uf f UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

INSTITUTO DE BIOLOGIA DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR GCM

ROTEIRO DE AULAS PRTICAS

PRTICA No 1 - FUNDAMENTOS DE FOTOMETRIA E ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORO

1. Princpios gerais O termo espectro foi utilizado inicialmente por Newton, quando este descobriu que a luz branca, ao atravessar um prisma, dividida em vrias cores. Atualmente, sabe-se que o espectro visvel apenas uma pequena parte do espectro eletromagntico. A luz , portanto, definida como uma forma de energia eletromagntica, formada por ondas que apresentam comprimentos diferentes. O comprimento de onda () medido em nm onde 1,0 nm equivale a 10-9 m. A tabela abaixo mostra as regies do espectro em relao ao comprimento de onda: REGIO: Raios X Ultravioleta Visvel Infravermelho Microonda () EM nm: 0,1-100 100-400 400-800 800-5000 5000-30000

INTERVALO (nm)

COR ABSORVIDA

COR COMPLEMENTAR

380-435 435-480 480-490 490-500 500-560 560-580 580-595 595-650 650-780

violeta azul azul esverdeada verde azulada verde Verde- amarelada amarelada alaranjada vermelha

Verde-amarelada amarela alaranjada vermelha prpura violeta azul Azul-esverdeada verde-azulada

A capacidade que as diversas substncias qumicas tm de absorverem luz em determinados comprimentos de onda pode ser utilizada para a sua determinao quantitativa e qualitativa, uma vez que o espectro de absoro caracterstico para uma determinada substncia e a quantidade de absoro

A cor dos objetos devida a duas causas: reflexo e absoro. Assim, um papel transparente, vermelho, recebe todos os da luz branca, mas reflete e transmite somente o vermelho, sendo o restante absorvido. Quando um objeto da cor branca, todos os so refletidos, se negro, porque, praticamente, todos os so absorvidos. No entanto, existe uma cor (ou ) que mais absorvida, a qual corresponde chamada cor complementar. Se uma soluo absorve na faixa de 435-480 nm, que corresponde radiao azul, a sua cor (cor complementar) ser o amarelo; a sensao visual do amarelo ser dada pelo conjunto de todos os outros componentes da luz branca, que no foram absorvidos. A tabela abaixo mostra as cores de cada intervalo de radiao da faixa do visvel e as suas respectivas cores complementares:

(intensidade) composto.

dependente

da

concentrao

do

A intensidade da radiao transmitida por uma soluo pode ser determinada em aparelho (fotmetro), que dever ser constitudo de: uma fonte luminosa, um seletor de (filtro ou prisma), um compartimento para a amostra, uma clula fotoeltrica (ou fototubo) e um sistema para amplificao e medida do sinal (corrente eltrica) proveniente da clula fotoeltrica (medidor de potencial eltrico = potencimetro). Pode-se selecionar o comprimento de onda que incidir sobre a soluo usando-se um monocromador (prisma ou retculo de difrao) ou um filtro ptico (vidro colorido ou quartzo, que transmite uma determinada faixa de na regio do ultravioleta, UV). Se o aparelho dispe de filtro ptico, denominado fotmetro ou fotocolormetro e se dispe de prisma ou retculo denominado de

espectrofotmetro. Este ltimo muito til, pois pode selecionar faixas de comprimentos de onda

extremamente estreitas, nas regies do UV, visvel e infravermelho (IV). A fotometria de absoro, portanto, presta-se tanto para a medida da concentrao de compostos naturalmente corados, como daqueles incolores, mas passveis de adquirirem cor mediante o emprego de certos reativos, bem como de compostos incolores que absorvem UV ou IV. Esta metodologia, por conseguinte, tem largo emprego na qumica analtica quantitativa. Alguns poucos exemplos: na determinao de atividade enzimtica ou nas dosagens de compostos orgnicos em fluidos biolgicos, como glicose, uria, protenas, etc., em que se dosa um produto colorido, obtido por meio de uma reao qumica, ou um produto incolor que absorva na regio do UV ou do IV. Ensaios imunolgicos quantitativos (como o ELISA: Enzyme-Linke

seguinte

formulao

pode

ser

feita:

Transmisso = It / Io (luz transmitida / luz incidente). Observe que o termo transmisso tem aplicao limitada, uma vez que, a It I0 menos a luz que absorvida no s pela substncia que se deseja medir, mas tambm pelo solvente, pelo material da cubeta e por outras substncias a existentes. Assim, It a luz transmitida aps as absores pela substncia de interesse mais os interferentes. Para corrigir tal efeito, admite-se It =1 (100% de Transmitncia) a luz transmitida aps I0 atravessar a cubeta contendo uma soluo denominada branco. Este branco contm todos os componentes do meio, exceto a substncia a ser medida. No escuro, bloqueada a passagem de luz para o fototubo (fotoclula), a Transmitncia = 0, ou seja, no h luz transmitida a ser medida. Na prtica, a transmitncia (T), que medida em uma escala de 0 (no escuro) a 100% (com o branco

ImmunoadSorbent Assay) tambm usam a fotometria.

