Nocoes Sobre Analise de Alimentos - Apostila

U N I V E R SI D A D E F E D E R A L PR- REITORI A DEPARTAMENTO PROGRAMA
DE DE DE
DO
MARANHO
E X T E N S O ALIMENTOS GU A
T E C N OL O GI A Q U M I C A
DE E
C O N T R OL E
DE
QUALI DADE
NOES DE ANLISES FSICO-QUMICAS E MICROBIOLGICAS DE ALIMENTOS
PR OF . DR. VI CT OR EL IA S M OUC HRE K FIL HO P R O F A . D R A . A D E N I L D E R I B E I R O N A SC I M E N T O
SO LU S - M A 2006
PROGRAMA DE CONTROLE DE QUALIDADE DE ALIMENTOS E GUA PAVILHO TECNOLGICO - UFMA
LABORATRIO DE BROMATOLOGIA Prof. Dr. Victor Elias Mouchrek Filho victo@ufma.br
LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA Profa. Dra. Adenilde Ribeiro Nascimento adenild@bol.com.br
ANLISES FSICO-QUMICAS ................................................................................................. 1 1 BROMATOLOGIA................................................................................................................. 1 1.1 DEFINIO....................................................................................................................... 1 2 AMOSTRAGEM PARA ANLISE FSICO-QUMICA .................................................................. 7 2.1 DEFINIES ..................................................................................................................... 7 2.2 AMOSTRA ........................................................................................................................ 8 2.3 AMOSTRAGEM ................................................................................................................. 8 2.4 QUANTIDADE DE AMOSTRA ............................................................................................ 10 2.5 ALIMENTOS COM EMBALAGENS ..................................................................................... 11 2.5.1 EMBALAGENS PEQUENAS E MDIAS............................................................................... 11 2.5.2 EMBALAGENS GRANDES ............................................................................................... 11 2.6 DETERMINAO DA QUANTIDADE DE AMOSTRA ............................................................ 12 2.7 ALIMENTOS SEM EMBALAGEM....................................................................................... 14 2.8 ALIMENTOS LQUIDOS ................................................................................................... 14 2.9 ALIMENTOS SEMI-SLIDOS ............................................................................................ 15 2.10 ALIMENTOS SLIDOS ................................................................................................... 16 2.11 ENVIO DE AMOSTRAS AO LABORATRIO ...................................................................... 17 2.11.1 INVIOLABILIDADE ...................................................................................................... 17 2.11.2 CONSERVAO .......................................................................................................... 18 2.11.3 INTEGRIDADE ............................................................................................................. 18 2.12 IDENTIFICAO DA AMOSTRA ...................................................................................... 18 2.13 DESTINO DAS AMOSTRAS ............................................................................................. 20 2.14 RESULTADOS DAS ANLISES BROMATOLGICAS .......................................................... 20
2.15 QUANTIDADE MNIMA DE AMOSTRA PARA ANLISE BROMATOLGICA ........................ 21 2.16 UNIDADES BSICAS DE AMOSTRAS ............................................................................... 22 3 ANLISE PERCENTUAL DE ALIMENTOS ............................................................................. 23 3.1 PREPARAO DA AMOSTRA ........................................................................................... 24 3.2 MATERIAL ..................................................................................................................... 26 3.3 QUANTIDADE DE AMOSTRA ............................................................................................ 27 4 ANLISES FSICO-QUMICAS DE ALIMENTOS ................................................................... 30 4.1 DETERMINAO DE UMIDADE........................................................................................ 30 4.1.1 MTODOS TERMOGRAVIMTRICOS ................................................................................ 31 4.2 DETERMINAO DE CINZAS ........................................................................................... 32 4.3 DETERMINAO DE LIPDIOS ......................................................................................... 33 4.3.1 MTODO DE SOXHLET .................................................................................................. 35 4.3.2 MTODO DE GERBER .................................................................................................... 36 4.3.3 MTODO PONDERAL .................................................................................................... 36 4.3.4 MTODOS INSTRUMENTAIS ........................................................................................... 38 4.4 DETERMINAO DE PROTENA ...................................................................................... 38 4.5 DETERMINAO DE PH.................................................................................................. 42 4.6 DETERMINAO DE CARBOIDRATOS.............................................................................. 42 4.6.1 DETERMINAO DE AMIDO (MTODO QUMICO MTODO DE FEHLING) ........................ 42 4.6.2 DETERMINAO DO GRAU BRIX OU SLIDOS SOLVEIS (MTODO FSICO) ..................... 45 4.7 DETERMINAO DO VALOR CALRICO.......................................................................... 45 4.8 DETERMINAO DO RESDUO SECO ............................................................................... 46 4.9 DETERMINAO DE DENSIDADE..................................................................................... 46 4.10 DETERMINAO DE GRAU ALCOLICO ........................................................................ 47 4.11 DETERMINAO DE ACIDEZ TOTAL ............................................................................. 47 4.12 DETERMINAO DE ACIDEZ (LEOS E GORDURAS VEGETAIS) ..................................... 48 REFERNCIAS ...................................................................................................................... 49 ANLISES MICROBIOLGICAS............................................................................................. 51 CAPTULO I ......................................................................................................................... 51 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS ........................................................................................ 51 1 HISTRIA DOS MICRORGANISMOS NOS ALIMENTOS .......................................................... 51 2 CLASSIFICAO DOS MICRORGANISMOS .......................................................................... 52 3 FONTES PRIMRIAS DE MICRORGANISMOS ENCONTRADAS NOS ALIMENTOS .................... 52
4 CAUSAS DA CONTAMINAO DOS ALIMENTOS .................................................................. 55 CAPTULO II ........................................................................................................................ 56 MICRORGANISMOS IMPORTANTES NA MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS ............................ 56 1 BACTRIAS ....................................................................................................................... 56 1.1 MORFOLOGIA ................................................................................................................ 56 1.2 MEIOS DE CULTURA PARA O CULTIVO DE BACTRIAS .................................................... 57 1.2.1 CARACTERSTICAS DO MEIO DE CULTURA ...................................................................... 58 1.2.2 CLASSIFICAO DOS MEIOS DE CULTURA ...................................................................... 58 2 FUNGOS ............................................................................................................................ 58 2.1 BOLORES ....................................................................................................................... 59 2.1.1 CARACTERSTICAS GERAIS............................................................................................ 59 3 LEVEDURAS ...................................................................................................................... 60 3.1 CARACTERSTICAS GERAIS ............................................................................................ 60 CAPTULO III ...................................................................................................................... 63 PARMETROS INTRNSECOS E EXTRNSECOS DOS ALIMENTOS QUE AFETAM O CRESCIMENTO MICROBIANO .............................................................................................. 63 1 FATORES INTRNSECOS..................................................................................................... 63 2 FATORES EXTRNSECOS ................................................................................................... 67 2.1 TEMPERATURA AMBIENTAL........................................................................................... 68 2.2 UMIDADE RELATIVA ...................................................................................................... 69 2.3 PRESENA E CONCENTRAO DE GASES DO AMBIENTE ................................................. 69 3 COMBINAO DOS PARMETROS INTRNSECOS E EXTRNSECOS ...................................... 70 CAPTULO IV....................................................................................................................... 71 DOENAS DE ORIGEM ALIMENTAR ..................................................................................... 71 1 BREVE HISTRICO............................................................................................................ 71 2 O PROBLEMA DAS DOENAS DE ORIGEM ALIMENTAR ...................................................... 72 3 CONTROLE DA CONTAMINAO DOS ALIMENTOS ............................................................. 74 4 CAUSAS DA CONTAMINAO DE ALIMENTOS .................................................................... 75 5 DOSE INFECTANTE ............................................................................................................ 75 6 VARIVEIS DO HOSPEDEIRO ............................................................................................. 76 7 MICRORGANISMOS CAUSADORES DE ENFERMIDADES DE ORIGEM ALIMENTAR ................ 77 7.1 PATGENOS DE ORIGEM ALIMENTAR: BACTRIAS ........................................................ 77 7.2 PATGENOS DE ORIGEM ALIMENTAR: EUCARIOTOS ...................................................... 85 7.3 PATGENOS DE ORIGEM ALIMENTAR: VRUS ................................................................. 88
CAPTULO V ........................................................................................................................ 91 MICRORGANISMOS INDICADORES ....................................................................................... 91 1 INDICADORES DE CONTAMINAO FECAL OU DA QUALIDADE HIGINICO-SANITRIA DO
ALIMENTO ........................................................................................................................... 93
1.1 COLIFORMES TOTAIS ..................................................................................................... 94 1.2 ENTEROCOCOS .............................................................................................................. 95 2 INDICADORES GERAIS DE CONTAMINAO DOS ALIMENTOS............................................. 96 3 CONTAGEM PADRO DE BACTRIAS AERBIAS MESFILAS (CONTAGEM PADRO EM
PLACAS) ............................................................................................................................... 97
4 CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS ............................................................................ 97 CAPTULO VI..................................................................................................................... 100 MTODOS DE ANLISES .................................................................................................... 100 PRTICAS .......................................................................................................................... 103 ESTIMATIVA DA POPULAO DE COLIFORMES TOTAIS, A 45C E ESCHERICHIA COLI ATRAVS DO NMERO MAIS PROVVEL (NMP)................................................................. 103 1 MTODO COLIFORMES TOTAIS ....................................................................................... 104 CONTAGEM PADRO EM PLACAS (CPP) DE MICRORGANISMOS AERBIOS MESFILOS VIVEIS ............................................................................................................................. 108 CONTAGEM DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS ........................................................................ 110 1 TCNICA DE ANLISES .................................................................................................... 111 PESQUISA DE SALMONELLA SPP. ......................................................................................... 112 1 TCNICA DE ANLISE...................................................................................................... 113 CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS............................................................................ 115 1 TCNICA DE ANLISE...................................................................................................... 115 APNDICES ........................................................................................................................ 117 REFERNCIAS .................................................................................................................... 127
A NLISES F SICO -Q UMICAS
1 B R OMA T OL OGI A 1.1 D E FI N I O A melhor definio de Bromatologia a etimolgica, uma vez que ela to ampla e genrica, que possibilita o estudo dos alimentos sob os mais variados aspectos. A palavra Bromatologia deriva do grego: Broma, Bromatos significa dos alimentos; e Logos significa Cincia. Portanto, por extenso dos termos BROMATOS E LOGOS, pode-se definir a Bromatologia como a cincia que estuda os alimentos. Por ser uma cincia muito ampla, permite subdividir-se a Bromatologia em vrias outras cincias, como se pode ver na Figura 1. A Bromatologia, dependendo do aspecto que enfoca, objetivada para a individualizao das suas funes. O termo Bromatologia, sem nenhuma outra especificao, relaciona-se com tudo aquilo que, alguma forma, alimento para os seres humanos; tambm se pode caracteriz-la melhor pelo novo termo: Antrepobromatologia. A Bromatologia tem a ver com o alimento, desde a produo, coleta e transporte da matria-prima, at a sua venda como alimento natural ou alimento industrializado. Tema ver com armazenamento, preparao e tratamentos tecnolgicos; com as embalagens, no relativo a tipo e tamanho; com rtulos, em relao s tintas utilizadas, os desenhos e tipos de letras, como tambm com o tamanho das mesmas. Enfim, tem a ver com todos, e cada um dos diferentes aspectos que envolvem um alimento. Tudo est legislado e regulamentado. Teoricamente, nada foi descuidado ou ficou sem a sua legislao especfica, j que, qualquer omisso poderia trazer srias conseqncias ao consumidor. A Qumica Bromatolgica a parte da Bromatologia que estuda a composio dos alimentos ou das substncias que so introduzidas no organismo como alimentos.
Noes de anlises fsico-qumicas de alimentos
Dr. Victor Elias Mouchrek Filho
comum incluir dentro da Qumica Bromatolgica, os aspectos referentes Anlise de Alimentos. Quando se est diante de um alimento, importante conhecer a sua composio qumica, bem como suas caracterstica de aptido para o seu consumo. Para se obter estes dados, na verdade, necessrio fazer a anlise qumica desses alimentos. Dependendo do tipo de anlise, sero as concluses a que se poder chegar.
BROMATOLOGIA
Qumica Bromatolgica
Microbiologia dos alimentos Parasitologia dos alimentos Bioqumica dos alimentos
Toxicologia dos alimentos
Bromatologia geral
Anlise dos alimentos
Zoo-bromatologia
Fito-bromatologia
Geo-bromatologia
Tecnologia dos alimentos
Figura 1. Fluxograma referente Bromatologia
Quando se iniciam estudos da Qumica Bromatolgica, importante conhecer-se tcnicas e mtodos adequados, que permitam, por exemplo, determinar a composio percentual dos alimentos, isto , que permitem determinar o teor, percentual, de umidade, cinza, fibra, protena, acares, lipdios, etc.; estes dados permitem o clculo do valor calrico destes alimentos.
Noes de anlises fsico-qumicas de alimentos Dr. Victor Elias Mouchrek Filho
Poder ser necessrio um estudo mais completo; neste caso, estudar-se-o, por exemplo, nas cinzas, os diferentes elementos que as compem; na gordura extrada, poder-se investigar quais os cidos que compem uma determinada cadeia carbnica; poder-se-ia investigar, ainda, os aminocidos que constituem uma protena isolada e purificada. Pode-se ver a amplitude do campo de trabalho, extrapolando cada um destes itens. Quando o analista se defronta com problema da presena de microrganismo, quer patognicos, quer no, o bromatlogo encontra-se defronte ao campo da microbiologia dos alimentos, especialidade, esta, extremamente importante. A parasitologia alimentar comumente estudada com a Zoobromatologia (estudo dos animais para a produo de alimentos), sendo que ela bem mais especfica, e trata s dos parasitas capazes de contaminar os alimentos. A Bioqumica dos alimentos ou Fisiologia Alimentar estuda a inter-relao existente entre as vrias substncias que integram um alimento. Os vegetais que so utilizados para a alimentao humana so estudados pela Fitobromatologia e a Geo-bromatologia, esta o estudo das zonas do planeta onde se produzem os alimentos. Evidentemente, necessrio regulamentar a produo, transporte, higiene e comercializao dos alimentos. Tambm necessrio normalizar e caracterizar, definir e exigir condies de aptido, permitir e aprovar substncias que , sem ser alimentos, esto relacionados intimamente com eles. Enfim, regular, orientar qualquer uma das muitas atividades que se relacionam, direta ou indiretamente, com os alimentos desde a sua produo, at a sua compra pelo consumidor. A listagem destas normas est tambm em mos da Bromatologia, atravs da Bromatologia Legal. H necessrio de se fazer anlise para conhecer as condies de aptido de um alimento. Estas anlises devero ser feitas tantas vezes quanto for necessrio para assegurar que o produto est em condies de ser consumido. nesta oportunidade que se verifica: a) b) c) Aprovao e obteno do registro; Controle bromatolgico oficial; Controle de qualidade.
a) Aprovao e obteno do registro Para que um alimento possa ser vendido em todo territrio brasileiro, ter que ser inscrito e registrado de acordo com a lei, isto significa que o interessado ter que fornecer amostras do produto final, para se fazer o controle analtico de acordo com as regulamentaes e mtodos considerados oficiais. Todo produto registrado ter que renovar o seu registro de dez em dez anos.
b) Controle bromatolgico oficial As autoridades, atravs de funcionrios competentes (inspetores bromatolgicos), podero tirar amostras dos alimentos terminados ou sem acabamento definitivo, para fazerem o controle bromatolgico necessrio, a fim de garantir a qualidade do produto. A amostra poder ser tirada na indstria, nos depsitos ou nos comrcios autorizados, j que, depsitos, indstrias ou comrcios no autorizados permitem a punio imediata, com interdio destes alimentos. Logo, so permitidos aos laboratrios especializados oficiais. Constatadas as caractersticas de aptido, o alimento poder ser liberado para a venda. Caso contrrio, so considerados alimentos no aptos para o consumo.
c) Controle de qualidade Esta anlise feita ao nvel de laboratrio bromatolgico de controle de qualidade, na prpria indstria, para se verificarem as caractersticas do produto que sai da fbrica, se est em condies de ser consumido. A Tecnologia dos Alimentos a parte da Bromatologia que estuda os processos utilizados na industrializao dos alimentos. Podemos defini-la pelas suas funes: Com o nome de Tecnologia Alimentar ou Tecnologia dos Alimentos, designam-se todos os processos necessrios transformao da matria-prima alimentar, em alimento apto ao consumo.
Compreende
as
vrias
etapas
necessrias,
desde
produo
(colheita,
armazenamento, transporte etc.), industrializao (seleo, lavagem, processamento, embalagem, etc.), e comercializao (armazenamento e distribuio etc.). Na realidade, vai bem mais longe: experimenta, tenta, sugere, aprova, rejeita etc., novas tcnicas de aproveitamento da matria-prima. Controla, fiscaliza, normaliza, dentro e fora da indstria, nos processos afins aos alimentos. Vejamos um exemplo: Embora o termo Tecnologia dos Alimentos permita a interpretao de que trata de processos tcnicos adequados para cada alimento, o fato que, para que seja possvel obter produtos de tima qualidade, ter que cuidar de alguns aspectos fora da indstria, tais como: a higienizao dos coletores para descartar matria-prima inadequada, ou para no machucar os produtos. Outros exemplos sero encontrados ao longo destas pginas; tambm so muito mais especialidades que podem originar-se, tendo, como base, a Bromatologia, mas no podemos deixar de falar de outras especialidades, embora brevemente. Trata-se da Toxicologia Alimentar ou Toxicologia dos Alimentos. Embora exista como cincia, s nos ltimos anos, juntamente com a Tecnologia dos Alimentos, o que mais ativa e o que mais progrediu nos ltimos tempos. Isto tem uma explicao muito vlida: a) por causa do enorme avano de um exrcito de substncias, que, sem ser alimentos, entram, recentemente, em forma macia, para formar parte dele; fazse referncia explicita aos aditivos alimentares; b) por causa de defensivos agrcolas, indiscriminadamente; c) por causa do uso de herbicidas de alto poder txico; d) por causa da substituio dos adubos orgnicos pelos adubos qumicos; e) por causa da poluio, que atinge graus alarmantes. Todas estas razes levaram a OMS a dizer que j no h alimentos sem contaminao e que a Toxicologia Alimentar trabalha constantemente para determinar o grau
de poluio ou de contaminao dos alimentos; tambm analisa profundamente as substncias utilizadas com os alimentos, sejam conservantes ou substncias que fazem parte da tecnologia deles. A responsabilidade dos tcnicos especialistas, neste terreno, enorme; partem da base de que o alimento est contaminado, mas no tm que determinar o grau de contaminao, como tambm, qual a Ingesto Diria Admissvel (IDA) de cada uma destas substncias. Tero que experimentar as substncias puras a todos os nveis: desde a fase embrionria, at a fase adulta, passando por estgios fisiolgicos normais, como gravidez, at os mais variados processos patolgicos. So tambm motivo de estudo da Toxicologia Alimentar, a inter-relao entre as vrias substncias que podem estar presentes, simultaneamente, num mesmo alimento. Em relao aos Aditivos Alimentares, tero que determinar e aconselhar quais as quantidades mximas permitidas em um determinado alimento. Como se pode ver, a Bromatologia estuda os alimentos, estuda sua composio qumica, sua ao no organismo, seu valor alimentcio e calrico, suas propriedades fsicas, qumicas, toxicolgicas e tambm adulterantes, fraudes, etc. Seu estudo, em geral, vai alm do simples estudo dos alimentos; sua meta , tambm, chegar a formular normas de proteo ao consumidor, ao produtor, ou ao industrial.
2 A M OST R A GE M
P A RA A N L I SE F SI C O - QU M IC A
A anlise fsico-qumica ou bromatolgica dos produtos alimentcios (naturais ou elaborados), precedida de uma srie de operaes anteriores, prvias anlise propriamente dita (Normas do Instituto Adolfo Lutz, 1985). Estas operaes, em geral simples, so de grande significao, para que os dados que se pretende obter, sejam a expresso mais fidedigna possvel, da realidade global. Os passos so: - amostragem; - envio da amostra; - preparao da amostra para anlise. Os alimentos podem existir em vrios estados fsicos: lquido, semi-slido e slido. Podem estar acondicionados nos mais variados tipos de embalagens, para a distribuio ao consumidor. As embalagens, tambm, podem apresentar-se em diferentes tamanhos: mdio, grande e pequeno. Tambm pode acontecer que os alimentos sejam distribudos a granel. Estas especificaes referentes a estados fsicos, tamanhos e formas, fazem com que as operaes para a amostragem sejam relativamente muitas, porm simples. No incomum ouvir-se que a tomada da amostra para anlise bromatolgica tem que ser feita com arte e cincia. Devem prevalecer o bom censo e a experincia, em todos os passos, especialmente no tocante quantidade e seleo da amostra.
2.1 D E FI N I E S Nas Normas Alimentares da FAO/OMS, conceitua-se a retirada da amostra como o processo de tirar ou selecionar recipientes ou unidades de um conjunto de produo. Como resultado destas operaes, se obtm uma informao que permite avaliar a qualidade do conjunto (lote examinado) e, decidir se pode aceitar, se deve rejeitar ou negociar a mercadoria a que se refere.
2.2 A M OST R A Define-se amostra como uma poro selecionada mnima, necessria para determinar as caractersticas de aptido de uma quantidade maior de alimento ou matria-prima alimentar. Esta deve ser representativa da totalidade.
2.3 A M OST R A GE M Entende-se, por amostragem, o conjunto de operaes necessrias para a tiragem da amostra. Aspectos fundamentais para a amostragem Na tomada da amostra para anlise bromatolgica, devem-se ter presentes alguns aspectos, que, por bvia a sua observao, ns a chamamos de aspectos fundamentais (Figura 2).
ASPECTOS FUNDAMENTAIS
A amostra para anlise bromatolgica tem que ser representativa da totalidade do alimento.
TO TALIDADE DO ALIM ENTO
A amostra para anlise bromatolgica no deve produzir prejuzo econmico sensvel.
LEMBRE-SE
A amostra para anlise de contra-verificao tem que ser representativa da totalidade da amostra.
TO TALIDADE DA AM O STRA
Figura 2. Aspectos fundamentais na tomada da amostra para anlise bromatolgica.

