ESPECTROFOTOMETRIA

Parte

1 espectro de absoro Parte 2 - Curva de calibrao Dosagem de amostra

Aplicaes da fotometria (Exemplo prtico) Dosagem de Proteina

A principal finalidade de uma medida espectrofotomtrica, nas regies do ultravioleta e visvel, avaliar quantidades.

Assim, extremamente importante efetuar uma rigorosa calibrao visando

obter resultados exatos. Para obter-se uma curva de calibrao alguns aspectos devem ser

considerados como: 1. 2. 3. A escolha de uma soluo padro ( Ex:proteina-Albumina) O estabelecimento de um branco adequado A seleo da rea espectral.(realizado em aula anterior)

Espectro de absoro do permanganato de potssio

A amostra (1) tem 66 mg/L de concentrao. As demais (2),(3),(4) e (5) foram diludas para (0,8), (0,6), (0,4) e (0,2) da concentrao da primeira amostra, respectivamente.

Absorbncia ( fixo)

Absortividade (constante para um fixo)

Lei de Lambert e Beer

A = c l

Concentrao da soluo que absorve a luz

Distncia percorrida pela luz atravs da amostra

Soluo padro
Constitui parte integrante da anlise quantitativa no laboratrio e usada na dosagem de amostra desconhecida. Uma soluo padro apresenta concentrao exata de uma substncia

conhecida, que servir como referncia na determinao fotomtrica de concentraes desconhecidas desta mesma substncia. Uma soluo padro tem grande importncia no preparo da curva de calibrao. Exemplo: uma soluo padro de albumina 10 mg/ml

Isto significa que foram pesados 10 mg de albumina que a seguir foram

dissolvidas em 1 ml de gua ou outro solvente. Evidentemente, a pessoa responsvel ( aqui o Armando! ) preparou uma

quantidade maior de soluo padro...

Preparo de uma curva padro (ou calibrao)

O preparo da curva de calibrao de grande importncia e deve ser bem entendido. Todo analista deve ser capaz de preparar suas prprias curvas de calibrao e interpretar os resultados obtidos. Para se obter o valor da concentrao de substncias cuja concentrao se

desconhece, necessrio estabelecer uma relao entre a absorbncia desta soluo em diferentes concentraes com as suas concentraes. Isto se chama curva de calibrao (curva padro).

BR 1.

10mg/ml

Preparar uma srie de padres exatos, cobrindo a faixa de trabalho usada ou indicada. Usar o padro recomendado para o mtodo a ser calibrado.

2. Dosar todos os padres de acordo com a tcnica recomendada. Efetuar as leituras colorimtricas, usando o branco apropriado para acertar o zero-A, alm do comprimento de onda recomendado pela literatura ou obtido pela curva de absoro espectral previamente realizada. 3. Obter os valores de Absorbncia. 4. Plotar os resultados em papel milimetrado, relacionando Absorbncia (ordenada) com as concentraes dos padres (abcissa). Examinar bem os pontos e decidir se eles sero cobertos por uma linha reta. Se os pontos aparentemente seguirem uma linha reta, traar uma curva de modo que mais se aproxime de todos os pontos obtidos. A curva no deve ser traada de ponto a ponto, mas interpolando atravs dos pontos. 5. Examinar a curva traada, avaliando se ela tem sensibilidade correta

Uma boa curva padro

A curva padro ideal deve ter ngulo aproximado de 45

0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 2 4 6 8

C
10 mg/ml

Na prtica, como ser a performance de vocs?

Curva padro de Albumina
Tubo Conc. (mg/ml) 2,0 Albumina 10 mg/ml (ml) gua (ml) Biureto (ml) 4,0 A

2
3 4

4,0
6,0 8,0

4,0
4,0 4,0

5
BR

10,0
--------1,0

4,0
4,0 -----

Temos que preparar as diluies do padro 10 mg/ml tendo como volume final 1,0 ml.

Albumina 10 mg/ml

Exemplo: Tubo 1 ( 2,0 mg/ml ) Recorremos a regra geral da diluio: Ci Vi = Cf Vf onde: Ci = concentrao inicial (10 mg/ml) Vi = volume a ser retirado do padro (?) Cf = concentrao final (2mg/ml) Vf = volume final (1,0 ml)

Albumina 2 mg/ml

Ci Vi = Cf Vf 10 mg/ml Vi (?) = 2 mg/ml 1,0 mg/ml Vi = 0,2 ml

Vi = 0,2 ml do padro + 0,8 ml de gua 1,0 ml (2 mg/ml)

Preenchendo a tabela para obter a curva...

Tubo Conc. Albumina (mg/ml) 10 mg/ml (ml) 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 ----gua (ml) Biureto (ml) 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 ----A

1 2 3 4 5 BR

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

-----

0,8

0,6
0,4 0,2 --1,0

Deixar os tubos em repouso por 10 minutos. Ler as absorbncias de todos os tubos contra o Branco no adequado. Traar o grfico e analisar.

Dosagem de protenas totais de uma amostra

1,0 ml da amostra 4,0 ml do reagente de biureto Esperar 10 minutos Ler contra o Branco

Amostra Conc. ?

Determinar a concentrao de protenas totais na amostra recorrendo curva padro

0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 2 4 6 8

C
10 mg/ml

O uso de Fator de Calibrao (FC)

um artifcio usado rotineiramente e seu clculo feito como:
concentrao padro FC = absorbncia padro

2. Obtendo o Fator de Calibrao pela prpria curva padro

A
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 2 4

Y2

FC = cotag
cateto oposto (sen )

Y1

cateto adjacente (cos )

Portanto: FC = 1 / tg Como: tg = sen / cos

C X1
6 8

X2 10

mg/ml

Ento: FC = cos / sen X2 - X1 Y2 - Y1

De onde se conclui que: cateto adjacente FC = cateto oposto

Finalmente, para calcular a concentrao da amostra: [amostra] = Absorbncia da amostra FC