Diagnstico Parasitolgico de Fezes

Prof. Magno Augusto Zaza Borges Esta apostila a compilao de vrias fontes, mas a maior parte est disponvel nos sites do CDC (Centro de Controle de Doenas dos EUA) e da OMS (Organizao Mundial da Sade).
Exame parasitolgico de fezes A maioria dos parasitos intestinais diagnosticada pelo exame de fezes. Os estgios usuais de diagnstico so ovos e larvas de helmintos e os cistos, trofozotos e oocistos dos protozorios. A identificao segura e correta de um parasito depende de bons critrios morfolgicos, que dependem de uma colheita bem feita e de uma boa preservao dos espcimes fecais.

O bolo fecal normal composto quase exclusivamente de fezes, mas em certas

situaes pode conter sangue e muco, ou ter uma considervel quantidade de tecido morto. Estas caractersticas evidenciam uma infeco parasitria, que pode ou no ser confirmada pelo exame de fezes. Por isso o exame macroscpico deve sempre proceder ao microscpico. Colheita

Cada amostra deve conter no mnimo as seguintes informaes: nome do paciente,

idade, sexo, nmero de identificao, nome do mdico, data e horrio de coleta. O recipiente deve ser limpo e seco, com a boca larga, de capacidade aproximada de 250ml para que possa conter uma amostra significativa e que tenha vedao hermtica. As fezes devem ser colhidas diretamente no frasco, ou em urinol, ou ainda em jornal ou papel limpo e transferidas diretamente para o recipiente. 20 a 40 gramas de fezes bem formadas ou 5 a 6 colheres de sopa de fezes lquidas so suficientes para exames de rotina Fezes obtidas de vaso sanitrio no podem ser aproveitadas, porque a gua e a urina poderiam destruir as formas trofozoticas. Fezes excretadas no solo no podem ser aproveitadas, porque larvas de vida livre e outros contaminantes do solo poderiam confundir o diagnstico (principalmente veterinrio). Fezes pastosas e mucosas so indicadas para a preparao de esfregaos corados e as formadas so empregadas em tcnicas de concentrao. Os recipientes com amostras fecais de pacientes com AIDS devem ser protegidos por um invlucro de plstico e identificados com etiqueta vermelha ou HIV positivo.

Estabilidade das amostras fecais Os trofozotos de protozorios no se multiplicam nem encistam fora do corpo humano, eles morrem e se degeneram aps a passagem. O tempo recomendado para amostras lquidas 30 minutos, enquanto das amostras pastosas o de uma hora aps a evacuao. Fezes formadas podem (quando no se procurar trofozotas) podem ser examinadas aps um dia. Neste caso, uma parte da amostra deve ser refrigerada e a outra parte deve ser preservada.

Preservao Para preservar a morfologia dos protozorios e prevenir um contnuo desenvolvimento de alguns ovos e larvas de helmintos, as amostras fecais que no forem entregues no laboratrio imediatamente aps a passagem devero ser fixadas.

A preservao temporria poder ser feita atravs da refrigerao (3-5oC) em recipiente

hermticamente fechado para evitar a dessecao. Nesta temperatura os ovos, as larvas e cistos mantm-se viveis por vrios dias.

A preservao permanente de trofozotos, cistos, ovos e larvas realizada atravs de

fixadores: a) Formol 5% e 10%

Utilizado para protozorios e helmintos, embora no seja recomendada para fixao de

trofozotos. A concentrao de 5% indicada para protozorios e a de 10% para helmintos. Preparo da soluo: Soluo de Formol a 5 e 10% (v/v) 5 ml 10 ml 95 ml 90 ml

Formaldedo 37-40%* gua destilada

* O formaldedo comercial apresenta uma concentrao de 37-40% de HCHO, embora para a diluio se considere 100%. Preservao da amostra: o o Misturar uma poro de fezes em trs volumes de soluo de formaldedo. A soluo aquosa de formol s permite o exame a fresco.

a) Fixador de Schaudinn Usado na preservao de fezes frescas ou amostras da superfcie da mucosa intestinal. Esta soluo fixadora usada para a preparao de esfregaos permanentes corados para demonstrao de protozorios intestinais.

Preparo da soluo: 110g 1.000 ml 600 ml 300 ml 15 ml 100 ml 5 ml

1. Soluo aquosa saturada de cloreto de mercrio II Cloreto de mercrio II gua destilada 2. Soluo estoque Soluo aquosa saturada de cloreto de mercrio II lcool etlico a 95% Glicerina 3. Soluo fixadora* Soluo estoque cido actico glacial * adicionar o cido actico glacial imediatamente antes do uso.

