1 INTRODUÇÃO

A malária é considerada uma doença infecciosa causada por protozoários do gênero

Plasmodium e transmitida por mosquitos Anopheles, sendo ainda um grave problema de
saúde pública em diversos países tropicais (BORGATI et al., 2017). Segundo estimativas
da OMS em 2018 a malária conseguiu atingir cerca de 228 milhões de pessoas e matar
aproximadamente 405 mil, principalmente no continente africano. Mesmo sendo uma
doença tratável, o subfinanciamento continua sendo um dos obstáculos para o controle e
a eliminação da doença, morrendo uma criança a cada dois minutos (ONU, news 2019).
A doença carrega consigo o fardo da ocorrência das mutações que acontecem e que
estão associadas à resistência dos parasitas frente as drogas antimaláricas, sendo um dos
principais fatores para o ressurgimento da doença e sua disseminação em novos ambientes
e populações. Atualmente, existem abordagens para enfrentar os desafios da resistência a
diversas drogas em P. falciparum, podendo ser combinações de terapias, elaboração de
análogos de drogas existentes, assim como inversores de resistência aos fármacos
(FAIDALLAH et al., 2016). Além disso, os antimaláricos existentes no mercado ainda
podem causar efeitos colaterais graves como cardiotoxicidade, hepatotoxicidade,
hipoglicemia, variando a frequência em que ocorre os efeitos entre as populações
(ASHLEY et al., 2018).
Dessa forma, se torna urgente a obtenção de novos protótipos que apresentem alta
atividade biológica contra o P. falciparum, tendo baixa toxicidade e menores níveis de
resistência. A partir deste ponto, iniciou-se o estudo de dois compostos bastante
consolidados na química medicinal, que são o 1H-1,2,3-triazol e o tiofeno. Esses
compostos estão presentes em diversos medicamentos já existentes no mercado como
antibióticos, anticancerígenos, antiagregante plaquetários (MONDINO et al., 2014), além
de possuírem uma grande variedade de atividades biológicas que vem sendo reportada
nos últimos anos para compostos contendo o núcleo 1H-1,2,3-triazólico e o tiofeno, como
atividade anti-inflamatória, anti-HIV, entre outras, incluindo atividade antimalárica
(MOHAREB et al., 2011; SANG et al., 2019)
A presença dos núcleos 1H-1,2,3-triazólicos e tiofênicos em compostos bioativos que
apresentam atividade antimalárica corrobora com o planejamento de compostos contendo
esses dois heterociclos. Com isso, o presente trabalho tem como objetivo o estudo da
associação destes dois núcleos (1H-1,2,3-triazol e tiofeno) para avaliar a atividade
sinérgica dos mesmos contra o Plasmodium falciparum, agente causador da malária.
1
2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Malária

A malária é uma doença transmitida por um vetor, parasitária, podendo ser encontrada
em cerca de 91 países do mundo. Dentre mais de 120 espécies de Plasmodium que podem
infectar diversas espécies de seres vivos como répteis, mamíferos e pássaros, seis deles
infectam regularmente seres humanos (ASHLEY et al., 2018).
O Plasmodium falciparum é o parasita que provoca o maior número de mortes por
estimular a anemia grave, porque produz muitos parasitas em estágio sanguíneo,
principalmente em crianças africanas. Em relação ao Plasmodium vivax, geralmente
desencadeia uma doença mais branda, mas podendo ainda ser grave, trazendo
consequências como uma morbidade associada significativa. O Plasmodium malariae, P.
ovale curtisi e P. ovale wallikeri são menos estudados, porém geralmente podem
apresentar gravidade da doença comparável a malária vivax não complexa. E por último
o Plasmodium knowlesi, que é uma infecção zoonótica, podendo causar a malária grave
(ASHLEY et al., 2018).
A doença é transmitida através da picada da fêmea do mosquito Anopheles. O vetor
é dependente de um ambiente adequado em termos de clima, altitude, vegetação, para que
ocorra a sua adequação e aconteça uma incidência significativa da doença. Por isso, a
implementação de medidas de controle também é uma das dependências da proliferação
da doença, e está intimamente ligada à pobreza, guerras, tragédias naturais. As
transmissões menos comuns da doença decorrem de transfusões sanguíneas ou de mãe
para filho, com raras ocorrências em locais não endêmicos. (ASHLEY et al., 2018).
As fases do ciclo de vida da malária são mostradas na Figura 1 (AMABIS et al.,
2004). Os esporozoítos são transmitidos para o hospedeiro através da picada da fêmea do
mosquito Anopheles. Em seguida, o parasita move-se para o estágio hepático pré-
eritrocítico que dura em média duas semanas, antes de iniciar o estágio sanguíneo, que é
o estágio onde acontece a replicação assexuada crescente do parasita, e a partir disso,
causando doenças humanas. Uma pequena parte dos parasitas já intraeritrocíticos,
começam o seu desenvolvimento sexual, elaborando gametócitos masculinos e
femininos. As transições distintas entre as fases do ciclo é o momento em que ocorre a
passagem da malária para o mosquito por meio de uma picada ao hospedeiro. No intestino
do mosquito há exflagelação dos gametócitos masculinos, e os gametas masculino e

2
feminino são fundidos formando um zigoto que posteriormente torna-se um oocineto
móvel, penetrando a parede intestinal do vetor. Após os oocistos formados, acontece a
liberação dos esporozoítos que migram assim para as glândulas salivares do mosquito,
completando o seu ciclo de vida. (ASHLEY et al., 2018).

Figura 1 – Ciclo de vida do Plasmodium.

Fonte: AMABIS et al., (2004)

A malária tem como característica uma febre aguda. Após a picada do mosquito
infectado em uma pessoa não-imune a malária, os sintomas costumam surgir com
aproximadamente dez a quinze dias. Um dos primeiros sintomas é a febre, calafrios e dor
de cabeça, podendo ser sintomas leves e confundíveis, sendo difícil reconhecer como
malária. No caso da infecção por P. falciparum, se a doença não for tratada dentro de
vinte e quatro horas, a ocorrência pode progredir para um caso grave da enfermidade,
procedendo em morte. A forma grave da doença provoca constantemente nas crianças um
ou mais sintomas como: malária cerebral, anemia grave, dificuldade para respirar em
função de acidose metabólica, entre outros sintomas. Já nos adultos, a doença
frequentemente atinge diversos órgãos. Em relação aos locais endêmicas da doença, os
indivíduos costumam desenvolver imunidade parcial, com ocorrência de infecções
assintomáticas (OPAS/OMS Brasil, 2019).

