Manual de Diagnstico Laboratorial das Coagulopatias Hereditrias e Plaquetopatias

Coordenao Geral de Sangue e Hemoderivados Departamento de Ateno Especializada Secretaria de Ateno Sade Ministrio da Sade

Novembro de 2010

ELABORAO Ana Suely Leite Saraiva Gisele Marlia Pianetti Sternick Maria Emlia Santos Silmara Aparecida Lima Montalvo Tnia de Ftima G. Siegl Machado Tnia Rbia Flores da Rocha

REVISO TCNICA Suely Meireles Rezende Joo Carlos Campos Guerra Marinez matos

LISTA DE TABELAS Tabela 1. Insumos bsicos necessrios ao funcionamento de um Laboratrio de Hemostasia 8 Tabela 2. Tempo de estocagem de amostras para testes de coagulao 17 Tabela 3 .Modelo para construo da curva de calibrao do tempo de protrombina 23 Tabela 4. Interpretao de testes de triagem 27 Tabela 5.Preparao das solues para o teste de FvW:Ag 42 Tabela 6. Preparo de solues para o teste de FvW:RCo 51 Tabela 7. Preparo de solues para o teste de FvW:CB 54 Tabela 8. Diferenciao da doena de von Willebrand subtipo 2B e pseudo doena de von Willebrand por agregao plaquetria com ristocetina na concentrao final de 0,5 mg/mL58 Tabela 9. Calibrao para a dosagem de FVIII:C 68 Tabela 10. Exemplo de clculo da correo do TTPA com pool de plasma normal 70 Tabela 11. Exemplo de resultado de testes para a deteco da presena de inibidor 71 Tabela 12. Correlao dos testes de triagem e dosagem especfica de fator 77 Tabela 13. Drogas, alimentos e complementos que interferem na funo plaquetria 78 .

LISTA DE FIGURAS Figura 1. Curva para deteco da sensibilidade de reagente 13 Figura 2. Fluxograma para interpretao dos testes para diagnstico da doena de von Willebrand. 36 Figura 3. Curva de calibrao-paralelismo para determinao de fator especfico 69 Figura 4. Ilustrao esquemtica dos testes de Bethesda (A) e Bethesda modificado (B) 73 Figura 5. Exemplo 1 do clculo da atividade residual do fator VIII. 75 Figura 6. Exemplo 2 do clculo de atividade residual do fator VIII 76 Figura 7. Curva de agregao plaquetria por sistema ptico com ADP, adrenalina, colgeno e cido araquidnico 104

SUMRIO LISTA DE TABELAS 3 LISTA DE FIGURAS 3 SUMRIO 4 1. Introduo 7 2. Condies mnimas para funcionamento de um Laboratrio de Hemostasia 8 3. Tcnica manual e equipamentos disponveis para os testes de hemostasia 9 4. Coleta de amostra para testes de hemostasia e variaes pr-analticas 10 5. Validao dos testes de hemostasia e estabilizao do intervalo normal de referncia 11 5.1. Porque validar? 11 5.2. Determinao de um intervalo normal de referncia 11 5.3. Caractersticas de desempenho de uma rotina validada 11 5.3.1. Verificar a exatido 11 5.3.2. Determinar a preciso 12 5.3.3. Determinar a sensibilidade dos fatores da coagulao 13 6. Implantao dos controles de qualidade interno e externo no Laboratrio de Hemostasia 14 6.1. Controle de qualidade interno no Laboratrio de Hemostasia 14 6.1.1. Controle de qualidade na etapa pr-analtica 14 6.1.1.1. Coleta de amostra 14 6.1.1.2. Transporte de amostra 14 6.1.1.2.1. Transporte de amostra em rotina laboratorial 15 6.1.1.2.2. Transporte de amostra para outra instituio 16 6.1.1.3. Processamento e estocagem de amostra 16 6.1.2 Controle de qualidade na etapa analtica 18 6.1.2.1. Material para controle de qualidade interno 18 6.1.2.1.3. Limites de aceitabilidade e variao 19 6.1.3. Controle de qualidade na etapa ps-analtica 19 7. Preparao e calibrao de pool de plasma normal 20 7.1. Coleta e preparao do pool 20 7.1.1. Preparo do pool de inibidor de fator VIII Modificao de Nijmegen 21 7.1.2 Calibrao do pool 21 8. Testes de triagem: tempo de protrombina, teste de tromboplastina parcial ativada e tempo de trombina 23 8.1. Tempo de protrombina 23

8.1.1. Curva de calibrao para determinao de atividade enzimtica 23 8.2. Tempo de tromboplastina parcial ativada 24 8.3. Tempo de trombina 26 9. Diagnstico laboratorial das coagulopatias hereditrias 27 9.1. Doena de von Willebrand 27 9.1.1. Introduo 27 9.1.2. Manifestaes clnicas 28 9.1.3. Diagnstico 28 9.1.4. Testes laboratoriais 28 9.1.4.1. Testes de triagem 29 9.1.4.1.1. Tempo de sangramento 29 9.1.4.1.2. Contagem de plaquetas 30 9.1.4.1.3. Tempo de tromboplastina parcial ativada 31 9.1.4.2. Testes confirmatrios 31 9.1.4.2.1. Determinao da atividade do fator VIII 31 9.1.4.2.2. Determinao do antgeno do fator de von Willebrand 32 9.1.4.3. Testes especiais 41 9.1.4.3.1. Agregao plaquetria com ristocetina 41 9.1.4.3.2. Diferenciao laboratorial entre doena de von Willebrand do tipo 2B e pseudo doena de von Willebrand 42 9.1.4.3.3. Ligao do fator de von Willebrand ao fator VIII 43 9.1.4.3.4. Padro multimrico do fator de von Willebrand 44 9.1.5. Recomendaes para coleta e processamento da amostra para os testes para diagnstico de doena de von Willebrand. 46 9.2. Hemofilias 47 9.2.1. Diagnstico laboratorial da hemofilia 47 9.2.1.1. Tempo de tromboplastina parcial ativada 47 9.2.1.2. Determinao da atividade de fator VIII e/ou fator IX 47 9.2.1.3. Inibidores 50 9.2.1.3.1. Tcnicas de deteco de inibidor 51 9.2.1.3.1.1. Deteco do inibidor pelo teste de mistura 51 9.2.1.3.1.2. Deteco do inibidor pelo teste de pesquisa de inibidor 52 9.2.1.3.4. Quantificao de inibidor 52 9.2.1.3.4.1. Mtodo Bethesda 53 9.3 Coagulopatias raras: deficincia de fatores I, II, V, VII, X, XI, XII e XIII 56 9.3.1. Fator VII 57 9.3.2. Fator V 58 9.3.3. Fator X 59 9.3.4. Fator XI 82 9.3.5. Fator XII 83 9.3.6. Fator XIII 62 9.3.7. Fator I 63 9.3.8. Fator II 64 10. Plaquetopatias 65 10.1. Introduo 65 10.2. Testes laboratoriais para a quantificao de plaquetas e caracterizao de plaquetopenia hereditria 68 10.3. Plaquetopatias hereditrias 69 10.4. Plaquetopatias adquiridas 70 10.5. Testes laboratoriais 71

10.5.1. Testes de triagem 10.5.2. Testes especficos 10.5.3. Testes especiais

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1. Introduo O Manual de Diagnstico Laboratorial das Coagulopatias Hereditrias e Plaquetopatias tem como objetivo principal abordar os principais aspectos dos testes laboratoriais necessrios para o diagnstico das coagulopatias e plaquetopatias. Desta forma, este Manual poder auxiliar os profissionais que atuam no laboratrio a realizar os testes de hemostasia com maior desenvoltura, visando uma padronizao das tcnicas utilizadas atravs da descrio de diretrizes bsicas para investigao laboratorial adequada. Este Manual foi elaborado por um grupo de profissionais atuantes em laboratrio, que reuniram informaes relevantes e atualizadas sobre as tcnicas e mtodos empregados em laboratrio de hemostasia. Sero abordados vrios temas relacionados prtica laboratorial, tais como, mtodos, reagentes, equipamentos, manuseio de amostras, anlise de qualidade e validao. No objetivo deste Manual ser fonte de referncia nica sobre o tema, devendo, os profissionais atuantes na rea, complementar as informaes e se manter atualizados com relao a teoria e prtica relacionada ao diagnsticos das doenas citadas.

2. Condies mnimas para o funcionamento de um laboratrio de hemostasia Diferentemente de inmeros procedimentos laboratoriais que passaram a ser realizados exclusivamente em equipamentos semi e/ou totalmente automatizados, os testes usuais de triagem e diagnstico das coagulopatias continuam dispondo de mtodos manuais, que utilizam banho-maria 37C para sua realizao. O princpio destas tcnicas se baseia na deteco visual da formao do cogulo de fibrina. Nos anos setenta, foram introduzidos os aparelhos semi-automatizados, com princpio de deteco fotomtrica ou mecnica da formao da fibrina. Em seqncia, aparelhos totalmente automatizados e interfaceveis, com sistemas de informao, foram desenvolvidos proporcionando maior agilidade na liberao de resultados em laboratrios clnicos de grande porte. Diante deste cenrio com vrias opes, ao planejar a criao de um laboratrio de hemostasia, torna-se imperativo quantificar o nmero de amostras a serem testadas, com vistas a realizar uma avaliao de custo-benefcio para a aquisio adequada do equipamento e dos insumos necessrios. A Tabela 1 lista alguns itens indispensveis para o funcionamento de um Laboratrio de Hemostasia. Tabela 1. Insumos bsicos necessrios ao funcionamento de um Laboratrio de Hemostasia Balana semi-analtica Banho Maria 37 C, com estante para tubos de hemlise Centrifuga de bancada com capacidade mnima de rotao de 1700 x g Climatizador de ambiente (aparelho de ar condicionado ou split) em locais com temperatura superior a 25C*. Cronmetro Freezer - 18C a - 20C e/ou - 60C a - 80C Geladeira Reagentes para determinao dos testes de triagem e de diagnstico de coagulao, de acordo com o mtodo/principio dos testes Negatoscpio ou outra fonte de luz para leitura da formao do cogulo Papel mono-log para grficos Pipetas automticas com volumes em microlitros: 50 l, 100 l, 200 l e 1000 l Ponteiras descartveis compatveis com as pipetas automticas Termmetro Tubos de hemlise vidro siliconizado (Pyrex n 9820) Tubos para coleta de amostra com Citrato de Sdio 3,2% * Temperatura Ambiente ideal: 18 a 25C. O projeto arquitetnico da rea laboratorial deve observar s normas sanitrias e de segurana do trabalho. Os laboratrios clnicos, de uma maneira geral, devem atender aos requisitos das seguintes legislaes: - RDC n 50, de 21 de fevereiro de 2002, referente s normas arquitetnicas; - RDC n 302, de 13 de abril de 2005, referente ao regulamento tcnico para funcionamento de Laboratrios Clnicos.