a) A amostra deve ser representativa da totalidade do alimento Quando se fala de representatividade da amostra, convm rever a definio, especialmente no que diz respeito poro selecionada e representatividade da totalidade. Imaginemos, por exemplo, que num depsito temos 1000 unidades de embalagens de diferentes tamanhos de um determinado alimento ou matria-prima alimentar, formando um conjunto de pilhas, onde as embalagens que as contm esto uma em cima das outras, formando vrias camadas. Pois bem, calculadas as quantidades de amostras necessrias, estas devero ser retiradas de todos os cantos das pilhas e de todos os nveis, como tambm, da parte central do conjunto de pilhas.
b) A amostra no deve causar prejuzo econmico significativo Sempre que so retiradas amostras para uma anlise de controle bromatolgico, h um prejuzo econmico, j que, por pouco que seja a quantidade tirada, esta tem um valor monetrio. O que este princpio determina, que esse valor monetrio das amostras seja, no possvel, o menor, sempre que no sejam descuidados os outros princpios. No exemplo anterior, calculadas as amostras a tirar, separar-se- uma maior quantidade das amostras de menor tamanho, em favor das amostras de tamanho maior; por outro lado, o bom censo do pessoal encarregado de tirar as amostras deve prevalecer, no s para selecionar os lugares e as amostras, como tambm para fazer os clculos que determinem a quantidade de amostra, se resultarem muito grandes.
c) A parte da amostra a ser analisada numa anlise de contraprova deve ser representativa da totalidade da amostra Deve ser to representativa, que, numa anlise de contra-prova, apresente os mesmos resultados que as outras anlises.
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No podemos esquecer que esta parte da amostra fica em poder do responsvel pelo alimento, portanto, ser utilizada no caso de, as outras anlises, delatem qualquer alterao e sejam declaradas como no aptas para o consumo. Neste caso, as autoridades, antes do descarte desses alimentos, tero que permitir a defesa do interessado, que, apresentando esta amostra far-se- anlises definitivas, que determinar o destino do alimento. Quando isto acontecer, responsvel pelos alimentos poder apresentar os seus prprios tcnicos e at novas tcnicas, sempre que estas sejam aprovadas ou de reconhecido uso para cobrir as necessidades analticas. No se deve esquecer que est em jogo uma partida de alimentos, que, grande ou pequena, significa um prejuzo econmico considervel, e lembrar, tambm, que a lei permite a defesa do interessado, em casos como este. importante ressaltar que neste princpio, a representatividade da quantidade total do alimento.
2.4 Q U A N TI D AD E
DE A M OST R A
A quantidade de amostra a ser colhida para anlise bromatolgica, depender da quantidade total de alimento a ser analisado. Esta quantidade ser obtida por clculos matemticos, sem nos importar se o alimento apresenta-se com ou sem embalagem. Em todos os casos, sejam unidades de alimentos quando estes possuam embalagens, se no o possurem sero calculados em quilogramas ou litros, as frmulas matemticas utilizadas so as mesmas, como tambm o mesmo critrio na escolha da amostra, sem esquecer que as quantidades de amostra a serem tiradas nunca podero ser inferiores s quantidades mnimas necessrias para as anlises bromatolgicas de controle, de verificao e de contra-verificao, como se ver mais adiante. No caso de ser necessrio fazer anlises bacteriolgicas, tirar uma quarta amostra, cuidando para proteger a amostra para que no sofra contaminao ou alterao das suas caractersticas.
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2.5 A L I ME NT OS
C OM E M BA L A GE N S
Podem estar contidos nas mais variadas formas e tamanhos de embalagens, bem como em embalagens feitas dos mais variados materiais. A forma e o material utilizado na confeco da embalagem, no altera as regras da tomada da amostra, porm, no acontece com o tamanho da amostra, uma vez que dele depende o peso lquido do alimento que contm. O Cordex Alimentarius (Norma C.A. C/RM 42/69. FAO/OMS) considera os alimentos pr-envasados em relao ao seu tamanho e peso, e os divide em: a) Alimento com peso lquido igual ou inferior a 1 (um) Kg; b) Alimentos com peso lquido maior que 1 (um) Kg, mas no mais de 4,5 Kg; c) Alimentos com pesos lquidos superiores a 4,5 Kg.
2.5.1 E M B AL A GEN S
P EQU E NA S E M D IA S
Quando as amostras se apresentam com embalagens de tamanho mdio ou pequeno, a amostragem consistir em tirar unidades fechadas (originais). Por embalagem original entende-se a embalagem tal qual se encontra no mercado para ser vendida: em garrafas, vidros, latas, caixas e outros tipos de embalagem.
2.5.2 E M B AL A GEN S
GR A N DE S
Quando o alimento se encontra em embalagem grande, procede-se como com os alimentos sem embalagem. Transfere-se para vidros ou caixas de papelo, apropriados, tendo o cuidado de homogeneiz-los.
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2.6 D E T ER MI N A O
D A QUA N TI D A DE D E AM OST R A
A quantidade da amostra, para todos os casos, dever ser calculada por frmulas matemticas: tira-se uma quantidade equivalente raiz quadrada da totalidade do alimento. Se essa quantidade for grande demais, pode-se reduzi-la, dividindo-a por dois; se essa continuar uma quantidade muito grande, pode-se reduzir, utilizando a resultante da rias cbica e, at, raiz cbica sobre dois. QUANTIDADE DA AMOSTRA
AMOSTRA
APRESENTAM-SE
COM EMBALAGEM
SEM EMBALAGEM
PEQUENA
MDIA
U N I D A D E
GRANDE
Q U A N T I D A D E
g kg ou ml l
LQUIDA
SEMI SLIDA
SLIDA
Figura 3. Determinao da quantidade de amostra.
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No se deve esquecer de utilizar o critrio da representatividade e prejuzo econmico. As quantidades de alimento podero ser calculadas em cada caso, ou tiradas das tabelas especiais, como a Tabela 1, onde os clculos foram feitos com base do tamanho do lote de alimentos.
Tabela 1. Clculos de alimentos com embalagens pequenas e mdias. UNIDADES At 9 10 a 25 26 a 50 51 a 75 76 a 100 101 a 150 151 a 200 201 a 250 251 a 300 301 a 350 351 a 400 401 a 450 451 a 500 501 a 600 601 a 700 701 a 800 801 a 900 901 a 1000 1001 a 1500 1501 a 2000 2001 a 2500 2501 a 3000 3001 a 4000 4001 a 5000 5001 a 6000 6001 a 7000 7001 a 8000 8001 a 9000 9001 a 10000 10001 a 12500 12501 a 15000 15001 a 17500 17501 a 20000 3 4 6 8 9 11 13 15 17 18 19 21 22 23 26 27 29 31 35 42 47 52 59 67 74 81 87 92 97 106 117 127 137 /2 3 4 5 6 7 8 9 9 10 11 11 12 13 14 15 16 18 21 24 25 30 34 37 40 43 46 49 53 59 64 69 4 5 5 6 6 7 7 7 7 8 8 9 9 10 10 11 12 13 14 15 17 18 19 20 21 22 23 24 26 27
3 3
/2 3 3 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 6 6 7 7 8 9 9 10 10 11 11 12 12 13 14
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2.7 A L I ME NT OS
SE M EM BA L A GE M
A tcnica a ser utilizada vai depender do estado fsico do alimento, sendo que as quantidades a tirar sero calculadas, utilizando o mesmo critrio anterior, da raiz quadrada ou cbica, em gramas (ou kg) ou em mL (ou litros), dependendo, se os alimentos slidos, semislidos ou lquidos (Tabela 1). O Manual Oficial para Anlise Bromatolgico de La Plata (B.A) (Argentina) distingue a amostragem de pequenas quantidades e de quantidades grandes de alimentos em relao a seu estado fsico.
2.8 A L I ME NT OS
L QU I D OS
So colocados em garrafas ou frascos de vidro de 50 mL a 1000 mL perfeitamente limpos e desengordurados e que possam ser fechados hermeticamente. Os recipientes de vidro so lavados e desengordurados com a mistura sulfocrmica (50 g de dicromato de potssio para 1,0 Kg de cido sulfrico) durante 12 horas a 24 horas. Depois deste banho oxidante so enxaguados e secados em estufa. Quando se torna necessria a anlise bacteriolgica do alimento, deve-se, alm disso, autoclavar os fracos a 120C por 20 minutos (Figura 4). As tampas dos fracos em que se colocam as amostras tambm devem estar limpas e esterilizadas. As tampas ideais so as de vidro esmerilhado. Mas podem ser utilizadas rolhas de plstico, borracha ou cortia, contanto que assegure um vedamento hermtico, que evite perdas da amostra, da ao do ar, da umidade ambiental e microbiolgica etc. importante homogeneizar os alimentos para que, quando a amostra colhida, ela seja representativa do total; quando os alimentos do qual se colhe a amostra est contido em recipientes de 10 ou mais litros, deve-se agit-lo; quando as embalagens so maiores ainda, deve-se encontrar um outro meio de homogeneizar, ou ento colher a amostra em diferentes nveis, utilizando tubos de vidro ou metal compridos, semelhantes a pipetas, e indicar, no rtulo, o nvel em que a amostra foi colhida.
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ALIMENTOS
LQUIDOS
S EM
VIDROS OU GARRAFAS
50 mL
- 1000 mL
ANLISE B ACTERIO L G ICA
AUTO CLAVE 120C x 20
ANLISE QUMICA
ESTUFA 120C x 2h
TAMPAS LIMPAS ATXICAS INATACVEIS
LIMPAS DESENGORDURADAS
Mistura sulfrico-crmica
Figura 4. Esquema para anlise de alimentos lquidos.
2.9 A L I ME NT OS
SE MI - SL ID OS
Coloca-se em vidros de boca larga a quantidade de alimentos semi-slidos, estabelecida segundo as normas, obedecendo s mesmas recomendaes dadas para alimentos lquidos. Quando se trata de pequenas quantidades de alimentos, o mtodo recomendvel o do quarteio, que consiste em fazer dois cortes perpendiculares com uma faca de ao
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inoxidvel, separando uma das partes; se uma parte no for suficiente, tomem-se duas partes opostas (1 e 4 ou 2 e 3). Quando a quantidade de alimento for grande, podem-se tirar pequenas pores de cada uma delas, at completar a quantidade necessria. Pode-se utilizar, para isto, um aparelho especial, que perfura a amostra em diferentes pontos. Obtm-se, assim, uma amostra representativa.
2.10 A L I ME N T OS
SL I D OS
Aplicam-se todas as normas conhecidas e adotadas para este tipo de alimento. As amostras podem ser colocadas em caixas, ou empacotadas. No empacotamento, utilizam-se folhas de papel impermevel, recobertas de papel grosso e amarradas com corda. No se deve esquecer, no final, de que necessrio lacrar a corda, carimbar e assinar. Sem dvida, estas normas para a amostragem de alimentos sem embalagens, so muito gerais, j que cada alimento tem sua prpria tcnica de extrao e, em muitos casos, seus prprios elementos, como acontece com o perfurador de queijos ou o extrator de cereais. Embora as tcnicas e utenslios de trabalho sejam muito importantes, para a grande maioria dos alimentos, as normas gerais acima explicitadas, resultam suficientes. Tabela 2. Clculo de quantidade de amostra para alimentos sem embalagem. Clculo de quantidades de amostras para alimentos sem embalagem Kg/1 At 25 26 a 50 51 a 75 76 a 100 101 a 150 151 a 200 201 a 250 251 a 300 301 a 400 401 a 500 501 a 600 601 a 700 701 a 800 801 a 900 901 a 1000
kg 0,158 0,182 0,249 0,296 0,352 0,417 0,479 0,524 0,590 0,665 0,740 0,805 0,865 0,921 0,974
UB em g ou mL lll lV V Vl Vll Vlll X Xl Xll Xlll XV XVl XVlll XlX XX

17
2.11 E N V I O
D E AM OSTR A S A O L AB OR AT RI O
O envio da amostra deve ser efetuado de tal maneira que assegure uma total garantia de inviolabilidade, conservao e integridade (Figura 5). No tendo estes cuidados, a amostra deixa de ser representativa e perde todo valor legal.
ENVIO DA AMOSTRA - I -
AMOSTRAGEM GARANTIA DE:

Para evitar trocas, substituies ou acrscimo de substncias prprias e estranhas
INVIOLABILIDADE
CONSERVAO
UNIDO AO CONCEITO DE NO ALTERAO
INTEGRIDADE
UNIDO AO CONCEITO DE NO RUPTURA
Figura 5. Envio de amostras ao laboratrio: inviolabilidade, conservao e integridade.
2.11.1 I N V I OL A BI LI D AD E Uma amostra pode ser uma arma legal que poder decidir o destino dos alimentos em estudo, isto , liberar ou condenar o alimento, sendo problemtico nos dois casos. No primeiro caso, porque podero ser liberados alimentos que esto aptos para o consumo, com as conseqncias imaginveis para o consumidor. No segundo caso, pela dupla perda, do alimento propriamente, e da perda econmica resultante. Esta norma de inviolabilidade dever ser observada para evitar trocas ou substituies totais ou parciais da amostra, que podero modificar os dados laboratoriais. Poder-se-o acrescentar ou substituir substncias prprias ou estranhas, com a finalidade de alterar os resultados das anlises.
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2.11.2 C ON SE R V A O Os alimentos perecveis, pelas prprias caractersticas, so possveis de decompor-se ou deteriorar-se. Uma amostra que seja enviada para o laboratrio e que sofra os ataques de fatores estranhos, no poder refletir o verdadeiro estado do alimento, portanto, os resultados das anlises sero duvidosos. A conservao vai unida ao conceito de no alterao, assim, dever enviar-se ao laboratrio, protegido de tal maneira, que no sofra deterioraes, sendo, o correto, acondicion-la em caixas de isopor com alguma mistura refrigerante ou simplesmente com gelo. Tambm, nestes casos, importante envi-la rapidamente para o laboratrio.
2.11.3 I N T E GR I DA D E Ao falar de integridade, devemos unir este conceito ao de no-ruptura da amostra. Considerando que qualquer alimento passvel de deteriorar-se pela ao da temperatura. Ar, umidade, etc., e que os alimentos com embalagens estariam protegidos dos fatores ambientais. No incomum que alimentos com embalagens de vidro cheguem, ao laboratrio, estragados, invalidando as anlises. To pouco incomum, que garrafas ou vidros cheguem vazados, com perdas, por incorreto fechamento. Estas amostras, nestas condies, perdem todo o valor analtico e legal.
2.12 I D E N T IF I CA O
DA A M OST R A
Toda amostra dever ser perfeitamente identificada. No se pode esquecer que o destino dos alimentos depender dessa amostra e que uma confuso pode trazer graves conseqncias. A identificao da amostragem a dois nveis: a) nas amostras propriamente ditas; b) nos pacotes, onde sero remetias (Figura 6).
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ENVIO DA AMOSTRA II IDENTIFICAO AMOSTRAGEM
DAS AMOSTRAS (rtulas)
produto peso data endereo nome dos inspetores estemunhas outros dados
DOS PACOTES (de papel, caixas de madeira ou de papelo)
atar lacrar carimbar identificar assinar outros dados
Figura 6. Envio de amostras ao laboratrio: identificao e amostragem.
Aconselha-se colocar um rtulo em cada amostra, indicando claramente o tipo de produto a ser analisado, peso lquido, data, endereo da indstria ou fbrica, nome dos inspetores ou responsveis pela amostragem, como tambm o nome de testemunhas. Se for necessrio, devero acrescentar-se outros dados que podero orientar os analistas, como pode ser o estado de higiene local, as condies ambientais, se os alimentos provocaram algum tipo de intoxicao. Enfim, todos os dados que sirvam pesquisa do laboratrio, para, assim, obterem-se os melhores resultados. No esquecer que, por regra geral, no se dever acrescentar conservantes s amostras, porm, se por razes especiais acrescentado algum conservante, dever anotar-se qual a substncia, como tambm as quantidades utilizadas. Nestas condies, as amostras so misturadas, separadas em trs partes iguais e empacotadas com papel, caixas de papelo ou de maneira e acondicionadas de maneira, tal que no possam deteriorar-se. Os pacotes so amarrados cuidadosamente, restando, para
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completar os cuidados, lacrar, carimbar, identificar e colocar a assinatura dois responsveis pela amostragem. As amostras assim acondicionadas so enviadas para o laboratrio no menor perodo de tempo, especialmente quando so alimentos perecveis. Neste caso, ter que ser substituda, a caixa de papelo ou madeira, pela geladeira de isopor.
2.13 D E ST I N O
D A S AM OST RA S
Como foi dito, as amostras colhidas, so divididas em trs partes, logo que forem perfeitamente misturadas. Cada uma destas partes vai cumprir funes diferentes (Figura 7). Das duas amostras que vo ao Laboratrio Bromatolgico, uma delas para fazer a anlise propriamente, sendo que a outra reservada para fazer a retificao ou verificao dos dados anteriores, ou seja, para repetir as anlises, em caso de dvida. A terceira amostra fica em poder do comerciante, industrial, enfim, em poder do interessado, para fazer a contraprova ou contra-verificao da anlise, caso seja necessrio. A terceira parte em que foi dividida a amostra ter que ser cuidada e protegida pelo interessado. Nas outras duas partes, que vo para o laboratrio, antes de serem abertas, so adotados os dados correspondentes amostra e tambm as condies em que chegaram.
2.14 R E SU L TA D OS
D A S A N LI SE S B R OM A TOL GI CA S
Feitas as anlises correspondentes, pode suceder que os alimentos sejam liberados (aptos para o consumo), ou que sejam condenados (no aptos para o consumo). No primeiro caso, comunicado, ao interessado ou responsvel pelos alimentos, que o lote foi liberado para o consumo. O segundo caso ocorre quando a primeira anlise indica que a partida no apta para o consumo. Repetem-se as anlises com a segunda amostra (retificao ou verificao). Se so confirmados os resultados, dever comunicar-se ao interessado que pode exigir uma contraprova ou contra-verificao, utilizando, para estas anlises, a terceira amostra (que ficou em seu poder). Como se pode ver, so extremas as precaues para evitar riscos sade da populao e liberar a venda de alimentos duvidosos.
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DESTINO DAS AMOSTRAS
AS AMOSTRAS TIRADAS COMA ARTE E CINCIA SO MISTURADAS E DIVIDIDAS EM TRS PARTES
LABORATRIO PARA ANLISE BROMATOLGICA
1 P A R T E 2 P A R T E 3 P A R T E
LABORATRIO PARA ANLISE DE VERIFICAO
NO LOCAL PARA A ANLISE DE CONTRA-VERIFICAO
Figura 7. Destino das amostras.
M N IM A DE AM OST R A PA R A A N L I SE B R OM A T OL GIC A
importante lembrar que as quantidades mnimas estabelecidas para uma anlise de controle bromatolgico so apenas suficientes para fazer uma anlise, mas tero que ser tiradas, sempre, quantidades suficientes, para que, quando se faz a separao da amostra em trs partes, cada uma delas, nunca, resulte em quantidade inferior mnima necessria para cada anlise. O Manual Oficial de Procedimentos de Inspetoria insiste na necessidade de tirar uma quarta amostra, nos casos em que se inclui a anlise microbiolgica, utilizando as mesmas tcnicas de clculos e procedimentos que a utilizada para tirar as amostras para anlises qumicas, s que tero que ser cuidados aspectos imprescindveis, inerentes esterilizao, lavagem, etc., dos vidros ou garrafas, para alimentos sem embalagem e, fundamentalmente, sua remessa urgente e em condies adequadas, para o laboratrio.
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2.16 U N I D A DE S
B SI C A S D E A M OSTR A S
Por razes de ndole prtica, estabelece-se um sistema de unidades bsicas para as amostras de alimentos slidos a granel, ou alimentos lquidos ou slidos armazenados em embalagens maiores. Para alimentos com embalagens pequenas ou mdias, costuma-se retirar unidades inteiras, como, por exemplo, uma garrafa de suco de tomate ou uma latinha de conserva. Cada unidade bsica (UB) equivalente a 50 g ou 50 ml de alimentos, dependendo do estado fsico do mesmo. Na Tabela 2, pode-se ver o nmero de UB a separar, em relao a raiz quadrada do lote de alimentos, em quilogramas ou litros, para posterior anlise. Estas tabelas tambm so vlidas para cada alimento. Dever entender-se que, se a embalagem original maior do que o mnimo necessrio, dever-se- utilizar o critrio da embalagem fechada. Por exemplo, se um alimento lquido estiver contido em garrafas de 500 mL e para a sua anlise so necessrias s 250 mL, dever ser utilizada a unidade original, ou seja, a garrafa de 500 mL.
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3 A N L I SE
PE R CE N T UA L DE A LI ME N T OS
O homem, historicamente, no se preocupou muito por conhecer qual contedo de nutrientes contidos nos alimentos que consumia; sua preocupao era obter esses alimentos e sua experincia, fruto da observao, indicavam quais eram os melhores ou mais convenientes. possvel que seja essa preocupao em obter os alimentos, que levou a acrescentar adubos nos vegetais e ainda na pastagem, para melhor alimentar os animais que serviriam de alimento ao homem. Estes adubos, aos poucos, foram necessrios para analislos, conhecer quais os princpios ativos contidos neles, enfim, quais as quantidades de nutrientes presentes para se obter os resultados mais favorveis. Foi na Alemanha e na metade do sculo passado, que um grupo de grandes fazendeiros resolveu criar uma estao experimental, para que, entre outros, se estudasse, quimicamente, os adubos e forragem. As determinaes das substncias contidas nesses alimentos para as plantas e para os animais chegavam a ser exatamente igual aos alimentos humanos, e sua aplicao nessa rea consistia, somente na substituio da amostra e a sua conveniente adaptao. Foi assim que surgiram os mtodos de Kjeldhal (protena), Soxhlet (gordura), e outros, que utilizados at hoje, com algumas modificaes, mas que, fundamentalmente, continuam a ser os mesmos. Uma das funes do analista em alimentos a determinao do valor calrico nutricional dos alimentos. Pata tanto necessrio conhecer-se e determinar o percentual das substncias contidas nos alimentos. Embora se requeiram conhecimentos de qumica e alguma prtica em laboratrio, estes so relativamente fceis de se conseguir num curto espao de tempo. Numa anlise percentual de alimentos costuma-se determinar o teor de: a) umidade; b) cinzas; c) gorduras; d) fibras; e) protenas; f) carboidratos. Quando se faz esse tipo de anlise, procura-se determinar o teor percentual das substncias ou grupos de substncias que constituem um determinado alimento. uma anlise genrica. Se houver necessidade de determinar especificamente qualquer um dos componentes de um alimento, deve se utilizar tcnicas prprias. A tabela a seguir um exemplo de dados analticos encontrados para 100,0 g de ervilha enlatada:
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Umidade.......................................82,6 g % Protenas......................................3,5 g % Gorduras........................................0,3 g % Fibras.............................................1,5 g % Cinzas.............................................1,1 g % Total.................................................89,0 g %
As anlises realizadas determinaro que estes 5 componentes constituem 89% do total, ou seja, de 100 g de alimento. Se esse valor for subtrado de 100, obtm-se, como resultado, 11%, valor que corresponde ao extrato livre de nitrognio identificado com os hidratos de carbono. pouco comum no encontrar todos estes componentes em um alimento composto; nos alimentos simples, porm, ocorre, com freqncia, a ausncia de um ou mais componentes mencionados. Os leos comestveis, por exemplo, no contm fibras; o acar no contm protena. Pode-se, pois, dizer que os alimentos de origem animal no contm fibras cruas, que so privativas do reino vegetal. Conhecendo-se a composio percentual de um alimento, pode-se determinar o valor calrico do mesmo. A FAO, em relatrio recente, analisa o fato e d uma mdia de 2500 cal para solucionar o problema da subnutrio. Ainda mais, nos pases desenvolvidos, esto aumentando as doenas pela ingesto exagerada de alimentos (mdia de 3380 cal); nos pases subdesenvolvidos vem aumentando as doenas devido subnutrio (mdia de 2000 cal). Para se obter estes dados basta multiplicar o peso em gramas, dos componentes, pelo equivalente calrico, e som-los.
3.1 P R E P A RA O
DA A M OST R A
A preparao da amostra, para analisar qualquer substncia ou grupo de substncias que compem o alimento, um caso especial. Trabalhar com alimento de origem vegetal no o mesmo que trabalhar com alimento de origem animal. Em suma, cada tipo de alimento um caso particular. Apesar de cada caso ser um caso, h operaes que so comuns a todas as situaes, para que as determinaes analticas sejam as melhores possveis. Supondo que a amostra seja representativa, pois os resultados da anlise valem quanto vale a amostra, deve se proceder das seguintes formas (Figuras 8 e 9).
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AMOSTRA
SEPARAR
NO COMESTVEL
COMESTVEL
PESAR
CALCULAR %
Figura 8. Procedimento para o preparo da amostra.
COMESTVEL
MOER TRITURAR
ACARES
-REDUTORES -NO REDUTORES
VITAMINAS
A D
B E
C K
OUTRAS SUB ST NCI AS
-UMIDADE -PROTENAS -GORDURAS -FIBRAS -CINZAS
Figura 9. Procedimento para o preparo da amostra.
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1) 2)
Eliminar, separar, tirar, etc., as partes no comestveis; Moer, triturar a amostra para facilitar a anlise.
Para esclarecer melhor, exemplifica-se com um caso: o da lingia conservada em banha. Para fazer determinaes analticas, dever remover-se toda a gordura que cobre a lingia; da lingia livre de gordura externa, corta-se uma fatia, perpendicularmente ao comprimento da mesma; nesta fatia estaro proporcionalmente as parte em contato com a banha e tambm a parte central e mdia. Esta fatia ou fatias sero trituradas por qualquer mtodo adequado, a fim de que os reagentes possam atingir melhor e mais rapidamente as partes componentes. Quando forem solicitadas, alm das determinaes citadas, o teor de vitaminas ou as percentagens de aucares redutores ou no redutores, aconselha-se de separar a amostra moda em trs partes.
3.2 M AT E RI A L Na determinao das percentagens de nutrientes contidas num alimento, so utilizadas tcnicas e material encontrado comumente em todos os laboratrios de qumica. O material tem que ser escrupulosamente lavado com gua e sabo, e logo, lavado com novamente gua destilada para a secagem. Quando o material estiver engordurado colocado em vidro que contenha uma mistura sulfocrmica (50 g de bicromato de potssio em 1Kg de cido sulfrico), de 12 a 24 horas. Tirar o material do vidro, lavar com gua da torneira e tornar a lavar novamente com gua destilada. A secagem vai depender da temperatura com que tratado o material. Geralmente, suficiente, colocar o material em estufa a 103 105C por no menos de duas horas (Figura 10). Aumentando a temperatura, diminui o tempo; por exemplo, a 180C, so suficientes 30 40, ou, a 220C, o tem p pode ser de 20, como mnimo.
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ANLISE PERCENTUAL
MATERIAL DE LABORATRIO
PREPARAO
CADINHO
- limpo
CPSULA PESA-FILTRO BALO
- desengordurado - seco em estufa (2 horas a 103C 105C) esfriar em dessecador
Figura 10. Procedimento de anlise.
Sem dvida alguma, a limpeza e secagem do material so de extremada importncia, j que eliminamos uma quantidade razovel de substncias que possam interferir nas tcnicas, alterando os resultados. Isto se torna mais importante, quando nos referimos a cadinho (determinao de cinzas), pesa-filtro (determinao de fibras), balo coletor (determinao de gordura), cpsula de porcelana ou copo de Bquer (determinao de umidade) ou, em geral, o material pra efetuar a pesagem das amostras j que esse material aporta dados que sero utilizados nas formulas para se obter os clculos. Transcorrido o tempo da secagem, tira-se o material, esfria-se em dessecador com slica-geral e pesa-se.
DE A M OST R A
A mostra, moda ou triturada convenientemente, ter que ser pesada. A quantidade utilizada depender muito das quantidades e disponibilidades e do tipo de amostra (Figura 11).
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COMESTVEL
MOER - TRITURAR
1a2g
cadinho
cinzas
0,5 a 2 g
balo
E rl en m eyer com t ubo de refluxo
protena
1a2g
fibra
1a3g
Papel de filtro
Cpsula de porcelana ou copo de becker
gordura
resto
umidade
Figura 11. Esquema para moagem e triturao.
Quando a amostra para anlise muito pequena, pesa-se todo o material e dividi-se convenientemente. No esquecer que para cada determinao, so necessrias duas amostras. Quando se dispe de muita amostra, as quantidades a serem tiradas dependem muito do tipo e da origem da amostra. Como se pode ver no esquema, as quantidades no podem ser rigorosas, pois se aconselha, 1-2g ou 0,5-2g, ou seja, entorno dessas quantidades. O tipo de amostra tambm importante, j que teremos que utilizar mais ou menos quantidades, dependendo das quantidades que ns acreditemos. Na determinao de protenas de um alimento de origem animal, utilizar menos amostra que em outro de origem vegetal, pois, no primeiro encontraremos bem mais protenas que no segundo e, portanto, no justifica a utilizao de uma amostra grande. Outros exemplos podem ser as fibras, que, como foi dito, so privativas do reino vegetal. Se for necessrio determin-las em um alimento de origem vegetal, suficiente 1 grama, ou menos at, segundo mtodo, quanto mais 2 gramas; pode acontecer a busca de fibras em conservas de origem animal, mas condimentadas. Neste caso,
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as quantidades de amostras devero ser maiores, j que as fibras, estaro presentes em muito pouca quantidade, pois sua origem so as espcies acrescentadas. Pode ser til separar e pesar a amostra para determinao de cinzas, gordura, protena e fibras reservando o resto para a determinao da umidade. O material seco servir, se for necessrio para repetir algumas das experincias.
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4 A N L I SE S F SI C O -Q U M IC A S
DE
A LI ME NT OS
NORMAS TCNICAS DE MTODOS FSICOS E QUMICOS PARA ANLISE DE ALIMENTOS (INSTITUTO ADOLFO LUTZ)
D E UM ID A DE
A perda de peso pelo produto quando aquecido com intuito de remover a gua chama-se anlise de determinao da umidade. Pelo fato da gua ser uma substncia muito abundante na natureza, ser parte de todos os organismos vivos, ser indispensvel para manter os processos biolgicos, ser parte de todos os alimentos de origem vegetal e animal, isto , da grande maioria dos alimentos, por ter caractersticas especiais e por ser considerada como adulterante universal dos alimentos, a determinao de gua de grande importncia. A determinao da umidade muito importante, porque da umidade depende a melhor ou pior preservao do material. A gua contida no material encontra-se sobre as seguintes formas: a) gua de umidade a gua que esta em estado livre dentro da substncia e, relativamente fcil de ser removida;
b)
gua de cristalizao - Encontrada na substncia para formar estado cristalino, acarreta modificao da natureza fsica da substncia.
c)
gua de constituio a gua que entra na formao da substncia, como, por exemplo, H2SO4 que tem uma molcula de gua, porque resulta de SO3 + H2O H2SO4.
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4.1.1 M T OD OS
T E RM OGR AV IM TR I C OS
Tambm chamados de mtodos indiretos ou de dessecao at peso constante. A determinao feita por diferena entre o alimento mido e o alimento seco. A temperatura, nestes mtodos, ter que ser regulada em funo do tipo de amostra, sendo compreendida entre 70C e 105C. Utilizam-se temperaturas de at 70C nos alimentos sacarnicos, tais como o acar, glicose, lactose e outros, onde prevalecem os hidratos de carbono. para se evitar a carbonizao desses alimentos. Outros acares, como a levulose, se decompem a temperaturas elevadas (a 70C, j inicia a decomposio). A temperatura de 103- 105 mais utilizada, j que a grande maioria dos alimentos a aceita sem sofrer quase que nenhuma deteriorao, exceto perda de gua. Alguns autores utilizam temperaturas inferiores (90C-100C) e outros, temperaturas superiores (105C110C); na prtica, vai depender do grau de triturao da amostra, e do tempo. Ns adotaremos a temperatura de 103C-105C, como a temperatura tima, j que o ponto de evaporao mxima 100C. Alguns autores utilizam o Banho-Maria fervente (100C), apesar de ser a estufa a fonte de calor de eleio. O inconveniente do uso da estufa a formao, por oxidao, de algumas substncias normalmente ausentes nos alimentos no tratados. Estes elementos aumentam o peso do resduo. Outro inconveniente que, juntamente com a perda de umidade, podem se perder algumas outras substncias volteis temperatura de trabalho, como podem ser os essenciais e outros princpios ativos. Quando se supes que esta perda possa ser considervel, aconselhase quantific-la, em separado, para logo, em outras determinaes, fazer a diferena no final dos clculos. Em termos gerais, as pequenas diferenas que podem aparecer, por excesso ou por falta, so muito pequenas, portanto, podem-se desprezar, especialmente em funo da importncia desta determinao, como, por exemplo, sobre a qualidade de alguns alimentos como o leite, frutas secas, alguns tipos de queijos, etc., ou para a tipificao dos cereais e
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alimentos em p (farinhas, leite em p) e ainda para conhecer o grau de desidratao (amadurecimento) de outros alimentos, como o mel e o queijo tipo duro. A determinao de umidade pelo mtodo direto feita pesando-se 5 g da amostra em cpsula de porcelana ou pesa-filtro previamente aquecido em estufa a 105C, por 1 hora, resfriado em dessecador at a temperatura ambiente e pesado. Aquece-se em estufa a 105C, por 3 horas. Resfrie em dessecador, at a temperatura ambiente. Pese. Repita as operaes de aquecimento e resfriamento at peso constante. Para saber-se que amostra no contm mais umidade, bastar verificar, em sucessivas pesagens, at obter-se peso constante, em duas pesagens consecutivas, no mesmo intervalo de tempo. O valor da umidade expresso pela seguinte Equao (1).
100xN = umidade% a 105 0 C m
Eq. (1)
Onde: N = perda de peso em gramas da amostra; m = massa da amostra em gramas.
D E CI NZ A S
Resduo mineral fixo, minerais totais ou cinzas o nome dado ao resduo obtido por aquecimento em temperatura prxima a 550 - 600C. Nem sempre este resduo representa toda a substncia inorgnica presente na amostra, pois alguns sais podem sofrer reduo ou volatilizao nesse aquecimento. Geralmente, as cinzas so obtidas por ignio de quantidade conhecida da amostra, entre 1 e 5 g, em cadinho ou cpsula de platina, porcelana ou outro material resistente ao calor, e mantido em mufla a 650C, at eliminao completa do carvo. As cinzas devero ficar brancas ou ligeiramente acinzentadas. (Em caso contrrio, esfriar, adicionar 0,5 mL de gua, secar e incinerar novamente). Algumas amostras contendo sais de metais alcalinos que retm propores variveis de dixido de carbono nas condies
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da incinerao, so tratadas, inicialmente, com solues de carbonato de amnio ou clcio sulfrico diludo e, aps secagem do excesso do reagente, aquecidos e pesados. So, ento, denominadas Cinzas Carbonatadas ou Cinzas Sulfatadas, respectivamente. Muitas vezes, vantajoso combinar a determinao direta de umidade e a determinao de cinzas, incinerando o resduo obtido na determinao de umidade. A anlise de cinzas insolveis em cido, geralmente cido clordrico a 10% (p/p), d uma avaliao de slica (areia) existente na amostra. Alcalinidade das cinzas outra determinao auxiliar, no conhecimento das cinzas. A determinao das cinza feita pesando-se 5g da amostra em cadinho de porcelana previamente aquecida em mufla a 650C, resfriado em dessecador at a temperatura ambiente e pesado. Carbonize a amostra em temperatura baixa e incinere em mufla a 650C. Resfrie em dessecador at a temperatura ambiente e pese. Repita as operaes de aquecimento e resfriamento at peso constante. O valor das cinzas expresso pela seguinte Equao (2).
100xN = cinzas% a 600 0 C m
Eq. (2)
Onde: N = massa em gramas da cinza m = massa da mostra em grama
D E L IP DI OS
So co mpostos de car bono, hidrognio e oxignio, co m predo mnio de hidro gnio, desprendendo maior nmero de calor ias em sua co mbust o do que o s carbo idrat o s, que t ambm so compostos de carbo no, hidrognio e oxignio .
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As gorduras, leos e banhas esto contidas nos alimentos naturais em propores variveis entre 1-2 em frutas e hortalias; e 70% em alguns tipos de nozes. Outros alimentos, como os leos comestveis e a manteiga, contm perto de 99% de lipdios. A determinao de lipdios em alimentos feita, na maioria dos casos, pela extrao intermitente da frao lipdica por meio de um solvente orgnico adequado. Aps a extrao e remoo do solvente, determina-se, gravimetricamente, a quantidade de lipdios presentes. O resduo obtido no , na verdade, constitudo unicamente por triglicerdios, mas por todos os compostos que, nas condies da determinao, possam ser extrados por solvente. Geralmente, so fosfatdios, esteris, vitaminas A e D, carotenides, leos essenciais, etc., mas em quantidades relativamente pequenas, que no chegam a representar uma diferena significativa na determinao. Os solventes mais comuns usados so: o ter etlico (ter sulfrico) e o ter de petrleo. A mistura desses dois solventes tambm recomendada. O ter etlico apesar de ser um bom extrator de lipdios tem algumas desvantagens: a) Deve estar completamente livre de gua (anidro); b) Contendo gua, dissolver tambm alguns mono e dissacardeos, provocando desvios na determinao; c) A amostra a ser usada deve estar completamente seca; d) No extrai completamente derivados como a lecitina; e) altamente inflamvel e, quando oxidado, explosivo; f) Sua recuperao deve ser acompanhada com grande cuidado. O ter de petrleo, por sua vez, apesar de no ser o solvente por excelncia, traz uma srie de vantagens: a) No extrai outras fraes que no sejam as lipdicas; b) No afetado por pequenas quantidades de gua; c) A sua recuperao por destilao muito mais conveniente, porm, que seu custo muito maior.
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A extrao pode ser levada a efeito em um extrator intermitente, sendo o mais comum o aparelho de Soxhlet. Neste aparelho o produto a ser extrado fica completamente protegido d indesejvel elevao da temperatura. O material colocado no cartucho deve ser completamente dessecado, pois, assim, o ter penetra rapidamente em sua massa, alm de ser prevenida a possvel extrao conjunta de substncias indesejveis, solveis em gua, bem como arrastamento da prpria gua, o que provocaria um erro. O material deve ser triturado, para permitir melhor atuao do solvente. O tempo de extrao varivel dependendo da natureza do produto. Tem-se indicao do ponto final do processo quando uma gota do solvente recm-destilado no acusar a presena de gordura (teste da mancha na folha de papel) Recupera-se por destilao a maior parte possvel do solvente. Neste caso, os teores de substncias etreo-solveis podem ser desde traos, como no caso do amido, ou at 15 %, como no caso do abacate. As carnes e pescado tambm apresentam um teor bastante varivel de lipdios, esta variao est em funo da manipulao do alimento e condies do animal.
4.3.1 M T OD O
DE
S OX HL ET
A determinao de lipdios em amostras slidas feita pesando-se 3 g da amostra em um cartucho apropriado para este tipo de anlise pertencente ao aparelho de extrao Soxhlet, com auxlio de um pedao de algodo desengordurado, cobre-se o cartucho. Extrai-se em aparelho de Soxhlet, o qual composto pelo cartucho, contendo amostra, acoplado em condensadores que por sua vez se acoplam a um balo volumtrico (previamente aquecido por uma hora em estufa a 105C, resfriado em dessecador at a temperatura ambiente e tarado), com hexano, por cinco horas. Evaporado o solvente coloca-se o balo com resduo na estufa a 105C para evaporar o solvente restante. Esfria-se em dessecador at a temperatura ambiente e pesa-se. O teor de lipdios determinado pela Equao (3).
100xN = %lipdeos m
Eq. (3)
36
Onde: N = massa em gramas de lipdio m = massa da amostra em gramas
4.3.2 M T OD O
DE
G ER B ER
Este mtodo foi desenvolvido por volta de 1892 como sendo o mais rpido para a determinao prtica de lipdios. Entretanto, com o surgimento de mtodos instrumentais, o mtodo de Gerber perdeu sua importncia. Contudo, devido a sua execuo simples e sua aplicao, apresenta exatido e reprodutibilidade nos resultado. Os especficos tubos ou butirmetro foram desenvolvidos para os diferentes tipos de produtos lcteos, com escala apropriadas e especficas. O procedimento envolve medidas especficas da quantidade de amostra a ser adicionada, seguida de medidas especficas de cido sulfrico e lcool amlico para auxiliar na separao da fase aquosa e oleosa. A adio de cido sulfrico causa aumento na temperatura, que aumenta a medida que os lipdios so dissolvidos. A mistura centrifugada em uma centrfuga especial de Gerber a 1.100 rpm por um tempo determinado; aps, os tubos so colocados em banho-maria calibrado a 65 C para padronizar as amostras e a leitura dada direto na escala do butirmetro.
4.3.3 M T OD O P ON DE R AL Nesta tcnica o alimento homogeneizado com pequenas propores da mistura de lcool etlico, ter etlico, ter de petrleo e hidrxido de amnio de formando duas fases. Uma contendo a frao lipdica e outra contendo os acares. Em seguida retira-se uma alquota da fase lipdica coloca-se em uma cpsula de porcelana e evapora-se o solvente em banho-maria. Pesa-se a cpsula com a frao lipdica resultante. A det er minao de lip d ios em amost ras lquidas feit a medindo -se 10 mL da amo st ra. Transfer e-se para uma provet a graduada co m ro lha esmer ilhada co m capac idade de 100mL. Adicio na- se 2mL de hidrxido de am nio e 10 mL d e lco o l et lico. Fecha-se a provet a e agit a- se. E m seguida
37
acrescent a-se 25mL de t er et lico, vo lt ando a agit ar, adic io na- se finalment e 25mL de t er de pet rleo ag it anda- se mais u ma vez. Ap s u ma ho ra em repo uso fazse a le it ura da so luo et rea t ot al, e em seguida ret ira- se uma alq uo t a de 25mL e t ransfere- se p ara u ma cpsu la d e po rcelana pr eviament e t arada. Coloca-se a cpsula em banho- mar ia para evaporao dos so lvent es. Aps essa et apa leva-se par a est ufa a 105C por meia hora, em segu id a resfr ia-se em dessecador at a t emper at ura ambient e. Pesa-se. A Equao 4 expressa o clculo para o valor da substncia graxa da amostra 25mL (sol. etrea total) ___________ P3 = (P2 P1) V ___________________________ x
x=
Onde: P1= massa da cpsula vazia;
V P3 25mL
Eq. (4)
P2 = massa da cpsula + substncia graxa; P3 = massa da substncia graxa; V = volume em mL da soluo etrea total; x = substncia graxa na soluo etrea. A Equao 5 expr essa a percent agem de lipdios: 10mL (amostra) _______________ x 100 mL ___ ___________________ Lipdio s (%) Lipdios (%) = x 10 E q. ( 5)
38
4.3.4 M T OD OS
I N ST RU ME N T AI S
A determinao por cromatografia gasosa fornece um resultado muito mais preciso sobre a natureza do leo e gordura, especialmente quando se utiliza coluna capilar, que fornece uma informao detalhada, quantitativa e qualitativa, sobre a quantidade de cada cido graxo presente em triglicerdeos, incluindo os ismeros cis e trans, e cidos instaurados. O tpico procedimento de separao, identificao e quantificao de cidos graxos envolve: a) b) Hidrlise dos leos utilizando um lcali como o hidrxido de potssio; Esterificao dos cidos graxos produzidos no item (a) para produzir composto com maior volatilidade que eles prprios; c) A separao dos steres envolve a injeo das misturas adequadas de steres obtidos nos procedimentos anteriores (a, b) na coluna capilar para a separao, identificao e quantificao de cada ster. Esta tcnica exige uma programao de temperatura para se obter uma satisfatria separao de todos os compostos. A identificao dos steres pode ser realizada pela comparao dos tempos de reteno dos padres nas mesmas condies de anlise, e a quantificao pode ser obtida pelo clculo da integrao da rea do pico cromatogrfico ou pela curva analtica.
D E P R OT E N A
So substncias compostas por carbono, hidrognio e nitrognio, tendo alguns outros elementos presentes tais como, fsforo, ferro e o enxofre. Depois da gua, representam as partes mais importantes do organismo dos animais e vegetais. As protenas se classificam de acordo com sua composio qumica em: Holoprotenas, que produzem apenas aminocidos, por meio de hidrlise; e Heteroprotedios ou protedios, que por meio da hidrlise, alm de aminocidos produzem outros produtos. Agem tambm como elemento energtico na ausncia de carboidratos e gorduras, sendo os produtos de origem animal os mais ricos em protenas.
39
A determinao de protdeos baseada na determinao de nitrognio, geralmente feita pelo processo de digesto de Kjeldahl. A matria orgnica decomposta e o nitrognio existente finalmente transformado em amnio. Sendo o contedo do nitrognio das diferentes protenas aproximadamente 16%, introduziu-se o fator emprico 5,75 ou 6,25 ou 6,38 (ANVISA), para transformar a massa em gramas de nitrognio encontrada massa em gramas de protdeo. O mtodo de Kjeldahl (AOAC, 1984) foi descrito foi descrito a mais de um sculo, em 1883. Johan Gustav Christoffer Thorsager Kjeldahl publicou um trabalho sob o ttulo Um novo mtodo para determinaes de nitrognio em compostos orgnicos em uma revista dinamarquesa, sendo que o sucesso do mtodo foi imediato e desde ento o mais amplamente usado. Neste mtodo, por meio de uma digesto cida, o nitrognio da amostra transformado em sulfato de amnio (NH4)2SO4, o qual posteriormente separado por destilao na forma de hidrxido de amnia (NH4OH) e finalmente determinado pela titulao. O mtodo basicamente dividido em trs etapas: a) Digesto o nitrognio orgnico transformado em amnio, e os componentes orgnicos so convertidos em CO2, H2O, etc; b) Destilao fase em que o gs amnia liberado e recolhido em uma soluo receptora; c) Titulao determinao quantitativa da amnia recolhida contida na soluo receptora. As reaes que ocorrem durante o processo da determinao dos compostos nitrogenados podem ser assim resumidas: a) Digesto durante a fase de digesto, coloca-se no tubo de Kjeldahl a amostra embrulhada, de preferncia em papel impermevel, juntamente com a mistura cataltica (K2SO4 e Se) e o H2SO4 concentrado. Faz-se o aquecimento em bloco aquecedor, e observam-se provavelmente as seguintes reaes:
H2SO4
Matria orgnica
+ catalisador
SO2 + CO2 + H2O + R NH2
40
H2O + R NH2
H2SO4
R OH + NH3
2 NH3 + H2SO4
(NH4)2SO4
O carbono contido na matria orgnica oxidado e o CO2 se desprende, e, no final da digesto, o material fica completamente claro, depois de passar por uma fase bastante escura, no inicio da digesto. Alm dos agrupamentos proticos, existe o nitrognio sob forma de amina, amida e nitrila, que so transformados em gs amnio (NH3). Este gs formado reage com o cido sulfrico (H2SO4) formando o sulfato de amnio ((NH4)2SO4), conforme indicaram as reaes. O sulfato de amnio formado, que fica no tubo, ao se esfriar, forma cristais.
b)
Destilao pode ser feita por aquecimento direto ou por arraste a vapor, sendo prefervel este ltimo. O sulfato de amnio tratado com hidrxido de sdio (NaOH) a 40 %, em excesso, e ocorre a liberao do gs amnia (NH4OH), conforme reao a seguir:
(NH4)2SO4 + 2 NaOH
Na2SO4 + 2 NH4OH (2H2O + 2NH3)
Ao se adicionar o NaOH, devem-se usa algumas gotas de fenolftalena, no destilado, para garantir um ligeiro excesso de base. O gs NH3 desprendido ento recebido em um erlenmeyer contendo cido clordrico (HCl 0,02 mol/L) mais o indicador misto de Patterson que, no incio, era de cor rosa, adquirindo a cor verde medida que se vai formando o NH4Cl. 2 NH4OH (2H2O + 2NH3) + 2 HCl(excesso) 2 NH4Cl + H2O
c)
Titulao a ltima fase onde o excesso de HCl titulado com soluo padro de hidrxido de sdio (NaOH 0,02 mol/L) com fator conhecido at viragem do indicador (Titulao por retorno).
41
HCl(excesso)
+ NaOH
NaCl + H2O
Na anlise de protena, pesa-se 0,1g da amostra em papel com ausncia de nitrognio. Transfere-se para um tubo de Kjeldahl, juntamente com 4,0mL de cido sulfrico. Adiciona-se 1,0g de uma mistura cataltica (K2SO4 e Se, numa proporo de 2:1). Aquece-se em uma chapa eltrica apropriada, na capela, at a soluo se tornar clara, esfria-se em seguida. Acrescenta-se com cuidado, 2mL de gua destilada, acrescentando 1mL do indicador fenolftalena. Adapta-se o tubo ao conjunto de destilao, mergulha-se a extremidade afilada do condensador em 40mL de cido clordrico (0,02 mol.L-1), contendo no erlenmeyer de 250mL, e 3 gotas do indicador misto de Patterson (vermelho de metila e azul de metileno) na proporo de 5:1. Titula-se o excesso de cido clordrico (0,02 mol.L-1) com soluo de hidrxido de sdio (0,02 mol L-1). A porcentagem do nitrognio expressa pela Equao (6).
%N = V x 0,028 m
Eq. (6)
Onde: V = diferena entre o volume de cido clordrico (0,02 mol L-1) adicionado e o volume de hidrxido de sdio (0,02 mol L-1) gastos na titulao da amostra em mL. 0,028 = Miliequivalente grama do N versus a concentrao da soluo versus a percentagem. m = massa da amostra em gramas A porcentagem de protena expressa pela Equao (7). %P = %N x 5,75 ou 6,25 ou 6,38 Onde: 5,75 = fator de converso para protena vegetal. 6,25 = fator de converso para protena animal. 6,38 = fator de converso para protena derivada de leite. Eq. (7)
42
DE PH
um fator de extrema importncia nos alimentos. Dependendo de seu valor contribui para o desenvolvimento de bactrias ou inibe o crescimento das mesmas. Portanto, o pH um fator determinante na qualidade dos alimentos. Ao analisar o pH obtm-se a confirmao ou no do bom estado de conservao em que o alimento em questo se encontra. Nesta anlise do pH, pesa-se 15 g da amostra em um bquer e adiciona-se 15mL de gua destilada, homogeneiza-se bem com auxlio de um basto de vidro, realizando posterior leitura, no qual inserido o eltrodo de vidro combinado na amostra, Anotando o resultado da leitura.
D E CA R B OI D RA T OS
fonte de energia dos organismos vivos, o que proporciona o combustvel necessrio para os movimentos, e so compostos de carbono, hidrognio e oxignio, na mesma proporo da gua (CnH2nOn). A partir dos carboidratos, e com a absoro de outros compostos presentes no solo ou no ar (nitrognio) formam-se as gorduras e as protenas. Para determinao de carboidrato esta feita pela diferena do valor 100 subtrado do somatrio dos valores j obtidos das anlises anteriores (umidade, cinza, protena e lipdios). A determinao de carboidratos a expressa pela Equao (8). % de carboidrato = 100 - (%umidade + %cinzas + %protena + %lipdios) Eq. (8)
4.6.1 D E TE R MI N A O
D E A MI D O
(M TODO
QU MI C O
M T OD O D E
F E HL I N G )
O amido um polissacardeo de reserva da clula vegetal, sintetizado pelas plantas na fotossntese em presena de gua e gs carbnico e sob a ao da luz, tendo a clorofila
43
como catalisador da reao. Tem massa molecular entre 60.000 e 1.000.000 e formado por cadeias lineares de molculas de glicoses, chamado de amilose (Figura 12) e por cadeias altamente ramificadas de molculas de glicoses, chamado de amilopectina (Figura 13). Ligaes ( - 1 - 4)
Figura 12 Molcula de Amilose
Ligaes ( - 1 - 6)
Figura 13 Molcula de Amilopectina
No incio do sculo XIX, o qumico Kirchhoff descobriu que, pela fervura com cido, podia converter o amido em uma substncia de sabor adocicado, constituda principalmente de glicose. Essa tcnica no apresentava boa produtividade e o processo, realizado sob condies cidas e temperatura de 140 a 150C, ainda gerava subprodutos indesejveis.
44
Na anlise de amido pesa-se mais ou menos 5g de farinha, passa para um erlenmeyer de 250 mL, junta-se 100 mL de gua destilada e 5 mL de cido clordrico concentrado. Cobrese com um tampo de algodo e coloque no autoclave por 30 minutos a 1atm. Deixar esfriar, passar para um balo aferido de 500 mL e colocar umas gotas de fenolftalena (1 a 3 gotas) juntar uma quantidade de soluo concentrada de NaOH 10N (5,5 mL), equivalente ao cido adicionado, afim de neutraliz-lo, completar o volume com gua destilada, agitar bem, filtrar e colocar o lquido na bureta (glicose). Medir 5 mL de cada uma das solues de Fehling, juntar 40 mL de gua destilada e ferver por 1 minuto. Em seguida titulou-se (a quente), com a soluo de glicose at colorao vermelho brilhante (vermelho tijolo); neste ponto fecha-se a bureta, adiciona-se 3 gotas de azul de metileno a 1% e continua-se a titulao at colorao vermelho brilhante.
Volume gasto na titulao Exemplo: 16 ml 500 ml
16mL
0,05 (ttulo de Fehling) x
Exemplo:
16 mL 500 mL
0,05 (titulo de Fehling) x
x = 1,5625 g de Glicose
Em 5g amostra 100 g
1,5625 g de Glicose % de Glicose % de Glicose x 0,9 = % de Amido
Fator de Converso da Glicose em Amido.
45
4.6.2 D E TE R MI N A O
F SIC O )
DO
G R AU B RI X
OU SL I D OS SOL V E I S
(M T OD O
A quantidade de acares em uma soluo pode tambm ser medida pelos sacarmetro de Brix, aremetro de Baum ou refratmetros. A medida refratomtrica d o teor exato de substncia seca em todos os casos em que se trate de solues aucaradas puras. Quando se utiliza o aremetro de Baum deve-se multiplicar a medida lida pelo fator de converso de 1,6 para a determinao ser Express em graus Brix. No caso da medida ser realizada com sacarmetro de Brix o valor o apresentado no sacarmetro. Para ambos os casos a medida realizada inserindo-se o aremetro de Baum ou sacarmetro de Brix em uma proveta contendo o lquido a ser determinado o teor de slidos solveis ou acares. Para anlise com refratmetro de Brix procede-se colocando uma pequena alquota da amostra na superfcie do prisma. Aps alguns segundos observa-se a marcao da escala.
D O V AL OR C AL RI C O
a quantidade de calor em calorias desprendida pela combusto de um grama de uma substncia no organismo, sendo que a combusto de hidratos, gorduras e protenas, dentro do organismo animal, no so to completas. Efetivamente, nem todas as substncias com as quais um animal se alimenta so digeridas e assimiladas. O valor calrico determina o teor de calorias dos alimentos. A determinao do valor calrico obtida pela protena (P), lipdios (L) e carboidratos (C), atravs da Equao (10). Valor calrico (kcal/ 100g) = (P x 4) + (L x 9) + (C x 4) Eq. (10) Onde: P = valor da protena (%) L = valor de lipdios (%) C = valor de carboidratos (%)
46
4 = fator de converso em kcal para protena e carboidrato metabolizados pelo organismo 9 = fator de converso em kcal para lipdios metabolizado pelo organismo.
D O R E S D U O SEC O
Deno mina- se mat r ia seca, ou resduo seco, o conjunt o de todo s o s co mponent es do aliment o, com exceo da gua. Para a det er minao de resduo seco, pesa-se 10g de ar eia lavada e m cpsu la de porcelana. Aquece-se em est ufa po r u ma ho ra a 105C, resfr iada em dessecador at a t emperat ura ambient e. Pesa- se. E m seguida adicio na-se 5 mL da amo st ra e mist ura- se. Aquece- se em banho - mar ia, po r t rint a minut os. Seca-se e m est ufa a 105C por uma ho ra. Resfr ia- se em dessecador at a t emperat ura amb ient e e pesa-se. A det er minao de resduo seco fo i calculada at ravs da Equao 11. Resduo seco (%) = Onde: N = massa em gramas de resduos seco; A = volume em mL da amostra.
100 N A
E q. ( 11)
D E DE N SID A DE
A anlise de densidade muito importante e bastante simples de ser realizada. por meio dela que podemos ter um indcio preliminar sobre adulteraes e possveis falsificaes. Para esta anlise coloca-se o densmetro em uma proveta contendo 250 mL da amostra. Faz-se a leitura diretamente na escala do densmetro.
47
4.10 D E T E RM IN A O
D E GRA U A LC OLI CO
A fermentao alcolica consiste em reao bioqumica da glicose e frutose (predominantes) originando lcoois e dixidos de carbono, alm de certo nmero de produtos secundrios. O etanol o produto mais relevante da fermentao devido sua proporo, simplicidade de formao, relativa carncia de toxidade dos produtos de fermentao e pela estabilidade biolgica proporcionada. O conhecimento da concentrao de etanol na aguardente importante por diferentes razes. Por exemplo, para comprovar o rendimento de etanol a partir de uma concentrao de acar ou para verificar se o vinho cumpre o limite estipulado. Para esta anlise coloca-se o alcometro de Gay-Lussac em uma proveta contendo 250 mL da amostra. Faz-se a leitura diretamente na escala do alcometro.
D E AC I DE Z TOT AL
Aplica-se em qualquer tipo de alimento. Determina o contedo de cidos de um alimento, por meio de titulao com hidrxido de sdio. Para essa anlise pesa-se 10 g da amostra. Transfere-se para um erlenmeyer com auxilio de 75 mL de gua destilada, recentemente fervida e resfriada e agita-se. Adicionam-se 3 gotas de fenolftalena e titula-se com hidrxido de sdio 0,1 N at colorao rsea. A acidez total determinada pela seguinte Equao (13).
mL de NaOH 1 N % = V x f x 10 m
Eq. (13)
Onde: V = volume em mL gasto na titulao f = fator de correo da soluo de NaOH 0,1N m = massa da amostra em gramas
48
10 = fator de converso da Normalidade Os valores podem ser expressos em valores relacionados com cidos orgnicos: 1 mL de soluo de NaOH 0,1 N = 0,007 de cido ctrico anidro; 1 mL de soluo de NaOH 0,1 N = 0,0075 de cido tartrico; 1 mL de soluo de NaOH 0,1 N = 0,0067 de cido mlico.
D E AC I DE Z ( L E OS E GOR D U R A S VE GET A I S )
Este mtodo aplica-se a leos e gorduras vegetais. Definido como o nmero de mg de hidrxido de sdio necessrio para neutralizar os cidos livres de um grama de amostra. Este ndice indica o estado de conservao dos leos e gorduras, uma vez que com o tempo, pode ocorres o fenmeno da hidrlise com o aparecimento de cidos graxos livres. Para essa anlise pesa-se 2 g da amostra em um erlenmeyer de 75 mL. Adiciona-se 25 mL de soluo de lcool etlico neutralizado e agita-se. Adicionam-se 3 gotas de fenolftalena e titula-se com hidrxido de sdio 0,1 N at colorao rsea. A acidez total determinada pela seguinte Equao (14).
ndice de acidez oleca % p/p = V x f x 100 x 0,0282 m
Eq. (14)
Onde: V = volume em mL gasto na titulao f = fator de correo da soluo de NaOH 0,1N m = massa da amostra em gramas 10 = fator de converso em percentagem 0,0282 = miliequivalente grama do cido olico.
49
REFER NCI AS
ASCAR, J.M. Alimentos: aspectos bromatolgicos e legais. So Leopoldo: UNISINOS, 1985, vol.1. CARVALHO, H. H. Alimentos: mtodos fsicos e qumicos de anlise. Porto Alegre: UFRGS, 2002. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analticas do Instituto Adolfo Lutz: mtodos fsicos e qumicos de anlises de alimentos. 3. ed. So Paulo, v.1, 1985. MORETTO, E. Introduo cincia de alimento. Florianpolis: UFSC, 2002. SILVA, D.J. Anlise de alimentos (mtodos qumicos e biolgicos). Viosa, UFV, 1981. SILVA, J. F.C. Noes sobre anlise de alimentos. Belo Horizonte: Escola Superior de Agricultura, 1967.
Noes de anlises microbiolgicas de alimentos
Dra. Adenilde Ribeiro Nascimento
51
A NLISES M ICROBIOLGICAS C A PTULO I M ICROBIOLOGIA

