Etec Dr. Celso Giglio / Etec Raposo Tavares contagem.
contagem. Para a determinação do número de micro-
Disciplina: Microbiologia
Curso/Módulo: MODULAR QUÍMICA (2°AQN).
Prof. Vitor Amaral
Roteiro de Aula prática 3A – Contagem em Superfície e
Diluição Seriada
INTRODUÇÃO
CONTAGEM
Os microrganismos podem ser quantificados de
forma direta, contando-se microscopicamente o número
de células presentes num determinado material ou
superfície, ou indiretamente. Um destes métodos é
través da contagem do número de microrganismos
viáveis utilizando um meio de cultura apropriado. Essa
possibilidade permite que se avalie a quantidade de
microrganismos na água, em alimentos como leite,
carnes, vegetais, superfícies, ar. Para efetuar a contagem
total de bactérias numa determinada amostra faz-se
diluições decimais seriadas da amostra. Pode-se usar a
técnica de disseminação com alça de Drigalsky (Spread
Plate), em meios de cultura apropriados. Após o período
de incubação em condições de temperatura e atmosfera
adequadas faz-se a contagem do número de colônias em
Unidades Formação de Colônia (UFC) por grama,
mililitro,centímetros quadrados ou metro cúbico, de
amostra.
DILUIÇÃO SERIADA
A diluição seriada é a técnica que permite a contagem do
número de micro-organismos de amostras com
concentrações muito elevadas. Considerando-se que
cada colônia de bactérias formada sobre um meio de
cultivo se origine de uma unidade formadora de colônia
(cadeia ou grumo de bactéria), quando a concentração
de micro-organismos inoculados é muito grande, haverá
o crescimento de colônias de maneira sobreposta
impossibilitando a contagem. A amostra deve então ser
diluída de forma seriada para que a concentração de
micro-organismos diminua, dando origem a colônias
suficientemente separadas, possibilitando assim, a
- Meio de cultura PCA ou de contagem
organismos da amostra original multiplica-se o número
de colônias formadas a partir da amostra diluída, pelo
volume de diluição. Uma diluição é uma expressão de
concentração, não de volume. Uma diluição indica a
quantidade relativa de substâncias em uma solução.
Quando a palavra diluição é usada, ela deve significar o
número de partes que foram diluídas em um número
total de partes. Em outras palavras, uma diluição deve
significar o volume de concentrado no volume total da
solução final. O menor número corresponde ao número
de partes da substância que está sendo diluída; o maior
número refere-se ao número total de partes da solução
final.
A figura a seguir demonstra a técnica de diluição
seriada.
OBJETIVOS DA AULA
Desenvolver a técnica de coleta e semeadura de
micro-organismos em superfície de meio de cultura
sólido (PCA) para contagem total de micro-organismos
de amostras microbiológica (solo) concentrada aplicando
a técnica de diluição seriada.
MATERIAIS
CONTAGEM EM SUPERFÍCIE E DILUIÇÃO SERIADA
- Água destilada comum e estéril
- Proveta de 100mL
- Papel alumínio
- Espátula
- Autoclave
- Alça de Drigalski ou espalhamento
- Micropipeta de 1000uL e ponteira
- Micropipeta de 100uL e ponteira
- Amostra de Solo
- Béquer de 100mL
- Caneta permanente ponta fina (preferência)
- Placas de Petri 90mm estéreis
- Tubos de ensaio de vidro e tampa de rosca
- Contador manual ou contador de colônia
- Balança semi-analítica
- Estante de tubo de ensaio
- Erlenmeyer 200mL
- Filme PCV
- Estufa de incubação à 35°C
METODOLOGIA
Preparo da Solução de Solo
- Coletar 2 amostras de 500g de solo diferentes (mais
orgânico e solo de barranco) e pesar 10g em béquer
estéril de 100mL na balança semi-analítica.
- adicionar no béquer com a amostra de solo, de forma
estéril, 100mL de água destilada estéril.
- com a espátula flambada em bico de bunsen e esfriada,
mexer vigorosamente por 2 minutos até completa
dissolução do solo na água.
- deixar o béquer com a solução de solo descansar por 2
minutos para decantar as partículas mais pesadas.
Preparo do Meio de Cultura PCA
- Em erlenmeyer de 200mL preparar 200mL de meio de
cultura de contagem de placa (PCA) de acordo com o
fabricante (ler rótulo e fazer o cálculo de preparação
para 200mL).
- adicionar com auxílio da proveta de 100mL, cerca de
200mL de água destilada no erlenmeyer e homogeneizar
o máximo possível.
- Colocar uma tampa de papel alumínio na boca do (duplicata A e B) e espalhar com alça de drigalski estéril o UFC Final = UFC Fator diluição x 10
erlenmeyer e um pedaço de fita indicadora de autoclave conteúdo da amostra, até que todos o conteúdo seja OBS: o resultado corrigido pelo fator de diluição da
e autoclavar o meio de cultura à 121°C, 1 atm por 15 absorvido pelo meio de cultura. solução de solo inicial (10g/100mL ou 1:10, p/v). O