3. Tcnica manual e equipamentos disponveis para os testes de hemostasia Embora existam muitos aparelhos automatizados disponveis para a realizao de testes em coagulao, a tcnica manual ainda muito utilizada em laboratrios de hemostasia. Esta tcnica, alm de ser bastante didtica para o aprendizado inicial dos mtodos em hemostasia, permite, ainda, a comparao dos resultados obtidos com os aparelhos automatizados. A utilizao de tubos de vidro siliconizado permite um melhor desempenho da tcnica manual. O tamanho conveniente de 75 x 10 mm; diferentes tipos de tubo podem ser utilizados, porm estas diferenas podem influenciar o tempo de coagulao obtido, particularmente para testes de triagem como tempo parcial de tromboplastina ativada (TTPA). Se houver uma mudana na tcnica ou nos reagentes utilizados, uma comparao dos resultados dever ser realizada antes de dar continuidade rotina de exames. Diferenas sistemticas entre a tcnica manual e automatizada pedem um novo intervalo de normalidade. Etapas importantes para a qualidade dos testes realizados manualmente so: Os reagentes devero ser pr-aquecidos a 37C por pelo menos 5 minutos antes da realizao dos testes. O plasma-teste e os reagentes devero ser misturados rapidamente. O cronmetro dever ser iniciado simultaneamente com a mistura de reagentes. A leitura dever ser realizada posicionando o tubo em um ngulo de 90C por trs vezes a cada 5 segundos com constante observao para o incio da formao de fibrina.

4. Coleta de amostra para coagulao e suas variaes pr-analticas As variveis pr-analticas se referem a todos os fatores que afetam a qualidade da amostra antes do incio do teste. A observao das variveis pr-analticas nos testes de coagulao extremamente importante para que se obtenha confiabilidade e qualidade em todos os resultados dos testes de hemostasia. Para a coleta de amostras de exames de coagulao, o paciente deve estar em jejum mnimo de 4 horas. Recomenda-se seguir as orientaes abaixo para uma coleta adequada. As amostras devero ser coletadas atravs da utilizao de seringa e/ou sistema a vcuo que permita uma coleta rpida, sempre em tubos de vidro siliconizados ou tubos de poliestireno. As amostras no resultantes de puno imediata devem ser descartadas, pois o material colhido para realizao de testes de coagulao deve advir de coleta no traumtica e o garroteamento no deve ultrapassar 1 minuto. Para a determinao da dosagem dos fatores VII, VIII e fator de von Willebrand (FVW), as amostras devero permanecer a temperatura ambiente, para evitar ativao da coagulao por baixa temperatura. Na coleta com seringa, a agulha dever ser sempre retirada ao se transferir o sangue para o tubo contendo o anticoagulante, para que no haja hemlise da amostra, o que inviabiliza os resultados. A homogeneizao deve ser feita atravs da inverso do tubo (5 vezes), delicadamente, sendo esta medida importante para impedir a hemlise. Coletas com seringa e sistemas a vcuo no podero ser utilizados conjuntamente. O tubo para coleta dever conter citrato de sdio (0,109 mol/L) 3,2% tamponado. A soluo de citrato de sdio tamponada para prevenir aumento no pH, o que pode afetar os resultados. Esta soluo poder ser estocada a 4C por trs meses, desde que seja sempre inspecionada para a verificao de material particulado que pode significar contaminao. A proporo sangue/anticoagulante deve ser exatamente de 9:1 (por exemplo, 4,5ml de sangue para 0,5 ml de citrato). A concentrao de citrato de sdio dever ser ajustada em pacientes com valores de hematcrito acima de 55%. Em amostras com hematcrito elevado, a relao sangue/anticoagulante (9:1) no mantida, podendo causar excesso de citrato para o volume de sangue presente no tubo. Isso pode levar a uma falsa elevao do tempo de coagulao. Deve-se, por isto, ajustar o volume de citrato atravs da frmula: C= (1,85 x 10-3)(100-HCT)(V sangue) Onde, C = Volume de citrato; HCT = Hematcrito do paciente; V = Volume de sangue adicionado (se o tubo for de 5 mL, ento o volume ser 4,5 mL). Para hematcrito abaixo de 20%, no h informaes disponveis que sustente recomendao especfica.

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5. Validao dos testes de coagulao e estabilizao do intervalo normal de referncia 5.1. O que validao? A validao um processo documentado que demonstra que um procedimento encontra-se estvel e capaz de produzir informaes pr-determinadas. 5.2. Porque validar? A principal responsabilidade do profissional que atua no laboratrio assegurar que as informaes e servios providos pelo mesmo atendam as necessidades dos usurios. Para isso, ele deve atentar para informaes de cunho cientfico geradas por instituies de reconhecida excelncia pela comunidade cientfica. Estas instituies regulam e padronizam procedimentos no laboratrio, atualizando-as constantemente de acordo com novos conhecimentos. Assim, para que o laboratrio mantenha um bom nvel de excelncia, anlises peridicas devem ser realizadas atravs de consultas na literatura atualizada. Desta forma, fundamental que cada laboratrio planeje um programa de validao que contemple as necessidades locais. Para orientar a implantao deste programa, algumas diretrizes precisam ser seguidas, tais como as expostas nos prximos tpicos. 5.3. Determinao de um intervalo normal de referncia A fim de adequar a interpretao dos resultados dos testes de hemostasia, fundamental que se tenha informao sobre a populao normal (local). A seleo de indivduos saudveis para determinao de valores normais ser influenciada por consideraes prticas da rotina laboratorial local. Mais frequentemente, doadores de sangue ou funcionrios da instituio podem ser utilizados. A seguir, encontram-se algumas consideraes importantes para a determinao de um intervalo normal de referncia. Um valor de referncia normal dever ser sempre estabelecido localmente; literatura e informaes de bula devero ser usadas somente como um guia. Para realizao do tempo de protrombina (TP) e do TTPA possvel que um novo lote de reagente da mesma empresa tenha uma faixa de normalidade diferente do anterior. O controle de qualidade interno dever informar se houve alguma mudana, sendo que algumas delas podero indicar a necessidade de um novo valor de normalidade. O nmero de indivduos normais ideal para se estabilizar um valor de normalidade de 120. Porm, pela dificuldade de se obter este nmero de indivduos, os estatsticos recomendam uma populao de, no mnimo, 40 indivduos. Convencionalmente, o valor de referncia normal dever conter 95% dos valores obtidos resultando em uma curva Gaussiana de distribuio normal. Se esta distribuio for diferente, amostras adicionais devero ser includas Se a distribuio for normal, deve-se, ento, calcular a mdia e o desvio padro dos valores normais e usar como faixa de normalidade o resultado de 2 desvios padro para o limite inferior e superior. 5.4. Caractersticas de desempenho de uma rotina validada 5.4.1. Verificar a exatido Exatido a concordncia entre a melhor estimativa de uma quantidade e seu valor real. Assim, a inexatido expressa por uma diferena numrica entre a mdia de um conjunto de medies em replicata e o valor verdadeiro, estando, assim, associada ao erro sistemtico. A exatido um dado importante para correlacionar o resultado obtido no laboratrio com a clnica e obter uma investigao diagnstica adequada. Uma das formas de se avaliar a exatido atravs da participao do laboratrio em um programa

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de controle de qualidade externo, assunto este abordado com mais detalhes no captulo 6. 5.4.2. Determinar a preciso A preciso refere-se melhor concordncia encontrada em medidas repetidas. Esta concordncia pode ser verificada atravs do desvio padro ou coeficiente de variao, sendo que, quanto menor o desvio padro, maior a preciso. Esta verificao permite tomada de decises imediatas de liberao ou no de um resultado.