Esfregaos devem ser preparados com amostras fecais frescas. Aps a preparao, mergulhar as lminas durante 30 minutos no fixador. Terminada a fixao, os esfregaos podem ser corados, montados e examinados.

Os esfregaos fixados pelo Schaudinn apresentam excelentes resultados de colorao quando corados pela hematoxilina-frrica ou pelo tricrmico.

c) Soluo mertiolato-iodo-formaldedo (MIF) Este mtodo permite obter ao mesmo tempo a preservao e a colorao de quase todos os estgios dos protozorios, de ovos e larvas de helmintos que se encontram nas fezes. Este procedimento tambm permite o exame direto a fresco do material fecal ou depois de vrias semanas, sem a necessidade de outra colorao. O corante-fixador MIF composto por duas solues estoques mantidas separadamente em frascos de mbar e misturadas imediatamente antes do uso. Este mtodo indicado para trabalhos de campo.

Blagg et al. (1995) mostraram que o exame do sedimento resultante da centrifugao

do material fecal preservado pelo MIF apresenta melhores resultados do que o exame direto a fresco na pesquisa de protozorios e ovos de helmintos intestinais. Preparo da soluo

1. Soluo I (Soluo estoque MF, estvel) Glicerina 2 ml Formaldedo 37-40% 10 ml Tintura de mertiolato 1:1.000 (pode ser 80 ml substitudo por igual volume de 100 ml 5g mercurocromo a 0,2%) gua destilada 2. Soluo II (soluo de iodo de lugol)* Iodo, forma cristalina (I2)

Iodeto de Potssio (forma cristalina) (KI) 10g gua destilada 100 ml * O iodeto de potssio dissolvido em gua e o iodo adicionado lentamente com agitao at a sua completa dissoluo. Filtrar e manter a soluo em frasco mbar. Preservao da amostra: o Misturar 9,4 ml da soluo I com 0,6 ml da soluo II, imediatamente antes do uso, pois o iodo causa uma densa precipitao, impedindo uma boa colorao dos protozorios. Misturar, vigorosamente, uma parte de fezes frescas, para duas a trs partes da soluo de MIF. Segurana Profissionais de sade que trabalham com exames de fezes, enfrentam muitos riscos potenciais, como a ingesto de ovos e cistos, penetrao de larvas infectantes na pele e infeco por patgenos encontrados nas fezes e fludos biolgicos. Estes riscos podem ser minimizados com a adoo de cuidados comuns, bem como prticas padres em laboratrios microbiolgicos (Biosegurana nvel 2). Estas incluem: Utilizar avental, luvas e culos protetores quando processando as amostras; No comer, beber, fumar, aplicar cosmticos ou manipular lentes de contato no laboratrio; Descontaminar a bancada de trabalho pelo menos uma vez por dia, ou depois de manipular qualquer material potencialmente infectante; Se estiver com cortes ou abrases na pele das mos, cobri-los com bandagem adesiva; Remova as luvas e lave as mos sempre que completar uma tarefa envolvendo material fecal

Fixador Formol 10%

QUADRO COMPARATIVO DOS FIXADORES PARA EXAMES DE FEZES Vantagens Desvantagens Fcil de preparar; Inadequado para preservao de Boa preservao da morfologia de ovos de helmintos, larvas e cistos de protozorios; Apropriado para procedimentos de concentrao; Compatvel com kits de Inadequado para mtodos de concentrao; Contm mercrio, que txico; Inadequado para a preservao de ovos e larvas de helmintos. Inadequado para a preservao da morfologia de trofozotos de protozorios. O iodeto interfere com outros mtodos de colorao; O iodeto pode causar distoro em protozorios. imunoensaio (Elisa). Boa preservao de cistos e trofozotos de protozorios; Fcil preparao para lminas permanentes. trofozotos; Pode interferir como PCR, especialmente depois de muito tempo de fixao.

Schaudinn

MIF

Alm de fixador, corante; Fcil preparo; til em trabalhos de campo;

Adequado para os mtodos de concentrao.