1.1. Leis da fotometria O princpio bsico da fotometria baseado no fato de que: partculas dispersas ou dissolvidas em uma soluo interferem seletivamente com um raio de luz que passa atravs desta soluo. Esta interferncia depende dos seguintes fatores: a) cor do composto ou do tipo de ligao qumica presente; b) tamanho da partcula; c) transparncia da soluo; d) combinao dos fatores acima. Deste modo, as partculas podem absorver e transmitir parte do espectro, dependendo da sua concentrao, da sua natureza qumica e/ou da sua cor. Se pudermos medir o total de luz que incide (Io ) sobre a soluo de uma determinada substncia e o total da luz transmitida (It), podemos avaliar o quanto a substncia absorveu (absorvncia: A) O esquema abaixo mostra como funciona um fotmetro ou um espectrofotmetro:

na passagem da luz), pouco utilizada, pois substituda pelo valor de densidade ptica (D.O.) ou absorvncia (A), termo mais aceito atualmente, que corresponde ao logaritmo do inverso da transmitncia: A = log 1/T A absorvncia , desta forma, medida em uma escala de 0 (log 1/1) a infinito (log 1/0). A relao da A com a concentrao pelas de uma da Leis substncia de pode ser a

compreendida absorvncia

Lambert-Beer: proporcional

soluo

concentrao da substncia na soluo e distncia percorrida pelo feixe luminoso que atravessa a soluo (caminho ptico): A = . l.c, onde: = coeficiente extino molar, que constante para cada substncia, e definido como a absovncia (A) de uma soluo l molar da substncia em um determinado comprimento de onda (), numa cubeta de caminho ptico l = l cm (largura da cubeta) e c = concentrao da soluo.

Observe, portanto, que a absorvncia uma funo linear da concentrao. Assim, para uma mesma substncia, considerando-se o caminho ptico constante, a A diretamente proporcional concentrao desta substncia. No entanto, as Leis de LambertBeer nem sem pre so obedecidas. Algumas desobedincias so conhecidas e atribudas a fatores como: mudana na natureza do soluto, valores muitos altos ou muitos baixos das concentraes das solues, etc. Tambm as presenas de cidos, bases e sais na soluo podem contribuir para essas desobedincias, por estarem mais completamente dissociados, medida que aumenta a diluio, visto que absoro da luz pelos ons diferente daquela apresentada pelas molculas no ionizadas. Para se evitar discrepncias das Leis de Lambert-Beer, devese trabalhar com solues mais diludas e construir, previamente, uma curva padro, em que so usadas concentraes conhecidas (e crescentes) da substncia em anlise, e verificar as absorvncias no comprimento de onda indicado e na cubeta de caminho ptico adequado. Desta forma, teremos os limites de 4. Procedimentos 4.1. Procedimentos gerais de ajuste do fotmetro Ligar o aparelho; Selecionar o comprimento de onda adequado. Ajustar o zero de transmitncia; Introduzir a cubeta com o branco (gua destilada) e ajustar a 100% de transmitncia, no boto 3. Reagentes Soluo de KMnO4 3 mg /100 mL.

correspondente; Repetir os ajustes acima. Obteno do espectro de absoro: Ajustar o comprimento de onda inicialmente em 450 nm; Ajustar o 100% de transmitncia com o branco. Isto coincide com o 0 de absovncia; Colocar a cubeta com a soluo de permanganato de potssio concentrao de 3 mg/100 mL; Ler a absorvncia e registr-la; Ajustar o a 490 nm, repetir o ajuste do branco, recolocar a soluo de permanganato e ler, novamente, a absorvncia correspondente a este ; Repetir estas operaes para os seguintes valores de : 530, 570 e 610; Fazer o grfico do espectro de absoro do permanganato em papel milimetrado, relacionando absorvncia (ordenada) contra (abcissa); Determinar o de absoro mxima.

concentrao nos quais a soluo obedece s Leis de Lambert-Beer, ou seja, onde h linearidade. emprego da curva padro, podemos, Com o tambm,

determinar a concentrao de uma soluo problema. O comprimento de onda () usado para a obteno da curva padro obtido pela preparao do espectro de absoro da substncia em estudo e , normalmente, o onde a absorvncia para a substncia apresenta o valor mximo.

2. Objetivos Determinar o espectro de absoro de uma soluo de permanganato de potssio; Caracterizar o comprimento de onda () onde ocorre absoro mxima; Construir uma curva padro do permanganato de potssio. 450 490 A

530 570 610 Dados:

de Lambert-Beer, admitindo que nada interferiu em seu procedimento. 5.3- Explique por que no se deve usar cubetas de vidro para leituras na regio do ultravioleta..