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5.4.3. Determinar a sensibilidade dos fatores da coagulao Os testes de TP e TTPA so considerados testes de triagem da coagulao. importante conhecer a sensibilidade destes testes na identificao da deficincia de diferentes fatores da coagulao. Um teste com pouca sensibilidade, ou seja, incapaz de identificar anormalidades pode gerar resultados inadequados que prejudicam a investigao das coagulopatias. A sensibilidade de um determinado reagente pode ser especfica para uso em um determinado equipamento ou para uso combinado com outros reagentes. Recomenda-se, assim, seguir alguns passos para esta verificao: Preparar diluies que avaliam diferentes nveis de concentraes do fator em estudo. Para isso, deve-se utilizar um plasma humano padro com concentrao conhecida como amostra, e um reagente de plasma deficiente no fator em questo, como diluente. Exemplo: fazer diluies com concentraes de 100%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% e 2,5%. Testar cada amostra em duplicata; Fazer uma curva correlacionando o resultado de TTPA ou TP obtido com a concentrao esperada. Identificar em qual ponto est o seu intervalo de referncia para o TTPA ou TP, que corresponder sensibilidade do seu reagente (Figura 1). Figura 1. Curva para deteco da sensibilidade de reagente

Abreviao: TTPA tempo de tromboplastina parcialmente ativado

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6. Implantao dos controles de qualidade interno e externo no Laboratrio de Hemostasia O termo garantia da qualidade pode ser usado para descrever todos os procedimentos que so realizados para assegurar a confiabilidade dos testes e anlises do laboratrio. Isso inclui a escolha do teste, a coleta de uma amostra, a obteno de um resultado de uma maneira correta, interpretao do resultado, e, quando apropriado, a comunicao destes resultados para o profissional requisitante. O controle de qualidade interno (CQI) e externo (CQE) so componentes distintos entre si, embora complementares, de um programa de qualidade. O CQI usado para padronizar uma srie de tcnicas e processos em realizao de acordo com um perodo de tempo. Assim, ele usado para garantir a consistncia de resultados dia aps dia no laboratrio. O CQE utilizado para identificar o grau de acordo entre os resultados de diferentes laboratrios. Desta forma, o CQI prope avaliar a preciso dos resultados atravs da sua reprodutibilidade e o CQE avalia a exatido deste mesmo resultado, uma vez, que resultados precisos no so necessariamente corretos ou exatos. Para isso, torna-se necessrio que o laboratrio tenha procedimentos definidos para esta avaliao, ou seja, no basta apenas usar controles normais e patolgicos, mas estabelecer e padronizar programas consistentes de qualidade (CQI e CQE) que avaliem a rotina constantemente e rotineiramente. Outro item to importante quanto os j descritos a padronizao dos processos envolvidos desde a solicitao mdica dos exames at a liberao do resultado. Todas as atividades do laboratrio devem ser documentadas atravs de instrues de trabalho ou procedimento operacionais padro (POP), aprovadas e colocadas a disposio do corpo tcnico e de apoio. Os POP so documentos que descrevem detalhadamente cada processo do laboratrio. Contudo, importante ressaltar que a instituio de um programa de qualidade envolve a construo de uma srie de processos, cada um com fontes potenciais de erro. Assim, recomenda-se considerar as seguintes etapas para sua implantao: (1) Etapa pranaltica, (2) Etapa analtica e (3) Etapa ps-analtica. O programa depender de um fluxo de rotinas prprias de cada laboratrio no havendo, assim, um protocolo pronto a seguir, ou seja, cada laboratrio dever propor seu prprio programa de qualidade que contemple os CQI e CQE. No entanto, h algumas recomendaes que devem ser utilizados como guia, para que o mesmo seja completo. 6.1. Controle de qualidade interno no Laboratrio de Hemostasia 6.1.1. Controle de qualidade na etapa pr-analtica 6.1.1.1. Coleta de amostras O procedimento de coleta de amostra foi descrito na sesso 4. No entanto, esto listados abaixo alguns exemplos de procedimentos para boa qualidade na coleta: Quando houver a necessidade de alterar o tubo de coleta quanto ao material ou fabricante, necessrio que sejam conduzidos no laboratrio estudos paralelos de validao. A diferena ou variabilidade atribuda aos diferentes tubos ou fabricantes pode no ser aparente para amostras com valores dentro do intervalo de referncia, mas pode variar quando valores prolongados so testados. 6.1.1.2. Transporte de amostra

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6.1.1.2.1. Transporte de amostra em rotina laboratorial O transporte de amostra de sangue total em gelo (2-8C) no recomendado para a maioria dos testes de coagulao que utilizam plasma, devido possibilidade de ativao dos fatores VII, VIII e FVW em baixas temperaturas, alm de provocar ativao Plaquetria. Idealmente, o transporte e o processamento das amostras no devem ultrapassar uma hora. No entanto, o tempo permitido de aceitabilidade de uma amostra depende do teste que ser realizado. Por exemplo, de acordo com a Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), para o teste de TP, permitido a anlise aps 24 horas sem comprometer o resultado com variaes clinicamente relevantes. muito importante que o laboratrio tenha documentado, para cada amostra, a data e horrio do envio e recebimento da amostra.

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6.1.1.2.2. Transporte de amostra de plasma para outra instituio As amostras devero ser centrifugadas, o plasma dever ser separado, acondicionado e enviado em gelo seco. As amostras devero chegar ao local de destino ainda congeladas. O procedimento de envio de amostra biolgica por via area dever respeitar as normas vigentes no pas. Vale lembrar que estas normas sofrem revises anuais e os procedimentos devem ser checados antes do envio. De acordo com o manual IATA (International Air Transport Association) - DGR (Dangerous Goods Regulations), as substncias (amostras e gelo seco) so consideradas produtos perigosos e seus embarques devem estar de acordo com as regulamentaes federais. O embarcador o responsvel legal e deve assegurar que as substncias esto apropriadamente identificadas, classificadas, marcadas, etiquetadas, documentadas e em condies para o transporte em conformidade com as regulamentaes. Ainda, deve-se comprovar que os produtos perigosos esto embalados em conformidade com todos os requerimentos aplicveis ao transporte areo. Preparo da embalagem Forrar o fundo da caixa de isopor com uma camada de gelo seco de aproximadamente 5 cm; Posicionar sobre esta camada de gelo seco os containeres fechados contendo os tubos com as amostras congeladas eqidistantes entre si e das paredes da caixa do isopor; IMPORTANTE: As condies de transporte areo (vibrao, temperatura e presso) podem provocar um efeito em substncias e embalagens que alteram o seu estado normal. Desta maneira, no se deve adicionar gelo seco no container de amostra e lacrlo. Esta substncia libera gases que so perigosos quando no houver local para ser extravasado podendo provocar exploses. Cubrir os racks com gelo seco, formando uma nova camada de gelo seco de aproximadamente 5 cm; Preencher o restante do espao da caixa com gelo seco de tal forma que no comprometa o fechamento da mesma; Encaixar a tampa da caixa de isopor e selar; Colocar na embalagem as informaes do remetente e destinatrio REMETENTE. (Nome da instituio / Endereo completo / Nome da pessoa responsvel pelo embarque e respectivo telefone) DESTINATRIO. (Nome da instituio / Endereo completo / Nome da pessoa responsvel pelo recebimento e respectivo telefone) Aplicar uma tira de fita adesiva no centro da caixa de papelo e uma em cada lateral; Identificar a rea externa da caixa com a numerao adequada disponvel para cada material transportado, de acordo com as especificaes da IATA; Entregar a embalagem preparada com os formulrios para a empresa de transportes. 6.1.1.3. Processamento e estocagem de amostra de plasma Quanto ao processamento da amostra de plasma, a centrifugao dever ser realizada a temperatura ambiente. No entanto, algumas centrfugas podem aumentar a temperatura interior no processo de centrifugao. Desta forma, recomenda-se a utilizao de centrfugas com monitoramento de temperatura. Quanto estocagem de amostras, de acordo com a Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) algumas consideraes de tempo e temperatura devem ser respeitadas (Tabela 2). No entanto, muitos laboratrios utilizam freezers domsticos, que no so

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adequados para laboratrio, devido a sua incapacidade em manter a temperatura a -20C aps a abertura da porta. Assim, a Federao Mundial de Hemofilia recomenda o no armazenamento de amostras de plasma a -20C devendo ser utilizado apenas freezers < -35 C ou -70 C .

Tabela 2. Tempo de estocagem de amostras para testes de coagulao Estocagem de amostras para testes de coagulao Estocagem com sangue total Teste TA 25C At 12 horas At 4 horas Refrigerado Congela do No No Alquota de plasma e processamento TA 25C At 24 horas 4 horas Refrigerad o No 4 horas Freezer - 20C 2 Semana s 2 Semana s Freezer - 70C 12 meses 12 meses

TP TTPA

No Desconheci do

TTPA para anlise de 1 hora Heparina no fracionad a TTPA (para anlise 4 horas de FVIII e FVW) Outros 4 horas

Desconheci do

No

4 horas

4 horas

+++ 2 +++ Semana Descos nhecido

No

No

4 horas 4 horas

4 horas

++++ 2 ++++ Semana 6 anos s Depende da anlise ver tabela anexo A-1

Desconheci do

No

4 horas

Adaptado de CSLI 5 edio 2008.

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Abreviaes: + Sangue total diretamente em gelo ou refrigerao mantida por banho de gelo; ++ Temperatura deve ser controlada; +++ Deve ser pobre em plaqueta; ++++ Deve ser bem homogeneizado antes do teste. Abreviaes: TA, temperatura ambiente; TP, tempo de Protrombina; TTPA, tempo de tromboplastina parcialmente ativado; FVIII, fator VIII; FvW, fator de von Willebrand. 6.1.2 Controle de qualidade na etapa analtica Consiste na anlise diria da amostra controle com valores dos analitos conhecidos para avaliar a preciso dos ensaios. Atravs do controle de qualidade na etapa analtica (CQI EA) pode-se avaliar o funcionamento confivel e eficiente dos procedimentos laboratoriais na gerao de resultados vlidos, que possam contribuir eficazmente no estabelecimento do diagnstico. Desta forma, ele tem a funo de garantir a reprodutibilidade (preciso), verificar a calibrao do sistema e indicar o momento de se promover aes corretivas quando surgir uma no conformidade. 6.1.2.1 Material para controle de qualidade Interno Com o objetivo de avaliar a preciso de um mtodo necessrio realizar anlise de alquotas de uma mesma amostra. importante incluir amostras de controle de qualidade com valores normal e anormal para assegurar que um mtodo controlado em diferentes nveis de resultados. O material de controle deve ser similar a amostra teste e deve ser analisado no mesmo tempo, utilizando a mesma metodologia. O material deve ser estvel para uso por um determinado perodo. Especificamente para testes de coagulao, o material de controle deve ser estocado a -80 C ou estar na forma liofilizada para no comprometer sua estabilidade e, por conseguinte, os resultados. O descongelamento deve ser realizado a 37 C por, no mximo, cinco minutos. Pelo menos um controle de qualidade deve ser includo em cada grupo de ensaio. Para testes de triagem (TP, TTPA e TT) deve-se incluir um controle normal e um controle anormal a cada incio de rotina ou a cada 8 horas para os laboratrios que funcionam 24 horas. Em todos os casos, o material controle deve ser tratado exatamente como a amostra. So quatro os tipos de materiais indicados como controle em um laboratrio de coagulao: Controle normal (origem comercial); Controle anormal (origem comercial); Pool de plasma normal (geralmente preparado no laboratrio, isto , in house) e Plasma de paciente pr-diagnosticado com uma coagulopatia. Os controles de origem comercial so teis devido estabilidade que apresentam por um determinado perodo, o que no atingido com o pool in house. Atravs da utilizao destes controles, possvel avaliar isoladamente o sistema equipamento/ reagente independentemente da variao da amostra. Por outro lado, o pool de plasma o controle normal mais prximo da amostra do paciente e, por isso, essencial a sua incluso no painel de controle do laboratrio. O material de um paciente com diagnstico comprovado de uma coagulopatia de valia, uma vez que uma fonte de informao diferente do controle anormal comercial. Por exemplo, no caso de um paciente com o diagnstico de hemofilia grave cujo nvel de fator menor que 1%, esta amostra auxilia a verificao da curva de calibrao em nveis no contemplados por controle comercial. importante salientar que a utilizao do controle normal e anormal comercial previsto como uma exigncia da ANVISA na RDC n 302 que normatiza procedimentos de laboratrio clnico.