DE
A LIMENTOS
1 H I ST RI A
D OS MI C R OR GA NI SM OS N OS AL I ME N TOS
At ualment e micro rganis mos
sabemo s
que
os
microrganismos do s cient ist as.
so Hav ia
encont rado s ep id emias
prat icament e em t o do s o s lugares. Ant es da inveno do microscpio, o s eram desco nhecido s devast ado ras, cu jas cau sas no se conheciam. Os aliment os est ragava m freq ent ement e e no se po d ia co nt ro lar esse pro cesso ; famlias int eir as morr iam. Na Idade Md ia, milhares de pessoas mo rr iam de ergot ismo sem q ue se so u besse que se t rat ava d e um fungo ( Claviceps purpurea ). Possivelment e a pr imeira pessoa a suger ir a exist ncia da relao ent re os microrganis mo s e a det er io rao do s aliment o s fo i A. Kircher (1658), que examino u car ne, le it e e o ut ras subst ncias e ver ificou a presena de ver mes invis veis a olho nu. Co nt udo suas obser vaes no foram aceit as. E m 1765, L. Lpallanzanii derrubou a teoria da gerao espont nea com os seus exper iment os. Ap esar da impo rt ncia das cont r ibuies menc io nadas, fo i o md ico francs L. Past eur, o primeiro cient ist a a co mpreender o papel do s micro rganis mo s no s aliment os. E m 1857, ele mo st rou que o azedament o do leit e cru era devido ao cresciment o de microrganismo s e em 1860, emprego u o calo r para dest ru- lo s, processo ho je chamado de Past eur izao. A microbio logia de aliment o s: est uda t odo s o s micro rganis mo s qu e co nt amina m o aliment o e t ambm aqueles que so import ant es na produo de aliment o s e bebidas.
52
2 C L A SSI F IC A O Os
D OS M IC R OR GAN I SM OS
microrganis mo s
so
classificados
em
t rs
grupos
dist int os,
depend endo do t ipo de int erao exist ent e ent re microrganis mo s e aliment os, confo r me descr it o a segu ir. 1) Os micro rganis mo s nos aliment os so causadores de alt er a es qumicas prejudiciais result ando na det er iorao microbiana. Essas alt er a es so co nseqncias da at ivid ade met ab lic a dos microrganismo s. 2) Os micro rganis mo s present es nos aliment os podem represent ar r isco s sade int o xicao . 3) Os micro rganismos present es nos aliment os causam alt era es benficas em um alimento, modificando suas caract er st icas or ig inais de fo r ma a t ransfo r m- lo em u m no vo aliment o fabr icao de aliment o s fer ment ados. microrganismo s ut ilizado s na pat ognico s doenas de or igem aliment ar infeco o u
3 F ON T E S
P R IM RI A S D E M IC R OR GAN I SM OS E N C ON TR A D A S NOS A L IM EN T OS
Gneros
espcies
mais
import ant es
present es
nos
produt os
aliment c io s so enco nt rado s nas fo nt es descr it as a seguir. a) Solo: O so lo cont m a maior var iedade de microrganis mo s pro cedent es de t odas as fo nt es d e co nt aminao . Organis mo s do so lo ent ram na at mosfera pe la ao do s vent os e depo is nos corpos dgua que so arrast ados para alcanar o int er ior ou a super fc ie dos aliment os. So especialment e import ant es alguns bolores, leveduras e algumas espcies do s gnero s bact er ianos Bacillus , Clo st ridium , Enterobacter , Escherichi a , Micrococcus , Alcali genes , Flavobact erium , Ch romob acterium , Pseudomona s , Prot eu s , Strepto coccus , Leucono stoc , Acetobacter . b) gua: As gu as nat urais no s cont m sua prpr ia microbiot a, co mo t ambm microrganis mo s pro ced ent es do so lo e po ssivelment e de
Noes de anlises microbiolgicas de alimentos Dra. Adenilde Ribeiro Nascimento
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microrganis mo s pro cedent es de animais e de guas residuais. As espcies bact er ianas exist ent es nas guas nat urais so pr incipalment e espcies do s gnero s Pseudo mona s , Chromoba cteriu m , Proteus , Micrococcus , Bacillus , Enterococcus , Enterob acter e Escheri chia coli . provvel que as t rs lt imas bact r ias sejam co nt aminant es. Para a microbio logia de alimentos do is aspect os so important es: o aspect o de sade pblica e o aspect o econmico. c) guas residuai s: Quando so ut ilizadas guas residuais do mst icas sem t rat ament o exist e a po ssibilidade de cont aminao por microrganis mo s pat ognico s para o ho mem (doenas do trato int est inal). As guas nat urais cont aminadas co m guas residuais aport am o s microrganis mos nos mar iscos, pescado s e outros alimentos de or igem mar inha. Bact r ias do grupo co lifor me, Enterococos , Vi brio , out ras bact r ias int est inais e vrus so as pr incipais co nt aminant es. d) Ar: A co nt aminao dos aliment os pelo ar pode t er import ncia t ant o po r razes higinicas quant o econmicas. Os microrganis mos pat geno s, em especia l os que so respo nsveis po r infec es resp irat rias po dem ser t ransmit ido s pelo ar que po ssive lment e cont amina os aliment os. e) Animai s: Todos os animais saudveis possuem uma microbio t a co mp lexa, que po de ser t ransit r ia ( microbiot a nor mal de alguns indivduo s) e pat o gnica (capazes de mat ar seus hospedeiros). Grande quant idade de microrganis mo s freqent ement e enco nt rada em: pele reas midas especialment e vir ilha ou ent re os dedos; t rato resp irat rio nar iz e o ro far inge; t rato dig est ivo boca e int est ino gro sso; t rato urinr io part e ant er ior da uret ra; t rato genit al vag ina;
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A super fcie da pele dos humano s e out ros animais expost a ao ar, so lo e gua o s quais co nt amina m os alime nt os e equipament os. f) Manipuladores: O pessoal que t rabalha nas p lant as de indst r ias que fabr icam aliment os pode cont amin- los durant e sua manipulao e t rat ament o. Alguns pesqu isadores cit am que os seres humano s eliminam d e 10 3 a 10 4 microrganismo s vivo s po r minut o . O n mero e t ipo de micro rganis mos eliminados possuem uma relao nt ima co m o ambient e d e t rabalho. A microbiot a das mos e roupas dos manipuladores de aliment os po de ser or iunda do so lo, gua, poeira e out ros ambient es. Out ras fo nt es impo rt ant es so as fo ssas nasais, a bo ca e a pele. E m co nd i es mu it o precr ias de higiene t ambm os microrganis mo s do t rat o gast rint est inal podem co nt aminar as mo s dos manipuladores e, conseqent ement e, os aliment os po r eles preparados. As mos podem veicu lar vr io s micro rganis mo s impo rt ant es,
depend endo do t ipo de aliment o manipulado ou do mo ment o da co let a das amost ras para anlise. Os manipuladores de aliment os t m um import ant e papel na preveno das t o xinfec es aliment ares e das dema is doenas de or igem aliment ar. As mos rar ament e est o livr es de bact r ias, que podem ser
t ransit r ias o u semiper manent es no int er io r o u na super fcie d a pele. A micro biot a das mos geralment e consist e de est afilo cocos. Eles adere m super fcie da pele e persistem no s fo lculos capilares, po ro s, cavidades e les es causadas por rachadura na pele, e eles no so facilment e remo vido s. g) Utens lios Cont aminao cruzada: Ut ens lios co mo recipient es, bandejas, facas, t buas, mo edores et c., tm papel import ant e co mo font e de co nt aminao. As cont aminaes cruzadas causam cont aminaes ps-processament o do aliment o (ou seja, aps a et apa de coziment o). Po dem ser evit adas por meio de:
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planeja ment o
cu idadoso
do
ambient e
dist r ibu io
de
equipament os da fbr ica; cont role do moviment o de pessoal; hbit os adequados do s man ipu lado res quant o hig iene.
4 C A U SA S
D A C ON TA M IN A O D OS A LI MEN T OS
Exist e um grande nmero de fat ores que cont r ibue m para t ornar u m aliment o inseguro , causando toxinfeces quelas pessoas que o ingerem. As pr incipais cau sas po dem ser resumidas como: co nt ro le inadequ ado de t emper at ura durant e o coziment o ,
resfr ia ment o e a est ocagem; higiene pessoal insuficient e; cont aminao cruzad a ent re pro dut o s crus e pro cessado s; mo nit o rament o inadequado dos processos.
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C A P T U L O II M I CR OR GA NI SM OS I MP OR T AN TE S
NA
M I CR OB I OL OGI A
DE
A LI ME N T OS
da elaborao de a liment os o u por serem respo nsveis po r to xinfeces aliment ar es.
D
so
ent re os microrganis mos exist ent es, as bact r ias e os fungo s t m int er esse para a micro bio logia de aliment os por serem responsveis po r pro cesso s de det er io rao , por part icipare m
1 B A CT RI A S As caract er st icas das bact r ias em r elao sua origem, reser vat rios e o co nheciment o a respeit o de sua habilidade em so breviver e crescer nos aliment o s aliment ar es cresc iment o. fat o res na impo rt ant es det er iorao no dos cont role t ant o A das toxinfeces est co mo aliment os. preveno
diret ament e relacio nada co m a dest ruio da bact r ia e co m a inibio de seu
1.1 M ORF OL OGI A As bact r ias podem ser enco nt radas sob for ma de bacilo s (em fo r ma de bast o), cocos (for ma esfr ica) e espir ilo s ( for ma de saca-ro lhas ou curvadas). As bact r ias indiv idua is po dem fo r mar pares, grupo s, cadeias ou o ut ros agrupament o s; t ais for maes so usualment e caract er st icas de u m gnero part icular ou de uma espcie de bact r ia. A for ma de uma bact r ia det er minada po r her ed it ar iedad e.
Genet icament e, a maior ia das bact r ias mono mr fica, ist o , elas mant m u ma nica fo r ma. Ent ret ant o, uma srie de co ndies ambient ais pode modificar sua for ma, a qual, quando alt erada, dificult a sua ident ificao .
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Algumas bact r ias so pleo mr ficas, o que significa que elas podem ter vr ias fo r mas, e no apenas uma. Invis veis ao o lho hu mano, as bact r ias so nor malment e medidas em micr met ros (m), que so equivalent es a 1/1000mm (10 -3 mm). As clulas bact er ianas var iam em t amanho depend endo da espcie, mas a ma io r ia t em apro ximadament e de 0,5 a 1 m em d i met ro o u largura. O t amanho, a for ma e o arranjo das bact r ias co nst it uem su a mo r fo logia, sua aparnc ia ext er na.
1.2 M EI OS
D E C U LT U R A P AR A O C UL TI V O D E B AC T R I A S
O meio de cu lt ur a deno minado o mat er ial nut r ient e prepar ado no labo rat rio para o cresciment o de micro rganismo s. Algu mas bact r ias pode m crescer nor malment e em qualquer me io d e cu lt ura, o ut ras necessit am d e meio s especiais e exist em aquelas que no so capazes de crescer em nenhum meio de cu lt ura j desenvo lvido. Os micro rganis mo s que crescem e se mu lt ip lica m no s meio s de cult ur a so deno minados cult ura. Para o cresciment o de microrganis mos no laboratrio h uma grande var iedad e de meio s de cult ura. Muit os desses meio s so disponveis em fo r ma co mercia l e co nt m t o do s o s component es desejados sendo necessr io so ment e a ad io de gua para post er ior est erilizao. Os me io s de cu lt ura est o const ant ement e sendo desenvo lvidos o u mesmo cln ica. Para per mit ir o cresciment o, o meio de cult ura dever cont er u ma fo nt e de energia, uma fo nt e de car bo no, nit rognio, enxo fr e, fsforo e to do s o s fat o res o rgnico s que o o rganismo no capaz de sint et izar. at ualizados para o iso lament o e a ident ificao de bact r ias, pr incipalmente nas reas de pesqu isa de alimentos, gua e micro bio logia
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1.2.1 C A R A CT E R STI C A S
D O M E I O D E C ULT U R A
O meio de cu lt ura deve ser preparado de acordo com o t ipo nut r it ivo do microrganis mo qu e se pret end e cu lt ivar ; Devero cont er quant idad e de gu a necessr ia; pH ajust ado; O meio de cu lt ura dever inic ialment e ser est r il.
1.2.2 C L A SSIF I CA O
D OS M EI OS D E C UL TU R A
I. Quant o co nsist ncia: lqu ido II. manut eno. III. Quant o nat ureza: sint t ico sint t ico. Quant o fu no:
caldo; semi-s lido ; s lido selet ivo ;
agar.
enr iquecime nt o;
d ifer encia l;
quimicamente definido; no-
2 F U N GOS Os organismos do Reino do s Fu ngo s po dem se u n icelu lares o u mu lt icelulares. Os fungos mult icelular es grandes, t ais co mo cogumelo s, po dem parecer algu mas vezes co mo plantas, mas no so capazes de realizar a fot ossnt ese, co mo a maio r ia das plant as. Os fungos verdadeiros possue m parede das clu las co mpost a pr incipalment e de u ma subst nc ia chamad a d e qu it ina. As for mas unicelular es do s fu ngo s, as leveduras, so microrganismo s ovais, maio res que as bact r ias. Os fungos mais t picos so os bolores. Ao lo ngo do s lt imo s dez anos, a incidncia de infeces import ant es causadas po r fu ngos tem au ment ado. Estas infeces esto ocorrendo co mo
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infeces
nosocomia is
em
indiv duos
co m
sist ema
imuno l g ico
co mpro met ido . Os fu ngo s t ambm so benficos, so utilizados pelo s ho mens co mo aliment o s (cogumelo s), par a a produo de co mida (po) e drogas (lco o l). Das mais de 100.000 espcies conhecidas de fungos, apenas cerca de 100 so pat o gnicas dos ho mens e dos anima is. O est udo dos fungos chamado de mico lo gia. Os fungos tm sido ut ilizados na biotecno logia h muit os anos. Tambm po dem ser usado s pela engenhar ia gent ica, no cont role bio l gico de pragas.
2.1 B OL OR E S 2.1.1 C A R A CT E R STI C A S