6. Questes complementares 1) Espectrofotmetro: TURNER, modelo 330. 2) Soluo: KMnO4 ( 3 mg/ 100 mL ). 3) - Comprimento de onda. 4) A - Absorvncia. 4.2. Curva padro - Obteno Preparar solues de permanganato de potssio nas concentraes citadas na tabela abaixo: Concentrao de KMnO4 (mg/100mL) 3,00 2,00 1,50 1,00 0,75 0,50 Ler as absorvncias das diferentes solues de permanganato ( : 530 nm) e registr-las; Construir, em papel milimetrado, a curva padro (absorvncias na ordenada e concentraes na abcissa), considerando os pontos zero de absoro e de concentrao. 6.1 Voc pesou l, 2 e 3 mg de permanganato de potssio e dissolveu cada uma quantidade em 50 mL. As absovncias destas solues, em 530nm, foram, respectivamente, 0,2, 0,4 e 0,6. A abosvncia de uma soluo desconhecida do sal foi 0,3. Calcule a sua concentrao, em mg/100mL. 6.2 Para a dosagem da glicose do sangue de um paciente, a amostra foi diluda em 10 vezes (no processo de desproteinizao). 1mL do desproteinizado e 2mL de Absorvncia cada um dos padres de glicose (P) de 10, 20 e 30mg/100mL foram processados para a dosagem da glicose, sendo o volume final, em todos os tubos, ajustados para 5mL. em Aps as de leituras onda

espectrofotomtricas

comprimento

adequado, as absorvncias obtidas foram: Amostra...................... ...0,180 P-10 mg/100mL............. 0,150 P-20 mg/100mL..............0,298 P-30 mg/100mL..............0,400. Qual a concentrao da glicose no sangue do paciente? 6.3 - O coeficiente de extino molar () de uma substncia de peso molecular 200 14,5. Uma soluo desta substncia apresentou , numa cubeta de caminho ptico de 2 cm, a absorvncia de 0,800. Qual a

concentrao (em mg/L) da substncia nesta soluo? 5. Questes para discusso 5.1- Voc dispe dos filtros azul, verde, vermelho e amarelo de um fotmetro. Qual deles voc usar, para que uma soluo de cor vermelha tenha uma absoro (contra o branco) o mais prximo de zero possvel? 5.2- Avalie, nas condies experimentais acima, se o permanganato de potssio segue, estritamente, as Leis

PRTICA No 2 - ESTUDO FSICO-QUMICO DAS PROTENAS

1. Introduo As protenas, excluindo a gua, so os compostos qumicos mais abundantes nos organismos, com extrema versatilidade de conformaes e funes. O estudo de aspectos importantes da bioqumica nos leva, invariavelmente, ao estudo de protenas. Portanto, torna-se importante a existncia de mtodos adequados de purificao e quantificao destes compostos. A purificao e caracterizao de uma protena baseiam-se em suas caractersticas fsico-qumicas. Por serem das Dependendo dos aminocidos que fazem parte protenas (estrutura primria), podem-se ter
R R O C C NH HN CH C CH O R 0 C NH H Cu+2 R NH C H C O

formadas por aminocidos e considerando-se que os aminocidos aromticos absorvem luz na regio ultravioleta, as protenas, em geral, podem ser detectadas atravs da absoro de luz a 280 nm. No entanto, a deteco de protenas em materiais biolgicos envolve reaes especficas com determinados reativos, os quais originam substncias coloridas que absorvem luz na regio visvel, permitindo a sua quantificao. Dentre os mtodos utilizados, situa-se o mtodo do biureto, que baseado na reao do sulfato de cobre em meio alcalino (reativo do biureto) com protenas e peptdeos (no mnimo tripeptdeos). O nome do mtodo provm do fato de que a uria aquecida a 180oC dar reao positiva com desprendimento de amnia:
0 C NH2 N H H H N 0 C NH2 BIURETO H NH3 0 C NH2 0 C NH2 N H

diferenas fisico-qumicas individuais entre protenas numa mistura, as quais podem ser utilizadas para a separao e purificao destes compostos. Por exemplo, mtodos cromatogrficos podem ser baseados em diferenas no peso molecular e/ou carga eltrica. As protenas so macromolculas coloidais, possuem uma camada de solvatao ou hidratao. Ao seu redor interagem molculas de gua, que permitem a sua solubilidade. Diversas substncias, entre elas os sais inorgnicos ((NH4)2SO4, Na2SO4 e outros) podem alterar a camada de solvatao de protenas, aumentando (salting-in) solubilidade. As protenas possuem estruturas espaciais bem definidas que, segundo o nvel de complexidade, podem ser caracterizadas como estruturas secundria, terciria e quaternria. A funo biolgica est associada ou diminuindo (salting-out) a

estrutura espacial, que, por sua vez, depende da estrutura primria (a simples disposio dos

aminocidos na cadeia polipeptdica). Certos agentes podem alterar a conformao espacial original das protenas, sem que ocorra alterao da estrutura primria, modificando, desta forma, algumas de suas propriedades biolgicas. Este efeito, chamado de desnaturao, pode ser produzido pelo aumento da