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6.1.2.1.3. Limites de aceitabilidade e variao Os resultados dos controles so plotados em um grfico controle e comparado com os limites aceitveis de erro para aquele analito. Quando os valores encontrados na amostra controle esto dentro dos limites aceitveis, isto , dentro da mdia mais ou menos dois desvios-padro, conclui-se que o mtodo analtico est funcionando adequadamente. Por outro lado, quando os valores encontrados na amostra controle se esto fora dos limites aceitveis, isto , o valor encontrado ultrapassa a mdia mais ou menos dois desvios-padro, a equipe deve ser alertada para a possibilidade de problemas no processo, indicando que o mtodo analtico no est funcionando adequadamente. Atualmente, h vrios sistemas de controle para as variveis analticas. De uma maneira geral, o emprego destes sistemas muito til para sanar inmeros problemas que surgem na realizao de um exame de laboratrio. Um bom sistema de controle deve ter as seguintes caractersticas: Prever a avaliao do desempenho de mtodos, equipamentos e tcnicas. Os sistemas de controle de qualidade internos mais empregados so: Sistema de controle de Levey-Jennings Sistema de controle atravs das regras Westgard 2. Fornecer informaes sobre exatido e a preciso de cada mtodo; 3. Ter sensibilidade suficiente para detectar variaes nas diversas fases do ensaio; 4. Ser fcil de implantar, manter e interpretar e 5. Ser capaz de revelar os diversos tipos de erros ou variaes que possam ocorrer. As amostras para CQI comerciais so providas com bulas que fornecem um intervalo de resultado aceitvel. No entanto, os resultados obtidos so dependentes de reagentes e da maneira de deteco do mtodo. O intervalo de referncia dever demonstrar essas variaes e, desta forma, ser determinado por cada laboratrio, sendo a bula do controle utilizado apenas como um guia. De acordo com a Federao mundial de Hemofilia (FMH) o CV% dos resultados em diferentes dias para TP e TTPA deve ser menor que 8% e, preferencialmente, mais baixo. Para os outros ensaios, tal como dosagem de fatores da coagulao, o CV% pode chegar a 10%. 6.1.3. Controle de qualidade na etapa ps-analtica Os processos ps-analticos consistem nas etapas executadas aps a realizao do exame. Estes so: clculo de resultado, anlise da consistncia de resultados, liberao dos laudos, armazenamento de material, transmisso e arquivamento de resultados. Um exemplo deste tipo de anlise a avaliao de paralelismo de curvas (padro, controle e paciente) na realizao da dosagem de fatores de coagulao, explanado no captulo 9. 6.2. Controle de qualidade externo no laboratrio de hemostasia O CQE considerado um controle interlaboratorial. Consiste na comparao da exatido dos exames de um laboratrio com os de outros. O CQE visa padronizar os resultados de laboratrios diferentes atravs da comparao interlaboratorial de anlises de alquotas do mesmo material. Em um programa de CQE abrangente, anlises respectivas dos resultados obtidos por laboratrios participantes permitem, no somente a identificao do laboratrio com resultado discordante, mas tambm a anlise de todos os reagentes e mtodos inadequados que o laboratrio possa possuir em sua rotina. Com a participao efetiva neste programa o laboratrio pode assegurar que os seus resultados se aproximam o mximo possvel do valor real (exatido) dentro de uma variedade analtica permitida. No CQE, os laboratrios participantes analisam amostrascontrole de concentraes desconhecidas que lhes so enviadas pelo programa. Aps a

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anlise, o programa recebe os resultados dos participantes, separa-os por grupo de metodologias e reagentes iguais (quando possvel), determina a mdia de consenso de cada grupo e calcula o respectivo desvio-padro. Por ltimo, realizada uma avaliao dos resultados de cada laboratrio e emitido ao participante um conceito, de aceitabilidade ou no. A principal funo do CQE testar a competncia individual do laboratrio. A participao contnua no programa est relacionada com um melhor desempenho individual, assim como a uma menor variabilidade dos resultados. H muitas razes possveis para um laboratrio produzir um resultado insatisfatrio, podendo o(s) fator(es) responsvel(is) ser imediatamente identificado(s). Por outro lado, a identificao de problemas latentes nem sempre bvia. Grandes programas so capazes de identificar alteraes no desempenho dos testes, os quais so relativamente especficos para problemas em reagentes ou metodologia utilizados. A total confidencialidade dos resultados deve ser uma importante caracterstica do programa.

7. Preparao e calibrao de Pool de plasma normal 7.1. Coleta e preparao do pool O pool local poder ser preparado coletando-se sangue de 20 a 40 pessoas sadias e que no tenham usado nenhuma medicao que possa interferir com os fatores da coagulao nos ltimos 10 dias. importante salientar que o nmero de doadores para composio do pool deve representar a distribuio normal obtida, por isso recomendase que quanto maior o nmero de doadores, melhor qualidade tem o pool. Para que se obtenha uma distribuio homognea, o ideal que se tenha um nmero semelhante de homens e mulheres com idade entre 20 e 50 anos. Materiais Tubos plsticos com anticoagulante citrato de sdio a 3,2%; Frascos Erlenmeyer ou becker plstico; Tromboplastina clcica; Cefalina; Cloreto de clcio 0,025 M. Tubos de hemlise (12 x 75 mm) Micropipetas automticas; Banho-maria a 37 C; Microtubos plsticos com tampa; Caixa para armazenamento em Freezer; Banho de gelo. Recomenda-se que todo o procedimento, desde a coleta at o congelamento, no exceda quatro horas. Aps a centrifugao a 3000 rpm por 15 minutos para obteno de plasma pobre em plaqueta (PPP), deve-se proceder ao processamento, sem demora, do TP e TTP de todas as amostras para verificar se os resultados se encontram dentro da faixa de normalidade estabelecida pelo laboratrio. As amostras, cujos resultados estiverem fora desta faixa devero ser descartadas, no devendo ser utilizadas para a preparao do pool. Deve-se observar, ainda, a presena de hemlise ou lipemia, devendo ser excludos os plasmas lipmicos e/ou hemolisados. Durante a preparao, manter as

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amostras de plasma em gelo. A seguir, deve-se pipetar a mesma quantidade de plasma de cada amostra coletada, mistur-los em recipiente de plstico grande, homogeneizar bem, evitando a formao de bolhas e, em seguida, testar a mistura para os testes de TP e TTPA. O valor obtido do pool de plasma normal deve ser anotado e utilizado como parmetro de CQI em ensaios posteriores. Para uso na rotina laboratorial, alquotas mnimas de 0,5 ml a 1,0 ml devem ser preparadas e acondicionadas em microtubos plsticos tipo eppendorf com tampa. Estes tubos devem ser identificados com data de realizao e o nome do tcnico que preparou o pool. Deve-se proceder ao congelamento rpido das alquotas, seguidas de armazenamento em estantes identificadas coma sigla PPN. Uma vez descongelada para uso, a alquota de pool no poder ser utilizada novamente. A validade do pool varia de acordo com as condies de armazenamento; por seis meses e trs meses, se armazenadas a - 80 C e -35 C, respectivamente. 7.1.1. Preparo do pool de inibidor de fator VIII pela tcnica de Nijmegen Bethesda modificada O mtodo de Bethesda com a modificao de Nijmegen a tcnica de escolha para a realizao do teste de quantificao de inibidor. Para realizao desta tcnica, recomenda-se o preparo de um PPN especifico que tenha uma estabilidade melhor, uma vez que, esta tcnica exige condio de temperatura diferenciada. Deve-se utilizar tubos para coleta contendo o anticoagulante citrato de sdio 0.109 M (3,2%) previamente tamponado com imidazol slido na seguinte proporo: a cada 25 ml da soluo de citrato de sdio 0,109 M adicionar 1,7g de imidazol slido. Essa modificao aumenta a sensibilidade e especificidade do teste. Para evitar resultados falso-positivos importante assegurar que o pool tenha cerca de 100% de fator VIII. Materiais Tubos para coletacom anticoagulante citrato de sdio a 3,2%; Imidazol slido, C3H4N2 Rolhas de borracha siliconadas; Tubo de hemlise; Pipetas automticas Outra forma de preparar este pool atravs da adio de tampo imidazol slido na concentrao de 0,1 M ao pool j preparado, ajustando o pH por adio lenta de 1N HCl, em agitao constante a 4o C. 7.1.2. Calibrao do pool A obteno do pool de doadores de sangue baseia-se na necessidade de se ter um plasma referncia representativo da populao local para uso como calibrador na rotina do laboratrio de hemostasia. Poder ser utilizado como controle normal e para realizao das curvas de calibrao de TP, fibrinognio e dosagem de fatores. Uma mistura preparada seguindo a tcnica descrita acima, de forma correta, tem concentrao de aproximadamente 100 U/dl (100%) ou 1 U/ml para os fatores II, V, VII, IX, X, XI e XII. J para os fatores VIII e FVW, a concentrao obtida varivel, no podendo, assim, assumir concentrao de 100 U/dl. Desta forma, no recomendada sua utilizao para calibrao do fator VIII e FVW. Objetivando padronizar mundialmente as substncias utilizadas para diagnstico das coagulopatias, a Organizao Mundial de Sade possui preparaes-padro, (OMS International Biological Reference National Institute for Biological and Control
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NIBISC) com concentraes conhecidas e unidades padronizadas. H fornecedores que utilizam estas preparaes como referncia para preparo de calibradores e controles comerciais. Portanto, quando no h disponibilidade de calibrador comercial para realizar uma curva de referncia recomenda-se a calibrao do pool com preparaes de referncia (NIBISC).