Mtodos e tcnicas As fezes devem ser distribudas no laboratrio O ou dos quanto a sua fecal ser sendo semiconsistncia. lquido seguido observado material deve

pastoso

primeiro, espcimes

formados e formados. Observao macroscpica: Examinar e revolver como basto de vidro todo o material fecal evacuado. adultos e proglotes de tnias. Anotar observadas as e caractersticas coletar vermes

Exame microscpico Exame direto fresco A lmina montada diretamente do material fecal. Utilizado para pesquisa de cistos de

protozorios e ovos de helmintos. mtodo pouco sensvel e s apresenta resultados positivos em infeces massivas. Procedimento: Misturar um pouco das fezes (menos que a cabea de um palito de fsforo), adicionar uma gota de soluo salina e de lugol se necessrio. Colocar a lamnula e observar direto ao microscpio em aumento de 100X e 400X.
Mtodos de concentrao Mtodo de Hoffmann, Pons e Janer - HPJ. (Sedimentao espontnea) Utilizado na pesquisa de cistos de protozorios e ovos de helmintos. 1. Dissolver cerca de 10g de fezes em 10 ml de H2O em frasco pequeno (bquer) 2. Filtrar em gaze dobrada em quatro, utilizando um clice de sedimentao 3. Lavar o frasco 2X despejando a gua na gaze 4. Completar o clice com gua e homogenizar com basto de vidro. 5. Deixar em repouso de 2 a 24 horas. 6. Com uma pipeta tampada, retirar uma amostra do fundo do vrtice do clice, destampando a pipeta aps emerg-la, para no revolver o sedimento. Na ausncia de pipetas pode se usar canudos plsticos. 7. Examinar ao microscpio, adicionando uma gota da soluo de lugol se necessrio. Mtodo de Kato 1. Colocar 60 a 70 mg de fezes em uma lmina de microscopia. 2. Cobrir as fezes com celofane embebido em soluo aquosa de verde de malaquita a 3%, aps a remoo do excesso do corante. 3. Comprimir a lamnula, com uma folha de papel absorvente, e espalhar o material com uniformidade at as margens da cobertura de celofane. Examinar ao microscpio. Mtodo de Willis

1. Diluir 5g de fezes num bquer com soluo saturada de acar ou sal (NaCl). 2. Filtrar em gaze dobrada em quatro em um frasco (vidro tipo Snap-cap) e completar
com a soluo saturada de NaCl at formar um menisco convexo na boca do frasco. Colocar na boca do frasco uma lmina, que dever estar em contato com o lquido. 3. Deixar em repouso por 5 minutos.

4. Retirar rapidamente a lmina voltando para cima a parte molhada. 5. Cobrir com lamnula, levar ao microscpio e examinar com a objetiva de 10x e/ou de 40x (pode-se ou no corar pelo lugol). Mtodo de Blagg ou sedimentao por centrifugao 1. Coletar as fezes recm-emitidas em liquido conservador MIF. 2. Homogenizar bem. 3. Filtrar a suspenso em gaze cirrgica dobrada em quatro, num copo plstico descartvel 4. Transferir 1 a 2 ml do filtrado para um tubo cnico de centrifugao, com capacidade de 15 ml. 5. Acrescentar 4 a 5 ml de ter sulfrico e agitar vigorosamente (importante para desengordurar o material) 6. Centrifugar por 1 minuto a 1500 rpm. 7. Com auxlio de um basto, descolar a camada de detritos da parede do tubo. 8. Inverter o tubo para desprezar o lquido, mantendo-o com a boca voltada para baixo, at limpar as paredes do mesmo, utilizando um basto de vidro com um algodo na extremidade. 9. Acrescentar ao sedimento gotas de salina ou lugol. 10.Inverter o tubo em uma lmina, deixando escoar todo o sedimento. Se a quantidade de sedimento for excessiva, utilizar uma pipeta para coleta-lo e preparar as lminas. 11.Cobrir com lamnula e examinar ao microscpio. 12.Obs: existe no mercado o Coprotest, um processo simplificado e seguro e sedimentao por centrifugao. Consiste no seguinte: 13.O paciente compra em farmcia o recipiente do Coprotest, o qual j vem com conservador (formol 10%); coloca as fezes no recipiente, fecha o frasco e agita por dois minutos para homogeneizar, enviando em seguida o frasco para o laboratrio. O laboratorista recolhe a amostra em um tubo de centrfuga, acrescenta 3ml de acetato de etila ou ter, agita e centrifuga por trs minutos; despreza os detritos e o lquido sobrenadante e examina ao microscpio. Mtodo de Faust (Centrfugo-flutuao) Utilizado na pesquisa de cistos de protozorios e ovos de helmintos. 1. Dissolver cerca de 5g de fezes em 10ml de gua e filtrar em gaze dobrada em quatro. 2. Depositar o material em tubo cnico de centrfuga e centrifugar a 1500 rpm por 2 minutos. 3. Desprezar o sobrenadante e ressuspender novamente em 10 ml de gua.