GER A I S
Os bo lores for mam uma massa v isve l ( chamada de miclio , co mpo st a de lo ngos filament os as hifas) que se ramificam e se expandem. O cresc iment o semelhant e a algodo , algu mas vezes enco nt rado so bre o po e as frut as, so miclios de fu ngos. E les obtm seus alimentos absorvendo so lu es de mat r ia o rgnica de seu ambient e que pode ser o so lo, a gu a do mar, a gua do ce, um anima l ou uma planta hospedeira. O aspect o macro sc p ico de todo bolor que cresce na super fcie de u m aliment o po de indicar a classe e a ordem a que pert ence. E m geral a maior ia dos bo lores necessit a menor quant idade d e u mid ade disponve l. Pode ser calculada a quant idade tot al de umidade de u m det er minado aliment o que limit a o cresciment o dos bo lores, por exemplo 14 a 15% nas far inhas e alg u ns frut os secos impediro ou ret ardaro o cresciment o dos bo lores.
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A maio r ia do s bo lo res consider ada mes filo s (25-30C), algu ns po dem crescer ent re 35-37C ou a t emperat uras super iores. Alguns so psicr filo s, crescem em t emp erat uras de r efr igerao, -5 a -10C. So aerbios, necessit am de oxignio para crescer (crescem na super fcie dos aliment os). Quase t o do s o s bo lo res so capazes de crescer dent ro de um amplo int er valo de pH (ent re 2 e 8,5), ainda que a maior ia cresa me lhor em p H cido . E les ut ilizam mu it os t ipos de aliment os, desde o mais simples at o mais co mp lexo. Alguns bo lo res produzem substncias que inibem outros
micro rganis mos. D eter minados co mpostos qumicos se co mportam co mo mico st t icos por inibir o cresciment o de bo lores (co mo por exemp lo, o cido s rbico, o s pro pio nat o s e o s acet atos), out ros so especificament e fungic idas po r dest ruir os bo lores. O inc io do cresciment o dos bo lores lento quando co mparado co m as bact r ias e as leveduras.
3 L E V E D UR A S 3.1 C A R A CT E R ST IC A S As leveduras
GE RA I S
so
fungos
unicelular es,
no- filament osos,
caract er ist icament e esfr icos ou ovais, so amplament e dist r ibudos na nat ureza: so freqent ement e encont radas como um p branco cobr indo frut as e fo lhas. As leveduras que se enco nt ram no s alime nt o s po dem ser benficas o u prejud icia is. As fer ment aes produzidas pelas leveduras int ervm da elaborao dos aliment os co mo po, cerveja, diferent es t ipos de vinho s, vinagre e os queijos mat urado s. As leveduras so preju d icia is qu ando
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pro duzem alt eraes nos sucos de frut as, xarope, melao, mel, car nes, vinho s, cer veja e out ros aliment os. As levedur as se classificam pr incip alment e basead a nas suas
caract er st icas mor fo lgicas, aind a que p ara a micro bio lo g ia do s aliment o s, suas propr iedades fis io lgicas t m maior import ncia. As caract er st icas mor fo lgicas das leveduras so det erminadas
mediante obser vao microscpica. A for ma pode ser desde esfr ica a o v ide, alimo nada, cilndr ica e t r iangu lar. O cresciment o das leveduras se ver ifica at ravs de um vu na super fcie do meio lquido e produo de um pigmento carotenide. O aspect o do cresciment o desse micro rganismo t em import ncia quando est e produz p ig ment o na super fcie dos aliment o s. Nos cult ivo s em agar d ifc il d ifer enciar as co l nias de leved uras d e co l nias de bact r ias, a o bser vao microscpica dos microrganismos a nica fo r ma segur a qu e ex ist e para a diferenciao. A ma ior ia das co l nias jo vens das leveduras mida e mucosa, so co lnias brancas, cremes o u rosadas. So o xidat ivas, fer ment at ivas. Na super fcie de um lquido, as leveduras o x idat ivas po dem crescer em for ma de pe lcula, de vu, ou de espu ma; so deno minadas leved uras fo rmado ras de pelcu la. As levedur as fer ment at ivas cr escem em t oda massa do lquido e produzem di xido de car bo no. A maior ia das leveduras cr esce em subst ratos co m elevadas
co ncent raes de acar e d e sal, necessit am d e mais u midad e do que o s bo lo res. O int er valo de t emperat uras de cresciment o da maior ia das levedur as semelhant e dos bo lores co m a t emperat u ra t ima em t o rno de 25-30C e u ma t emperat ura mxima de 35-47C. Alg u mas esp cies so capazes de crescer t emperat ura de 0C ou in fer io r es. Uma reao cida pr xima de pH 4 a 4,5 est imu la o cresciment o da maior ia das leveduras.
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As leveduras crescem me lhor em aero bio se, algumas espcies do t ipo fer ment at ivo so capazes de crescer, lent ament e em anaero bio se. E m geral, os acar es so fo nt es d e ener g ia mais apro pr iad a par a as leveduras, mesmo as oxidat ivas.
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C A P T U L O III P A R M E TR OS I N T R N SE C OS
E
E X TR N SE COS
D OS
A L I M EN T OS
QUE
A F ET AM
C R E SC I ME NT O M I C R OB I AN O
est ar relacio nado s s caract er st icas do a liment o ( int r nsecos) ou ao ambient e em que est e aliment o se encont ra (ext r nseco s).
xist em muit os fat ores que afet am o cresciment o bact er iano e, port ant o, podem au ment ar a probabilidade de ocorrncia d e enfer midades t ransmit idas por aliment os. Esses fat ores po dem
1 F A T OR E S I N T R N SE C OS Esses fat o res so aqueles relacio nados com as caract er st icas prpr ias do aliment o que podem est imular ou ret ardar o cresciment o microbiano. Esses fat o res so o s seguint es: pH; At ividade de gua; Pot encia l d e o xi-reduo; Nut rient es; Const it u int es ant imicro bianos; Est rut uras bio lgicas; Cada microrganismo tem um pH mnimo , timo e mximo de cresc iment o.
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E m ger al, as leveduras e o s bo lo res t o leram me lho r a acid ez do que as bact r ias. O pH int r nseco do s aliment o s d iferent e em cada u m deles, mesmo que a maior ia t enha um pH neut ro ou cido. Os aliment o s cu jo p H baixss imo ( valo res infer iores a 4,5) no so alt erado s facilment e pelas bact r ias, sendo mais sensveis s a lt eraes po r leveduras e bo lores. Todo aliment o que t em um pH int r insecament e baixo t ende a ser mais est vel, do ponto de vist a microbio lgico do que um aliment o neut ro.
pH 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bol or es Le vedur a s A l i cy c l obac i l l us spp. Sal mone l l a spp. A c e t obac t e r spp. Li st e ri a monoc y t oge ne s Ye rsi ni a e nt e roc oli t i ca E sc he ri c hi a c ol i Cl ost ri di um bot ul i num B ac i ll us c e re us Campy l obac t e r spp . Shi ge l l a spp. Vi bri o parahae mol y t i c us Vi bri o c hol e rae Cl ost ri di um pe rf ri nge ns Fon t e: Ja y (2000).
Figu ra 1 . pH aproximado para o cresciment o de alguns microrganis mo s de origem aliment ar
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Os bo lo res so capazes de crescer dent ro de uma escala mais ampla de valo res de pH do que as leveduras e as bact r ias. O cresciment o das leved uras fer ment at ivas est imulado por um pH de apro ximadament e 4,0 a 4,5. O cresc iment o da maio r ia das bact r ias est imulado por um pH prximo da neut ralid ade, embo ra algu mas, co mo as acidificant es, cresam em pH mdio, enquant o que o utras, co mo por exemplo as bact r ias co m at ividade prot eo lt ica, so capazes de crescerem em pH elevado (bsico ), as bact r ias da clara do s o vo s ar mazenados.
Tabela 1 . Valo res de pH de diversos aliment os. Fai xa de pH Leit e Car ne ver me lha Baixa acidez (pH 7,0-5,5) Peixe Po Mant eiga Veget ais fer ment ado s Md ia acidez (pH 5,3-4,5) Queijo Cot t age Bananas Vagem cido (pH 4,5-3,7) Maio nese Tomat es P icles em conser va e Sucos de frut a Mu it o cido (<pH 3,7) Chucrut es Frut as ct r icas Mas
Fon t e: For s yt h e (2002)
Ali mento
pH 6,3-6,5 6,2-5,4 6,6-6,8 5,3-5,8 6,1-6,4 5,1-3,9 4,5 4,5-5,2 4,6-5,5 4,1-3,0 4,0 3,9-3,5 3,3-3,1 3,5-3,0 2,9-3,3
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Tabela 2. Pr incipais grupos de aliment os e seus valores de a w . Valores de a w Ali mentos Car ne e pescado frescos 0,98 Frut as e hort alias frescas Leit e Hort alias enlat adas em salmour a Est rato de tomat e 0,93-0,98 Car nes curadas enlat adas E mbut idos fer ment ados Queijo submet ido a t rat ament o indust r ial E mbut idos secos ou fer ment ados 0,85-0,93 Leit e condensado Queijo Frut as secas 0,60-0,85 Far inha Cereais Co mpo t as e gelias Chocolat e Mel 0,60 Bisco it o Bat at a ing lesa Ovo s e ho rt alias desidrat ado s Leit e em p
Fon t e: Fr a zi er e West h off (2003)
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Tabela 3 . Valo res de a w para mult ip licao de microrganismo s import ant es em aliment o s. Microrgani smos Pseudomona s spp. Escherichi a coli Enterobacter aerogenes Clost ridium botulinum t ipos A e B Vib rio parahaemolyti cus Mucor spino sus Rhizopus spp. Candida spp. Staphylococccus aureus Aspergillu s spp.
Fon t e: Fr a zi er e West h off (2003)
aw 0,97 0,96 0,95 0,94 0,94 0,93 0,93 0,90 0,86 0,70
2 F A T OR E S E X T R N SE C OS Os fat ores ext r nsecos dos aliment os so aquelas propr iedades
ambientais de ar mazenament o que afet am os alimentos e os microrganis mo s. So o s seguint es: t emperat ura ambient al; umidade relat iva; presena e co nst ruo de gases do ambient e.
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2.1 T E M PE R AT U RA
A MB IE N T AL
O fat or ambient al ma is impo rt ant e que afet a a mu lt iplicao dos microrganis mo s a t emperat ura. Os microrganis mo s podem se mult iplicar em uma faixa bast ant e amp la de t emperat ura, sendo -34C a menor t emperat ura e 110C a maior. Os micro rgan ismo s so class ificados de acordo com as t emperat uras: psicr filo s; psicrot rficos; mes filo s; t erm filo s (t er m d icos). Os microrganis mos psicr filo s -0C e 20 C t emper at ura t ima d e
cresc iment o 10C e 15C. Os microrganismo s psicrot rfilos -0C e 7C. Micro rgan ismo s mes filo s: t emperat ura t ima de mult iplicao ent re 25C e 40C, mnima ent re 5C e 25C e mxima ent re 40C e 50C. Os microrganismo s mes filo s correspondem grande maior ia de impo rt ncia em aliment o s, incluindo a maior part e dos patgenos de int er esse. Microrganismo s t er m filos: t emperat ura t ima de mult iplicao ent re 45C e 65C, mnima ent re 35C e 45C e mxima ent re 60C e 90C. A maior ia das bact r ias coagul aus , t er m filas import ant es em aliment o s
pert encem aos gneros Bacillus e Clostri dium , incluindo t ant o espcie s det er io rant es quant o perf ring ens ). Alg u ns membro s do grupo archaea apresent am uma t emperat ura t ima de cresciment o em t o rno o u super ior a 80C. Est as bact r ias so deno minad as t ermodr icas, o u, algu mas vezes de hipert er m filo s. A maior ia dest es
( Bacillus
Cl ostridium
thermosaccharolyti cum ), botulinum , Clostridium
espcies
pat o gnicas
( Clostridium
69
o rganismo s vive em fo nt es de guas quent es associadas at ividade vulcnica. A t emperat ura mais alt a conhecida qu e su po rt a o cresciment o bact er iano de 100C.
2.2 U M I D AD E
RE LA T IV A
A umidade relat iva in flu encia d ir et ament e a at iv idad e d e gua do aliment o . Se u m aliment o com baixa at ividade de gua est ar mazenado e m u m ambient e co m a lt a u mid ade relat iva, a at ividade de gua dest e aliment o au ment a, per mit indo a mu lt ip licao de microrganis mo.
2.3 P R E SE N A
E C ON CE NT R A O D E GA SES D O A M BI E NT E
A co mposio gasosa do ambient e que envo lve um aliment o pode det er minar o s t ipo s de microrganis mos que podero predominar. A presena de o xignio favorecer a mult ip licao de micro rganismo s aer bio s, enquant o que sua au sncia favo recer aos anaerbios, embora haja bast ant e var iao na sensib ilidade dos anaerbio s ao oxignio. Modificaes na co mposio gasosa so capazes de causar alt era es na micro bio t a que so br evive ou que se mult iplica em det er minado aliment o . At mosferas modificadas co mo recurso t ecno lgico para correspondem a ambient es nos quais o aument ar a vida t il dos aliment o s.
oxignio total ou parcialmente subst itudo por outros gases, so empregadas E mbalagens co nt endo d iferent es co mbinaes ent re oxignio, nit rognio e gs car b nico so as mais empr egadas indust r ialment e, embora out ros gases possam tambm ser ut ilizados ( mo nxido de car bo no , xido nitroso e di xido de enxo fre). A embalagem a vcuo t ambm bast ant e empr egada em especia l para car nes.
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3 C OM B IN A O
D OS P AR ME T R OS I N TR NSE C OS E E XT R N SE C OS
O co nheciment o do s fat ores int r nsecos e ext r nsecos que agem so bre det er minado aliment o per mit e prever sua vida de prat eleira, sua est abilidade micro bio lgica, conhecer a capacid ade de cresciment o e/o u pro duo de toxinas po r micro rganis mo s p at ognicos. Vr ios fatores ou tcnicas so empregados para cont rolar os efe itos dos micro rganis mo s no s aliment os; barr eir as t ecno lgicas, combinao de mt o do s de preser vao.
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C A P T U L O IV D OE N A S
DE
O R I GEM A LI M EN T AR
1 B R EV E H I ST R IC O Ant igament e, acred it ava- se que as doenas, infeces e at mesmo indisposies fs icas eram causadas por maus espr it os. Segundo regist ros enco nt rado s, h cerca de 2000 a.C., Mo iss
elabo rou leis para prot eger seu povo cont ra doenas infeccio sas. As mo s dever iam ser lavadas aps o sacr ifc io dos animais e ant es das refeies. Leis foram est abelecid as para animais co mest veis de t odos os t ipos. Anima is er a m pro ibidos os quais inclu ram os suno s, ho je conhecidos co mo freqent es excret o res de salmo ne las, assim co mo reser vat r ios de parasit as, co mo a Trichin ella spi rali s e T aenia soli um e pequenas cr iat uras, co mo macaco s, rato s, lagart os, cobras e carac is, t o do s co nhecido s ho spede iro s de salmo nelas. As bact r ias cau sadoras de int oxicaes aliment ar es fora m
pr imeir ament e d escr it as po r Gaert ner em 1888. E las foram iso ladas do o rganismo de um ho mem que havia mo rr id o durant e u m surt o de gast rent er it es que at ing iu 59 pesso as na Ale manha. E m 1896, E. van Er mengem, na Blg ica, descr eveu o Clost ridiu m botulinum , o o rganismo respo nsvel pelo bot u lismo . Ent re os anos 1909 e 1923 muit as das bact r ias ho je conhecidas co mo respo nsveis por um grande nmero de int oxicao aliment ar. Apesar dos ext ensivo s ensinament o s so bre a hig iene do s aliment o s para a preveno de do enas de or igem aliment ar a incidncia de surt os e caso s espordicos cont inua a crescer.
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2 O P R OB L EM A
DA S D OE N A S D E ORI GEM A L IM E NT A R
Muit os casos de doenas o u enfer mid ades causadas po r aliment o s no so no t ificado s, po is seu s sint o mas so geralment e par ecidos co m gr ipes. sabido que apenas u m pequ eno n mer o de caso s de enfer midade s causadas po r aliment o s no t ificado aos rgos de inspeo de aliment os, de co nt ro le e s ag ncias de sade. I sso se deve, em part e, ao fat o de que mu it os pat geno s present es em aliment os causam sint o mas brandos, e a vt ima no busca au xlio md ico . Po rt ant o, o nmero de casos not ificados pode ser defin ido como a pont a do iceberg , tendo em vist a o nmero real de to xinfeces causadas por aliment o s (Figu ra 2).
Casos notificados Casos avaliados por mdicos de hospitais, mas no notificados Doentes que no procuram aconselhamento mdico
Enfermidade branda ou assintomtica
Fon t e: For s yt h e (2002)
Figu ra 2 . P ir mide que ilust ra a not ificao dos casos: pont a do iceberg .
Vr io s
ag ent es
cau sadores
de
doenas
no
ho mem
podem
ser
t ransmit idos pelos aliment os: pro duto s qumico s ( met ais pesados, pest icidas) ; toxinas nat urais de plant as e animais ( alcal ides, hist amina) ; parasit as (amebas, helmint os) ;
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bact r ias pat o gnicas; fu ngos toxignico s. A ocorrncia de t oxinfeces de or igem bact er iana depende do co nju nt o de circunst ncias peculiar es e de alguns ou todos os seguint es fat o res: 1) o organis mo in fect ant e (agent e causador) em gneros aliment cio s, nos manipuladores de aliment o s e no s animais; 2) as mos dos manipuladores de alimentos transmit indo os
organismos do s alimentos crus para os alimentos cozidos e par a os equ ipament o s, ro upas e o ut ros ut enslio s de cozinha, ou, provavelment e, do pr prio manipu lado r de aliment o para os aliment os cozidos; 3) super fcies cont aminadas por aliment os crus; 4) aliment o s favo rveis ao cresciment o bact er iano; 5) condies favorveis para est ocagem a t emper at uras mor nas por u m per o do de 2 horas ou mais; 6) pesso as su scept veis. A Organizao Mundia l d e Sade d efine enfer midad e t ransmit ida po r aliment o co mo sendo aquela de nat ureza txica ou infeccio sa causada po r agent es que invadem o organismo por meio da ingest o de aliment o s co nt aminado s. As enfer mid ad es de or igem alimentar ocorrem quando uma pessoa co nt rai uma doena devido ingest o de aliment os cont aminados co m micro rganis mos ou t oxinas indesejveis. Essa co ndio , freqent ement e, deno minada co mo to xinfeco aliment ar. To xinfec es aliment ares ou enfer midades t ransmit idas por aliment o s co mpreendem: infeces aliment ar es;
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int o xicaes aliment ares. As in fec es a liment ares so decorrent es da ingest o de aliment os co nt aminado s co m agent es infecciosos co m reaes provocadas pela sua presena e seu s met ab lit o s. As infeces alimentares so divididas em do is tipo s: 1) aquelas em que o s microrganis mo s patgenos no necessar ia ment e se mu lt iplicam no aliment o; o aliment o s at ua co mo veiculador. Exemplo: microrganis mos patgenos co mo os que produzem a tuberculose, a dift er ia, as d isent er ias, a febre t if ide, a c lera, hepat it e infeccio sa et c. ; 2) aquelas em que os aliment o s po dem servir de me io de cu lt ura par a que o s microrganismo s pat geno s se mu lt ip liq uem e alcance m nve is capazes para o correr enfer midades uma infeco nos por consumidores Salmonella , de aliment os. Exemp lo : produzidas Vibrio parahaemolyticus ,
Escherichi a coli . pro vvel qu e o s surt os de infeces aliment ar es do segundo t ipo sejam ma is severo s que o s surt os or iginados por outros pat genos int est inais.
3 C ON T R OLE Os
D A CON T AM IN A O D OS A LIM E NT OS
microrganis mos
pat ognicos
est o
present es
no
so lo
e,
co nseqent ement e, nas co lhe it as, no gado, nas aves e nos peixes. Port ant o, inevit vel qu e o s pro dut o s crus ut ilizados co mo ingr edient es sejam vecu lo s de co nt aminao pato gnica. Dessa for ma, para evit ar t oxinfeces aliment ar es, o s pat geno s dos ingredient es devem ser cont rolado s. Os pro gramas de cont role devem ser sempre qu e necessr io . ident ificados e
implant ados, sendo
mo nit o rado s quant o sua eficcia, al m de serem revisados e modificado s,
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4 C A U SA S
D A C ONT A MI N A O DE A LI ME NT OS
Exist e um grande nmero de fat ores que cont ribuem par a t ornar u m aliment o inseguro, causando to xinfec es quelas pesso as que o s ing erem. As pr incip ais cau sas podem ser resumidas como: cont role inadequado da t emperat ura durant e o coziment o , o
resfr ia ment o e estocagem; higiene pessoal insuficient e; cont aminao cruzad a ent re pro dut o s crus e pro cessado s; mo nit o rament o inadequado dos processos.
5 D OSE
I N FE C T AN TE
A dose infect ant e refer e-se ao nmero de microrganis mo s necessr io s para causar a enfer midade, mas, para a maior ia das bact r ias, a quest o sobre a dose infect ant e mn ima no pode ser respondida facilment e. E m pr imeiro lugar, deve-se ter em ment e que os consumidores exist em grupos especiais de r isco cr ianas, ido so s, mu lher es grvidas e pessoas imunodepr imidas que po dem ado ecer q uando expost as a um nmero menor de microrganis mo s pat o gnicos do que o necessr io par a causar enfer midade em um adult o sad io (Tabela 4). Al m disso, h vr ios fatores fisio lgicos que influencia m a do se in fect ant e mn ima, co mo grau de acidez gst r ica, cont edo gst r ico, micro biot a int est inal, e, no menos import ant e, o est ado imuno lgico da pesso a. Est e est ado , po r sua vez, influenciado pela imunidade de infeces prv ias, pelo est ado nut r icio nal e pelo est resse.
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Tabela 4 . Resposta cln ica de adultos a diferent es doses de desafio co m pat genos ent r icos. Organismo Shigella dysenteriae Shigella f lexneri Vib rio chol erae Salmonell a T yphi Salmonell a spp. Escherichi a coli pat ognica Clost ridium perf ringens Yersinia ent erocolitica
Fon t e: HACCP (2001)
Dose de desafio (clu las) 10 1 -10 4 10 2 -10 9 10 3 -10 9 10 4 -10 9 10 5 -10 1 0 10 6 -10 1 0 10 8 -10 9 10 9
6 V A R I VE I S
D O HOSP E DE IR O
Idade; Est ado geral de sa de; Gravidez; Uso de med icament os co m ou sem prescr io mdica; Dist rbio s met ab lico s; Alco o lis mo , cirro se, hemocro mat ose; Quant idade de aliment o inger ido; Var iao de acidez gst r ica: uso de ant icidos, var iao nat ural, aclor idr ia; Dist rbio s gent icos;
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Est ado nut ricio nal; I munoco mpetncia; Hist ria pregressa cirrgica; Ocupao .
7 M I C R OR GA NI SM OS 7.1 P A T GE N OS
C AU SA D ORE S D E EN FE R MI D A DE S D E ORI GEM AL I ME NT A R
DE OR I GE M AL IM E NT A R : B A C T R IA S
1. Salm onella spp. O gnero Salmonella p ert ence famlia Ent erobact er iaceae. So gra m negat ivos, anaerbios facult at ivos, no for ma m esporos e t m for ma de bast o net es curt os. A t emperat ura t ima de cresciment o de aproximadament e 38C e a t emperat ura mnima de 5 C. Co mo no for mam esporos, so relat ivament e t er mosensve is, podendo ser dest rudos a 60 C por 15 a 20 minut o s. Exist em ma is de 2.5001 so rot ipo s de salmo nelas, dent re o s quais 1.478 pert encem subespcie I, inclu indo Salmonella sorot ipo Typhi. Mudanas sig nificat ivas ocorrem na no menclat ura e t axo no mia d as salmo nelas nos lt imos ano s, baseadas, pr incipalment e, nas suas caract er st icas bio qumicas. O gnero Salmon ella est dividido em duas espcies Sal monell a enteri ca e Salmonell a bongo ri , sendo a pr ime ira subdivid ida em seis subespcies. Essas ent ero bact r ias so t ransmit idas ao ho me m, pr incipalment e, po r meio de consumo de alimentos co nt aminados por fezes de animais ou hu manas. Os sint o mas caract er st icos de doenas de origem aliment ar causadas po r Salmonella so: diarria, nuseas, febre branda e calafr io s, algumas vezes, v mit o s, do r de cabea e fraqueza.
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O per o do de incu bao ant es da doena de cer ca de 16 a 72 horas. A enfer midade , nor ma lment e, aut olimit ant e e persist e durant e 2 a 7 dias. A pesso a in fect ada excret ar grandes quant idades de Salmonella pelas fezes durant e o perodo da doena. A do se in feccio sa var ia de acordo co m a idade e a sade da vt ima, co m o aliment o e ainda co m a linhag em da Salmo nella . As doses infecio sas po dem var iar de 20 at 10 6 clulas. Uma a mp la var ied ade de aliment os co nt aminados associada s salmo nelo ses, inclu indo car ne bovina cr ua, aves do mst icas, o vos, leit e e der ivados, peixes, camares, per na de r, fer ment os, cocos, mo lho s, t empero s para salada et c. A cont aminao do aliment o ocorre devido ao cont role inadequado d e t emperat ura, de prt icas de manipulao ou por cont aminao cruzada de aliment o s crus co m aliment os pro cessado s. O micro rganis mo se mu lt ip lica no aliment o at at ing ir a do se in feccio sa.
2. Shigella spp. A Shigel la uma bact r ia alt ament e co nt ag io sa qu e co lo niza o t rato int est inal. bast ant e similar a E. coli , mas pode ser diferenciada por no pro duzir gs a part ir de car bo idrat os e por ser lact ose negat iva. A Shigella se pro paga po r co nt ato d iret o e indiret o com indivduos infect ados. O aliment o ou a gua podem ser cont aminados por co nt ato dir eto ou indir eto co m mater ial feca l de pessoas infect adas. A Shigella causa surt os freqent emente em cr eches e asilo s. Os pr incipais sint o mas da shigelo se so: diarr ia branda ou grave, aquo sa ou sanguino lent a, febr e, nuseas, podem ocorrer v mitos e do res abdo mina is. Os sint o mas aparecem dent ro de 12 at 96 horas aps exposio Shigella ; o per odo de incubao de, normalment e u ma semana. O nmero
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de microrganis mo s necessr ios para causar a infeco em adult os de 10 a 10 2 microrganismos. As medidas de cont role e preveno da shigelo se de or igem aliment ar est o relacio nadas co m a boa higiene pessoal e educao dos manipulado res de aliment o. A co nt aminao de aliment os ou gua co m Shi gella spp. ind ica cont aminao micro rganis mo. recent e co m fezes hu manas, devido a frag ilid ade d esse
3. Escherichi a coli Escherichi a coli a espcie predo minant e ent re os d iverso s
micro rganis mos anaerbios facult at ivos que fazem part e da microbio t a int est inal de anima is de sangue quent e. Pert ence famlia E nt erobact er iaceae e ent re suas pr incipais car act er st icas dest acam- se: bacilos gram negat ivo s no espo ru lado s, capazes d e fer ment ar g licose co m produo de cido e gs. A maio r ia fer ment a t ambm a lact ose, com produo de cido e gs. As linhagens pat ognicas de E. coli so divididas de acordo com o s sint o mas cln ico s no s segu int es grupos. E. coli ent erotoxignica (ETEC) E. coli ent ero pato gnica (EPEC) E. coli ent erohemorrgica (EHEC) E. coli ent ero gregat iva (EAggE C) E. coli ent ero invasora (EIEC) E. coli difusa ment e adesiva (DAEC) A import ncia da E. coli co mo pat geno humano t em sido reco nhecid a desd e seu descobr iment o, 1885, pelo Dr. Theo do r Escher ich. Est relacio nada co m casos de diarrias, pr inc ipalment e infant il, co m co lit es hemorrgicas, d isent er ias, infeces da bexiga, dos r ins, infeces de fer idas cirrgicas,
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sept icemia,
sndro me
urnico - hemo lt ic a.
Algu mas
dest as
enfer mid ades
termina m em bit os. Recent ement e, a import nc ia da E. coli foi relacio nada co m a presena de cep as produt oras de cit ot o xina Vero (VTEC), do so rot ipo O 1 5 7 :H 7 que t em o casio nando mo rt alidade. A E. coli O 1 5 7 :H 7 uma cepa ent ero -hemorrgica (EHEC) implicada em surt o s de DT As, qu ando se inger em aliment os mal cozidos e por t ransmisso de pesso a a pesso a. Os pr incip ais sint o mas da enfer midade so dores abdo minais, diarria sangu ino lent a, edema da mucosa do c lon, aps um a do is dias de incubao . A enfer mid ad e dura apro ximadament e o it o dias. O gado u m reser vat rio nat ural de EHEC, razo pela qual o s aliment os de or igem anima l, pr inc ipalment e a car ne bovina, parecem ser o pr incipal vecu lo desse pat geno. Diversos surt os de colit e hemorrg ica o corrido s no s Est ados Unidos, Canad e Japo foram clar ament e associado s co m co nsumo de hambr gueres. surto s de t oxinfeces aliment ares co m mor bilidade e
4. Listeria m onocytog enes A Li steria u ma bact r ia gra m posit iva, que no for ma espo ros, cresce ent re 0 e 4 2C. A p ast eur izao suficient e para dest ruir o organis mo. O gnero dividido em o it o espcies, dent re as quais a L. monocytogenes a que cau sa maio r preo cupao co m enfer midades causadas por aliment os. J fo i enco nt rada em uma var iedade de aliment os, t anto crus co mo processado s, o nde pode sobreviver e se mult iplicar rapidament e durant e a est ocagem. Ent re esses aliment o s, inc luem- se le it e e queijo supost ament e past eur izados, car nes, veget ais cru s, frut o s do mar e peixes. Sua capacidade de crescer em t emper at uras t o baixas qu ant o 3C per mit e mu lt ip licao em aliment os refr igerados.
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L.
monocytogenes
respo nsvel
por
infec es
o po rt unist as,
in fect ando , mu lheres grvidas, recm- nascidos e idosos. Os sint o mas da list er io se so: meningit e, encefalit e e sept icemia; po de levar ao abo rto, nasciment o de fet o mo rto ou premat uro quando a mulher grv ida infect ada no segundo e t erceiro t rimest res. A do se in fect iva de L. monocytogenes desconhecida. O per odo de incubao excessiva ment e lo ngo: de 1 a 90 dias.
5. Staphylococcus au reu s A espcie Sta phylo coccus aureus um microrganismo mu it o
co nhecido pela sua pat ogenic idad e ao homem e o ut ro s animais. Fo i est udada pela pr ime ir a vez po r Denys em 1894 e, post erior ment e por Bar ber, em 1914. So ment e em 1 930 fo i definit ivament e reconhecida a import nc ia do s est afilo co co s na int o xicao aliment ar. O gnero Staphyl ococcus possui ma is de t rint a espcies. A produo de ent erot oxina est associad a pr incipalment e espcie S. aureus , embo ra out ras espcies co mo S. intermedi us e S. hyicus t ambm t enham sido reco nhecidas co mo produt oras. O S. aureus u m dos agent es pat ognicos mais co muns, e responsvel po r severas in feces e m humanos. E st ampla ment e dist r ibu do na nat ureza e o s hu mano s e o s anima is so seus pr inc ipais reser vat rios. So cocos gram posit ivo s, pert encent es fa mlia Micrococaceae. So facu lt at ivos anaerbios, co m ma ior cresciment o sob condies aerbias, quando ent o, produzem cat alase. S. aureus causa int oxicao pro vo cada p ela ing est o do aliment o que apresent a a t o xina pr- fo r madora. O per odo de incubao de um surt o var ia, geralment e, de 30 minut o s a o it o horas, sendo a mdia de duas a quat ro horas, ap s a ing est o do aliment o cont aminado.
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Os pr incipais sint o mas so : nuseas, v mit o s, cibr as abdo mina is (geralment e bem do lorosas), diarr ias e sudorese, dores de cabea, calafr io s e a queda de presso art erial. Os Sta phylo coccus est o present es nas vias nasais e na gargant a, al m do cabelo e p ele. Apesar dos manipuladores de aliment os ser em, no r malment e, as pr incipais fo nt es de cont aminao dos aliment os, quando h surt os, os equipament os e as super fcies tambm podem ser a fo nt e das cont amina es. Os aliment o s nor malment e associados s int oxicaes so car nes e produtos de car ne, frangos e pr odutos de ovos, saladas co mo as d e at um, galinha, bat at a e macarro, produtos de panificao co mo creme, t o rt as de creme, leit e o u pro dut o s lct eos.
6. Clost ridium perfringens O Clost ridium perf ringens u m bast o net e anaer bio , gram po sit ivo , fo r mador de espo ro s. amplament e dist r ibudo no ambient e e frequent ement e enco nt rado no int est ino de hu mano s e de anima is. As caract er st icas de int oxicaes causadas por Cl. perf ringens so : do r abdo mina l, nusea, diarria aguda, sintomas que aparecem de 8 a 12 ho ras ap s a ing est o do micro rgan ismo. A fo r ma mais co mum da int oxicao caract er izada por dores abdo mina is int ensas e d iarrias que inic iam 8 a 12 horas aps o consumo do aliment o cont endo grande quant idade do microrganis mo, o qual produz as toxinas cau sado ras da enfer midade. As car nes, os produt os crneos e os mo lhos so alimentos ma is freqent ement e implicados. Os esporos ger mina m e a bact r ia se mult ip lica at nveis causadores de enfer midades durant e os per odos de refr igerao e est ocagem. O co nt ro le desse microrganismo at ingido pr incipalmente por meio de co co e do resfr iament o.
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7. Clost ridium botulinum O Clostridium b otulinum um bast onet e gram posit ivo, anaer bio est r it o . Causa uma doena de or igem alim ent ar deno minada bot ulismo. Trat a-se de u ma int oxicao aliment ar causada pela ingest o
neuro toxinas pr- for madoras. O micro rganismo enco nt rado por to da a nat ureza. Exist em quat ro espc ies clin ic ament e impo rt ant es: Cl. bot ulinum , Cl. perf ringens causam enfer midades relacio nadas ingest o de aliment os. Exist em set e t ipos basicament e pela ant igenicidade da t oxina. Os t ipos A, B, E e F so o s pr inc ipais causadores de bot ulis mo humano (t ipos C e D em animais). Vr ias neurotoxinas for am ident ificadas e est o ent re as t oxinas mais pot ent es co nhecidos pelo ho mem. O micro rganis mo fo r ma espo ro s, o s quais podem ser t ransmit idos pelo ar e cont aminar jarras abert as ou lat as. Uma vez fechadas, as condies anaerbias favorecem o cresciment o do s espo ro s e a produo de toxinas. Os sint o mas do bot ulismo so: viso dupla, nusea, v mit o, fad ig a, to nt uras, dor de cabea, gargant a e nar iz secos, falhas respirat rias. O bo t u lismo asso ciado com aliment o enlat ado de baixa acidez (pr incip alment e aquele de pro duo caseira), veg et ais, peixe e pro dutos de car ne. Tambm associado co m mel. O bot ulismo infant il mais brando do que a verso adult a. Essa bact r ia no po de crescer em aliment o s cido s o u acid ificado s co m pHs meno res que 4,6.
8. Bacillus cereus O B. cereus u m pat geno aliment ar formador de esporos que fo i iso lado pela pr imeira vez em 1887. Os esporos podem so breviver a mu it o s processos de coco. O micro rganis mo cresce bem em aliment o s co zido s devido inat ivao da microbiot a compet idora. O B.cereus um bast onet e gram posit ivo, aerbio facult at ivo , enco nt rado po r to da a nat ureza, sendo iso lado do so lo , da veget ao, gua e dos plos de anima is. co mument e
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enco nt rado em baixos nve is nos aliment os (<10 2 UFC/g), o s quais so considerado s aceit veis. As int o xicaes aliment ares inicia m quando o alimento suje it o a abusos de tempo-temperat ura, propic iando que um nvel baixo d e o rganis mo s se mu lt ip liquem at nve is (>10 5 UFC/g) s ig nificat ivo s (necessr ios par a int oxicao). Exist em do is t ipo s reconhecidos de int o xicaes aliment ar es causadas po r B. cereus : o diarr ico e o emt ico. Ambos so autolimitant es e a recuperao ocorre dent ro de 24 ho ras. O B. cereus produz t oxinas diarricas durant e o cresciment o no int est ino delgado humano, enquant o as toxinas emt icas so pr- for madoras no aliment o. Os sint o mas da int oxicao aliment ar causada por B. cereus so : nuseas, v mit os, dores abdo mina is e possvel diarr ia. Uma grand e var iedad e de aliment os, incluindo car nes, le it e, veget ais e peixes, fo i asso ciad a ao t ipo diarr ico de int oxicao. Os surt os do t ipo emt ico so geralmente associados co m produt os de arroz, no entant o, outros aliment o s r icos em amido, co mo bat at as, massas e produtos de queijo s. As mist uras par a aliment o s co mo mo lho s, pudins, sopas, massas fo lhadas e saladas, so freqent ement e relacio nadas a surt os aliment ares. A presena de um grande n mero de B. cereus (>10 6 organismo s/g) em aliment os ind icat ivo do cresciment o at ivo e pro liferao do microrganis mo e um per igo pot encial sade.
9. Vibrio pa rahaem olyticu s Est e micro rganis mo fo i iso lado pela pr imeir a vez em 1951. at ualment e reconhecido co mo o maior causador de gast rent er it es de or ig e m alimentar no Japo. Isso po rque o microrganismo associado co m o consumo de aliment os mar inho s. Os sint o mas t p ico s de doenas aliment ares causadas por V.
paraha emol yticu s so : d iarrias, dores abdo minais, nuseas, v mit os, dores de cabea, febre e t remo res.
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O organismo est present e, no r malment e, em qu ant idade in fer io r a 10 3 UFC/g em peixes e fr ut o s do mar, excet o em guas mor nas, onde a cont age m po de aument ar para 10 6 UFC/g. As infeces causadas por esse micro rganis mo foram associad as ao consumo de peixes e fr ut os do mar cru s, mal cozidos ou cozidos e reco nt amina do s. A refr igerao inadeq uad a de frut o s do mar co nt aminados co m esse microrganismo per mit e a sua prolifer ao , o que au ment a a possibilidade da infeco. O organismo bast ant e sens vel ao calo r, e os surtos devem- se, fr eqent ement e, a processos de manipulao inadequados e a abusos de t emperat uras. O cont role d esse microrganis mo po de ocorrer por meio da preveno da sua mult iplicao aps a pesca pelo resfr ia ment o (25C) e pe la coco com t emperat ura int er na maior do que 65C. O iso lament o de qualquer espcie de Vibrio a part ir d e aliment o s co zido s indica prt icas de hig iene inadequadas, j que o micro rganis mo dest ru do rapidament e pelo calo r.
7.2 P A T GE N OS
DE OR I GE M AL IM E NT A R : E U C A RI OT OS
1. Cryptosporidium parvum O modo de t ransmisso do pat geno pela rot a fecal-oral, inclu indo aliment o s e gua. Os ho spedeiros incluem humanos e anima is do mst ico s, inc lusive o gado. Podem sobreviver no ambient e por longos per odos, o nd e per manecem infeccio sos e resist em a qumicos usados para pur ificar gua para uso humano. Podem, cont udo, ser remo vidos do sist ema de gua t rat ada po r meio de filt ragem. Os pr inc ipais sint o mas em humanos so: febre, d iarria, dores abdo minais e ano rexia. A do ena, geralment e, o co rre por menos de 30 d ias, mas po de se pro longar em indivduos imunodeficient es e levar mo rt e.
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2. Taenia saginata e T. solium As in fec es po r ver mes achat ados em humanos so causadas devido ingest o de ver mes na car ne de bo i ( Taen ia sagin ata ) e na car ne de porco ( T. solium ). Ambos os organismo s so , o br igat o riament e, par asit as do int est ino hu mano. Tais ver mes t m um ciclo de vid a co mp lexo . A fo r ma lar val ing er ida at ravs de car nes de bo i ou porco infect adas e se desenvo lve at a fo r ma ad u lt a (po dendo alcanar vr io s met ros de compr iment o). Interromper o ciclo de vida do organismo a pr inc ipal medida de co nt ro le, o que po de ser feit o pela inspeo complet a da car ne e do coziment o adequ ado (>60C).
3. Toxoplasm a gondii O T. gondii o agent e causador da toxoplasmo se que pode ser enco nt rado em car nes ma l co zidas e cruas t ais co mo porco, cordeiro, carne de bo i e de aves. Os ho sped eiros pr imr io s so os gatos, sendo que a infeco hu mana se d quando h cont at o co m as suas fezes. A in feco t ambm o co rre pela ingest o de carne mal cozida ou crua de hospedeiros int er medir io s t ais co mo roedores, sunos, gado, cabra, galinha e pssaros. O microrganis mo causa hidro cefalia e cegueir a em cr ianas, enquant o, em adult os, os sint o mas so menos graves. E m indivduo s imunodepr imido s, po de causar hepat ite, mio cardit e ou co mbinaes dessas doenas. O coziment o apropriado das car nes dest r i o microrganis mo .
4. Micotoxinas As mico t o xinas so pro duto s txicos d e cert o s fungo s micro sc p ico s o s quais, em algumas cir cunst nc ias, desenvo lvem- se sobre ou em produt os aliment c ios de or ige m anima l ou veget al. Cent enas de micot oxinas fo r a m ident ificadas e so pro duzidas por cerca de 200 var iedades de fungos.
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As micot oxinas so met ab lit o s secu ndr io s que fo ram respo nsveis po r grand es ep id emias em hu manos e animais. As micotoxinas so produzidas pelo s g nero s de fu ngo s Aspergill us , Fusari um e Penici llium . Esses fungo s so encont rado s no ambient e e fazem part e da flora nor mal das plant as. H quat ro t ipos de t oxicid ade: Ag uda, resu lt ando em danos aos r ins ou fgado; Crnica, result ando em cncer de fgado; Mut agnica, causando danos no DNA; Terato gnica, cau sando cncer em cr ianas por nascer. Aflato xin as: As aflat oxinas so co mpo st os t xico s que so pro duzido s po r cert as linhagens dos fungos Asp ergil lus f lavu s e Aspergillus parasiticus sob co ndies favorveis de t emperat ura e u midad e. Esses fu ngo s crescem em cert o s aliment o s e ra es, result ando na produo de aflat oxinas. Tm sido encont radas em no zes, amendo ins e out ras sement es o leosas, milho e sement e de algo do. As aflat oxinas de maior int eresse so caract er izadas co mo B 1 , B 2 , G 1 e G 2 . A aflat oxina B 1 a mais co mument e encont rada e a mais t xica. As aflat o xinas pro duze m necrose aguda, cirrose e carcino ma no fgado em d iversas espcies animais. A t o xicidade po de ser influenciada po r fat o res ambient ais, nvel de exposio e durao exposio, idade, sade e est ado nut r icio nal. Ocratoxinas: As ocrat oxinas so produzidas por Penicilliu m
verru socum e Penicillium vi ridi catum . S o enco nt radas pr incip alment e nos cereais, po rm nve is sig nificat ivos de cont aminao podem ocorrer em suco de u va, vinho t int o , caf, cacau e fr ut as secas. As ocratoxinas so po tencialmente nefrticas e carcinognicas, sendo a sua po t ncia var ivel d e aco rdo co m as espcies e o sexo.
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Fumosina: As fu mo sinas so um grupo de micot oxinas produzidas pelo Fusariu m , as qu ais t m ocorrncia mundia l no milho e produt o s der ivados. As fumo sinas so bast ant e est veis durant e o processament o de aliment o s. Zearalenona: A zearale lo na um met ab lit o fngico produzido pr incipalment e por Fu sari um grami nearium e F. culmorum , os quais co lonizam milho, cevada, t r igo , aveia e so rgo . Est es co mpo st o s po dem cau sar graves pro blemas de reproduo infert ilidade em animais, especia lment e e m suno s. O co nt ro le de mico t oxina muit o difcil, uma vez que se deve prevenir a invaso at ravs das sement es pelo fungo, do so lo ou mesmo do ar ant es da co lheit a. A secagem e a est o cagem adequad as so pro cessament o s mu it o t eis, mo st rando bo as prt icas de gerenciament o dos locais d e pro duo. A seleo de gros co m lu z ult ravio let a (para evidenciar as aflat o xinas) ut ilizada na produo de milho, sement e de algodo e figo. Pron s: As encefa lo pat ias espongifor mes t ransmiss veis em anima is e hu mano s so causadas por pr o ns (part cu la de pro t ena in feccio sa). Os pr o ns so fo r mas modificadas de uma protena normal. Essas protenas acumula m-se no cr ebro , causando buraco s ou placas e os subseqent es sint o mas clnicos, levando mo rt e. Na encefalo pat ia espongifor me bo vina (doena da vaca lo uca) h evidncias de que o agent e infeccio so se trat a de um pr o n.
7.3