3
 Em países endêmicos as plantas costumam ser utilizadas como medicamento, tratando
diversas doenças, onde uma delas é a malária. A quinina é um exemplo de medicamento
antimalárico importante, sendo um alcaloide isolado no século XIX das cascas de quinas
do Peru, usadas extensamente durante a Segunda Guerra Mundial. A cloroquina é uma
quinolina, exemplo de medicamento antimalárico muito utilizado, tendo como protótipo
para a sua síntese a quinina. A sua ampla utilização levou à resistência ao P. falciparum
em 1960. A partir deste fato, inúmeros novos medicamentos antimaláricos foram
sintentizados, como amodiaquina, primaquina, e mefloquina, assim como compostos não
quinolínicos como lumefantrina e artemisinina (BORGATI et al., 2017).
A descoberta da cloroquina através de alterações na estrutura da quinina foi amplamente
abandonada por muitos laboratórios em razão das preocupações quanto a toxicidade e a
complexidade das reações. (FAIDALLAH et al., 2016).

2.2. Heterociclos azólicos

A classe dos compostos heterocíclicos representa aproximadamente a metade de todos

os compostos conhecidos atualmente; e por isso apresentam uma importância
incontestável, principalmente no que se refere a inúmeras aparições dos compostos em
medicamentos (MELO et al., 2006). Diversos fármacos contendo estes compostos
heterocíclicos são utilizados mundialmente, onde apresentam atividades farmacológicas
variáveis, como atividade antihipertensiva (losartan, 1); antiviral (ribavirina, 2);
antitumoral (carbamato de fluorouracila, 3); antifúngica (fluconazol, 4; antiinflamatória
e analgésica (dipirona, 5); antiprotozoária (metronidazol, 6); inibidora da β-lactamase
(tazobactama sódica, 7) e antimicrobiana (benzilpenicilina, 8) (Figura 2) (MELO et al.,
2006).

4
 Figura 2 – Exemplos de heterociclos nitrogenados farmacologicamente ativos.

Fonte: Adaptado de MELO et al.,(2006)

Os compostos heterocíclicos aromáticos nitrogenados de cinco membros participam
da classe de substâncias denominada “azol”. Um dos heterocíclicos considerados mais
simples é o pirrol (9); e mesmo aqueles compostos heterocíclicos de cinco membros
apresentando um oxigênio ou um enxofre, adicionalmente a um nitrogênio, denominam-
se azol, sendo nomeado assim, respectivamente, de tiazol(10) e oxazol(11). Na Figura 3
abaixo identifica-se outros membros mais simples da classe, como: pirazol (12), imidazol
(13), 1,2,3-triazol (14), 1,2,4-triazol (15), tetrazol (16) e pentazol (17) (MELO et al.,
2006).

Figura 3 – Heterociclos aromáticos azoicos

Fonte: Adaptado de MELO et al., (2006)

2.3 1,2,3-triazóis
Os triazóis despertam grande interesse pelo fato de apresentarem uma ampla
aplicação, como no uso pesticidas, explosivos, e principalmente na criação de novos
fármacos (MELO et al., 2006). O estudo afinco desta classe de heterocíclicos só surgiu

5
após o fim da Segunda Guerra Mundial, em função das descobertas de suas diversas
aplicações no início da década de 50, evoluindo assim os estudos em relação aos variados
sistemas triazólicos. Todos os compostos 1H-1,2,3-triazólicos, sem exceção, são
produzidos sinteticamente, sem haver até o momento, nenhum indício da aquisição desta
classe de compostos a partir de outras fontes naturais (MELO et al., 2006).
Os triazóis são compostos aromáticos heterogêneos que exibem seis elétrons π,
podendo apresentar-se como três estruturas tautoméricas, as substâncias que não
possuírem substituintes no átomo de nitrogênio (MELO et al., 2006). O 1H-1,2,3-Triazol
é um composto que apresentou através de medidas de momento de dipolo, 83% de
equilíbrio na orientação do triazol simétrico 2H-1,2,3-triazol. Diferentemente do 1,2,4-
triazol, onde experimentos e cálculos teóricos mostraram uma predileção pela forma
1,2,4-4H-triazol (MELO et al., 2006). Estes triazóis podem ser subclassificados como
simétricos (1,2,4-triazóis) ou vicinais (1,2,3-triazóis), mostrado na Figura 4 (MELO et
al., 2006), onde os compostos mais pesquisados são os simétricos. Todavia, os compostos
vicinais receberam grande interesse, após descobertas de métodos mais eficientes de
obtenção e do seu potencial em atividades biológicas e aplicações (MELO et al., 2006);
inclusive diversos estudos sobre o 1H-1,2,3-triazol em relação a malária (KUMAR et
al.,2020; BOECHART et al.,2014; RAJ et al.,2014), por exemplo, vem sendo
desenvolvido.

Figura 4 - Equilíbrio tautomérico em 1,2,3- e 1,2,4-triazóis não-substituídos.

Na literatura, encontra-se 1,2,3-triazóis 1,4-dissubstituídos sintetizados que foram

acessados para atividade antimalárica in vitro contra a cepa Plasmodium falciparum, de
acordo com o protocolo de microensaio de Rieckmann e colaboradores com pequenas

6
modificações (RIECKMANN et al.,1978). Os valores médios de IC50 foram calculados a
partir de experiências realizadas em duplicata, onde a cloroquinina e o quinino foram
utilizados como fármacos de referência. Foi observado que alguns dos triazóis
sintetizados exibiram considerável atividade inibidora antimalárica; sendo os compostos
20a (IC50, 0,1784 µM) e 20b (IC50, 0,1835 µM) os que apresentaram melhor atividade
contra P. falciparum (Esquema 1) (KAUSHIK et al., 2017).