4. Repetir os passos 2 e 3 at que o sobrenadante apresente-se claro. 5. Adicionar 10 ml de sulfato de zinco (ZnSO2) 33 %, densidade 1.180, homogenizar e centrifugar a 1500 rpm por 2. 6. Recolher com ala de platina a pelcula superficial, adicionar uma gota da soluo de lugol e observar ao microscpio. Mtodos de recuperao de larvas Coprocultura: Misturar partes iguais de fezes e vermiculita ou carvo triturado em gros pequeno (tamanho de arroz) em uma placa de Petri ou copo plstico; Umedecer ligeiramente (mantendo mido nos dias seguintes); Deixar a mistura descansando uma temperatura de 25oC; Dois a 5 dias aps, recolher as larvas pelo mtodo de Baermann-Moraes.

Mtodo de Baermann-Moraes Tomar 8 a 10g de fezes ou material de coprocultura. Colocar numa gaze dobrada em quatro ou tela de nilon, formando uma pequena trouxa. Colocar o material assim preparado sobre um funil de vidro, contendo um tubo de borracha com um tubo de vidro, conectado em sua extremidade inferior;

Adicionar ao funil gua aquecida (45oC) em quantidade suficiente para entrar em contato com as fezes; Deixar uma hora em repouso; As larvas vivas presentes vo migrar para o tubo na parte inferior do tubo de borracha. Derramar o lquido presente neste tubo em uma placa de petri e observar as larvas presentes ao microscpio, coradas com lugol.

Quadro comparativo com as principais caractersticas dos parasitos mais comuns Parasito Trofozoto de Entamoeba histolytica encontrados em exames de fezes humanas Foto Caractersticas Protistas 12-60 , assimtrico, um ncleo esfrico e com cariossoma central.

Trofozoto de Entamoeba histolytica Trofozoto de Giardia lamblia Cisto de Giardia lamblia

Esfrico, 10-20 , 4 ncleos com cariossoma central e delicada cromatina perifrica. Alguns cistos podem apresentar cromtides. 9-21x5-15 , com formato de pra, movies, com inmeros flagelos, com dois ncleos centrais caractersticos. Oval, 8-12 de comprimento e 7-10 de largura. Dois ncleos, que tendem a se posicionar fora do centro da clula. Um espao claro entre a parede celular e o citoplasma. 10-35 , normalmente esfrico, contm 8 ou mais cistos (nem sempre todos so vistos). Cariossoma excntrico, cromatina perifrica grosseira e irregular. Raramente apresentam cromtides. Helmintos - Nematoda

Cistos de Entamoeba coli

Ovos frteis de Ascaris (Famlia Ascarididae)

60x45 , Arredondado ou ovide, com uma casca espessa. Coberto com uma camada espessa e irregular chamada camada mamilonada. Normalmente de cor marrom. Perdeu a camada mamilonada. As outras caractersticas so as mesmas do ovo frtil.

Ovo decorticado de Ascaris

Ovos frteis de Ascaris (Famlia Ascarididae)

60x45 , Arredondado ou ovide, com uma casca espessa. Coberto com uma camada espessa e irregular chamada camada mamilonada. Normalmente de cor marrom. Perdeu a camada mamilonada. As outras caractersticas so as mesmas do ovo frtil.

Ovo decorticado de Ascaris

Ovo infrtil de Ascaris

90x40 , alongado, casca mais fina e material interno formado por uma massa de glbulos.

Ovos de Ancilostomdeos (Famlia Ancilostomidae) Ovos de Enterobius (Famlia Oxyuridae)

Oval, elipside, 60x40 . Casca muito fina e transparente. Podem apresentar uma mrula (esq) ou podem estar larvados (dir).

55x26 , Alongado, no formato de um D ao contrrio. Casca fina e regular. So normalmente encontrados larvados.

Ovos de Trichuris trichiura

54-22 , alongado, em forma de barril, com oprculo polar.

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Helmintos - Plathyhelminthes Ovos de Taenia Ovos redondos ou sub-esfricos, com dimetro de 31 to 43 m, com uma espessa casca radialmente estriada, normalmente de cor marrom. Dentro de cada ovo h um embrio (oncosfera) com 6 ganchos.

Ovos de Hymenolepis

Ovos arredondados ou um pouco ovais, medindo 60 to 80 m, com uma membrana interna estriada e uma membrane externa fina, com um grande espao entre elas. Possui uma oncosfera com 6 ganchos. Ovos grandes (114 a 180 m) com um espinho lateral proeminente na sua poro final. Sua extremidade inicial suavemente encurvada. Quando maduro contm um miracdio em seu interior.

Ovos de Schistosoma mansoni

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