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8. Testes de triagem 8.1. Tempo de protrombina O TP avalia as via extrnseca e comum da coagulao. dependente da integridade dos fatores VII, V, II, e X. O teste consiste na adio de tromboplastina (fator tecidual) e posterior mensurao do tempo de cogulo. O fator tecidual ativa o fator VII, ativando a via extrnseca, formando o complexo protrombinase ancorado pela tromboplastina, que culmina na gerao de trombina. Esta atua na molcula do fibrinognio, formando a fibrina, que ser estabilizada pelo fator XIII. Um TP prolongado pode indicar deficincias hereditrias, principalmente do fator VII ou adquiridas, como deficincia de vitamina K, doena heptica, coagulao intravascular disseminada ou uso de medicamentos. o teste de escolha para monitorizar o uso de anticoagulantes orais antivitamina K. O TP mais sensvel deficincia do fator VII e tem menor sensibilidade aos fatores da via comum e para deficincia de fibrinognio. A tromboplastina ou fator tecidual pode ser extrado de tecido cerebral humano, de porco ou coelho. Atualmente, fator tecidual recombinante vem sendo cada vez mais utilizado, e o TP mensurado com essa tromboplastina parece ser mais confivel na identificao de variantes de deficincia de fator VII. A origem da tromboplastina interfere na sua sensibilidade, por isso os resultados de um TP do mesmo paciente na mesma amostra podem variar de um laboratrio para outro. Em funo disso, criou-se uma tromboplastina padro. Conforme ser explicado adiante, os reagentes para TP devem ser comparados tromboplastina padro, e essa comparao chamada de ndice de Sensibilidade Internacional ISI. Materiais e Reagentes Tubos de ensaio de vidro 12 x 75 mm Tromboplastina clcica Micropipetas automticas (100 a 200 l) Cronmetro Banho-maria 37C Soluo salina Procedimento Incubar a 37 C por 60 segundos 100 l de plasma citratado pobre em plaquetas (PPP); Adicionar 200 l de tromboplastina clcica pr-aquecida a 37C Cronometrar o tempo de coagulao. As provas devero ser realizadas em duplicata. 8.1.1 Curva de calibrao para tempo de protrombina A cada mudana de lote ou marca do reagente necessrio realizar a curva de calibrao, para que se calcule a atividade enzimtica a partir da diluio seriada de um plasma calibrador conhecido. Deve-se fazer diluies do calibrador em tampo utilizando tubos plsticos e testar para obteno do tempo em segundos, conforme Tabela 3: Tabela 3. Modelo para construo de curva de calibrao do tempo de protrombina Atividade enzimtica (%) Diluio do calibrador 100 Puro

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50 25 12,5 6,25

1:2 1:4 1:8 1:16

Os tempos de coagulao de cada diluio so relacionados graficamente com as respectivas atividades percentuais, em escala mono-log. Para validar a curva, deve-se testar um plasma controle normal e anormal (controles internos) conhecidos. 8.1.2. Relao Normatizada Internacional A RNI foi instituda pela Organizao Mundial de Sade para padronizar as diferenas de resultados de TP entre os vrios laboratrios. Essas diferenas ocorrem devido diferena de mtodos, aparelhos e tromboplastinas. Todos os fabricantes de tromboplastina devem determinar o ISI mediante a padronizao de sua tromboplastina frente a uma tromboplastina de referncia internacional (International Reference Preparation) proveniente de crebro humano, que define a sensibilidade do reagente. Quanto mais prximo de 1,0 for o ISI, mais sensvel a tromboplastina. O clculo do RNI feito de acordo com a seguinte frmula: RNI = [TP do paciente/TP normal (mdia do valor de referncia)] ISI Os resultados do TP podem ser reportados em tempo de protrombina, atividade enzimtica (%) e RNI. O valor de referncia para o TP varia de acordo com o reagente utilizado. Um tempo de protrombina alargado est relacionado com uso de medicamentos, hepatopatias ou deficincia de fator VII, principalmente. Como j mencionado, o TP pouco sensvel deficincia de fibrinognio. Entretanto, na hipofibrinogenemia grave (abaixo de 100 mg/dl de fibrinognio) e na afibrinogenemia (ausncia de fibrinognio), o TP encontra-se alargado e incoagulvel, respectivamente. O teste da mistura (com pool de plasma normal na proporo 1:2) deve ser realizado para identificar se o prolongamento ocorre por deficincia de fator ou presena de inibidor. Se houver correo do TP, deve-se determinar o fator VII inicialmente. Caso sua dosagem esteja normal, deve-se avaliar o resultado do TTPA e ento testar, os fatores V, II ou X de acordo com a clnica do paciente. No havendo correo do TP na mistura, deve-se fazer a pesquisa de inibidores dirigidos contra fatores da via extrnseca e comum. Os inibidores de fator VII so raros. 8.2. Tempo de tromboplastina parcial ativada O TTPA o teste de triagem para a avaliao dos fatores das vias intrnseca e comum da coagulao. Detecta as deficincias dos fatores VIII, IX, XI e XII, precalicrena e cininognio de alto peso molecular. Dependendo da sensibilidade do reagente, o TTPA pode ser mais sensvel s deficincias de fator VIII e IX, e menos sensvel s deficincias dos fatores XI e XII ou dos fatores envolvidos na via comum. usado como teste de triagem para deficincias de fator, presena de inibidores e para monitorar o uso da heparina no fracionada.

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Quando uma mistura de plasma e fosfolipdeo (substituto da plaqueta) recalcificada, a fibrina formada a uma velocidade normal que depende dos fatores envolvidos na via intrnseca (pr-calicrena, cininognio de alto peso molecular, fatores VIII, IX, XI e XII) e na via comum (fatores X e V, protrombina e fibrinognio). O TTPA realizado por adio de tromboplastina parcial, a cefalina, que uma substncia carregada negativamente e um ativador da via intrnseca. O cloreto de clcio adicionado e o tempo necessrio para formar o cogulo medido. A tromboplastina parcial utilizada no TTPA incapaz de ativar a via extrnseca, que requer tromboplastina completa, isto , o fator tecidual. Por conseqncia, este teste faz um bypass na via extrnseca, no sendo afetado pela deficincia de fator VII. No caso de controle de heparinoterapia no fracionada, importante realizar o teste o mais rpido possvel (em at 1 hora) aps a coleta, para evitar a neutralizao heparina pelo fator plaquetrio 4. Materiais e Reagentes Tubos de vidro 12 x 75 mm Micropipeta automtica (100 l) Cefalina contendo um ativador (slica, caolim, cido elgico, etc) Cloreto de clcio 0,025 M Cronmetro Banho-maria a 37C Procedimento 100 l do plasma teste 100 l de cefalina ativada Incubar a mistura a 37C por 3 minutos 100 l de cloreto de clcio 0,025 M pr-aquecida a 37 C Cronometrar o tempo de coagulao As provas devero ser realizadas em duplicata Resultados: Os resultados so relacionados em tempo (em segundos) erelao TTPA paciente/TTPA mdia do valor de referncia. Um TTPA prolongado com um TP normal indica uma possvel deficincia dos fatores VIII, IX, XI, XII, cininognio de alto peso molecular, precalicrena ou a presena de um inibidor da via intrnseca. Nesses casos, uma mistura de plasma normal e plasma teste dever ser feita (1 parte de plasma teste + 1 parte de plasma normal, v/v). Caso haja correo de mais de 50% da diferena existente entre os tempos de coagulao do plasma-teste e da misturas sugere-se a deficincia de um fator. Caso contrrio, mediante a ausncia de correo, isto sugere a presena de um inibidor de um dos fatores da coagulao, ou do tipo no especfico, tal como um anticoagulante lpico. O clculo para a interpretao dos resultados est descrito no captulo 9. O TTPA deve ter sensibilidade para detectar deficincias de fator. Entretanto, a sensibilidade reagente-dependente e certos reagentes podem no detectar deficincias moderadas de fator. Portanto, a escolha do reagente para TTPA deve ser feita cuidadosamente, uma vez que existem no mercado diversos tipos de cefalinas, com diferentes sensibilidades a heparina, s deficincias de fator e a presena de anticorpo lpico. Alm disso, a fosfatidilserina e fosfatidilinositol so importantes na composio da cefalina. Ainda, tem sido descrito uma melhor sensibilidade do ativador slica para deteco da deficincia de fatores da coagulao em relao ao cido elgico.