Esquema 1 – Síntese de 1H-1,2,3-triazóis contendo grupo funcional tio éter,

antimalárico.

Fonte: Adaptado de KAUSHIK et al., (2017)

Chu e colaboradores (2019), em seus estudos com a associação do núcleo 1,2,3 triazol
a outros compostos, utilizaram dez fluoroquinolonas substituídas com 1,2,3-triazol na
posição N-1, sendo testadas in vitro contra a linhagem CQS 3D7 de P. falciparum usando
como padrão o medicamento ciprofloxacino. Os resultados indicaram que a maioria dos
híbridos apresentaram atividades relevantes com IC50 variando de 1,33 a 6,96 mg/mL,
sendo mais potentes do que a ciprofloxacina sozinha (IC50: 8,82 mg / mL) (CHU et al.,
7
2019). A relação de estrutura atividade mostrou que a inserção de grupos alquil ou de um
anel aromático na posição N-1 (posição R) do referido triazol não causa o aumento da
atividade; em contrapartida o benzil e os álcoois alquil levam a uma maior perda de
atividade. O híbrido 21, em particular, com IC50: 1,33 µg / mL (Figura 5) foi 6,63 vezes
mais ativo, comparado ao ciprofloxacino, podendo atuar como um protótipo para
otimização subsequente. (CHU et al., 2019).

Figura 5 – Estrutura química de híbrido de triazol-quinolona

Fonte: Adaptado de CHU et al., (2019).

Chu e colaboradores (CHU et al 2019) no mesmo trabalho de pesquisa, utilizaram

híbridos de triazol-amidina 22 (IC50: 14,2–866,0 nM), onde foi encontrado um grande
potencial contra as linhagens CQR e CQS de P. falciparum. Para esta classe em questão
de híbridos, é sugerido que se ligam à hematina fortemente e cause a morte dos parasitas
pela inibição da formação de hemozoína de maneira similar à Cloroquina. Os híbridos
mais ativos e potentes comparados a Cloroquina (IC50: 95,63 nM) foram dois: 22a e 22b
com IC50: 14,2 e 79,5 nM respectivamente, contra a linhagem CQR. No estudo,
camundongos que foram infectados por P. vinckei petteri (279 BY), ambos (0,8 mg/kg e
2 mg/ kg), mostraram atividade antimalária potente in vivo com uma completa eliminação
do parasita na corrente sanguínea dos camundongos infectados e uma cura total sem
renovação/recrescimento depois da administração. Outros testes demostraram que o
composto 22a (Figura 6) foi o composto mais potente in vitro e in vivo, apresentando um
valor de ED50 por via oral de 18 mg/kg e causou uma cura total a 30 mg/kg (CHU et al.,
2019).

8
 Figura 6 – Estrutura química do híbrido triazol-amidina

Fonte: Adaptado de CHU et al., (2019).

Em estudo de Joshi e colaboradores (JOSHI et al 2013) foi sintetizado uma nova série
de análogos de quinolina e amida triazólica. Os compostos 23a-c foram considerados os
mais ativos da série contra a cepa D10 do Plasmodium falciparum sensível à cloroquina,
com valores de IC50 na faixa de 349 e1247 nM, com exceção de 23c, também exibindo
atividade semelhante contra a cepa K1 resistente a cloroquina. Os resultados demonstram
a viabilidade de produzir análogos hidrofílicos com forte atividade e baixa resistência
cruzada com cloroquina (Figura 7).

Figura 7 - Triazóis com atividade antimalarial.

Em estudo de Jarrahpour e colaboradores (JARRAHPOUR et al 2018) foram

sintetizados alguns novos derivados β-lactâmicos conjugados com dois núcleos 1,2,3-

9
triazol. Os resultados mostraram que os compostos 25a-d exibiram atividades
antimalárica potentes com IC50 variando de 0,85 a 1,81 μM contra a cepa de P. falciparum
K1 resistente à cloroquina que foi o medicamento padrão utilizado, que apresentou uma
IC50 de 0.80μM. (Figura 8).

Figura 8 - Estrutura de compostos com núcleo bistriazóis-1H-1,2,3-triazóis com atividade antimalarial.

2.4 Tiofeno

O composto tiofeno foi descoberto em 1882 através do alemão Victor Meyer, depois
da investigação de uma falha de um teste (Teste indofenina de Von Baeyer´s) para
identificação de benzeno, tendo sua fórmula molecular confirmada como C4H4S
(CAMERON, 1949). O tiofeno com ponto de ebulição 84°C é encontrado como uma
impureza no benzeno comercial obtido do alcatrão de carvão (ALLINGER et al., 1984).
Logo após dois anos, em 1885, dois Professores, Jacob Volhard e Carl Paal, das

10
Universidades de Halle e Erlangen, respectivamente, realizaram ao mesmo tempo a
síntese de derivados de tiofeno, o que contribuiu muito para o estudo desse novo
composto descoberto (CAMERON, 1949).
O tiofeno é um hidrocarboneto heterocíclico aromático de cinco membros, que está
entre os compostos heterocíclicos mais estudados. O tiofeno é fácil para processar em
reações, quimicamente estável e suas aplicações sintéticas têm sido uma questão
constante de investigação nas últimas seis ou sete décadas. O interesse neste heterociclo
se expandiu da química inicial de corantes ao design moderno de fármacos,
biodiagnósticos, bloquear co-superestruturas de polímero auto-montadas e condutividade
de dispositivos sensoriais (BARBARELLA et al., 2005). A versatilidade da química que
o tiofeno possui permite grande diversidade em estruturas químicas baseadas no
composto. O tiofeno pode ser funcionalizado nas posições α e β para enxofre ou no
enxofre o próprio átomo. (BARBARELLA et al., 2005).
A síntese mais geral de tiofenos a partir de precursores de cadeia aberta consiste no
aquecimento de compostos de 1,4-dicarbonila com pentassulfeto de fósforo. É um método
mais amplamente aplicável do que o semelhante para furanos, uma vez que uma ou ambas
as carbonilas podem estar na forma de íon carboxilato, que é reduzido durante a reação.
O próprio tiofeno foi sintetizado desta forma a partir do succinato de sódio (ALLINGER
et al., 1984).
Atualmente a produção de compostos contendo átomos de enxofre em sua composição
é de grande interesse e importância, tanto pelo seu uso como intermediário sintético como
pelo seu potencial biológico. Na química medicinal o tiofeno se apresenta em diversos
estudos contra várias doenças como HIV (SANG et al., 2019), câncer (MOHAREB et al.,
2011), inflamação (LAHSASNI et al., 2018; GONZAGA et al., 2017), além de ser um
composto já consolidado e presente em inúmeros medicamentos (MONDINO, 2014).
A malária é também uma doença onde há pesquisas a respeito da ação do tiofeno contra
ela, principalmente pelo fato, de que, o parasita causador da doença adquiriu resistência
há alguns medicamentos existentes como a cloroquina, sulfadoxina, pirimetamina e
outros fármacos antimaláricos que antes combatia a enfermidade (SOUZA et al., 2019;
NARULA et al., 2019). Em um estudo de perfil antiplasmódico de compostos
selecionados foram identificados compostos com atividade inibidora rápida do
crescimento in vitro dos parasitas, comparando sua ação com o fármaco “Artesunato” já
existente no mercado, que também possui atividade rápida e é indicado para o tratamento
de malária aguda, causada pelo Plasmodium falciparum. Dentre os compostos
11
apresentados o tiofeno apresentou esta característica inibitória (Tabela 2) (SOUZA et al.,
2019).
Tabela 2 – Atividade inibitória contra P. falciparum.

