o brometo de
etídio. A mutagenicidade deste corante também é menor em relação ao
brometo de etídio, segundo o teste de Ames. Este corante poderia ser utilizado
em uma aplicação padrão de coloração pós-eletroforese para DNA em géis
de agarose. Alternativamente, Nancy-520 também pode ser utilizado para
coloração pré-eletroforese simplesmente adicionando o corante à agarose
líquida antes de derramar o gel.
O gel pode ser visualizado diretamente após a execução da eletroforese, sem
quaisquer etapas adicionais. Este corante também pode ser usado para
determinar as concentrações de DNA ds em solução. Adiciona-
cionalmente, esta aplicação poderia ser realizada em uma placa de 96 poços
com fundo de vidro, usando concentrações conhecidas de ds DNA como
padrão (Baeumle e Merck 2009).
GelRed e GelGreen
GelRed e GelGreen foram projetados especificamente para serem
impermeáveis à membrana celular e, portanto, não tóxicos e não mutagênicos.
Além disso, eles oferecem maior sensibilidade e baixo fundo em comparação
com corantes em gel concorrentes.
Também conhecido como ET-27, ou corante no. 35, o GelRed é uma
alternativa menos tóxica e mais sensível ao brometo de etídio. O
o corante emite coloração forte após a ligação ao DNA e fuoresce com
coloração laranja sob luz ultravioleta.
GelGreen também é conhecido como laranja de acridina-13 ou corante nº. 20.
O GelGreen possui propriedades semelhantes às do laranja N-alquilacridínio
e emite coloração esverdeada sob a influência da luz ultravioleta. Ambos os
corantes são impermeáveis à luva de látex, à membrana celular, não tóxicos
para as células, não mutagênicos, não reativos, não corrosivos, não
inflamáveis e não tóxicos para a vida aquática se presentes nos resíduos
(Biotium 2021).
EvaGreen
Embora semelhante ao SYBR green I, o EvaGreen apresenta melhor
estabilidade. O primeiro foi testemunhado a degradar-se depois
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Limite de detecção Referências
Pode detectar no mínimo 25 pg de DNA Kirsanov et al. (2010)
Pode detectar até 60 pg por banda de DNA ds usando Tuma et al. (1999)
transiluminação de 300 nm
Pode detectar apenas 4 ng de RNA por banda Kirsanov et al. (2010)
usando transiluminação de 300 nm
Pode detectar 0,5 ng de Baeumle e Merck (2009)
DNA Pode detectar menos de 0,1 ng de Biotium (2021)
DNA Pode detectar menos de 0,1 ng de DNA
Quanto ao PCR 3,0× 102 cópias Lu et al. (2013)
múltiplos ciclos de congelamento-descongelamento, que são superados pelo
último. EvaGreen mostra estabilidade mesmo em temperaturas mais altas
de 65 °C e durante um período de uso prolongado de 6 meses. Idealmente,
EvaGreen é o melhor corante alternativo de ligação ao DNA que pode ser
usado em PCR quantitativo em tempo real e análise da curva de fusão do
DNA. É ambientalmente seguro, não mutagênico e não citotóxico. É
impermeável à membrana celular, principal fator responsável pela sua baixa
toxicidade (Biotium 2021).
Conclusão
Liberação de efluentes de diversos laboratórios de pesquisa e
institutos em corpos d'água podem representar uma ameaça aos organismos
aquáticos, aos recursos naturais e à saúde humana. Estudos de toxicidade
indicam que os corantes utilizados em estudos de DNA são principalmente
mutagênicos e podem impor riscos à saúde humana e aos organismos. Para
superar essas preocupações, os corantes presentes nos efuentes de
laboratórios devem ser degradados a níveis e formas não tóxicas. Por ser
uma técnica moderna e econômica, a biodegradação utilizando bactérias,
fungos, algas e plantas é uma das técnicas promissoras para a desintoxicação
desses corantes de DNA. A degradação fotocatalítica também é uma
abordagem possível para o mesmo. Através deste artigo de revisão, resumimos
informações de última geração sobre toxicidade, degradação e alternativas
de corantes de DNA comumente usados. As lacunas de investigação
identificadas gerariam novas oportunidades em investigação e inovação nesta
área. A pesquisa na degradação microbiana desses corantes é limitada e
requer uma análise aprofundada de intermediários e produtos finais do
processo de degradação, novas cepas e culturas mistas para mineralização
completa e novos mecanismos para gerenciar esses resíduos de corantes de
DNA gerados em laboratório no futuro.
Contribuição da autora Nancy George: análise e redação e revisão crítica do
trabalho. Abhrajit Debroy: apresentou a ideia do artigo, realizou a pesquisa
bibliográfica e redação. Mohini Yadav: realizou a pesquisa bibliográfica e redação.
Shubhankhi Dey: executou o
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pesquisa e redação bibliográfica. Radhika Dhawan: realizou a busca e redação da
literatura.
Declarações
Aprovação ética e consentimento para participar NA.
Consentimento para publicação Os autores dão seu consentimento para publicação.
Interesses conflitantes Os autores declaram não haver interesses conflitantes.
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