P AT GE NOS D E ORI GEM A LI ME N TA R : V R U S
1. Hepatite A O vrus da hepat it e A (HAV) t em sido iso lado e co let ado de vr ias part es do mundo. O per odo de incubao para o HAV var ia de 10 a 50 d ias
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(com mdia de 30 dias). O per odo de comunicabilidade se estende do comeo da incu bao at por vo lt a de uma sema na do incio do desenvo lviment o de ict er cia. O ma ior per igo de t ransmisso da doena ocorre durant e a met ad e do perodo de incubao at bem ant es dos pr ime iros sint o mas. S int o mas t p ico s da hep at it e A so : febre, arrep io s, mal-e st ar, perda de apet it e, nuseas, ict er cia, ur ina de cor escura, fezes de cor mais clara, dores abdo mina is na r ea do fg ado . O HAV excret ado nas fezes de pessoas infect adas e pode produzir do enas quando indivduos su scept veis co nso mem aliment o s ou gu a cont aminado s. As frut as e suco de frut as, le it e e produt os lct eos, veget ais, saladas, mo luscos e as saladas so as font es mais freqent es. A co nt aminao de aliment os por int er mdio s de manipuladores in fect ados co mu m. O HAV possui uma dist r ibuio mundia l, ocorrendo t ant o de maneir a epidmica quant o espordica. t ransmiss vel pr incipalment e po r meio de cont at o pessoa-pessoa por cont aminao fecal, porm t amb m po dem oco rrer fo nt es ep id micas co mo aliment os ou guas cont aminadas. As condies higinico-sanitr ias deficientes e a superpopulao facilit am a t ransmisso. Os surt os de HAV so comuns em inst it uies, casas super lo t adas e pr is es.
2. Rotavru s Os ro t avru s so classificados co mo pert encent es famlia Reo vir idae. Seis grupos sorolgicos foram ident ificados, t rs dos quais ( A, B e C) infect am hu mano s. As gast rent er it es causadas por rot avrus so aut o limit ant es, var iam de br andas a graves e so caract er izadas por v mit o s, d iarria aquo sa e febre baixa. Resume- se que a dose infeccio sa deva ser de 10 a 100 part culas vir ais infecciosas. Co mo uma pessoa co m diarria causad a po r rot avrus excret a grandes quant idades de vrus (10 8 -10 1 0 part culas in feccio sas/ mL d e fezes), do ses infeccio sas podem ser fac ilment e adquir idas pelo co nt at o com mos, objet o s e ut enslios cont aminados.
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Os ro t avrus so t ransmit idos por rot a fecal-oral. A cont aminao pesso a-pessoa disseminada po r mo s co nt aminadas e, pro vavelment e, o meio mais import ant e pelo qual esse vru s t ransmit ido em pequ enas co mu nidades t ais co mo cln icas ger it ricas e pedit r icas, ber r io s e residncias. Os manipuladores cont aminados podem cont aminar aliment os que no sero po st erio r mente cozidos co mo, por exemplo, saladas, frut as e aper it ivo s. Os rot avr us so bast ant e est veis no amb ient e e t m sido enco nt rado s em a mo st ras est uar inas. A incidncia de infeco de ro t avrus similar em pases co m nveis alt o s e ba ixo s d e padr es de sade. Os rot avr us do grupo A so endmico s no mundo int eiro. E le o causador de d iarrias gr aves em cr ianas e inclui cerca da met ade dos casos que necessit am d e ho sp it alizao.
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C A P T U L O V M I CR OR GA NI SM OS I N D IC A D ORE S
evidncia ind ir et a referent e a uma car act erst ica part icular do hist r ico da amost ra. No rmalment e, so associados a microrganis mo s de or igem int est inal. Out ro s grupo s po dem ser usados co mo indicadores em det er minadas sit ua es. Po r exemp lo , a presena de bact r ias gr am negat ivas em aliment os t rat ados t ermicament e u m ind icat ivo de t rat amentos t rmicos inadequados. Microrganismo s indicadores vm sendo ut ilizados na avaliao da qualidade microbio lgica da gua h lo ngo tempo e ma is recent emente na de aliment o s devido s dificuldades enco nt radas na det eco de microrganismo s pat o gnico s, co mo , po r exemplo, Salmonella . Microrganismo s indicadores so grupos ou espcies de
t ermo microrganis mo indicador pode ser aplicado a qualq uer grupo t axon mico , fisio l g ico ou eco l g ico de microrganis mos, cuja presena ou au sncia proporciona uma
micro rganis mos, que, quando present es em um aliment o, pode fornecer infor ma es so bre a o co rrncia da cont aminao de or igem fecal, sobre a pro vvel presena de pat genos ou so bre a det er iorao do aliment o, alm d e po derem ind icar co nd i es sanit r ias ina dequadas dur ant e o processa ment o , pro duo o u armazenament o . O t er mo microrganis mo ind icado r fo i su ger ido po r Ingram, em 1977 , para u m o rganis mo marcado r cuja presena indicasse a possvel pr esena de u m pat geno. Os microrganis mo s ind icadores so mais co mument e ut ilizados para avaliar a segurana e a hig iene aliment ar do que a qualidade.
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De for ma ideal, um ind icado r de segurana aliment ar deve apresent ar cert as caract er st icas import ant es: ser det ect vel de for ma fcil e rp id a; ser facilment e dist ingu ve l de outros membro s da micro bio ta do aliment o ; possuir um hist r ico de asso cia es co nst ant es co m o pat geno cuja presena visa a indicar ; est ar sempre pr esent e quando o pat geno de int eresse est iver present e; no deve est ar present e co mo co nt amina nt e nat ural do aliment o , po is assim sua det eco no indicar, necessar ia ment e, a presena de mat r ia fecal ou do s pat geno s; est ar au sent e do s aliment os que so livres de pat genos, co m exceo , t alvez, de nmeros mnimos; possuir caract er st icas e t axas de cr esciment o equivalent es s do pat geno. No ent ant o , nem sempre t odas essas caract erst icas so obser vadas. Os microrganis mo s indicadores usua lment e ut ilizados so: co lifor mes, Escherichi a coli , ent erobact r ias, ent erococos. Os co lifor mes so bact r ias gram negat ivas, anaer bias facu lt at iva s em fo r ma d e bast o net es. Os cr it r io s ut ilizados para ident ificao so : a pro duo de gs pro venient e da g licose e out ros acar es e a fer ment ao da lact ose at a pro duo de cido e gs em per odo de 24 a 48 horas a 37C. O grupo dos colifor mes inc lui espcies do gnero Escherichi a , Klebsiella , Enteroba cter e Cit robacter , alm de E. coli . Os co lifo r mes fo r am hist oricament e ut ilizados co mo microrganis mo s ind icadores para ser vir co mo uma medida de co nt aminao fecal e, assi m
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med ir a presena po t encial de pat genos ent r icos em gua. Cont udo, co mo a maior ia do s co lifo r mes encont rada no meio ambient e, essas bact r ias po ssuem limit ada relevncia h ig inica. Devido ao fat o do s co lifo r mes serem dest ru dos co m cert a facilidade pelo calor, sua cont agem pode ser t il em t est es de co nt amina es p s-processament o.
1 I N D I C A D OR E S
D E C ON TA MI N A O FE C AL OU D A QUA L ID A DE HI GI NI C O -
SA N I T R I A D O A LI ME N T O
O uso de Escherichia coli co mo u m in d icado r de co nt aminao de o rig em fecal present e em gu a fo i pro po sto em 18 92, u ma vez qu e esse micro rganis mo t em seu habit at no t rat o int est inal de humanos e anima is. Mu it as cep as da bact r ia so ino fensivas, cont udo algumas so pat ognicas e causam do enas d iarricas. At ualment e, seis t ipos pr incip ais de E. coli so classificados e m grupo s especficos baseados nos fat ores de virulncia, mecanis mo s de pat o genicidade, sndro me clnica e dist intos sorot ipos O:H. E ssas cat ego r ias so E. coli ent eropatognica (EPEC), ent ero to xig nicas (ETEC), ent ero invasiva (EIEC), d ifu so aderent e (DAEC), ent eroagregat iva (E AEC) e ent ero -hemo rrg ica (EHEC). Recent ement e, a import nc ia da E. coli foi relacio nada co m a presena de cep as produt oras de cit ot o xina Vero (VTEC), do so rot ipo O 1 5 7 :H 7 que t em o casio nado mo rt alidade. O indicador ideal de co nt aminao fecal dever ia pr eencher alm do s requ isit os anter ior ment e citados, os seguintes: t er como habit at exc lu sivo o t rato int est ina l do ho mem e o ut ro s animais; dever ia ocorrer em n mero s mu it o alt o s nas fezes; dever ia haver t cnicas r pidas, simples e precisas para a su a det eco e/o u co nt agem.
surt os
de
toxinfeces
aliment ar es
co m
mor bilidade
94
1.1 C OL IF OR ME S
T OT A I S
Est e grupo co mpost o por bact r ias da famlia Enterobact eriaceae , so capazes de fer ment ar a lact ose com produo de gs, quando incubado s a 35-37C por 24-48 horas. So bacilos gram negat ivos no esporulados. Fazem part e desse grupo as bact r ias do gnero Escherichia ,
Enteroba cter , Citrobact er e Kl ebsiella , alm de serem encont rados nas fazes, t ambm po dem per sist ir lo ngos per odos e se mult ip licar em ambient es no fecais, co mo veget ais, so lo. A presena de co lifor mes t ot ais no aliment o no ind ica, necessar iament e, co nt aminao fecal recent e. O nd ice de co lifo r mes tot ais ut ilizado para avaliar as condies higinicas, sendo que as alt as co nt agens significam cont aminao ps-processament o, limpezas e sanifica es d efic ient es, t rat ament os t rmicos inefic ient es ou mult iplicao durante o processament o ou estocagem. Co lifor mes a 45C e Escherichia coli as bact r ias pert encent es a est e grupo correspondem aos co lifor mes t ot ais que apresent am a capacidad e de co nt inuar fer ment ando lact ose co m produo de gs, quando incubadas t emperat ura de 45C. Nessas co ndies, em t orno de 90% das cult ur as de E. coli so posit ivas. O ndice de co lifo r mes a 45C o u de E. coli nos aliment o s empreg ado co mo ind icador de cont aminao fecal, ou seja, co ndies hig in ico-sanit r ias, vist o que se est ima que a populao dest e grupo co nst ituda de uma alta proporo de E. coli , que t em seu habit at exclusivo no t rato int est inal do ho mem e de o ut ro s animais. Assim, su a presena po de indicar a po ssibilidade de ocorrerem outros microrganis mo s entr icos na amost ra. E m aliment os co mo veg et ais fr esco s, o nico ind icado r vlido d e co nt aminao fecal a E. coli , j que os demais ind icadores de cont aminao fecal so enco nt rado s nat uralment e nesse t ipo de aliment o. E m aliment os fresco s de or igem animal, a ocorrncia de n mero s elevados de Ent erobact r ias pode indicar manip u lao sem cu idado s d e hig iene e/o u ar mazenament o inadequado.
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E m aliment os processados, a pr esena de um nmero considervel de co lifor mes ou de Ent erobact r ias pode indicar: processament o pro cessament o , inadequado sendo as e/ou causas recont aminao mais fr eqent es p saquelas
provenient es da matr ia-pr ima, equipament o sujo ou manipulao sem a devida higiene; pro lifer ao microbiana que poder ia per mit ir a mu lt iplicao de micro rganis mo s p at ognicos.
Diferen ciao dos coli formes A enumer ao dos co lifor mes pode ser efet uada ut ilizando mt o do s co nvencio na is e mt odos rpidos. O mt o do co nvencio nal ainda muit o empregado o mt odo dos t ubo s mlt ip los que pode ser ut ilizado para est imar o nmero de co lifor mes pela t cnica do Nmero Mais Pro vvel (NMP). Para d ifer enciao ent re o s co lifo r mes fecais dos no- fecais so necessr ios t est es bioqumicos para id ent ificao das espcies. Esses t est es so co let ivament e designados co mo rea es IMVic I indo l; M ver melho de met ila; Vi reao de Vo ges-Proskauer e C cit r at o. Out ro s t est es t ambm so suger idos co mo o s
car bo idrat o s e amino cido s.
1.2 E N T E R OC OC OS A dist r ibuio de Enterococcus na nat ureza ampla e eles fazem p art e da microbiota nor mal do ho mem e de animais, part icular ment e, do trato int est inal. So fr eqent ement e ut ilizado s co mo ind icado res co mp lement ares do grupo de colifor mes na det er minao de cont aminao fecal. A relao exist ent e ent re as co nt agens de co lifor mes fecais e ent erococos fecais pode ind icar se a co nt aminao recent e de origem humana ou animal.
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Ap esar das amp las aplicaes dos co liformes co mo ind icadores de poluio fecal, exist em co nt ro vrsias so bre sua ut ilizao e est udo s ep idemio lgicos sugerem a cont agem de Enterococcus co mo uma alt er nat iva, pr incipalment e pelo fat o dest es microrganis mo s res ist irem a vr ias co ndies ad versas co mo sa linidade elevada, desidr at ao, det ergent es e desinfet ant es, congela ment o, pH cido e trat ament o t rmico moderado. Os ent erococos so um grupo de microrganis mos que vm se
dest acando nos lt imo s anos co mo pat genos oport unist as. Sua bio lo gia e taxono mia tm passado por alteraes significat ivas ao longo do tempo. O gnero fo i cr iado em 1984, co m a t ransferncia de St reptoco ccu s f aecalis e S. f aecium para Entero coccus f aecali s e E. f aecium . Os ent ero co co s so cocos gram posit ivo s, anaerbio s facult at ivos. As espcies mais enco nt radas em aliment os so Enterococcu s f aecali s e E. f aecium . Ap esar das limit aes do uso desses micr organismos co mo indicadores de co nt aminao fecal, sua presena em nmeros elevados em aliment o s ind ica prt icas sanit r ias inadequadas ou exposio do aliment o a condi es que per mit iram a mult iplicao dos microrganismo s. Para det er minao do s Enterococcus usada a t cnica dos t ubos m lt ip los e co nt agem em placa.
2 I N D I C A D OR E S
GE RA I S DE C ONT A MI N A O D OS A L IM E NT OS
So grupo s de micro rganismo s que, quando present es em nmeros elevados nos aliment os podero causar a det er iorao e/ou a reduo da vid a de prat eleira. E ssas co nt agens for necem infor maes gerais sobre as co nd ies dur ant e o processament o do aliment o. As co nt agens de bact r ias viveis baseiam-se no nmero de bact r ia s que se desenvo lvem em p laca co m meio s d e cu lt ura no s q uais fora m
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ino cu lad as quant idades previament e co nhecid as do
aliment o
d ilu do e,
po st erio r ment e, ino cu ladas so b det er mina das condies ambient ais.
3 C ON T A GEM
PA D R O D E B A C T RI A S A ERB I A S ME SFI LA S ( C ON TA GEM
P A D R O EM PL A C A S )
Est a cont agem det ect a, em um alimento, o nmero de bact r ias aer bias o u facu lt at ivas e mes filas pr esent es t ant o sob for ma veget at iva quant o esporulada. A co nt agem p adro em placas (PCA) t em sido usada co mo ind icador da qua lidade higinica dos aliment os, fornecendo t ambm idia sobr e seu t empo t il de conser vao. Sua presena em grande nmero indica: mat r ias-pr imas excessivament e co nt aminadas; limp eza e d esin feco de super fcies inadequadas; higiene inadequada na produo; co nd i es inad equadas de t empo/t emper at ura durant e a produo o u a co nser vao dos aliment os, ou uma co mbinao dest as cir cunst nc ias. A det er iorao de aliment os pode ser causada pelo cresciment o de micro rganis mos que levar iam alt er a es o rgano lpt icas. Nest e caso, n mero s elevados so esperados e var iam co m o t ipo de aliment o e micro rganis mo present e. A ma io r ia do s aliment o s apresent a, quando essas alt eraes so det ect veis, nmeros super iores a 10 6 UFC/g ou mL do aliment o .
4 C ON T A GE M
D E BOL ORE S E LE V ED U R A S
O cresciment o de bo lores e leveduras mais d emo rado do que o de bact r ias em aliment os de baixa acidez e alt a at ividade de gua. Port ant o ,
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d ificilment e sero responsveis pela d et er io rao desses aliment o s. E m aliment o s cido s e de baixa at ividade de gua, no ent ant o, o cresciment o de fu ngo s maio r, pro vo cando det er iorao co m grande preju zo econ mico e m frut as frescas, veget ais e cereais. So t amb m responsveis pela det er iorao de su cos de fr ut as, queijo s, aliment os congelados, desidrat ados e em co nser va co mo p icles, quando ar mazenados em condies inadequadas. A pr esena de fungos filament osos ( bo lores) e levedur as em ndice elevado nos aliment os pode fo rnecer vr ias info r maes: condies higinicas defic ientes de equipament os; mult ip licao no produto em deco rrnc ia de fa lhas no
processament o e/ou estocagem; mat r ia-pr ima co m cont aminao excessiva. A pr esena desses microrganis mo s pode tornar-se um per igo sad e pb lica dev ido pro duo de micot oxinas pelos bo lores. Algumas medidas devem ser t o madas po r manipu lado res d e aliment os suscet veis a essa cont aminao, na t ent at iva de reduzir ou elimin- la: boas prt icas de hig iene leva m reduo da carga de esporos; esses aliment os devem chegar o mais rapidament e possvel ao consu midor; o armazenament o de aliment o s co ngelado s deve ser a t emper at uras in fer io r es a -12C; eliminar ou reduzir o co nt ato co m o ar atravs d e embalagens, por exemplo ; adicio nar cidos ou conser vadores qum icos co mo benzoatos ou sorbat os, para ret ardar o cresciment o f ng ico . Baixas cont agens de bo lores e leveduras so nor mais em aliment o s fresco s e co ngelados, no sendo, port anto, significat ivas. So ment e quando o
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cresc iment o de bo lor for visve l ou o alimento apresent ar um nmero elevado de leveduras, o co nsu mido r ser capaz de reconhecer a det er iorao. Est a det er io rao por leveduras no prejudic ial sade.
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C A PTULO VI M TODOS
DE
A NLISES
1. Amost ragem A o bt eno co rret a das amo st ras, seu t ranspo rt e para o laborat rio e sua preparao para anlise so et apas fundament ais para o sucesso de uma anlise microbio lgica. Seguir as seguint es et apas: A amo st ra deve ser represent at iva, os produt os pront os para consu mo devem ser co let ado s em su as embalagens o r ig inais fechadas, co m especificaes de dados que o ident ifique co mo , n. do lot e, dat a de fabr icao, et c. Quando embalagens abert as precisam ser analisadas, import ant e que sejam aco ndicio nad as adequ adament e para evit ar cont aminao com out ros aliment os, manipuladores, e co m o ambiente. Os pro dut o s aco ndicio nados e m emba lagens, de difcil t ranspo rt e para o laborat rio podem ser amost rados in loco, co m a mx ima assepsia. Aliment os per ecveis refr ig erado s devem ser mant ido s ent re 0 e 44C at o inc io da anlise. Quando se t rat ar de aliment o s congelados, as amo stras devem ser descongeladas so ment e para a realizao da anlise. Co mo regra geral, to da amo st ra deve ser analisada at 36 horas aps sua o bt eno. Produtos perecveis que no puderem ser analisados nesse per o do podem ser refr igerado s ou ainda congelados, dependendo do t ipo de produto, objet ivo da anlise e t ipo de micro rganis mo a ser pesq u isado .
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O n mero de unidades a serem co let adas para anlise e dos cr it r io s adotados para aprovao ou reprovao de um produto definem um plano de amostragem.
2. Preparo da amost ra para anli se microbiolgica 2.1 Coleta da amost ra Tcnicas asspt icas devem ser ut ilizadas em t odas as et apas; Deve- se proceder limp eza e a d esin feco da emba lag em do aliment o a ser analisado com lcoo l a 70%; A quant idade analisada do aliment o muit as vezes na faixa de 25g (o u mL) 50g A mo st ra precisa ser ho mo geneizada co m d ilu ent e apro pr iado, a esco lha do diluent e d epend e do t ipo do pro duto e dos micro rganis mo s a serem pesqu isados; A ho mogeneizao das amo st ras co m o dilu ent e po de ser feit a em liquid ificadores ou ho mogeneizadores de laborat rio, deno minado s stoma cher .
2.2 Reti rada da amost ra A operao de ret irada da amo st ra deve ser efet uada,
prefer encia lment e, dent ro de uma capela de fluxo laminar, ou prxima de u m bico de Bunsen, co m a chama a me ia alt ur a. As embalagens devem ser desinfet adas ant es de sua abert ura que dever o co rrer de maneir a asspt ica. Amost ras de aliment os lquidos devem ser ret iradas co m pipet a est r il, e os aliment os slidos ou semi-s lidos deve m ser pesado s assept ica ment e.
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2.3 Preparo das di luies No preparo das dilu ies sucessivas, podem ser ut ilizados diverso s d ilu ent es; so luo salina-pept onada, salina a 0,85% ou gua est r il e out ros. Para o bt eno da d ilu io inicia l (1/10) procede-se do seguint e modo: a) Ret irar assept icament e pores de 25g ou 25 mL da amo st ra, co lo cando se em ho mogeneizadores est er ilizados ; b) Ad ic io nar 225 mL do diluent e; c) Ho mo geneizar po r alguns minut os em velocidade r eduzida, par a no danificar as c lulas microbianas. d) A part ir da d ilu io inic ial (1/10), proceder s diluies seguint es (1/100); (1/10 00), et c. (Apndice A).
2.4 Solues di luent es a) Soluo salina pept o nada Clo ret o de S dio .......................8.5g Pept o na....................................1,0g gua dest ilada..........................1000mL Disso lver o s co mpo nent es em gua dest ilada. Dist r ibuir em t ubos de ensa io (9 mL).Est er ilizar em aut oclave a 121C/15min. b) Soluo salina 0,85% Clo ret o de S dio......................0,85g g ua dest ilad a.........................100mL Disso lver o cloret o de sdio em gua dest ilada. Dist r ibuir em tubos de ensa io e est er ilizar em aut oclave a 121C/ 15 min.
103
P RTICAS
E ST I M A TI V A
DA
P OP U LA O A T R AV S
DE
C OL IF ORM E S T OT A I S ,
45 C
E SC HE RI C HI A
C O LI
DO
N M E R O M AI S P R OV VE L ( NM P )
espo ru ladas, de met abo lismo aerbio ou facult at ivo anaerbio, da famlia das Entenobact eri acea e . O grupo do s co lifo r mes t ot ais (CT) apresent a a caract er st ica de fer ment ar a lact ose com produo de gs dent ro de 48 horas a 35C. Mais de 20 espcies de bact r ias podem ser classificadas co mo co lifo r mes, or iginr ias t ant o do t rato gast rint est inal do ho mem e de animais, co mo tambm de outros ambientes. O grupo de co lifor mes a 45C for mado pelos co lifor mes qu e fer ment am lact o se, co m produo de gs dent ro de 24-48 horas, e m t emperat ura de 45C, no r malment e em Caldo EC. Podem ser Cit rob acter f reundi , Enterobacter spp., ( inclu indo E. aerog enes e E. cloacae ), Klebl siell a et c. Ent ret ant o, Escherichi a coli a nica espcie cujo habit at o t rato gast r int est inal do ho mem e de anima is. Enterobacter , Kl ebsi ella e Cit roba cter po dem d esenvo lver-se fo ra do t rato int est inal, t ais co mo veget ais e so lo . Quando se det er mina a populao dos co lifor mes a 45C, 90% corresponde po pu lao de Escherichia coli . A t cnica mais u sada nos laborat rios par a det er minao de co lifor me s (tot ais e a 45 C) a do nmero mais pr ovvel (NMP) dos t ubos mlt ip lo s, o nde se est ima quant it at ivament e est e grupo, ut ilizando-se a Tabela de Ho sk ins ( Apnd ice B). Out ras t cnicas so ut ilizadas para det erminao de co lifor mes co mo membr ana filt rant e e simplate .
radicio na lment e, as bact r ias do grupo colifor mes t m sido consideradas co mo indicadoras de poluio fecal em aliment os e guas. S o bast onet es gr am negat ivas, no
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1 M T OD O
C OL IF ORM E S T OT A I S
Prova Presuntiva Visa det ect ar a presena de microrganis mos fer ment adores de lact o se, especialment e fase. o grupo co lifor me. Clulas est ressadas por t rat ament o s t rmico s, pelo conge lament o ou out ro mot ivo, podem ser recuperados nessa
Procedi mento Selecio nar t rs diluies adequadas da amost ra e inocular uma sr ie d e t rs t ubo s de ensaio co nt endo, em cada t ubo, 10 mL de Caldo Laur il Sulfat o e t ubo s de Dur han invert idos co m cada u ma das d ilu i es decima is prepar adas. Co lo car, em cada t ubo co m o Caldo Laur il, 1,0 mL de do inoculo. I ncubar em est u fa de bact er io lo g ia a 35-37C por 24 a 48 horas. Aps as 48 horas, ret irar o s t ubos de ensaio d a est ufa. S o considerados posit ivo s aqueles qu e apresent arem t urvao do meio e presena de gs ( bo lhas de ar) no int er io r do s t ubo s d e Durhan. E m seguida cont ar o nmero de t ubos posit ivo s co rrespo ndent es a cada d ilu io (Apndice C).
Prova Confi rmatria (Coli formes totai s) O meio ut ilizado, o Caldo Verde Br ilhante Lact ose Bile 2%, cont m do is in ib ido res ( Bile e Verde Br ilhant e) do cresciment o da microbiot a aco mpanhant e, especialment e bact r ias gr am-posit ivas. Assim, a produo d e gs nos t ubo s, nas co nd i es do t est e, indica que houve desenvo lviment o o u bact r ias gra m- negat ivas que fer ment ar am lact ose, caract er st icas do grupo co lifor me.
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Procedi mento Riscar os tubos de ensaio po sit ivo s no Caldo Laur il Su lfat o para os t ubo s de Caldo Verde Br ilhant e a 35-37C por 24 a 48 horas. Os t ubos po sit ivos apresent am t ur vao e for mao de bo lhas de gs nos t ubos de Durhan. Anotar os resu lt ados de consult e a tabela para NMP (Nmero Mais Provvel) para co lifor mes t ot ais por grama ou mL.
Coliformes a 45C Para a qualificao dos colifor mes a 45C r isque os t ubos de ensaio po sit ivo s no Caldo Laur il Su lfat o e/o u do s t ubo s po sit ivo do Caldo Verde Br ilhant e para os t ubos de Caldo EC e colo q ue no banho - mar ia po r 24 ou 48 ho ras. Os t ubo s po sit ivo s apresent am posit ividade seme lhant e nos Caldo Laur il e Verde Br ilhant e. Anotar os resu lt ados co nsult ando a tabela do NMP para co lifor mes a 45C por grama ou mL.
Identi ficao de Escherichi a coli A part i de cada t ubo de ensaio posit ivo com Ca ldo EC r iscar ( est r iar ) placas de Petr i para Agar EMB (Eosina Azul de Met ileno ) co m au xilio de a la de nquel cro mo e incu bar a 35C por 18 a 24 horas. Ter o cuidado de, durant e a inocu lao , no co lo car muit o mat er ial da amo st ra, afim de no super lot ar as p lacas, proporcio nando s co l nias cr esciment o iso lado, t ranscorr ido est e t empo , ver ificar o cresciment o de co lnia s co m caract er st icas de E. coli , o u seja, 2 a 3 cm d e d imet ro , com br ilho met lico esverdeado ou com cent ro escuro (Apndice D). De cada placa correspondent e a cada t ubo, repicar de 2 a 3 co l nia s caract er st icas para t ubo com Agar Tr iptona de So ja (TSA) inclinado e incubar po r 18-24 ho ras a 35-37C.
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E fet uar em cada cult ura em TS A, as pr ovas bioqumicas descr it as a seguir.
1 Produo de indo l A part ir das cult ur as e m TS A inclinado, inocular t ubos co nt endo o meio SIM ( meio S ulfet o Indo l Mot ilidade) ou gua t r ipt onada e incube a 35C po r 24 horas. Para o t est e do indo l, acrescent ar de 0,2 a 0,3 mL de reagent e Ko vacs. O apareciment o de um anel ver melho indica posit ividade do t est e. O meio SIM usado t ambm para prova de mot ilidade e, port ant o , a ino cu lao deve ser feit a co m agu lha, int r oduzindo-a e ret irando-a em linha e sem t o car o fu ndo do t ubo de ensaio. Int erpret ar a prova de mot ilidade ant es da ad io do reagent e de Ko vacs, observando se h cresciment o difuso a part ir da linha de inoculao.
2 Teste de Voges-Proskau er A part ir das cu lt uras em TS A inclinado, inocular tubos de ensaio co m MR-VP e incube a 35C co m 48horas. Transfer ir 1mL do cresciment o para u m t ubo de ensaio, acr escent e 0,6mL de uma so luo de - nafto l e 0,2mL de uma so luo de KOH a 40%. Ag it ar vigorosament e aps a adio de cada reagent e. Deixar e m repo uso po r at 2 horas. O t est e posit ivo co m o surgiment o de u ma co lo rao ver melha o u rsea.
3 Teste de Vermelho de Meti la Reincubar os t ubos de ensaio co m MR-VP por mais 48 horas e realizar o t est e ap s 96 ho ras d e incubao. Adicio nar 4 got as de uma so luo de Ver melho de Met ila. O desenvo lviment o de uma cor ver me lha ind ica que o t est e posit ivo.
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4 Teste de Cit rato A part ir das cult uras em TS A inclinado, est r iar a super fcie inclinada do s t ubos co m Agar Cit rat o de Simmo ns e proceder a incubao a 35C po r 96 ho ras. O desenvo lviment o de uma co r azu l ind ica a po sit iv idade do t est e. Para evit ar resu lt ado s falso-posit ivo s, o Agar Cit rat o deve ser est r iado pr imeiro, para impedir a t ransferncia de prot enas ou carbo idrat os dos outro s meio s. S e u m in cu lo for muit o pesado , ap s a mort e bact er iana, co mpo st o s da parede celular podero liberar car bono e nit rognio suficient e para t amb m pro duzir result ados falso-posit ivos.
5 Interp retao do s resu ltados Est e grupo de t est es deno minado IMViC. Cons iderar a cult ura po sit iva p ara E.col i , quando forem o bt ido s o s segu int es result ados para o IMViC (Tabela 5).
Tabela 5 . IMViC. Indo l + VM + + VP Citrato Tipo E. coli t p ica E. coli at p ica
OBS: 1- Out ro s t est es bio qumico s podem ser adicio nados, co mo os t est es de car bo idrat o s e aminocidos. 2- Tabela do NMP (Apndice B).
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C ON T A GEM P A D R O
EM
P L A C A S ( CPP )
DE
M I CR OR GA NI SM OS A E R B I OS
M E SF I LOS V I V EI S
clu las est ressadas podem no se desenvo lver no meio, mesmo est ando present e no aliment o. uma met o do lo gia mu it o usad a para ind icar a qualidade higinica dos aliment os, fornecendo t ambm idias sobre o seu t empo t il de conser vao. Sua presena em grande nmero indica: a) Mat r ias-pr imas excessiva ment e cont aminadas; b) Limpeza e desinfeco de super fc ies inadequadas; c) Hig iene inadequ ada na produo; d) Condies inadequadas de t empo/t emper at ura durant e a produo o u a co nser vao dos aliment os ou uma co mbinao dest as cir cunst nc ias. As t cnicas ut ilizad as para se quant ificar as bact r ias so: Pou r Plate , Spread Plate . O mt odo CPP base ia-se na premissa de que cad a clula vive l, iso lada, ho mogeneizad a em u m me io s lido (agar), dar o r ig e m a u ma co l nia uma vez que t eor ia bio lgica que uma co lnia prov m de u ma nica c lula microbiana.
mt o do da Cont agem P adro em P lacas (CPP), est ima o nmero de clu las viveis co nt idas em um aliment o qualquer. Ent ret ant o, um mt odo passvel de erros, uma vez que
1 T C N I CA
D E AN LI SE
Ret irar assept icament e 25g ou 25mL da amost ra e preparar dilu i es sucessivas. P ipet ar alquot as de 1 mL de cad a d ilu io para p laca d e Pet r i est er ilizadas;
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Ad ic io nar a cad a p laca 15-20mL de Agar Padro para Cont agem, prev iament e fu nd ido e resfr iado a t emp erat ura de 45C. Ho mo geneizar em mo viment os suaves em for ma de o it o (cerca de dez vezes) e deixar a t emperat ura amb ient e, at a co mp let a so lid ificao do agar; Ap s a so lid ificao , incubar as placas em posio invert ida a 3537C/48 horas (Apndice E).
Resu ltado s Transcorr ido o t empo de incu bao , co nsid erar para co nt agem,
so ment e as placas da mesma d ilu io que apresent arem de 30 a 300 co l nias; o resu lt ado deve ser expresso seguindo a formula: N de unidades for madoras de co l nias/ mL o u g = N de co l nias x d ilu io. Sempre que quiser t rabalhar co m segurana, o mt odo CPP exige o uso de p lacas de Pet r i em duplicat as. Muit os erros podem ser co met idos na execu o do mt o do : erro s de pesagem, erros da amost ra, erros na medida dos vo lumes do s d ilu ent es e nas alquot as a serem dist r ibudas nas diluies, erro s no espalha ment o do inoculo , co nt aminao nas o pera es e erro s na ho mogeneizao das amo st ras. A cont agem padr o po der expressar nmeros de unidades for mado ras de co lnias (UFC) de difer ent es micro rganismo s que cr escem em d iferent es t emperat uras. Por exe mp lo : p sicr filos, mes filo s, psicrot r filo s e t er m filo s. Para ist o necessr io que a t emperat ura de incubao favorea est es difer ent es grupos de microrganismos. Assim, para bact r ias psicr filas, reco mend ada u ma incu bao de dez dias a t emperat uras de 7C para Pou r Plate , ou set e a o it o dias a 7C para Spread Plat e ; para psicr filas, incu bao de cinco d ias nas t emperat uras de 23-25C; para mes filas, o t empo de incubao meno r, de 24-48 horas em t emperat uras ent re 35-37C e para t erm filas, incubao a 24 horas a 55C.
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t cnica
de
semeadura
em
super fcie
ma is
adequada
par a
micro rganis mos ps icrt rofico s do que a semeadura em profundidade. Est a ult ima poder causar injr ias o u mo rt e das clu las se a t emperat ura do agar vert ido nas placas for maior que 45C. Prepare previament e as placas e est o que a 5C por vr io s dias ou semanas, desde que, aco ndicio nadas e m saco s p lst icos bem fechados, para prevenir a desidrat ao do meio. No resu lt ado , info r me o grupo de microrganismo s pesqu isados e as co nd ies de incubao. Po r exemplo: Co nt agem de bact r ias = 36; Diluio = 10 -3 ; N UFC = 36 x 10 3 UFC/g ou mL ou 36000 = 3,6 x 10 4 UFC/g ou mL.
C ON T A GEM
DE
S TA PHY LO C OC C U S
A U RE U S
Uma das causas mais freqent es dos surt os de int oxicaes est relacio nada co m a presena Estas de t oxinas pro duzidas so po r cepas isto de , Staphylococcus aureus . exotoxinas termoresistent es,
supo rt am t emperat uras de ebulio por at 30 minut os. A o r igem d as cepas t oxignicas o ho mem manipulador de aliment os, o qual abr iga essa bact r ia em suas fossas nasais, gargant a, cabelo e pele. Mu it o s de ns podemos ser port adores de S. aureus . A det er minao de S. aureus em aliment os pode ser feit a pelo mt odo de co nt agem dir et a em placa ou pelo mt odo de Nmero Mais Provve l (NMP). Geralment e ut iliza- se a Co nt agem Padro em P lacas (CPP). Para co nt agem em p lacas, o meio de cult ura ut ilizado o Agar Bair d Parker (BP), no qual as co l nias t picas de S. aureus assumem co lorao negra, so br ilhant es, apresent ando zo na de prec ip it ao em t o rne d e sua borda, a qual circu lada po r um halo clar o.
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Para a ident ificao de S. aureus so necessr io s, alm da obser vao de suas caract er st icas mo r fo lgicas e t int oriais, t est es bioqumico s t ais co mo : coagulase, t er mo nuclease, cat alase, t ut ilizao anaerbica de glicose e man it o l. E nt ret ant o, a at ual legis lao para aliment os ( ANVIS A, 2001), est abelece apenas o t est e de co agu lase po sit iva.
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D E AN LI SE S
Pesar assept icament e 25g ou medir 25mL, e prepar ar dilu i es decimais sucessivas. Ret irar de cada diluio alquo t as de 0,1 mL e semear pela t cnic a Spread Plate em p lacas de P et r i co m BP, previa ment e secas co m auxlio da ala de Dr ig alsk y. Invert er as placas e incu ba- las po r 48ho ras a 35C. Ver ificar a presena de co l nias t picas co m as segu int e s
caract er st icas: cir cu lar, co m 2 a 3mm de dimet ro, de colorao negra, geralment e co m borda br ilhant e, circu ndada po r do is halo s apresent ando u ma zo na o paca mais pr xima co l nia e out ra zona, mais ext er na, t ransparent e. Selecio nar placas co m 20 a 200 co lnias e cont ar as co lnias t pica s de S. aureus . Event ualment e, co l nias at picas podem se apresent ar cinzent as, sem um, o u ambo s, halo s t p icos. Iso lament o: Transfer ir cada co l nia su speit a para t u bo s de ensaio s co m 0,3 mL d e BHI e ino cu lar uma alada dest a suspenso em t ubo co m TS A inc linado, para manut eno da cu lt ura. I no cu lar o s t u bo s co m BHI e TS A po r 24horas a 35 C. Prova de coagulase: Adiconar a cada t ubo de ensaio co m BHI, 0,25 mL de plasma de coelho e agit ar. Incubar a 35C e examinar a for mao de co gu lo per iod icament e durant e 6 horas. Considerar posit ivo um cogu lo fir me e co mpact o, que no se desprende quando o t ubo inclinado o u invert ido (Apndice F).
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Colora o de G ram A part ir de cult ur a de 24 ho ras em TS A inclinado , realizar a co lo rao de Gram. Devem ser ident ificadas bact r ias gram posit ivas em for ma de co co s, arran jados caract er ist ica ment e em for ma de cacho de uva. Clculo do resu lt ado: Calcular o nmero de UFC/g ou mL em funo do nmero de co l nias t picas cont adas, diluio ino culada e per cent agem de co lnias confir madas. Por exemplo: Diluio 10 -2 , 30 co lnias t pica, 5 submet idas co nfir mao , 3 confir madas (60%): UFC/g ou mL = 30 x 10 2 x 10 x 0,6 = 1,8 x 10 4 .
P E SQU I SA
DE
S A LM O NE LLA
SP P .
Salmonell a eliminada pelas fezes. A possibilidade de cont at o dessas fezes co nt aminadas co m guas, super fc ies e manipuladores, torna iminent e a sua veiculao por aliment os. Exist em vr io s mt odos para o iso lamento de Salmonella , nenhum co mp let ament e sat isfat rio para iso lar t odos os sorot ipos present es em qualquer aliment o. E les co mpreendem as seguint es et apas: prenr iqueciment o, enr iquec iment o selet ivo, iso lament o em agar selet ivo e difer encia l e se leo de col nias suspeit as, co m as quais realizam- se provas bio qu micas, sorologia e fagot ipagem, que definiro, finalment e, o sorot ipo .
almonella u m gnero da famlia E nt erobact er iaceae, gram negat ivo , no esporulado. Vr ias espcies so pat ognicas ao ho mem e ao s animais. Habit ando o t rato int est inal de anima is,
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D E AN LI SE
A) Pr-enr iqu eciment o: Pesar 25 g ou medir 25 mL da amost ra e ad icio nar 225 mL de Caldo Lact osado ou gua Pept onada Tamponada. I ncubar a 35-37C por 24 horas. B) Enr iqu eciment o selet ivo: Agit ar o caldo pr-enr iqueciment o e ino cu lar 0,1 mL em 10 mL do meio Rapapport e 1,0mL em 10mL do Caldo Tet rat io nat o. Incubar os meio s a 37C e 4 2C/24 ho ras. C) P laquement o em me io se let ivo e diferencia l: Agit ar o s t ubos d e Caldo Rapapport e Tetrat ionat o e est riar uma a lada de cada cult ur a em placas nos seguint es me io s de cult ura: Agar Hekt o en, Agar Rambac e Agar XLD, ident ificando a origem das cult uras (Rapapport e t et rat ionat o). Incubar as p lacas invert id as a 35 C po r 24 horas. D) Seleo de co l nias su speit as: Transcorr ido o perodo de incubao do p laqueament o se let ivo, obser var as col nias suspeit as de Sal monel la co m au xlio de manuais especia lizados (Apndice G). E) Provas bioqumicas de tr iagem: Transfer ir duas ou mais co l nias suspeit as d e cada p laca p ara t ubos inclinados, cont endo Agar TSI e LI A. Co m auxlio de agulha de ino culao , to car levement e o cent ro da co lnia, estr iar na super fcie inclinada (pice) do TSI e dar uma picada na base. Sem fla mbar a agu lha, dar duas picadas na base do meio LI A e est r iar na super fcie. Ro t ular os t ubos, ident ificando a o r igem das cu lt uras e incu bar a 35C por 24 ho ras. Reaes tpicas de Salmonella no s t ubo s de TSI e LIA, so as seguint es: TSI pice alcalino (ver melho ) e base cida (amar ela), co m o u sem
pro duo de gs (bo lha) e de H 2 S (escur eciment o do meio ). LI A base alcalina (prpura), a maioria produz H 2 S. Colorao
ver melho-t ijo lo no pice do me io LI A no t ipo de Salmonell a .
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Submet er t odas as cult uras co m reaes t picas no meio LI A ( base alcalina) e/o u no meio TSI (alcalina/cida) a t est es bioqu mico s e sorolg icos. Descart ar apenas as cult ur as pice/ base c idas no meio TSI e aquelas co m base cida no me io LI A ( Apnd ice H).
Provas bioqu micas de con fi rma o Test e da urease: I nocular co m ala, t ubos de ensaio co m Caldo Uria. Incu bar a 3 5C po r 24 ho ras. Reao posit iva: alt erao da cor do meio par a ro sa escuro , pela v ir agem alcalina do indicador. A ma ior ia das cepas de Salmonell a urease negat iva ( no alt era a colorao do me io). Para o s t est es po st er iores, renovar as cult uras urease negat ivas e m meio TSI inclinado e incubar a 35C po r 24 ho ras. Test e de fer ment ao do dulc it o l: I nocular uma alada em tubos de ensa io co m Caldo Prpura de Bro mocresol co m 0,5% de dulcit o l. I ncubar a 35C por 48 horas. Reao po sit iva: acidificao do meio (amarelo). Reao negat iva: co lo rao prpura do meio. A maior ia das cepas de Salmon ella fer ment a du lcit o l. Test e de ut ilizao do malo nat o: Inocular cult ura para t ubos de ensaio co m Caldo Ma lo nat o e incubar a 35C por 48 horas, mas examinar ap s 24 ho ras. Incu bar u m t ubo co nt role no inoculado. A maior ia dos sorot ipos de Salmonell a malo nat o negat ivo (co lorao verde). malo nat o posit ivo (alt erao de cor verde para azul). Os t est es de indo l, ver melho de met ila, Vo ges-Pro skauer e cit rat o de S immo ns, j fo ram d escr it o s para ident ificao de Esch eri chia coli . As cu lt uras d e Sal monel la spp. apresent am o seguint e quadro (Tabela 6).
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Tabela 6 . Result ado do s t est es para Salmonella. Test e Cit rat o de Simmo ns Malo nat o Ver melho de met ila Voges-Proskauer Indo l Urease Lisina Acar es; lact ose Acar es; glicose Acar es; du lc it o l Motilidade ( meio SIM) Resu ltado + + _ + + + +
C ON T A GEM
DE
B OL OR E S
L E VE D U RA S
co mu m de det er io rao de aliment os estocados em ambient es do mst icos, alm d isso, alguns bo lores produzem micotoxinas.
s bo lores so fungos co m est rut uras filament osas. As leveduras so fungos unicelulares de for ma esfr ica, ov ide, cilndr ica. Os fungos so, t alvez, a causa ma is
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D E AN LI SE
Ret irar assept icament e 25g o u 25 mL da amo st ra e preparar as dilu ies sucessivas. Pipetar alquotas de 1mL de cada diluio para placas de Pet ri, fazendo de cada dilu io placas em duplicat as. Ad icio nar a cada placa 15 mL do Agar bat at a dext ro se, previament e fu nd ido , resfr iado a 45C e acid ificado co m o cido t art rico. Homogeneizar co m mo viment os em fo r ma
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de o it o . Deixar so lid ificar a t emperat ura ambient e. I ncubar as placas a 25 C po r 3 a 5 dias.
Resu ltado s Aps o per odo de incubao, considerar para cont agem so ment e as placas d a mesma d iluio que apresent arem de 30 a 300 co lnias. E m segu id a, mu lt ip licar a md ia das duas placas pelo fat or de diluio correspondent e, expressando o resu lt ado em Unidades For madoras de Co l nias por grama ou mililit ros (UFC/g ou mL) (Apndice I).
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APND ICES
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Apndice A . Esqu ema das d iluies sucessivas.
Alimento (25g)
225mL de H2O peptonada, 0,85% 10