URIA Quando a substncia contm duas ou mais ligaes peptdicas, produz uma cor azul-violeta com o reativo de biureto. Esta cor desenvolvida devida a um complexo entre o on cprico e duas cadeias peptdicas adjacentes:

temperatura do meio, alterao do pH ou pela adio de solventes orgnicos. A alterao da estrutura primria das protenas (quebra das ligaes peptdicas) ocorre por tratamento quente (100 C) em presena de cido ou base forte ou atravs de adio de enzimas proteolticas. Determinados agentes podem ser usados na precipitao de protenas, o que til na desproteinizao de materiais biolgicos, como o sangue: nions de cidos complexos (tricloroactico, tnico, fosfotngstico) formam sais insolveis onde a protena funciona como ction; metais pesados (cobre, zinco, prata, mercrio) em meio alcalino formam precipitados onde a protena atua como nion. Os aminocidos componentes de uma protena podem ser genericamente caracterizados se, aps sua hidrlise, efetuarmos a reao da ninhidrina. A ninhidrina (hidrato de tricetoidrindeno) reage com aminocidos produzindo cor prpura. uma reao inespecfica quanto identidade do aminocido, sendo a reao dependente da presena de grupos amina livres. O aminocido prolina, na verdade um iminocido, ao reagir com a ninhidrina produz colorao amarela.
o

Soluo concentrada de protenas. Soluo de ninhidrina 0,1g% (P/V). Soluo de aminocidos. cido tricloroactico (TCA ) 10% (P/V). Soluo saturada de sulfato de amnio (NH4)2 SO4. Soluo tampo de fosfato de sdio 0,2 M, pH 7,0. Etanol gelado. Resina Sephadex G-25 (faixa de separao PM 1000-5000 D). Soluo contendo compostos de diferentes pesos moleculares (azul de dextran: 2.000.000 D, vitamina B12: 1355 D em tampo pH 7,0, contendo sacarose).

4. Procedimentos Enumerar 12 tubos de ensaio

4.1. Reao do Biureto: Tubo 1 (tubo branco): colocar: 1 mL do reativo do Biureto + 0,5 mL de gua destilada; Tubo 2: colocar: 1 mL do reativo do Biureto + 0,5 mL da soluo diluda de protenas; Tubo 3: colocar: 1 mL do reativo do Biureto + 0,5 mL da soluo de aminocidos; Comparar o desenvolvimento de cor nos tubos.

2. Objetivos Realizar Realizar reao especfica para deteco de

protenas (reao do Biureto); reao especfica de deteco de

4.2. Reao da ninhidrina: Aquecer gua 100oC Tubo 4 (tubo branco): colocar 2 mL da soluo de ninhidrina + 0,5 mL de gua destilada; Tubo 5: colocar 2 mL da soluo de ninhidrina + 0,5 mL da soluo diluda de protenas; Tubo 6: colocar 2 mL da soluo de ninhidrina + 0,5 mL da soluo de aminocidos; Ferver os tubos de ensaio 4, 5 e 6 por 5 minutos; Comparar o desenvolvimento de cor nos tubos.

aminocidos (reao com a ninhidrina); Verificar a alterao de solubilidade de protenas em presena de solues salinas e solventes orgnicos; Verificar a ao de agentes desnaturantes; Observar a separao cromatogrfica (cromatografia de excluso molecular) de substncias de pesos moleculares diferentes.

3. Reagentes Reagente do Biureto: CuSO4 em soluo alcalina. Soluo diluda de protenas.

4.4. Precipitao cida:

Tubo 7 (tubo de centrfuga): colocar 1 mL de TCA 10% (P/V). + 1 mL da soluo diluda de protenas; Agitar e observar; Centrifugar (por 10 minutos), separando as fraes sobrenadante e precipitado; Colocar 0,5ml do sobrenadante no Tubo 8; Adicionar 1mL do reativo do biureto ao Tubo 8; Adicionar tampo ao precipitado do Tubo 7. Agitar; Comparar os resultados.

densa, devido presena da sacarose, esta se depositar sobre o gel. Continuar adicionando o tampo e acompanhar o fracionamento dos componentes da amostra, anotando os resultados.

5. Questes para discusso: 5.1- Explique o que ocorreu em cada etapa executada. 5.2- Pelos resultados obtidos no item 4.5, podemos afirmar que a soluo de sulfato de amnio saturado

4.5. Efeito da adio de sais: Tubo 9: Colocar 2 mL da soluo diluda de protenas + 2 mL da soluo saturada de sulfato de amnio. Agitar. Centrifugar 3000rpm por 10 minutos, separar as fraes sobrenadante e

precipita todas as protenas? Por qu? Como podemos saber se esta precipitao reversvel ou no? 5.3.- Pelos resultados obtidos no item 4.6, podemos afirmar que o etanol gelado precipita todas as protenas? Por qu? Como poderamos comprovar isto? O precipitado obtido (aps centrifugao) seria

precipitado; Colocar o sobrenadante no tubo 10. Adicionar igual volume de TCA 10% (P/V)., agitar e centrifugar novamente. Se aparecer algum precipitado, tentar dissolv-lo com 1 mL de tampo; Adicionar 1 mL de tampo ao precipitado do tubo 10 e agitar. Verificar o que acontece.

redissolvido em tampo? Por qu? 5.4 - Qual foi a ordem de eluio das amostras na coluna (item 4.7)? Por qu?

