CULTIVO DE LINFÓCITOS DE SANGUE PERIFÉRICO

PARA ANÁLISE CITOGENÉTICA

EQUIPAMENTOS NO LCH
• Capela de fluxo laminar;
• Incubadora 37 °C;
• Centrifuga;
• Vortex;
• Banho maria;
• Sistema de captura e análise;
 OBJETIVO
• Obtenção de células metafásicas, por Indução de mitose em ambiente
controlado;
• Preparo de cromossomos metafásicos para análises citogenéticas.

Fluorescence in situ hybridization - FISH Spectral karyotyping - SKY Bandas G

COLETA DE MATERIAL BIOLÓGICO

• Punção de sangue periférico

• Tubo heparinizado Porque não posso
usar outro
anticoagulante ?
 OBTENÇÃO DE LINFÓCITOS
METAFÁSICOS-HIPOTÔNICOS
1. Cultivo celular (indução de mitose);
2. Interrupção da mitose;
3. Hipotonia;
4. Fixação.
MATERIAL DE CULTIVO
• Meio RPMI-1640; (Meio basal)
• Soro fetal bovino; (Suplemento)
• Fitohemaglutinina; (Mitógeno)
• Tubo cônico tipo falcon;
Preparo do meio:
4mL de Meio RPMI-1640
+
0,5mL de Soro fetal bovino
+
0,1mL de Fitohemaglutinina
CULTIVO CELULAR
• Amostra de sangue periférico heparinizado + meio suplementado;
• Incubação a 37°C por 72h.
 OBTENÇÃO DE LINFÓCITOS
METAFÁSICOS-HIPOTÔNICOS
1. Cultivo celular (indução de mitose);
2. Interrupção da mitose;
3. Hipotonia;
4. Fixação.
CULTIVO CELULAR
• 71h após o início da incubação administrar Colchicina;
• Interfere na polimerização do fuso mitótico.
 OBTENÇÃO DE LINFÓCITOS
METAFÁSICOS-HIPOTÔNICOS
1. Cultivo celular (indução de mitose);
2. Interrupção da mitose;
3. Hipotonia;
4. Fixação.
CULTIVO CELULAR
• Hipotonia celular:
• Após a obtenção de células metafásicas;
• Adiciona-se solução hipotônica de KCl (0,075M);
• Importante para a dispersão cromossômica.
 OBTENÇÃO DE LINFÓCITOS
METAFÁSICOS-HIPOTÔNICOS
1. Cultivo celular (indução de mitose);
2. Interrupção da mitose;
3. Hipotonia;
4. Fixação.
CULTIVO CELULAR
• Interrupção do coque hipotônico e fixação:
• Remove água da célula, matam e preservam;
SOLUÇÃO FIXADORA DE CARNOY

Metanol + Ácido Acético

Proporção: 3:1
FIXAÇÃO DAS CÉLULAS
BANDAMENTO G
• Método de diferenciação cromossômica mais utilizados nos
laboratórios de citogenética.
• Tripsina;
• GTG - Giemsa; RICAS EM BASES GC
RICAS EM BASES AT
• GTW - Wright;
BANDAMENTO G