Microbiologia Industrial CEFET-PE Tcnicas de Laboratrio

CULTIVO DE MICRORGANISMOS EM LABORATRIO 1. INOCULAO E ISOLAMENTO

1.1 INOCULAO
Semear ou inocular significa introduzir artificialmente uma quantidade de amostra (inoculo) em um meio de cultura adequado, com a finalidade de iniciar um cultivo microbiano. Aps a inoculao, o meio de cultura incubado a uma temperatura adequada para o crescimento. A inoculao pode ser realizada em meio lquido, slido ou semi-slido, utilizando-se uma ala ou pipeta estril. Cultivo em meio lquido Habitualmente se realiza em tubos ou em frascos de laboratrio (erlenmeyers, p. ex.). O crescimento da populao microbiana evidenciado pela turvao do meio, por formao de pelcula ou por formao de sedimento.

Fig. 1 Tubo direita, meio BHI sem semeadura; tubo esquerda, meio BHI aps crescimento bacteriano. Observar turvao indicativa de multiplicao microbiana.

Cultivo em meio slido Pode ser conduzido em tubos ou em placas.

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a) Tubos com gar inclinado Para inoculao, move-se suavemente a ponta da ala sobre a superficie do gar com um movimento em zig-zag do fundo at a parte superior, com cuidado para no danificar (ferir) a superfcie do meio. b) Tubos com gar no inclinado Inocula-se introduzindo a ponta de uma ala em agulha no centro do meio. c) Inoculao em placas de Petri Pode ser em superficie ou em profundidade. A inoculao em superfcie pode ser realizada de duas formas: 1) Adiciona-se 0.1 mL de uma diluio da amostra com pipeta estril no centro da placa e espalha-se com o auxlio de uma ala de Drigalski estril. 2) Inocula-se com a ala de platina, conforme ser explicado mais adiante. No item tcnica de semeadura. Inoculao em profundidade: Adiciona-se 1 mL da amostra ou uma de suas diluies no centro de uma placa de Petri vazia. Verter sobre o inculo 20 mL de meio de cultura fundido e aquecido a 45C. Agitar a placa realizando movimentos circulares no sentido horrio e no sentido anti-horrio ou realizando movimentos em oito. Incubar as placas na posio invertida, uma vez que a elevada concentrao de gua no meio pode provocar condensao durante a incubao. No meio slido, cada clula vivel dar origem a uma colnia, portanto a inoculao em placas pode ser utilizada, no somente para cultivar microrganismos, como tambm para contar e isolar. Em geral quando se deseja obter colnias isoladas a partir de um determinado material, necessrio diluir a amostra em tubos com gua destilada estril.

TCNICA DE SEMEADURA
Alguns procedimentos so indispensveis para deteco e quantificao de diferentes microrganismos. Estas tcnicas consistem de regras de assepsia e segurana para evitar a contaminao dos meios de cultura com microrganismos do ambiente; para obter culturas puras; para evitar acidentes laboratoriais.
1.

A ala de platina deve ser flambada antes e depois de qualquer operao de semeadura. Para tanto, devem ser aquecidos ao rubro e a parte inferior do cabo deve ser passada na chama de 2 a 3 vezes. A posio correta para a flambagem da ala que a mesma faa um ngulo de 45 em relao mesa de trabalho. 2

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2. Antes de retirar o material para a elaborao do esfregao ou para semeadura deve-se esfriar a ala na parede interna do tubo ou na tampa da placa de Petri.
3.

Para a semeadura em tubos de ensaio, deve-se flambar rapidamente a boca dos mesmos logo aps a retirada do tampo de algodo. Este dever ser mantido seguro pelo dedo mnimo da mo que est segurando a ala. Aps a retirada do material com a ala, flambar novamente a boca do tubo e recolocar o tampo de algodo. Flambar a ala aps o uso. No pousar os tampes sobre a bancada.

4. As pipetas utilizadas em Microbiologia so previamente embrulhadas em papel e esterilizadas. Para uso, torcer o papel na regio central da pipeta, retirar primeiramente o papel na parte superior e depois a inferior (correspondente ponta da pipeta). Esta seqncia evita que a pipeta seja contaminada pelas mos do operador. Uma vez usada, a pipeta deve ser colocada dentro de uma cuba de vidro ou plstico, contendo desinfetante. 5. As placas de Petri devero ser abertas prxima ao bico de Bunsen para evitar contaminao com germes do ar. Uma vez semeadas as placas devem ser incubadas em estufas com tampa voltada para baixo. Tcnica de semeadura em placa de Petri a partir de cultura de bactria.