6 - Exerccios complementares: 6.1- Voc dispe num laboratrio de dois frascos idnticos, porm, no rotulados. Um deles contm

4.6. Efeito da adio de solventes orgnicos: Tubo 11: colocar 1mL da soluo de protenas + 2mL de etanol gelado (lentamente at o

soluo de aminocidos e, o outro, contm uma soluo de protenas. Qual seria o seu procedimento para identificar as duas solues e rotular os frascos?

aparecimento de uma ligeira turvao). 6.2- Descrever um mtodo que permita separar a 4.7. Cromatografia em peneira molecular: Montagem da coluna: numa coluna de vidro (aprox. 30 x 1,5 cm), colocar o gel suspenso em tampo pH 7,0, deixando a extremidade inferior da coluna aberta, at que o gel se acame. Cuidado para no deixar secar o gel, adicionando sempre tampo, at que o gel esteja equilibrado e acamado. Aplicao da amostra: aplicar 1mL da amostra sobre a superfcie da coluna, que dever estar com cerca de 2 cm de tampo sobre o gel. Como a amostra est mais protena no 6 de uma mistura que contenha seis protenas, sabendo-se que: a) as protenas de no 1, 3 e 5 precipitam pelo sulfato de amnio a 40% de saturao; b) as protenas de no 1, 2, 4 e 6 precipitam pelo etanol gelado; c) as protenas de no 1, 3, 5 e 6 precipitam pelo sulfato de amnio a 75% de saturao; d) os pontos isoeltricos das protenas 1 e 3 so iguais a 6,5 ; o da protena 2 7,2; o das protenas 4 e 6 se igualam a 6,3 e o da protena 5 6,8.

6.3- Num extrato biolgico existem hormnios proticos e isoenzimas, que devem ser isolados da maneira mais pura possvel para uso posterior. Voc dispe de sulfato de amnio, TCA, etanol, resinas cromatogrficas, equipamentos cromatogrficos e de eletroforese. Que mtodos voc poderia utilizar? Explique o seu princpio e como execut-lo. Que mtodos no poderiam ser utilizados?

com os seguintes resultados: a) reao fortemente positiva para o biureto e fracamente positiva para ninhidrina; b) a adio de cido forte gelado e posterior neutralizao do pH, no alteraram os resultados do item anterior; c) Com a adio de cido forte quente (100oC por 2 h) e posterior resfriamento e neutralizao do pH , a reao da ninhidrina foi positiva (fortemente positiva). Interprete e explique estes resultados.

6.4- Uma soluo a 1% de hormnio anti-diurtico (nonapeptdio) foi submetida aos tratamentos abaixo

PRTICA No 3 - CINTICA ENZIMTICA

1. Introduo Enzimas so catalisadores biolgicos: aceleram a velocidade das reaes qumicas, diminuindo a energia de ativao. Possuem, em geral, estrutura protica, sendo que foram descritas algumas molculas de RNA com atividade cataltica. As enzimas no alteram a

meio reacional so determinantes para a velocidade reacional. A velocidade de uma reao catalisada pode ser determinada, em instantes iniciais, atravs da

determinao do produto formado por unidade de tempo (caso mais comum) ou atravs da mensurao do substrato consumido por unidade de tempo. O produto formado pode ser medido diretamente atravs de alguma propriedade fsico-qumica caracterstica, ou ento fazer uma reao qumica com este produto produzindo um outro que possua propriedades apropriadas para medida. Uma propriedade freqentemente usada para tal fim a capacidade do produto a ser quantificado de absorver determinados comprimentos de onda de radiaes

constante de equilbrio nem a variao de energia livre das reaes, sendo regeneradas, sob a forma original, ao final da catlise. As molculas reagentes so

denominadas substratos (S) e produtos (P) so formados ao final. As enzimas so, geralmente, bastante

especficas com relao aos substratos, formando um complexo com estes durante a catlise: E + S ES E + P Algumas teorias procuram explicar esta

luminosas (o que no deve, em princpio, acontecer com qualquer outra substncia encontrada no meio

especificidade: 1- teoria de Fischer (chave-fechadura) , onde enzima e substrato seriam complementares; 2teoria de Koshland do encaixe induzido, ou seja, o substrato durante a catlise se encaixa na enzima; 3teoria que prope o perfeito encaixe no estado de transio, estado onde a barreira energtica (energia de ativao) foi vencida. Diversos so os fatores que influenciam a velocidade de uma reao enzimtica. Por terem estrutura protica, alteraes no pH, na temperatura, na fora inica do meio reacional podem modific-las (s vezes, at a estrutura dos substratos alterada), modificando, assim, a velocidade das reaes. Como esperado, a concentrao de substrato e de enzima no

reacional), aplicando-se os princpios da fotometria. Os ensaios de atividade enzimtica

desenvolvidos na aula prtica sero realizados com a enzima FOSFATASE, presente no extrato aquoso da batata inglesa. No ensaio, a enzima catalisar a reao de desfosforilao do para-nitrofenil fosfato, resultando na formao de um composto de cor amarelada em meio alcalino, o para-nitrofenol. Portanto, a atividade enzimtica colorao ser detectada no pelo aparecimento da meio reacional.

amarela

2. Objetivos Avaliar o efeito de alguns fatores que interferem na atividade enzimtica, tais como, o tempo de reao, a concentrao de substrato e a concentrao de enzima.