minutos. - Empilhar e vedar as placas com filme PVC e de forma resultado final expressar em notação científica e a
- Despeja de forma estéril em 8 placas de petri estéreis invertida, cultivar as placas em estufa de incubação à unidade de medida em UFC/g de solo.
20mL do PCA e esperar até completa solidificação. 35°C por 24/48h.
- para cada diluição serão utilizadas 2 placas (duplicata) Tabela 1 Exemplo – Resultados da Contagem de
para a realização da contagem, ou seja, 8 placas no total. Contagem de Superfícies de Bactérias Heterotróficas Superfície de bactérias de amostras de solo utilizando a
- Nomear as placas com 10-1 (A e B) para a primeira Totais ou Bactérias Mesófilas Totais em Amostras de técnica da Macro-diluição Seriada.
diluição (duplicata), 10-2 (A e B), 10-3 (A e B) e 10-4 (A e B). Solo Contagem em Diluições Seriadas
OBS: A e B representam as duplicatas. - Após o cultivo, desembalar as placas, organizar por Amostras (UFC/g de solo)
diluição, e realizar a contagem de todas as placas, com de Solo 10-1 10-2 10-3 10-4
Preparo dos Tubos de Ensaio para Diluição Seriada auxílio de contador manual ou contador de colônia e (10x) (100x) (1.000x) (10.000x)
- Utilizar de 4 a 5 tubos de ensaio estéreis com tampa de caneta permanente de ponta fina, todas as colônias que Solo I – A > 300 > 300 146 < 20
rosca e adicionar em cada um deles, de forma estéril, apareceram nas placas (inclusive as puntiformes). Solo I – B > 300 > 300 128 < 20
9mL de água destilada estéril ou soro fisiológico estéril. - As contagem válidas serão apenas consideradas as Média Solo
- numerar os tubos de 1 a 4 com caneta permanente e placas com a presença de colônias no intervalo de 20 a > 300 > 300 137 < 20
I
estes serão tratados como 10-1 (tubo 1), 10-2 (tubo 2), 10- 300 colônias. Placas com a quantidade inferior a 20 e Solo II – A > 300 > 300 278 < 20
3
(tubo 3) e 10-4 (tubo 4), para as diluições de 10x (tubo superior a 300 colônias deverão ser descartadas da Solo II – B > 300 > 300 231 < 20
1), 100x (tubo 2), 1.000x (tubo 3) e 10.000x (tubo 4). contagem final. Média Solo
- Tirar uma média das duas placas (duplicata) e refazer os > 300 > 300 254,5 < 20
II
Preparo da Macro-Diluição Seriada da Solução de Solo cálculos para a expressão final dos resultados em UFC/g Diluição
- com pipeta de 1000uL e ponteira compatível estéril, de solo, corrigindo os fatores de diluição pertinentes Utilizada na não não sim Não
pipetar 1000uL (1mL) da solução de solo no tubo 1 (10-1 dependendo das placas ou diluições escolhidas para a Contagem
ou 10x), descartar a ponteira e homogeneizar a amostra contagem. Contagem
de solução de solo. OBS: ao final, expressar o resultado final em notação Final de Solo I Solo II
- Com uma segunda ponteira, transferir 1000uL (1mL) do científica. Bactérias
tubo 1 para o tubo 2 (10-2 ou 100x), descartar a ponteira
Bactérias
e homogeneizar a amostra. RESULTADOS
Mesófilas
- Repetir o mesmo procedimento para os tubos 3 (10-3 Escrever um texto inicial sobre o local da coleta
Totais
ou 1.000x) e tubo 4 (10-4 ou 10.000x), sempre e expressar os resultados de acordo com o exemplo a
(UFC/g de
descartando a ponteira utilizada e transferindo para os tabela a seguir, refazendo os cálculos da diluição seriada,
solo)
tubos seguintes com nova ponteira, retirando amostras na sequência a seguir.
do tubo anterior.
CONCLUSÃO
- Ao final teremos 4 diluições da amostra de solução de UFC da Placa = Média do Valor Contado na Placa x 10
1) Por que foi necessária para a contagem, a técnica de
Solo OBS: volume da amostra na placa 100uL corrigido para
diluição seriada para amostras de solo? Explique.
1000uL ou 1mL.
2) Descreva a técnica de contagem de superfície e
Semeadura nas placas de Petri das Amostras Diluídas
explique o por quê ela recebe este nome?
da Solução de Solo UFC Fator de Diluição = UFC da Placa x 103
3) Faça uma pesquisa sobre a técnica de contagem em
- Para cada diluição (tubos de 1 a 4), pipetar de forma OBS: Correção do Fator de Diluição na Contagem, agora
profundidade e explique a diferença desta técnica com
estéril, 100uL (Micropipeta de 100uL e ponteira estéril) com valores positivos, por exemplo, 103 (valor dentro do
a utilizada no experimento.
do conteúdo de cada tubo em 2 placas de petri com PCA intervalo válido para a contagem).
4) Em questão de fertilidade do solo, em relação a ANEXO III – CONTADOR DE COLÔNIA DIGITAL
quantidade de bactérias, qual deles é mais fértil?
Explique.
5) Qual a relação entre fertilidade do solo e microbiota
do solo? Explique.

Referências Bibliográficas
- Adicionar as bibliografias consultadas.

ANEXO I – MACRO DILUIÇÃO SERIADA

ANEXO II – MÉTODO DE ESPALHAMENTO E

SEMEADURA DE SUPERFÍCIE PARA CONTAGEM