(a) (d)

(b)

(c)

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(d)

(f)

(g)

Procedimento: a.) flambar a ala; b.) remover o tampo de algodo; c.) introduzir a ala na cultura de bactria; d.) com a ala, delicadamente, semear na placa de Petri; e.) flambar novamente a ala; f.) a partir de um ponto j semeado, distribuir o material na placa, fazendo estrias no restante da placa.

1.2. ISOLAMENTO
Isolar significa separar um tipo de microorganismo a partir de uma populao que o contm. Em habitats naturais, raramente encontramos os microrganismos em cultura pura (um nico tipo de microrganismo), portanto faz-se necessrio um procedimento de isolamento para separar e identificar os distintos tipos de microrganismos presentes. O isolamento pode ser feito diretamente a partir de uma amostra quando os microorganismos esto numa proporo adequada. Quando o microrganismo que se deseja isolar se encontra em pequena quantidade, realizado o procedimento chamado enriquecimento que significa elevar a quantidade do microrganismo de interesse com relao ao restante da populao. A seguir se isola empregando o mtodo de isolamento por estrias ou por diluio, para posterior identificao. Procedimentos empregados no isolamento de microrganismos: a) isolamento por estrias b) isolamento por diluio Isolamento em placas por estrias
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Existem diversas tcnicas, todas com o objetivo de obter colnias isoladas. Tcnica A Consiste em carregar a ala de platina em O com a amostra e fazer estrias paralelas na quarta parte da superficie da placa; flambar a ala, esfriar, girar a placa 90 e continuar fazendo estrias recobrindo outro quarto da placa, aps tocar 3 ou 4 vezes a rea semeada inicialmente. Por ltimo, sem flambar novamente, fazer estrias no restante da superfcie da placa. Tcnica B Com a ala de platina carregada fazer 3 ou 4 estrias; flambar e fazer mais 3 ou 4 estrias perpendiculares s anteriores, flambar novamente e repetir o procedimento at esgotar a superficie da placa. Isolamento por diluio em meio slido usando tanto o mtodo de inoculao em profundidade como o mtodo de inoculao em superficie. Apenas necessria a diluio da amostra. Para tanto pode-se preparar diluies decimais utilizando-se gua estril ou outro diluente. A inoculao em profundidade pode ser realizada tal como descrita anteriormente. Uma outra forma preparar as diluies diretamente em tubos de gar fundido e aquecido (20 mL), agitar por rotao do tubo entre as mos e verter o meio em placas de Petri estreis.

CULTURA PURA
Uma cultura pura pode ser observada a partir de colnias isoladas em meio no seletivo, atravs de um exame microscpico que deve apresentar clulas morfologicamente semelhantes e com mesmo resultado para a colorao de Gram. Para facilitar a identificao, deve-se descrever as colnias macroscopicamente em funo do tamanho, forma, borda, elevao, transparncia e cor. Quando so obtidas colnias isoladas em meios seletivos, deve-se proceder a um novo isolamento em meio no seletivo utilizando-se o mtodo de estrias. Este procedimento conhecido como re-isolamento.

PESQUISA DE MICROORGANISMOS:
Quando se deseja saber se um determinado tipo de microorganismo est presente ou ausente numa amostra, deve-se realizar as seguintes etapas: a) enriquecimento b) isolamento por estrias em meios de cultura seletivos ou diferenciais. c) re-isolamento (meio de cultura no seletivo) d) identificao
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A etapa de enriquecimento pode subdividir-se em duas: pr-enriquecimento e enriquecimento seletivo. O pr-enriquecimento ou enriquecimento no seletivo deve ser realizado somente quando os microrganismos esto debilitados ou sofreram danos, sendo empregados apenas meios nutrientes lquidos, no seletivos. O enriquecimento seletivo realizado incubando-se a amostra em meios lquidos seletivos, ou seja, em presena de agentes qumicos ou biolgicos que favorecem o desenvolvimento em particular dos microrganismos pesquisados. Uma vez cumprida a etapa de enriquecimento, procede-se ao isolamento, empregando a tcnica de estrias em superfcie, utilizando-se meios de cultura seletivos e diferenciais. O re-isolamento em meios no seletivos, para obteno de culturas puras e identificao das mesmas, a etapa final. O resultado da pesquisa se d sempre expressando PRESENA ou AUSNCIA por grama ou mL de amostra inoculada na primeira etapa do procedimento (enriquecimento).

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