10

3. Reagentes Uma batata inglesa mdia (cerca de 110g). Substrato: para-nitrofenilfosfato de sdio 1mM (soluo fresca). NaOH 0,02N. Liquidificador. 4. Preparo de frao com atividade de fosfatase alcalina Descascar a batata; Homogeneizar a batata descascada em 200mL de gua, usando um liquidificador; Filtrar o homogeneizado em algodo.

IMPORTANTE: O homogeneizado deve ser usado no prazo mximo de 30 minutos.

5. Procedimentos Enumerar os tubos de ensaio que seu grupo vai usar; Colocar sempre os reagentes na mesma ordem em todos os tubos; O HOMOGENEIZADO DEVER SER

ADICIONADA SEMPRE POR LTIMO. Aps adicionar o homogeneizado, agite a mistura suavemente; A incubao ser realizada temperatura ambiente.

5.1. INFLUNCIA DO TEMPO DE REAO TUBO 1 2 3 4 5 6 SUBSTRATO (mL) 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 GUA (mL) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 HOMOGENEIZADO (mL) 0,5* 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Tempo aps a adio de 2mL de NaOH 0,02N (min) 0 2 5 10 20 30

*Adicionar 2mL de NaOH 0,02N antes da adio do homogeneizado (SOMENTE NO TUBO 1) Observe a cor desenvolvida em todos os tubos. Anote os resultados.

5.2. INFLUNCIA DA CONCENTRAO DA ENZIMA TUBO 7 8 9 10 SUBSTRATO (mL) 3,0 3,0 3,0 3,0 GUA (mL) 1,0 0,9 0,5 0,0 HOMOGENEIZADO (mL) 0,0 0,1 0,5 1,0

Aps 5 minutos de reao, adicione 2mL de NaOH 0,02N em cada tubo. Observe a cor desenvolvida nos tubos (7-10). Anote os resultados.

5.3. INFLUNCIA DA CONCENTRAO DO SUBSTRATO. (curva [S] x velocidade da reao)

11

TUBO 11 12 13 14 15 16

SUBSTRATO M 0,0 54,5 163,0 272,0 545,0 909,0

SUBSTRATO (mL) 0,0 0,3 0,9 1,5 3,0 5,0

GUA (mL) 5,0 4,7 4,1 3,5 2,0 0,0

HOMOGENEIZADO (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Aps 10 minutos de reao, adicione 2mL de NaOH 0,02N em cada tubo. Observe a cor desenvolvida nos tubos (11-16). Anote os resultados.

6. Questes para discusso: 6.1- Por que a enzima (homogeneizado) s deve ser adicionada por ltimo? 6.2- Como so fixadas as condies de dosagem de uma determinada enzima em condies timas? 6.3- Explique os resultados de cada item.

TUBO 1 2 3 4 5

ENZIMA (mL) 0,2 0,4 0,6 0,8 0,8

7.2 - Ao estudar-se in vitro a cintica da reao onde a 7. Exerccios complementares 7.1- A variao da velocidade de reao de uma enzima em funo de sua concentrao foi analisada em 5 tubos conforme o indicado na tabela abaixo. Cada tubo recebeu 0,8 mL de uma soluo de substrato 0,01mM. A enzima usada (E) estava contida num homogeneizado heptico a 10g% e na tabela abaixo esto indicados os volumes deste homogeneizado adicionado a cada tubo. O volume final em cada tubo foi o mesmo, ajustado com tampo apropriado. Ao final de 30 minutos de reao a quantidade de produto formado foi igual em todos os tubos, exceto no tubo 5 que foi mantido a 0oC durante toda a experincia. Com estas informaes, discuta: a) o fato de ter sido obtida a mesma quantidade de produto nos quatro primeiros tubos; b) sem alterar o tempo de reao, como seria possvel aumentar a quantidade de produto formado nesses quatro tubos? c) o que teria acontecido no tubo 5? formao do produto P (fumarato), a partir do substrato S (succinato) catalisada pela enzima E (succinato desidrogenase) verificou-se que: I) no sendo possvel obter-se a enzima pura, usou-se, sempre, um mesmo volume do mesmo extrato celular; II) a quantidade de substrato inicial estava em ligeiro excesso; III) o pH tinha sido previamente estudado e escolheu-se aquele que proporcionava o mximo de atividade enzimtica; IV) a formao de produto cresceu entre o instante zero (incio da reao) at 20 minutos da reao; V) a partir do 20o minuto de incubao, a velocidade de reao medida pela quantidade de produto formado por minuto, diminuiu. VI) todas as observaes acima foram obtidas em temperatura tima de reao. Pede-se: discutir os fatores, dentre aqueles analisados, que poderiam acarretar a diminuio da velocidade a partir do 20o minuto de incubao.