-1
1mL
Diluio
Homogeneizar 1mL 10-2 10-3
119
Apndice B . Tabela do Nmero Mais P ro vvel ( NMP), p ara sr ies d e t rs t ubos (NMP/g o u mL).
Nmero de tubos positivas nas diluies 10-1 10-2 10-3 NMP
Nmero de tubos positivos nas diluies 10-1 10-2 10-3 NMP
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
0 1 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3
0 0 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3
3 3 6 9 3 6.1 9.2 12 6.2 9.3 12 16 9.4 13 16 19 3.6 7.2 11 15 7.3 11 15 19 11 15 20 24 16 20 24 29
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3
0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3
9.1 14 20 26 15 20 27 34 21 28 35 42 29 36 44 53 23 39 64 95 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 2400
120
Apndice C . Enumerao de colifor mes t ot ais e a 45C.
10-1
10-2
10-3
1ml
1ml
1ml Caldo Lauryl (CL)
ESTUFA 35C/24-48h
2 aladas Teste Confirmativo coliformes a 45C (Caldo E.C.)
2 aladas Teste Confirmativo coliformes totais (Caldo VB)
BANHO-MARIA 45C/24h
ESTUFA 35C/24-48h
Gs (+) Presena de coliformes a 45C
Gs (-) Ausncia de coliformes a 45C
Gs (+) Presena de coliformes totais
Gs (-) Ausncia de coliformes totais
TESTE BIOQUMICO Teste API-20E
121
Apndice D . Ident ificao de Escheri chia coli .
Caldo E.C., presena de gs (+) para coliformes a 45C.
Agar Eosina Azul de Metileno (Agar EMB) com crescimento de E. coli.
Isolamento em Agar Tripcase Soja (Agar TSA)
Srie Bioqumica
INDOL
E. coli (+)
122
Apndice E . Esquema da t cnica de anlise de Cont agem P adro em P lacas de bact r ias mes filas.
10-1
10-2 1mL 1mL
10-3 1mL
10-4 9 mL sol. salina 0,85% NaCl
Amostra (25g)
225mL soluo salina estril
Plate Count Agar (PCA)
1mL
1mL
1mL
1mL
Incubao 37C/48h
Contagem das placas contendo 30 a 300 colnias
123
Apndice F . Co nt agem de Staphylococcus coagulase posit iva.
10-1
10-2 1ml 1ml
10-3 1ml
10-4 9 ml soluo salina
ALIMENTOS 25g ou 25 ml
225ml soluo salina estril 0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml
Agar Baird Parker (Agar BP)
ESTUFA 35C/24 horas
Caldo Infuso Crebro Corao (BHI) Agar Tripticase Soja (Agar TSA) ESTUFA 35C/24 horas
Agar BP com crescimento de Staphylococcus spp.
TESTES BIOQUMICOS
Teste de Coagulase
Teste de Catalase
(+)
(-)
(-)
(+)
124
Apndice G . Pesquisa de Salmonella spp.
ALIMENTO 25g ou 25ml
225ml de gua Peptonada Tamponada
ESTUFA A 35C/24 horas
1mL 10mL de Caldo Tetrationato