Estrutura IC50 (µM) relatado IC50 (µM) médio

(intervalo de confiança 95%)

0,512 0,25 (0,16-0,34)

0,826 1,00 (0,8-1,2)

Fonte: Adaptado de SOUZA et al., (2019)

Narula e colaboradores (Narula et al 2019) em seu trabalho sobre as novas dimensões

no campo da pesquisa de antimaláricos contra o ressurgimento da malária, sintetizaram
derivados de aminoquinolina híbridos à base de furano e tiofeno (Figura 9) onde foram
projetados e analisados por Opsenica et al. como sendo inibidores potentes da
polimerização da b-hematina (NARULA et al., 2019). Avaliando esses compostos
análogos, pode-se constatar que os mesmos seriam de 3 à 71 vezes mais potentes
comparado a cloroquina, contra a linhagem de W2. Dentre todos os análogos de furano e
tiofeno, o composto considerado mais potente foi o 28 ( IC50 15 nM, 2nM e 5 nM) contra
as linhagens PfW2, Pf Africano D6 e linhagem C235 multirresistente Pf (Tailândia),
respectivamente, mostrando uma potência mais elevada que a mefloquina (IC50 55 nM)
contra a cepa C235. (Figura 9) (NARULA et al., 2019).

12
 Figura 9 – Derivados híbridos de aminoquinolina à base de tiofeno

Fonte: Adaptado de NARULA et al., (2019).

Pieroni e colaboradores sintetizaram uma série de benzotiofeno-2-carboxamida que

foram avaliados frente ao agente etiológico causador da malária. Os compostos 29a-e
(Figura 10) apresentaram uma maior atividade antimalarial contra diferentes cepas de P.
Falciparum. O composto (3-clorobenzo [b] tiofen-2-il) (2,6-dimetilmorfolino) metanona
(30) foi utilizado como referência. (Pieroni et al, 2017).

Figura 10 - Compostos tiofênicos com atividade antimalarial

Em estudo de Konstantinovi e colaboradores foi relatado a eficácia de

aminoquinolinas acopladas aos anéis benzotiofeno e tiofeno na inibição do crescimento

13
do Plasmodium falciparum. Os benzotiofenos apresentados neste trabalho mostraram
atividades melhoradas contra uma cepa suscetível à cloroquina (CQS). Foram obtidos
quatro compostos, 31a-d que apresentaram atividade antimalarial mais potente,
apresentando uma hipersensibilidade às cepas resistentes. Isto contrasta fortemente com
a cloroquina, indicando assim que um maior desenvolvimento da série poderia fornecer
antimaláricos mais poderosos contra as cepas. (Figura 11) (Konstantinovi et al, 2017).

Figura 11 - Compostos tiofênicos com atividade antimalarial.

14
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral

Este trabalho tem como objetivo geral sintetizar Ésteres 1H-1,2,3-triazóis-tiofeno

(53a-h) para posteriormente analisar a sua potencial atividade antimalárica (Figura 12).

Figura 12: Ésteres 1H-1,2,3-triazol-tiofeno

3.2 Objetivos específicos

• Analisar com auxílio de cromatografias (cromatografia em camada delgada,

cromatografia em coluna) se houve a formação do éster 1H-1,2,3-triazol-tiofeno,
além de purificá-lo.

• Caracterizar os compostos sintetizados (1H-1,2,3-triazol e 1H-1,2,3-triazol-

tiofeno) através da ressonância magnética nuclear corroborando as suas estruturas
químicas.

• Enviar para análise as amostras dos compostos sintetizados para a realização do

ensaio antimalárico realizado na USP pela professora Célia Regina da Silva
Garcia.

15
4. METODOLOGIA

4.1 Síntese de compostos híbridos 1H-1,2,3-triazol-tiofeno

A metodologia terá início pela síntese de azidas aromáticas (34a-h) a partir de anilinas
devidamente substituídas (33a-h) através da reação de Sandmayer. A primeira etapa
consiste na formação do sal de diazônio seguido de uma reação de substituição
nucleofílica aromática com azida de sódio. As azidas aromáticas (34a-h) obtidas na etapa
anterior, juntamente com o álcool propargílico (35) serão utilizados para a síntese de
álcoois 1H-1,2,3-triazóis (36a-h) empregando a reação de cicloadição 1,3-dipolar
catalisada por cobre I gerado in situ. Para a obtenção do composto híbrido final, 1H-1,2,3-
triazol-tiofeno (32a-h) será realizado uma reação de substituição nucleofílica na
carbonila, empregando cloreto de 2-tiofeno carbonila (37), e catálise nucleofílica de
DMAP, em presença de piridina como base (Esquema 2).