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Adicionalmente, quando se avalia novos lotes de reagentes de coagulao, importante determinar seu nvel de sensibilidade para detectar deficincias de protenas da coagulao, tal como descrito no captulo 5. 8.3. Tempo de Trombina O TT avalia o tempo de coagulao do plasma citratado na presena de trombina, permitindo testar a converso de fibrinognio a fibrina. A trombina adicionada ao plasma-teste para determinar o tempo de formao do cogulo. O tempo de coagulao, aps a adio de trombina do plasma, inversamente proporcional a concentrao de fibrinognio plasmtica. O TT avalia diretamente o fibrinognio funcional, sendo utilizado para investigar defeitos na molcula do fibrinognio. Est prolongado na presena de heparina, em altas concentraes de imunoglobulinas (por exemplo, na macroglobulinemia de Waldenstrom), nas disfibrinogenemias, na hipofibrinogenemia, estando incoagulvel na afibrinogenemia. O TT para uso clnico deve ter concentrao de trombina de aproximadamente 4 U/ml para que se obtenha um tempo normal de cerca de 20 segundos. Assim, o teste ter sensibilidade suficiente para detectar anormalidades leves do fibrinognio. Material e reagentes Tubos de vidro 12 x 75 mm Soluo fisiolgica Trombina 4 U/ml (humana ou bovina) Micropipetas automticas (100 l e 200 l) Cronmetro Banho-maria a 37 C Tcnica 200 l do plasma teste Incubar a 37 C por 60 segundos Adicionar 100 l da trombina Cronometrar o tempo de coagulao As provas devero ser realizadas em duplicata Obs.: A soluo me de trombina pode ser mantida congelada, mas a soluo de trabalho deve ser descartada aps uso. O TT um teste de alta sensibilidade presena de heparina, sendo utilizado para deteco de heparina no fracionada contaminante de amostras colhidas de cateter de longa permanncia, mantidos com heparina. Neste caso, o TT incoagulvel e o TTPA prolongado, devendo ser feita nova coleta, de preferncia com coleta em stio distante do vaso cateterizado. Avaliao clnica dos testes de triagem O conhecimento sobre o princpio do teste, sua aplicao e resultado auxilia sugerir o diagnstico. Por exemplo, se um paciente tem apenas TTPA prolongado, tem histria de sangramento e do sexo masculino, o diagnstico diferencial em ordem decrescente deve incluir deficincia dos fatores VIII, IX e XI. Os fatores da via intrnseca que prolongam o TTPA, mas no esto relacionados com histria de sangramentos so o fator XII, precalicrena, e cininognio de alto peso molecular. As deficincias dos fatores da via extrnseca e comum, quando muito graves, se associam a prolongamento tambm do TTPA, como por exemplo, na afibrinogenemia (Tabela 4).

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Tabela 4. Interpretao de testes de triagem TTPA anormal isoladamente Associado com sangramento: deficincia dos fatores VIII, IX e XI. No associado com sangramento: deficincia de fator XII, pr-calicrena, cininognio de alto peso molecular e anticorpo lpico. TP anormal isoladamente Deficincia de fator VII TP e TTPA anormais Anticoagulantes, coagulao intravascular disseminada, deficincia de vitamina K, transfuso macia Afibrinogenemias, deficincias de fatores X, V e II.

9. Diagnstico Laboratorial das coagulopatias hereditrias: 9.1. Doena de von Willebrand 9.1.1. Introduo O FVW uma protena de adeso, sintetizado pelas clulas endoteliais e megacaricitos. Est presente no plasma, subendotlio e nos grnulos das plaquetas em forma de oligmeros contendo um nmero varivel de subunidades. A primeira das trs funes conhecidas do FVW na hemostasia de se ligar s estruturas expostas do sub-endotlio e, subseqentemente, s plaquetas, atravs do complexo de receptores plaquetrios GPIb-IX-V. Essa interao inicia a hemostasia primria, principalmente em condies de alto fluxo vascular (alta fora de cisalhamento). A segunda funo a ligao entre as plaquetas (agregao plaquetria) atravs dos receptores GPIIb-IIIa plaquetrios, tambm em condies de alta fora de cisalhamento. Alm disso, o FVW participa da hemostasia secundria, transportando o fator VIII na circulao, que quando livre rapidamente inativado. A doena de von Willebrand (DVW) a doena hemorrgica hereditria mais freqente e apresenta diferentes expresses fenotpicas com sinais e sintomas de intensidade varivel. Em 1993, Sadler, baseado em estudos de mutao gentica, classificou a doena em dois grandes grupos: doena resultante de alterao quantitativa e qualitativa. Alterao quantitativa tipo 1: a mais freqente, sendo caracterizada pela deficincia parcial do FVW. Esses pacientes podem apresentar sangramento de intensidade leve a moderada. Este fentipo heterogneo se deve a existncia de 3 subtipos: tipo 1 plaqueta normal, que se apresenta com quantidade e funo normais de FVW intraplaquetrio; tipo 1 plaqueta baixa, que se apresenta com reduo da quantidade do FVW, mas com funo normal e o tipo 1 plaqueta discordante, que se apresenta com quantidade normal de FVW e funo diminuda. Alterao quantitativa tipo 3: caracterizada por nveis plasmticos e plaquetrios indetectveis do FVW, o que ocasiona manifestaes hemorrgicas graves. Alterao qualitativa tipo 2: esta se subdivide em subtipo 2A que apresenta reduo da funo dependente de plaquetas, associada ausncia dos multmeros intermedirios e de alto peso molecular; subtipo 2B que se apresenta com maior afinidade pela GPIb plaquetria e ausncia dos multmeros de alto peso molecular; subtipo 2M que se

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apresenta com reduo da funo dependente de plaquetas no devido a ausncia de multmero de alto peso molecular e subtipo 2N (ou Normandy) que se apresenta com menor afinidade do FVW pelo fator VIII. Algumas disfunes plaquetrias assemelham-se DVW, como por exemplo, a DVW do tipo plaquetrio ou pseudo DVW. Trata-se de uma alterao da glicoprotena plaquetria Ib com grande afinidade pelo FVW. 9.1.2. Manifestaes Clnicas As formas mais leves da DVW so, na maioria das vezes assintomticas, podendo se apresentar com sangramento muco-cutneo tais como equimose, epistaxe, gengivorragia e menorragia. Por outro lado, as formas mais graves (DVW tipo 3) cursam com quantidade de fator VIII bastante reduzida, e, conseqentemente, podem apresentar sangramentos internos, dentre os quais hemartroses e hematomas intramusculares, manifestaes estas semelhantes hemofilia grave. A DVW pode ser adquirida, podendo, neste caso, estar associada a outras doenas, tais como mieloma mltiplo, linfoma no Hodgkin, doenas mieloproliferativas, gamopatias monoclonais, lpus eritematoso sistmico, outras doenas autoimunes ou idioptica. A DVW adquirida rara. 9.1.3. Diagnstico O diagnstico de DVW geralmente realizado em 3 etapas: (i) identificao do paciente com possvel DVW, baseado na histria clnica e em testes laboratoriais; (ii) diagnstico e definio do tipo de DVW e (iii) caracterizao do subtipo da doena (Figura 2). 9.1.4 Testes laboratoriais Os testes laboratoriais necessrios para o diagnstico da DVW so divididos em: Testes de triagem - Tempo de sangramento (TS) - Contagem de plaquetas - TTPA Testes confirmatrios - Determinao do fator VIII:C - Determinao plasmtica do FVW antgeno (FVW:Ag) - Determinao da atividade do FVW (FVW:RCo) - Ligao do FVW ao Colgeno (FVW:CB) Testes especiais - Agregao plaquetria induzida pela ristocetina (RIPA) - Capacidade de ligao ao FVIII (FVW:FVIIIB) - Anlise multimrica do FVW Figura 2. Fluxograma para interpretao dos testes para diagnstico da doena de von Willebrand

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Adaptado do Manual de diagnstico e tratamento da doena de von Willebrand, Ministrio da Sade, 2006. Abreviaes: FVW:Ag, fator de von Willebrand antgeno; FVW:RCof, cofator de ristocetina; FVIII:C, fator VIII coagulante; FVW:RCof/FVW:Ag, relao da atividade do fator de ristocetina e fator de von Willebrand antgeno; FVW:VIII, teste de ligao do fator VIII:C ao fator de von Willebrand; FVW:CB, ligao do fator de von Willebrand ao colgeno; RIPA, agregao plaquetria com ristocetina; MAPM, multmero de alto peso molecular; N, normal;,diminudo; , muito diminudo; , aumentado 9.1.4.1. Testes de triagem A investigao laboratorial da DVW tem incio com os seguintes testes de triagem: TS, contagem de plaquetas e o teste de anlise de funo plaquetria. Muitos centros europeus e americanos abandonaram o TS, substituindo-o pelo teste de anlise da funo plaquetria atravs do emprego do analisador de funo plaquetria, que um equipamento, que simula, in vitro, a alta fora de cisalhamento do vaso. Este apresenta maior sensibilidade, principalmente para o diagnstico da DVW. No Brasil, a disponibilidade deste equipamento recente e devido ao seu alto custo, poucos centros o utilizam. 9.1.4.1.1. Tempo de sangramento O TS um teste laboratorial realizado in vivo que avalia a funo hemosttica das plaquetas, vasos e FVW. O TS se refere ao tempo de durao do sangramento de uma pequena inciso provocada com o auxlio de uma lanceta. H duas tcnicas comumente utilizadas, a primeira foi desenvolvida por Duke, sendo posteriormente modificada por Ivy e colaboradores atravs da introduo do esfignomanmetro para manuteno da presso arterial a 40 mm de Hg durante o teste.