ENRIQUECIMENTO
0,1mL 10mL de Caldo Rapapport
ESTUFA A 35C/24 horas
Agar Hektoen
Estrias INCUBAO 35C/24H
Agar Rambach
Agar Tripcase Soja
Testes Bioqumicos
125
Apndice H . Ident ificao de Salmonella spp.
Testes Preliminares ( 1 Etapa )

a
Agar TSI
Uria
Agar LIA
Testes Finais ( 2 a Etapa )
Vermelho de Metila
Indol
Vogues-Proskauer
Citrato de Simmons
Fermentao de Lactose
Fermentao de Sacarose
Caldo Malonato
126
Apndice I . Cont agem de Bo lores e Leveduras.
10-1 ALIMENTOS 25g ou 25 ml 225ml salina 1ml
10-2 1ml
10-3 1ml
10-4 9 ml sol. salina
soluo estril 1ml 1ml 1ml 1ml Agar Agar Batata Dextrose Batata Dextrose adicionado cido adicionado deTartrico cido tartrico
ESTUFA B.O.D. 25C/ 5 dias
Contagem das placas que contenham entre 30 e 300 colnias (UFC/g ou ml)
127
REFER NCI AS
ADAMS, M. R. ; MOSS, M. O. Food microbiology . 2. ed. Cambr idge: Ro yal Societ y o f Chemist r y, 2002. ANVIS A, Agnc ia Nacio nal de Vigilncia Sanit r ia. Minist r io da Sade. Reso luo n. 12 de 2 de janeiro de 2001. Dirio O ficial da Unio , janeiro de 2001. AP HA, Amer ican Public Healt h Associat ion. Compendiu m of method s fo r
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U N I V E R SI D A D E F E D E R A L PR- REITORI A DEPARTAMENTO PROGRAMA

NOES DE ANLISES FSICO-QUMICAS E MICROBIOLGICAS DE ALIMENTOS

PR OF . DR. VI CT OR EL IA S M OUC HRE K FIL HO P R O F A . D R A . A D E N I L D E R I B E I R O N A SC I M E N T O

PROGRAMA DE CONTROLE DE QUALIDADE DE ALIMENTOS E GUA PAVILHO TECNOLGICO - UFMA

LABORATRIO DE BROMATOLOGIA Prof. Dr. Victor Elias Mouchrek Filho victo@ufma.br

LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA Profa. Dra. Adenilde Ribeiro Nascimento adenild@bol.com.br

A NLISES F SICO -Q UMICAS

Noes de anlises fsico-qumicas de alimentos

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Microbiologia dos alimentos Parasitologia dos alimentos Bioqumica dos alimentos

Toxicologia dos alimentos

Anlise dos alimentos

Tecnologia dos alimentos

Figura 1. Fluxograma referente Bromatologia

Noes de anlises fsico-qumicas de alimentos

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Noes de anlises fsico-qumicas de alimentos

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TO TALIDADE DO ALIM ENTO

A amostra para anlise bromatolgica no deve produzir prejuzo econmico sensvel.

Figura 2. Aspectos fundamentais na tomada da amostra para anlise bromatolgica.

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Noes de anlises fsico-qumicas de alimentos

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Figura 3. Determinao da quantidade de amostra.

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ANLISE B ACTERIO L G ICA

AUTO CLAVE 120C x 20

TAMPAS LIMPAS ATXICAS INATACVEIS

Figura 4. Esquema para anlise de alimentos lquidos.

UB em g ou mL lll lV V Vl Vll Vlll X Xl Xll Xlll XV XVl XVlll XlX XX

AMOSTRAGEM GARANTIA DE:

UNIDO AO CONCEITO DE NO ALTERAO

UNIDO AO CONCEITO DE NO RUPTURA

Figura 5. Envio de amostras ao laboratrio: inviolabilidade, conservao e integridade.

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ENVIO DA AMOSTRA II IDENTIFICAO AMOSTRAGEM

DAS AMOSTRAS (rtulas)

DOS PACOTES (de papel, caixas de madeira ou de papelo)

atar lacrar carimbar identificar assinar outros dados

Figura 6. Envio de amostras ao laboratrio: identificao e amostragem.

DESTINO DAS AMOSTRAS

AS AMOSTRAS TIRADAS COMA ARTE E CINCIA SO MISTURADAS E DIVIDIDAS EM TRS PARTES

LABORATRIO PARA ANLISE BROMATOLGICA

LABORATRIO PARA ANLISE DE VERIFICAO

NO LOCAL PARA A ANLISE DE CONTRA-VERIFICAO

Figura 7. Destino das amostras.

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Figura 8. Procedimento para o preparo da amostra.

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