Esquema 2 – Síntese compostos híbridos 1H-1,2,3-triazol-tiofeno

4.2 Cromatografia em Camada Delgada (C.C.D)

A cromatografia em camada delgada foi utilizada no requerido trabalho para

confirmar a síntese do composto intermediário 1,2,3-Triazol e o composto híbrido final
1H-1,2,3-triazol-tiofeno. Esta técnica de cromatografia se baseia na separação de
substâncias que tenham afinidades diferentes com a fase estacionária que pode ser sílica
ou alumina possuindo assim uma alta polaridade e a fase móvel que é composta por um
solvente ou mistura de solventes. Os compostos são espotados na base da placa, e é

16
deixada em contato com o eluente até subir por capilaridade, e atingir a extremidade
superior da placa. Ao ascender, será mais arrastado pelo solvente os compostos que foram
menos adsorvidos na fase estacionária, separando-os dos mais adsorvidos. O eluente ideal
é o que carreia o composto para o meio da placa (Figura 13). É uma técnica rápida,
simples e econômica; sendo, por isso bastante utilizada em acompanhamento de reações
orgânicas. (DEGANI et al., 1998).

Figura 13 – Cromatograma obtido por cromatografia em camada delgada.

Fonte: Adaptado de DEGANI et al., (1998).

4.3 Cromatografia em Coluna

A cromatografia em coluna foi utilizada no trabalho com o objetivo de purificar os

intermediários álcoois 1H-1,2,3-triazol 36a-h e o produto final sintetizado éster 1H-1,2,3-
triazol-tiofeno. Esta cromatografia é geralmente bastante utilizada nesses casos de
purificação de produtos de reações químicas e em isolamentos de produtos naturais.
Durante este processo de cromatografia é empregado o produto que se deseja separar as
impurezas no topo da coluna e em seguida o eluente é eluído pela fase estacionária. A
polaridade do eluente pode aumentar gradativamente, caso seja a finalidade o arraste de
substâncias polares, ou ela pode ser mantida durante o processo. A velocidade em que os
diferentes componentes da amostra irão se deslocar será dependente da maior afinidade
pela fase móvel ou pela fase estacionária. A Figura 14 abaixo exemplifica a cromatografia

17
em coluna (DEGANI et al., 1998).
Figura 14 – Ilustração de uma coluna cromatográfica

Fonte: Adaptado de DEGANI et al., (1998).

4.4 Ressonância Magnética Nuclear (RMN)

As análises de RMN 1H foram realizadas em temperatura ambiente utilizando o

equipamento Varian VXR Unity 500 MHz em solvente deuterado DMSO-D6, e assim
foram registradas. As constantes de acoplamento (J) foram dadas em Hertz, e os desvios
químicos dados em ppm. (SANTOS et al., 2020). A técnica de RMN H1 vai utilizar a
interação de ondas eletromagnéticas (radiofrequência) com spins nucleares, para
observar os núcleos 1H em moléculas que fazem interações covalentes. (RESENDE et al.,
2015). Este núcleo possui uma elevada razão magnetogírica, o que acarreta em uma
sensibilidade maior de detecção. Cada átomo de hidrogênio sentirá o campo magnético
diferente, em função da molécula em que o hidrogênio está realizando sua ligação,
apresentando assim sinais específicos no espectro de RMN (RESENDE et al., 2015).

4.5 Ensaio antimalárico

Todos os ensaios antimaláricos e cultura de células foram realizados na USP pelo

laboratório da professora Célia Regina da Silva Garcia.

18
4.5.1 Cultura de P. falciparum.

A avaliação biológica antimalárica se iniciou com a infecção de eritrócitos com P.

falciparum 3D7 e cepa knouckout para o receptor PfSR25 (pfsfr25-), onde foram
armazenados em frascos de cultura de 175cm² (Greiner Bio-One). Dentro desta cultura
tinha 0,04% de sulfato gentamicina, RPMI 1640 com 0,5% NaHCO3, 0,05% de
hipoxantina e suplementado com 0,5% de AlbuMAX I (Gibco); sendo armazenado essas
culturas a uma temperatura de 37°C em uma atmosfera com 5% O2, 5% CO2 e 90% N2.
Para a determinação da parasitemia posteriormente foi preparado um esfregaço de sangue
corado com Panotic Rapid (Laborclin) (SANTOS et al., 2020).

4.5.2 Ensaio de crescimento in vitro e análise de citometria de fluxo

Neste ensaio inicialmente hemácias foram infectadas com P. falciparum 3D7 (iRBC)
contendo 0,3% de parasitemia inicial, onde 1% de hematócrito foram incubados com
distintas concentrações de compostos variando de 0,0488 µM a 50 µM, durante 72h a
uma temperatura de 37°C sob mistura de gases. Um grupo controle foi utilizado, e o
mesmo foi tratado com um solvente (Dimetil Sulfóxido (DMSO) (v/v), possuindo uma
maior concentração de 0,25% (SANTOS et al., 2020).
Para determinar a parasitemia foi utilizado dispersão lateral versus fluorescência
(gráficos de pontos) de 103 células aproximadamente obtidas em um citômetro de fluxo
Accuri C6 (Becton Dickinson). O início do ensaio foi realizado com eritrócitos não
infectados e não corados para ensinar a autofluorescência dos eritrócitos. Para determinar
o IC50, ou seja, a concentração responsável por 50% de inibição, foi utilizado a curva de
resposta à concentração do composto determinada com o software GraphPad Prism
V5.01. 72h depois, os glóbulos vermelhos infectados com P. falciparum 3D7 foram
corados com um marcador de ácido nucleico SYBR Green I (1X) (Invitrogen) e marcador
de mitocôndria com base no potencial de membrana MitoTracker Deep Red (50 nM)
(Invitrogen), onde foram incubados a uma temperatura de 37°C durante 20min (SANTOS
et al., 2020).
Por fim, a parasitemia final do ensaio foi determinada através do citômetro de fluxo
com citômetro de fluxo BD Accuri C6, coletando 104 células; onde os gráficos de pontos
usando o software FlowJo V10.6.2 determinaram enfim a parasitemia. Para cada droga,
foram realizados em triplicata para calcular os valores de IC50 (SANTOS et al., 2020).