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PRTICA N 4 URINLISE 1. Introduo Os rins desempenham suas funes mais importantes ao filtrarem o plasma sangneo e removerem as substncias do filtrado em quantidades variveis, dependendo das necessidades do corpo. Alm disso, eles depuram as substncias indesejveis do filtrado (e, portanto, do sangue), ao excret-las na urina, enquanto devolvem ao sangue as substncias filtrada reabsorvida pelos rins. Entretanto, quando a carga filtrada excede a capacidade de reabsoro da glicose, a sua excreo urinria se d em nvel detectvel. Um grande aumento da concentrao plasmtica de glicose, capaz de elevar a carga de filtrao renal acima de 320 mg/minuto, ocasiona a excreo do excesso de glicose na urina. A glicose plasmtica no indivduo sadio quase nunca fica elevada o suficiente para causar a sua excreo pela urina. A glicosria (presena de glicose na urina) pode estar relacionada a vrias causas, como, por exemplo: fatores endcrinos, hepticos, neurolgicos e alimentares. No diabetes mellitus no-controlado, o nvel plasmtico de glicose pode atingir valores elevados, com conseqente excreo urinria desta ose. A presena de glicose na urina pode ser evidenciada atravs da reduo alcalina pelo cobre. Portanto, utiliza-se para a pesquisa de

indispensveis ao metabolismo. A intensidade de excreo de diferentes substncias na urina representa a soma de trs processos renais: filtrao glomerular, reabsoro de substncias dos tbulos renais para o sangue e secreo de substncias do sangue para os tbulos renais. A urina normal essencialmente composta de gua, tem colorao varivel entre o incolor e o amarelo (dependente da dieta, atividades fsicas e principalmente da ingesto de gua), e carreia substncias de excreo, resultantes do metabolismo do organismo. Todo sangue, ao passar pelos rins, filtrado ou depurado, eliminando seus catablitos, que so veiculados pela gua. Entretanto, podem aparecer na urina elementos

glicose na urina o reagente de Benedict, que consiste de uma soluo de sulfato de cobre em um meio alcalino. Os chamados corpos cetnicos (acetoacetato, cido -hidroxibutrico e acetona), quando presentes em nveis elevados na urina, indicam um quadro de jejum severo e prolongado ou diabetes mellitus no tratado. Em condies normais, o cido acetoactico e o cido -hidroxibutrico que entram na corrente sangnea so transportados, to rapidamente, para os tecidos, que suas concentraes plasmticas, combinadas, raramente se elevam acima de 3 mg/dL. Os corpos cetnicos so liberados do fgado e transportados at as clulas. Todavia, as clulas so limitadas, quanto quantidade de corpos cetnicos que podem oxidar, devido a vrias razes, dentre as quais pode-se destacar a quantidade de oxaloacetato que necessrio para iniciar a oxidao de Acetil-CoA no ciclo do cido ctrico. Os corpos cetnicos no sangue e na urina podem atingir nveis

anormais, como: albumina, glicose e altas quantidades de corpos cetnicos, sais e pigmentos biliares

(urobilinognio e urobilina). A anlise da urina fornece valiosas informaes no diagnstico de doenas renais, das vias urinrias, do trato genital e at de doenas sistmicas. Esta prtica refere-se a dois dos exames de rotina de urina, atravs dos quais possvel observar o metabolismo anormal envolvendo algumas substncias como a glicose e os corpos cetnicos. Em condies normais, no aparece glicose na urina em quantidade detectvel pelos reagentes

convencionais, visto que, praticamente, toda a glicose

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extraordinariamente altos, provocando uma condio conhecida como: cetonemia e cetonria,

verde (qualquer tom) com precipitado amarelo castanho ou marrom vermelho tijolo

positivo + positivo ++ positivo +++

respectivamente. A pesquisa de corpos cetnicos na urina realizada atravs do reagente de Imbert. Este reativo de uma soluo de nitroprussiato de sdio em cido actico glacial.

4.2. Pesquisa de Corpos Cetnicos colocar 8 ml de urina em um tubo de ensaio; adicionar 12 gotas do Reativo de Imbert e misturar; inclinar o tubo e com o auxlio de uma pipeta, deixar

2. Objetivo Analisar amostras de urina, quanto presena ou ausncia de glicose e de corpos cetnicos.

escorrer pelas paredes do tubo aproximadamente 3 ml de NH4OH 10%, lentamente, de tal maneira que os dois lquidos no se misturem; observar a superfcie de contato entre os dois lquidos.

3. Reagentes 8,5 mL de urina. 2,5 mL de Reativo de Benedict ( CuSO4; citrato de sdio e Na2CO3). 1 mL de Reativo de Imbert ( nitroprussiato de sdio e cido actico glacial). 3 mL de NH4OH 10% (p/v).