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Mais tarde, uma empresa farmacutica desenvolveu um dispositivo com tamanho e profundidade de inciso padronizados (Ivy modificado). Infelizmente, a maioria dos laboratrios no Brasil utiliza o TS pelo mtodo de Duke, devido ao alto custo do dispositivo mencionado. Tempo de sangramento de Ivy modificado O teste realizado na regio anterior do antebrao Material Algodo em lcool 70% Esfigomomanmetro Papel de filtro Dispositivo estril e descartvel para a inciso (que permite inciso de 1 mm de profundidade para adulto e 0.5 mm de profundidade para crianas abaixo de 9 anos de idade) Cronmetro Procedimento Com o auxlio do esfingomanmetro aplicada uma presso constante de 30 mm Hg em crianas e 40 mm Hg em adultos. Aps assepsia da regio anterior do antebrao, feita uma inciso padronizada quatro dedos abaixo da prega do cotovelo atravs de um dispositivo descartvel, sendo, ento, o cronmetro imediatamente acionado. A cada 30 segundos o sangue liberado deve ser absorvido com o papel de filtro sem que este entre em contato com a inciso. O teste dever ser controlado no mximo at 15 minutos. Caso o sangramento no pare, o teste deve ser interrompido, o local comprimido com uma gaze seca e o resultado reportado como superior a 15 minutos. O valor normal depende do dispositivo utilizado. Interpretao O TS prolongado reflete as alteraes quantitativas e/ou qualitativas das plaquetas, vasos e do FVW. Apesar da tcnica de Ivy modificada ser mais sensvel quando comparada de Duke, aquela no reprodutvel, sendo pouco sensvel para o diagnstico de disfunes leves a moderadas. No caso da DVW, o teste no deve ser utilizado para diagnstico, podendo apresentar resultados normais ou prolongados, uma vez que dependente do FVW intraplaquetrio. Quanto ao teste realizado em analisadores de funo plaquetria, os resultados so anormais na maioria dos pacientes com DVW, exceto no subtipo 2N. Porm, pacientes com o tipo 1 leve e moderado e tipo 2 podem apresentar resultados normais. 9.1.4.1.2. Contagem de plaquetas A contagem de plaquetas por mtodo manual ou automatizado auxilia no diagnstico de plaquetopenia que pode ocorrer na DVW do subtipo 2B. Contagem de plaquetas por mtodo manual Coleta O sangue para a contagem de plaquetas deve ser colhido preferencialmente em EDTA. Em casos de suspeita de pseudo-plaquetopenia, o sangue deve ser colhido tambm em citrato de sdio 3.2% e ao resultado devem ser acrescidos 10% ao nmero de plaquetas obtido. importante ressaltar que a agregao plaquetria in vitro, causa da pseudoplaquetopenia, pode ser minimizada ou abolida em amostras colhidas em EDTA, quando processadas imediatamente aps a coleta.

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Soluo de lise e diluio Oxalato de amnio 1% Oxalato de amnio ----------- 10 g gua destilada q.s.p. -------- 1000 ml Aps a solubilizao completa, a soluo deve ser filtrada para a retirada de qualquer resduo que possa interferir na contagem. A soluo pode ser mantida em geladeira por at 2 meses. Essa soluo facilita a contagem de plaquetas em cmara de Neubauer por deixar a membrana da plaqueta brilhante, diferenciando-a de outras partculas. Procedimento Aspirar 100 l de sangue com pipeta automtica, enxugando a ponteira, sem absorver o sangue do interior da ponteira Dispensar o volume no tubo plstico contendo 1,9 ml de oxalato de amnio 1% Tampar o tubo e homogeneizar o sangue diludo 5 vezes e aguardar 10 minutos para a hemlise completa Preparar a cmara de Neubauer. A lamnula deve ficar totalmente fixada na cmara. Aps 10 minutos da lise, preencher a cmara com o material, sem permitir a formao de bolhas ou extravasamento do lquido para fora da lamnula Deixar a lamina em repouso por 10 minutos para a sedimentao das plaquetas em cmara mida, que pode ser realizado utilizando recipiente fechado com bolas de gaze umidecidas Fazer contagem das palquetas presentes em 5 dos 25 quadrantes centrais (mesmo local de contagem de hemcias e plaquetas). Se nmero de plaquetas for abaixo de 10.000/mm3, as plaquetas presentes nos 25 campos devem ser contadas. Valor normal: 150.000 450.000/mm3 Interpretao Geralmente, o nmero de plaquetas na DVW normal, com exceo do subtipo 2B que pode apresentar plaquetopenia leve. 9.1.4.1.3 Tempo de tromboplastina parcial ativado O TTPA o teste de triagem dos fatores da via intrnseca da coagulao. utilizado como teste de triagem na DVW por ser sensvel a diminuio do fator VIII. Nos tipos e subtipos da doena que cursam com nveis reduzidos do FVW detectado o prolongamento do teste. A tcnica de execuo do TTPA foi descrita no captulo 8.2. Interpretao Na DVW, o TTPA pode estar normal ou prolongado, o que depende dos nveis plasmticos de fator VIII:C. Nas formas mais graves do tipo 1, tipo 3 e subtipo 2N ocorre o prolongamento do teste. 9.1.4.2. Testes confirmatrios 9.1.4.2.1 Determinao da atividade do fator VIII Usualmente a determinao do fator VIII:C realizada pelo mtodo coagulomtrico de um estgio baseado na gerao de trombina induzida por adio de cefalina ativada (TTPA). Este mtodo descrito na sesso 9.2.1.2.

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Interpretao Na DVW tipo 3, os nveis plasmticos do fator VIII:C so de 1% a 5% devido a grande reduo ou ausncia da sua protena transportadora. J na DVW tipo1, os nveis de fator VIII:C so ligeiramente mais elevados em relao ao FVW:Ag, podendo ser normais. No tipo 2 (exceto o tipo 2N com fator VIII:C diminudo), os nveis de fator VIII:C so duas a trs vezes maior que a atividade do FVW. 9.1.4.2.2 Determinao do antgeno do fator de von Willebrand A determinao da concentrao plasmtica do FVW:Ag essencial para o diagnstico da DVW. A determinao deve ser acurada, caso contrrio, a distino entre defeitos quantitativos e qualitativos torna-se praticamente impossvel. Atualmente, diferentes mtodos imunolgicos esto disponveis, porm com diferentes sensibilidade e especificidade. O mtodo de eletroimunodifuso foi o primeiro a ser desenvolvido. Brevemente, seu mtodo envolve a adio de gel de agarose a 1% contendo anticorpo anti-FVW a uma placa de vidro. Posteriormente, um pequeno volume de plasma calibrador em vrias diluies e de plasmas testes adicionado nos orifcios feitos no gel de agarose. A placa submetida a uma corrente eltrica e com a migrao do FVW ocorre a precipitao antgeno-anticorpo. Formam-se picos, que so visualizados atravs de corantes especficos de protenas, cuja altura diretamente proporcional concentrao do antgeno na amostra. Apesar de ser um mtodo simples, ele foi substitudo por outros mtodos mais sensveis e melhor padronizados, tal como o mtodo de ELISA. Recentemente, foram desenvolvidos mtodos automatizados com base em aglutinao com partculas de ltex (LIA). Segundo Budde, o LIA apresenta sensibilidade e especificidade comparveis ao mtodo ELISA. Alm de rpida determinao, possibilita, ainda, a avaliao de uma nica amostra em situao de urgncia. De acordo com estudos realizados em laboratrios europeus, americanos e asiticos, comparando-se os diferentes mtodos de quantificao do FVW:Ag, o mtodo de eletroimunodifuso apresenta grande variao dos resultados e pouca sensibilidade a baixos nveis do FVW quando comparado ao mtodo ELISA. Esses fatores tambm foram encontrados no mtodo que utiliza partculas de ltex, alm da interferncia do fator reumatide. O mtodo ELISA foi considerado o mais sensvel e com baixa variabilidade entre os ensaios, tanto os desenvolvidos in house quanto os comerciais. Porm, a confiabilidade dos resultados dependente da procedncia dos reagentes utilizados e, principalmente, da curva de calibrao. O Comit Internacional de Hemofilia e Doena de von Willebrand recomenda a utilizao do plasma referncia da Organizao Mundial de Sade por apresentar nveis acurados no somente do FVW, mas tambm de fator VIII:C, cofator de ristocetina e ligao FVW-colgeno. Mtodo ELISA Princpio Consiste da reao do anticorpo capturante (anticorpo especfico anti-FVW) e um segundo anticorpo ligado enzima peroxidase (anticorpo secundrio). Quando o complexo equimolar anticorpo capturante antgeno anticorpo secundrio formado na presena de um substrato especfico, ocorre o desenvolvimento de cor que diretamente proporcional concentrao do antgeno. Materiais e reagentes microplacas de 96 orifcios

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micropipeta automtica de 12 canais (100 l) micropipeta automtica de 100 l lavadora de microplaca de ELISA leitora de microplaca de ELISA com filtro 492 nm anticorpo de coelho policlonal anti-von Willebrand humano anticorpo de coelho anti- von Willebrand humano conjugado com peroxidase albumina de soro bovino (BSA) Tabela 5. Preparo de solues para o teste FvW:Ag Preparo das solues para FvW:Ag Tampo de sensibilizao da microplaca de ELISA (pH 9.6) Soluo A Bicarbonato de sdio Na2CO3 0.43 g Carbonato de sdio NaHCO3 0.72 g gua H2O q.s.p. 250 ml Tampo de lavagem Soluo B TRIS 4.85 g Cloreto de sdio NaCl 11.68 g Solubilizar os sais em 1 litro de gua H2O destilada Adicionar cido clordrico HCl concentrado at pH 7.4 Tween 20 2 ml gua H2O q.s.p. 2 litros Tampo de revestimento Soluo C TRIS 1.21 g Cloreto de sdio NaCl 2.92 g Soro de albumina bovina BSA 25 g Adicionar cido clordrico HCl concentrado at pH 7.4 gua H2O q.s.p. 500 ml Tampo de diluio (amostras e plasma padro) (10 vezes concentrado) Soluo D TRISMA base 4.84 g Cloreto de sdio NaCl 11.68 g Soro de albumina bovina BSA 20 g Adicionar cido clordrico HCl concentrado at pH 7.4 Tween 20 2 ml gua H2O q.s.p. 200 ml Tampo do anticorpo secundrio (10 vezes concentrado) Soluo E TRIS 1.21 g Cloreto de sdio NaCl 2.92 g Albumina bovina BSA 0.5 g Adicionar cido clordrico HCl concentrado at pH 7.4 gua H2O q.s.p. 50 ml Tampo do substrato (10 vezes concentrado) Soluo F Na3C6H6H5O7. 2H2O 3.25 g Fosfato de sdio NaH2PO4 . 2H2O 3.90 g Adicionar H3PO4 at pH 5.9 Soluo de bloqueio da reao Soluo G cido sulfrico H2SO4 3M