19
5 RESULTADOS e DISCUSSÕES
5.1 Síntese dos álcoois 1H-1,2,3-triazóis 36a-h

Esquema 3 – Síntese de álcoois 1H-1,2,3-triazóis 36a-h

As azidas 34a-h presentes no esquema foram obtidas a partir de anilinas 33a-h

devidamente substituídas. Sua estrutura química não foi elucidada nem passou por
etapa de purificação posterior devido à sua instabilidade. Em seguida foi realizada a
síntese dos álcoois 1H-1,23-triazol 36a-h que foram obtidos em rendimentos que
variaram de 54 a 90%. Esses resultados dos rendimentos são considerados de moderado
a excelente.
A estrutura química dos álcoois 1H-1,23-triazol 36a-h foi elucidada utilizando a
técnicas de RMN 1 H ( F i g u r a 1 5 ) . A critério de exemplificação, será utilizado o
composto 36e.
No espectro de RMN 1H observou-se o dupleto em 4,64 referente à ressonância do
hidrogênio metilênico H-6 e um tripleto em 5,37 referente à ressonância da hidroxila.
Ambos os sinais acoplam entre si em uma constante de acoplamento J de 5,5 Hz. Na
região aromática observa-se dois dupletos referente ao anel aromático. O dupleto em 8,23
ppm refere-se à ressonância dos hidrogênios H-2´ e H-6´ e em 8,43 observa-se o dupleto
referente à ressonância dos hidrogênios H-3´ e H-5´. Ambos os sinais acoplam entre si
em uma constante de acoplamento J de 9,3 Hz. Em relação ao hidrogênio triazólico H-5,
observa-se um simpleto em 8,66 ppm.

20
 Figura 15 – Espectro de RMN 1H de 36e

(1-fenil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metanol (36a). Obtido com 80 % de rendimento sob a

forma de um solido branco. p. f. 110-111 °C (p.f. lit. 109-110 °C) (ASSIS et al, 2019.)

RMN de 1H (300,00 MHz, DMSO-d6) δ: 4,74 (2H, d, J 5,5 Hz, H-6); 5,33 (1H, t, J
5,5, OH); 7,60 (2H, t, J 7,3 Hz, H-4´); 7,71 (2H, t, J 7,3 Hz, H-2´, H-6´); 8,02 (2H, d, J
7,3 Hz, H-3´, H-5´); 8,78 (1H, s, H-5)

21
(1-(4-clorofenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metanol (36b). Obtido com 80 % de rendimento
sob forma de um solido branco. p. f. 143-144ºC (p.f. lit. 144-145 °C) (ASSIS et al,
2019.)

RMN de 1H (500,00 MHz, DMSO-d6) δ: 4,63 (2H, d, J 3,3 Hz, H-6); 5,33 (1H, t,J 3,3,
OH); 7,62 (2H, d, J 9,1 Hz, H-3´, H-5´); 7,92 (2H, d, J 9,1 Hz, H-2´, H-6´); 8,66 (1H, s,
H-5)

(1-(2,5-diclorofenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metanol (36c). Obtido com 90 % de

rendimento sob forma de um solido amarelo. p.f. 117-118 °C (p. f. lit. 114-116 °C)
(ASSIS et al, 2019.)

RMN de 1H (300,00 MHz, DMSO-d6) δ: 4,75 (2H, d, J 3,3 Hz, H-6); 5,47 (1H, t, J 3,3
Hz, OH); 7,84 (1H, dd, J 1,6 e 5,2 Hz); 7,93 (1H, d, J 5,2 Hz, H-3´); 7,99 (1H, d, J 1,6
Hz, H-6´); 8,55 (1H, s, H-5)

22
(1-(3,4-diclorofenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metanol (36d). Obtido com 76 % sob a
forma de um solido amarelo. p. f. 123-124 °C (p. f. lit. 122-123 °C) (ASSIS et al,
2019.)

RMN de 1H (500,00 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 4,62 (d, J = 5,7 Hz, H-6), 5,33 (t, J =
5,7 Hz, -OH), 7,86 (d, J = 8,8 Hz, H-5’), 7,96 (dd, J = 8,8 e J = 2,5 Hz, H-6’), 8,26 (d,
J = 2,5 Hz, H-2’),8,77 (s, H-5)

(1-(4-nitrofenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metanol (36e) Obtido com 69% de rendimento

sob forma de um solido amarelo. p.f 192-193 °C (p.f. lit. 192-193 °C) (AGALAVE et
al, 2011.)

RMN de 1H (500,00 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 4,64 (d, J = 5,7 Hz, H-6), 5,37 (t, J =
5,7 Hz, -OH), 8,23 (d, J = 9,3 Hz, H-2’ e H-6’), 8,43 (d, J = 9,3 Hz, H-3’ e H-5’), 8,88
(s, H-5)

23
 (1-(4-metoxifenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metanol (36f). Obtido com 95 % de
rendimento sob forma de um solido castanho. p. f. 128-129 °C (p. f. lit. 127-129 °C)
(ASSIS et al, 2019.)

RMN de 1H (500,00 MHz, DMSO-d6) δ: 3,94 (OCH3); 4,72 (2H, d, J 5,5 Hz, H-6);
7,22-7,25 (2H, m, H-3´,H-5´); 7,88-7,92 (2H, m, H-2´, H-6´); 8,64 (1H, s, H-5)

(1-(4-fluorofenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metanol (36g) Obtido com 55 % de rendimento sob

forma de um solido castanho. p. f. 133-134 °C (p. f. lit. 133-134 °C) (ASSIS et al, 2019.)

RMN de 1H (500,00 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 4,62 (d, J = 5,6 Hz, H-6), 5,30 (t, J =
5,6 Hz, -OH), 7,65 (d, J = 8,9 Hz, H-3’ e H-5’), 7,94 (d, J = 8,9 Hz, H-2’ e H-6’), 8,69
(s, H-5).

(1-(p-tolil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metanol (36h) Obtido com 54% de rendimento sob

forma de um solido amarelo. p.f. 124-125 °C (p.f. lit. 124-125 °C) (ASSIS et al,
2019.)