RESULTADOS Nenhuma alterao ocorrida negativo

Presena de um anel violeta 4. Procedimentos 4.1. Pesquisa de Glicose colocar 2,5 ml do Reativo de Benedict em um tubo de ensaio; depositar 4 gotas de urina lmpida; misturar e levar ao banho-maria at entrar em ebulio; deixar esfriar espontaneamente (aproximadamente 15 minutos); observar a colorao do lquido. 5- Questes para Discusso

positivo

5.1- Comente (sucintamente) a participao dos hormnios: adrenalina, cortisol, glucagon e insulina no controle da glicemia, envolvendo as vias metablicas e os seus mecanismos de ao. 5.2- Por que em condies de jejum severo e prolongado ou o diabete melito no compensado pode acarretar uma cetonemia e conseqente cetonria? 5.3RESULTADOS

Conceitue

diferencie

(metabolicamente):

diabetes insipidus e diabetes mellitus e diabetes

negativo traos

cor inalterada (azul) verde-azulado ou verde

renallis.

PRTICA No 5 - ISOLAMENTO DE DNA DE CLULAS DE CEBOLA

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1. Introduo Nos organismos eucariontes e procariontes a informao gentica est localizada nas molculas de cido desoxirribonuclico (DNA), que so polmeros de nucleotdeos, nos quais o acar a desoxirribose. O DNA est localizado principalmente no ncleo dos eucariontes, associado com protenas (principalmente histonas) e dentro de organelas como mitocndrias e cloroplastos. Os mtodos utilizados para a deteco e dosagem do DNA celular nuclear de eucariontes (pois o de cloroplastos e mitocndrias no em geral, detectado pelas tcnicas rotineiras) implicam no rompimento das membranas citoplasmtica e nuclear. Neste experimento, o rompimento das membranas plasmtica e nuclear ser realizado com o tratamento do detergente aninico duodecil sulfato de sdio (SDS). Os tratamentos com detergentes, inicos ou no, so largamente utilizados na solubilizao de protenas e lipdeos de membrana. Nestes processos de solubilizao por detergentes, so formadas micelas, que consistem de protenas, lipdios e detergentes. O tratamento das clulas com uma concentrao relativamente alta de SDS resulta no rompimento das membranas celulares com a

isoamlico,

que

desnatura

as protenas e, aps

centrifugao, estas so retiradas da soluo de DNA.

2. Objetivo Isolar DNA de clulas de cebola.

3. Material Cebola. Soluo salina-EDTA: NaCl 0,15 M EDTA 0,1 M (pH=8,0). SDS 2% (P/V). Etanol absoluto 95%. Soluo Tris-EDTA (TE)* 10 mM Tris.Cl, 1 mM EDTA - pH 7,5. Obs: *Esta soluo mantm a fora inica, dissolvendo o DNA, alm de quelar ons divalentes, necessrios para a ao da DNase.

4. Procedimentos Cortar 5 g de cebola (fatia fina e bem picotada); Colocar a cebola picada em um tubo Falcon de 15 mL; Adicionar 2.5 mL de soluo salina EDTA; Adicionar 1.0 mL de SDS 2%; Macerar a cebola com ajuda de um basto de vidro durante 5 minutos; Filtrar a soluo com gaze para retirar os fragmentos de cebola; Colocar o filtrado em um tubo de vidro; Adicionar, lentamente, com pipeta, 4 mL de lcool

conseqente liberao das nucleoprotenas. A atividade da enzima digestiva (DNAase) ser inibida pela ao do EDTA em meio alcalino que altera pH e quela os ons divalentes necessrios ao da DNAase. A adio de etanol sobre a fase aquosa, contendo os cidos nuclicos dissolvidos, resultar na precipitao destes, uma vez que o etanol diminui a constante dieltrica da gua, promovendo uma menor solubilizao das molculas de DNA. Nas tcnicas de biologia molecular, o DNA deve estar livre de protenas, para isto, estas devem ser extradas. Normalmente, esse procedimento realizado utilizando-se uma soluo de clorofrmio/lcool

etlico 95% de modo que os dois lquidos no se misturem. Notar que na interface, forma-se um material insolvel filamentoso, o DNA;

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Introduzir um basto at a regio de interface. Imprimir-lhe um movimento circular e verificar que o material filamentoso ir aderir ao mesmo; Retirar o basto e dissolver o precipitado a ele aderido em 2 mL da soluo de Tris-EDTA.

A emulso ser separada em 3 camadas;

SOLUO DE DNA

A camada superior (aquosa) contm os dois tipos de cidos nuclicos (DNA e RNA) que devem coletados para posterior utilizao.

5. Questes para discusso: Desproteinizao (No realizada durante a aula prtica): Aps a dissoluo do DNA, adicione igual volume (2 mL) da mistura de clorofrmio:lcool isoamlico 24:1 (V/V), e agite vigorosamente por 30 minutos; Centrifugue a emulso resultante a 3000 rpm durante 10 minutos; 5.2 - Ao romper a clula e, tambm, suas organelas, pela tcnica descrita acima, o DNA no seria degradado por enzimas lisossomais? 5.1 - Qual a funo da soluo de SDS?