24
RMN de 1H (500,00 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 2,38 (s, -CH3), 4,61 (d, J = 5,6 Hz, H-
6), 5,24 (t, J = 5,6 Hz, -OH), 7,38 (d, J = 8,3 Hz, H-3´e H-5’), 7,76 (d, J = 8,3 Hz, H-2’ e
H-6’), 8,58 (s, H-5)

5.2 Síntese de ésteres híbridos 1H-1,2,3-triazol-tiofeno

Esquema 4 – Síntese dos ésteres híbridos 1H-1,2,3-triazol-tiofeno

A partir de álcoois triazóis 36a-h e cloreto de 2-tiofeno carbonila 37, obteve-se

ésteres 1H-1,2,3-triazóis conjugados ao núcleo tiofênico 32a-h, onde obtiveram
rendimento variando de 60 a 98%. Os compostos foram analisados por RMN 1H e a
critério de exemplificação será apresentado o espectro do compostos 32e.

Em seu espectro de RMN 1H observa-se os sinais simpleto em 5,50 ppm referente à

ressonância do hidrogênio metilênico H-6. Na região aromática observa-se os três
hidrogênios tiofênicos no formato de duplo dupletos. Em 7,22 ppm observa-se o duplo
dupleto referente à ressonância do hidrogênio H-4´´ que se encontra menos desblindado
devido ao maior distanciamento do enxofre e da carbonila. Este hidrogênio acopla com
H-3´´ com constante de acoplamento J de 3,8 Hz e com H-5´´ em 4,9 Hz. O duplo dupleto
em 7,85 ppm é referente à ressonância de H-3´´ e se encontra mais desblindado do que
H-4´´ pela proximidade da carbonila. Apresenta constante de acoplamento J de 3,8 Hz ao
acoplar com H-4´´ e de 1,2 Hz ao acoplar com H-5´´. Em 7,94 ppm observa-se o duplo
dupleto referente à ressonância do hidrogênio H-5´´ que se encontra mais desblindado por
estar vizinho ao enxofre. Este hidrogênio acopla com H-4´´ em 4,9 Hz e com H-3´´ em

25
1,2 Hz.
Os demais sinais são referentes à porção triazólica observados em 36e, os dupletos
em 8,23 ppm e 8,43 ppm referente aos hidrogênios H-2´/H-6´ e H-3´/H-5´ do anel
triazólico, apresentando acoplamento entre si com constante de acoplamento J de 9,3 Hz
e o simpleto em 9,06 ppm referente ao hidrogênio triazólico H-5´. (Figura 16).

Figura 16 – Espectro de RMN 1H de 53e

(1-fenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil tiofeno-2-carboxilato (32a), sólido branco, 80% de

rendimento, p. f. 98- 99 °C

RMN 1H (500 Hz, DMSO-d6) δ (ppm): 5.53 (2H, s, H-6), 7,10 (dd, J= 4,9 e 3.9 Hz, H-
4´´), 7,43-7,46 (m, H-4´), 7,51-7,54 (m, H-3´ e H-5´), 7,57 ( dd, J = 4,9 e 1,2 Hz, H-5´´),
7,84 (dd, J = 3,9 e 1,2 Hz, H-3´´), 7,73 (t, J = 8,9 Hz, H-2´ e H-6´), 8,64 ( s, H-5).

26
(1-(4-clorofenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil tiofeno-2-carboxilato (32b), sólido branco,
82% de rendimento, p.f. 132- 133 °C.

RMN 1H (500 Hz, DMSO-d6) δ (ppm): 5.48 (s, H-6), 7,22 (dd, J = 4,9 e 3.8 Hz, H-
4´´), 7,65 (d, J = 8.9 Hz, H-3´e H-5’), 7,84 ( dd, J = 3,8 e 1,3 Hz, H-5´´), 7,94 (m, H-3’’,
H-2’ e H-6’), 8,88 (s, H-5).

(1-(2,5-diclorofenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil tiofeno-2-carboxilato (32c), sólido

branco, 80% de rendimento, p. f.135-136 °C

RMN 1H (500 Hz, DMSO-d6) δ (ppm): 5.54 (s, H-6), 7,10 (dd, J = 4,9 e 3.8 Hz, H-
4´´), 7,44 (dd, J = 8,7 e 2,5 Hz, H-4´), 7,52 (d, J = 8,7 Hz, H-3´ ), 7,58 ( dd, J = 4,9 e 1,2
Hz, H-5´´), 7,68 (d, J = 2,5 Hz, H-6´), 8,17( s, H-5), 7,84 (dd, J = 3,8 e 1,2 Hz, H-3´´).

27
(1-(3,4-diclorofenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil tiofeno-2-carboxilato (32d), sólido
branco, 60% de rendimento, p.f. 124-124,7 °C.

RMN 1H (500 Hz, DMSO-d6) δ (ppm): 5.48 (s, H-6), 7,22 (dd, J = 5,0 e 3.8 Hz, H-
4´´), 7,85 ( m, H6´ e H-5´), 7,95 (m, H-3´´e H-5´´), 8,23 (d, J = 9,2 Hz, H-2´), 8,97 (1H,
s, H-5).

(1-(4-nitrofenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil tiofeno-2-carboxilato (32e), sólido amarelo

claro, 73 % de rendimento. O ponto de fusão não pode ser obtido pois o sólido se degradou
a 125 °C.

RMN 1H (500 Hz, DMSO-d6) δ(ppm) : 5.50 (s, H-6), 7,22 (dd, J = 4,95 e 3.8 Hz, H-
4´´), 7,85 (dd, J = 3,8 e 1,25 Hz, H-5´´), 7,94 (dd, J = 4,95 e 1,25 Hz, H-3´´), 8,23 (d, J
= 9,2 Hz, H-2´ e H-4´), 8,43 (d, J = 9,2 Hz, H-3´ e H-5´), 9,06 (1H, s, H-5).

28
(1-(4-metóxifenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil tiofeno-2-carboxilato (32f), sólido branco,
86% de rendimento, p.f. 101- 102 °C.

RMN 1H (500 Hz, DMSO-d6) δ(ppm): 3,84 (s, OCH3), 5.46 (s, H-6), 7,13 (d, J = 9,0
Hz, H-3´ e H-5´),7,21 (dd, J = 4,9 e 3.8 Hz, H-4´´), 7,79 (d, J = 9,0 Hz, H-2´ e H-6´), 7,84
(dd, J = 3,8 e 1,2 Hz, H-3´´), 7,93 (dd, J = 4,9 e 1,2 Hz, H-5´´), 8,73 (s, H-5).

(1-(4-fluorofenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil tiofeno-2-carboxilato (32g), sólido branco,

98% de rendimento, p.f. 120,6- 121,4 °C.

RMN 1H (500 Hz, DMSO-d6) δ (ppm): 5.47 (s, H-6), 7,22 (dd, J = 5,0 e 3.8 Hz, H-4´´),
7,43 (m, H-2´e H-6’), 7,84 (dd, J = 3,8 e 1,2 Hz, H-5´´), 7,95 (m, H-3’’, H-3’ e H-5’),
8,83 (s, H-5).

29
(1-(p-tolil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil tiofeno-2-carboxilato, sólido branco (32h), 78%
de rendimento, p.f. 140 - 141 °C.

RMN 1H (500 Hz, DMSO-d6) δ (ppm): 2,39 (s, CH3), 5,47 (s, H-6), 7,21 (1H, dd, J =
4,9 e 3.8 Hz, H-4´´), 7,39 (2H, d, J = 8,31 Hz, H-3’ e H-5’), 7,77(2H, d, J = 8,45 Hz, H-
2´e H-6’), 7,84 ( 1H, dd, J = 3,8 e 1,2 Hz, H-5´´), 7,93 (1H, dd, J = 4,9 e 1,2 Hz, H-3’’),
8,79( 1H, s, H-5).

5.3 Cromatografia em Camada Delgada do composto final 1H-1,2,3-triazol-tiofeno

A cromatografia em camada delgada (CCD) foi utilizada para acompanhar o

andamento da síntese do composto final 1H-1,2,3-triazol-tiofeno. Durante a síntese foi
elaborada uma placa de CCD foi montada, onde uma pequena quantidade de (1-(p-tolil)-
1H-1,2,3-triazol-4-il)metanol foi depositado em A; e em B o meio reacional. A partir disso
efetuou-se uma corrida com eluente de uma mistura de acetato de etila e hexano.
Observando a Figura 17 abaixo, percebe-se que existe uma mancha em B mais escura
(segunda mancha de cima para baixo); esta mancha é um indicativo de que o produto está
presente. Entretanto, como em A existe uma mancha na mesma altura que em B, na base
da placa, pode-se aferir que a reação não ocorreu totalmente em função da presença de
reagente, representado na mancha A.

30
Figura 12 – Placa de cromatografia em camada delgada de acompanhando de síntese do
composto final 1H-1,2,3-Triazol-tiofeno.

Fonte: O autor (2019).

5.4 Avaliação biológica antimalárica

Após a síntese de todos os compostos derivados dos 1H-1,2,3-triazóis foi possível

realizar a identificação dos compostos com potenciais antimaláricos, usando a cultura de
P. falciparum (3D7) para efetuar os testes de triagem dos compostos. A parasitemia dos
parasitas foi avaliada ao finalizar a incubação dos mesmos com os compostos durante
72h, usando um marcador duplo; 1) SYBR Green I, para marcar DNA e 2) MitoTracker
Deep Red, como marcador de mitocôndrias. Este marcado de mitocôndria é dependente
do potencial de membrana, garantindo assim apenas a marcação e seleção de parasitas
viáveis para a avaliação (SANTOS et al., 2020).
Foram selecionados para a triagem e teste em P. falciparum os oito compostos
sintetizados, onde foi possível identificar apenas dois compostos capazes de impedir
moderadamente o desenvolvimento da parasitemia de P. falciparum em 50% nas
concentrações testadas (53c e 53f). Os demais compostos testados obtiveram um
IC50>50µM (Figura 12). O processo para a obtenção dos valores de IC50 foram descritos
no item 4.5.2 da metodologia do trabalho.

31
 Figura 12: Ésteres 1H-1,2,3-triazol-tiofeno moderadamente ativos contra Plasmodium
falsciparum

A artemisinina foi o medicamento utilizado como controle positivo da cepa 3D7

avaliada na pesquisa, em concentrações variando de 0,15 nM a 160 nM durante 72 horas.
A parasitemia final também foi alcançada através da citometria de fluxo utilizando a dupla
marcação com SYBR Green I e MitoTracker Deep Red. Como resultado de IC50, o mesmo
variou de 6.20±0.73nM (SANTOS et al., 2020). Comparativamente, pode-se observar que
os compostos 53c e 53f não obtiveram resultados muito próximos ao medicamento
controle do experimento, contra a mesma cepa 3D7. E em razão disso, o ensaio de
citotoxicidade não foi realizado devido à sua atividade biológica não indicar vantagem
para a continuidade dos estudos.

7 CONCLUSÃO

Neste trabalho o objetivo principal foi alcançado com sucesso, onde foram sintetizados
oito compostos inéditos ésteres 1H-1,2,3-Triazol-tiofeno (32a-h) com ótimos
rendimentos variando de 60 a 98%; além da síntese do composto intermediário álcoois
1H-1,2,3-Triazol com rendimentos também considerados de moderado a excelente (54 a
90%).
Todos os compostos foram purificados por cromatografia em coluna e caracterizados
por ponto de fusão e espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear 1H. Todos os
sinais obtidos pelo espectro de RMN 1H corroboraram com a estrutura química de todos

32
os compostos sintetizados. Dessa forma comprovou-se que a metodologia utilizada foi
robusta.
A atividade antimalárica dos oito compostos propostos (53a-h) foi analisada pela
professora Célia Regina da Silva Garcia na USP, onde utilizou-se a cepa 3D7 de P.
falciparum como agente causador da malária. A partir disso identificou-se apenas dois
compostos capazes de impedir moderadamente o desenvolvimento da parasitemia de P.
falciparum em 50% nas concentrações testadas (53c - IC50 22,53µM e 53f - IC50
24,85µM). Os resultados não demonstraram ser promissores e por isso os estudos não
foram levados adiante.

33
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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