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orto-diamino fenileno (1,2-benzenodiamino) - OPD - tabletes de 5 mg perxido de hidrognio (H2O2) 30% Cloreto de sdio (NaCl) TRISMA base Bicarbonato de sdio (Na2CO3) Carbonato de sdio (NaHCO3) Na3C6H6H5O7. 2H2O Fosfato de sdio dihidratado (NaH2PO4. 2H2O) Tween 20 cido fosfrico (H3PO4) cido clordrico (HCl concentrado) cido sulfrico (H2SO4) Procedimento 1. Sensibilizao da microplaca - em cada orifcio da microplaca adiciona-se 125 l do anticorpo primrio diludo em soluo A (5 a 10 g/ml). A seguir, veda-se a placa para evitar a evaporao. 2. Incubar a microplaca por 12 horas a 40C (pode-se deixar a microplaca por at 10 dias em geladeira) 3. Lavar a microplaca 2 vezes com a soluo B (volume de 200 l) 4. Adicionar 170 l da soluo C em todos os orifcios e em seguida mant-la sob agitao constante (a 200 rpm) por 2 horas 5. Lavar a microplaca 4 vezes com a soluo B (volume de 200 l) 6. Diluir o plasma referncia com a soluo D 1:50 (100%) (10 l plasma + 490 l soluo D) diluio 1 1:100 (50%) (100 l diluio 1 + 100 l soluo D) diluio 2 1:200 (25%) (100 l diluio 2 + 100 l soluo D) diluio 3 1:400 (12.5%) (100 l diluio 3 + 100 l soluo D) diluio 4 1:800 (6.25%) (100 l diluio 4 + 100 l soluo D) diluio 5 1:1.600 (3.12%) (100 l diluio 5 + 100 l soluo D) diluio 6 1:3.200 (1.56%) (100 l diluio 6 + 100 l soluo D) diluio 7 7. As amostras teste devem ser diludas na mesma soluo D com base na atividade do fator VIII:C. Por exemplo, os pacientes que apresentarem atividade do fator VIII:C entre 60-150%, a diluio deve ser 1:200; nos com menos de 60%, as diluies sero 1:50 e 1:100 e com a atividade maior que 150%, as amostras devem ser diludas 1:400. Obs. Tanto a curva referncia quanto as amostras teste devem ser realizadas em duplicata Incubar 100 l de cada diluio da curva referncia e das amostras teste por 2 horas temperatura ambiente Lavar a microplaca 3 vezes com a soluo B (volume de 200 l) Adicionar 100 l de anticorpo secundrio diludo em soluo E na concentrao de 5 g/ml Agitar a microplaca temperatura ambiente por 60 minutos Lavar a microplaca 3 vezes com a soluo B Preparar o substrato por adio de 5 mg de OPD em 12 ml de tampo F e 10 l de perxido de hidrognio 30% Adicionar 100 l da soluo em cada orifcio e manter a microplaca temperatura ambiente, no abrigo da luz, por 10 minutos

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A reao bloqueada por adio de 50 l de H2SO4 3M A leitura espectrofotomtrica realizada a 492 nm A curva de referncia deve ser traada em papel semi-logartmico (densidade ptica versus % de FVW) Os resultados das amostras teste devero ser obtidos a partir da curva referncia. Se a amostra teste foi diluda 1:100 e 1:200, o resultado obtido a partir da curva deve ser multiplicado por 2 e 4, respectivamente Interpretao Na DVW tipo 1 o nvel plasmtico do FVW:Ag pode estar leve ou moderadamente reduzido; no tipo 3 indetectvel ou muito baixo (< 5%). J nos subtipos 2A, 2B e 2M os nveis so levemente reduzidos. No subtipo 2N, o FVW:Ag pode estar normal. 9.1.4.2.3 Determinao da atividade do fator de von Willebrand A avaliao da atividade do FVW pode ser mensurada atravs da determinao do cofator de ristocetina (FVW:RCo), ligao FVW-colgeno (FVW:CB) e ligao FVWFVIII:C (FVW:VIIIB). Esses testes, com exceo do FVW:VIIIB, considerado teste especial, devem ser utilizados rotineiramente em servios especializados de diagnstico da doena de von Willebrand e outras coagulopatias. FVW:RCo Este teste reflete a propriedade funcional do domnio A1 do FVW em interagir com o complexo GPIb/IX plaquetrio. Alm do teste de aglutinao tradicional descrito por McFarlane, que utiliza plaquetas frescas ou formolizadas e agregmetro, atualmente so realizados testes de atividade pelos mtodos de ELISA, aglutinao com partculas de ltex manual e automatizado. As modificaes no FVW:RCo por mtodo imunolgico foram propostas inicialmente por Vanhoorelbeke e colaboradores. Os autores avaliaram a atividade do fator determinando a interao do FVW com um fragmento da GPIb capturado em microplaca, na presena de ristocetina. A ligao detectada por adio de anticorpo conjugado com peroxidade e substrato cromognico. Os resultados obtidos apresentaram sensibilidade e especificidade semelhante ao teste ELISA para a determinao do FVW:Ag. Outra alternativa de avaliao de atividade por ELISA, j comercializada, a ligao do FVW a anticorpos monoclonais que reconhecem o stio ligante GPIb. Entretanto, alm do alto custo do kit, Preston FE mostrou que, em alguns casos, a atividade encontrada por esse mtodo pode no se correlacionar com o padro multimrico da protena. O teste que utiliza partculas de ltex cada vez mais utilizado pela rapidez de execuo e boa sensibilidade, principalmente o automatizado. O ensaio utiliza partculas de ltex sensibilizadas com o anticorpo monoclonal direcionado ao stio do FVW que se liga a GPIb plaquetria. A atividade do FVW determinada pela medida do aumento de turbidez produzida pela aglutinao das partculas de ltex como conseqncia da interao do receptor GIb do FVW e o anticorpo monoclonal. Os resultados podem ser superestimados em plasma hemolisados, altos nveis de bilirrubina e triglicrides. A FVW:RCo por mtodo de aglutinao plaquetria com a utilizao do agregmetro ainda o padro ouro, apesar do alto coeficiente de variao ( 20-30%). As plaquetas utilizadas para este teste podem ser formolizadas e estocadas por at 3 meses. O uso de plaquetas frescas tem a desvantagem do risco de agregao durante a lavagem, comprometendo o teste. Quanto s plaquetas de origem comercial, alm de seu alto custo, apresentam sensibilidade reduzida em relao s preparadas no laboratrio.

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Apesar do FVW:RCo por aglutinao de plaquetas ser o mtodo padro-ouro, este apresenta algumas desvantagens, tais como a grande variabilidade intra e interlaboratorial, a dependncia de equipamento (agregmetro) e pelo fato de ser uma tcnica que demanda tempo. Ligao FVW-colgeno (FVW:CB) Quando este teste foi desenvolvido por Favaloro e colaboradores, acreditava-se que o mesmo substituiria o FVW:RCo, devido ao emprego do reagente fisiolgico colgeno e da maior sensibilidade do mtodo ELISA. Porm, foi verificado que os dois mtodos avaliam diferentes stios ligantes do FVW, o FVW:RCo avalia o stio A1e o FVW:CB avalia o stio A3. Atualmente, os dois mtodos de avaliao funcional do FVW fazem parte do painel de diagnstico da DVW, principalmente na diferenciao dos subtipos 2A e 2M. A sensibilidade do teste em detectar a DVW e discriminar os seus subtipos dependente da fonte de colgeno utilizada no ensaio (colgeno tipo I e a mistura dos tipos I e III). O defeito especfico na ligao colgeno-FVW associado mutao do FVW no domnio A3 independente de tamanho de multmero e tem sido pouco encontrado nos pacientes at o momento. A presena dessa mutao no altera o FVW:RCo e, assim, a doena no detectada a menos que seja realizado o teste FVW:CB. O FVW:CB utilizado como teste complementar ao FVW:RCo e FVW:Ag no somente para a diferenciao dos subtipos 2A e 2M, mas tambm os subtipos 2A e 2B. O teste FVW-colgeno (FVW:CB) testa a funo de adeso do FVW ao colgeno, que imobilizado na microplaca de ELISA. Sua capacidade de ligao depende da presena dos multmeros de alto peso molecular. A discriminao do teste entre FVW normal e com ausncia dos altos pesos moleculares do FVW de cerca de 90%. At recentemente, o teste FVW:CB era apenas realizado in house, devido dificuldade de ligao estvel do colgeno placa de ELISA por um longo perodo. Atualmente, encontram-se no mercado dois kits comerciais com microplacas sensibilizadas com o colgeno tipo III de sensibilidade comparada ao teste in house, porm de alto custo. Ligao FVW-FVIII:C (FVW:VIIIB) Trata-se de um teste importante para diferenciar a DVW tipo 2N da hemofilia A leve ou moderada. A intensidade do defeito de ligao do fator VIII:C ao FVW varia com diferentes tipos de mutaes, que, at o momento, foram identificadas nos domnios D e D3 do gene que codifica o FVW. Os mtodos utilizados para a avaliao da afinidade entre o fator VIII:C e o FVW podem ser cromognico, imunolgico ou ambos.

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FVW:RCo Mtodo agregomtrico Princpio O FVW:RCo por mtodo agregomtrico avalia a atividade do FVW na presena de plaquetas humanas normais lavadas e fixadas com formalina. As plaquetas tratadas so adicionadas aos plasmas teste ou de referncia, em vrias diluies, e a ristocetina em concentrao constante. No passado, a ristocetina foi utilizada como antibitico, tendo sido retirada do mercado por causar plaquetopenia. A ristocetina promove mudanas estruturais no FVW facilitando a sua ligao com a GPIb plaquetria com conseqente aglutinao. A reao de aglutinao das plaquetas detectada atravs do agregmetro de sistema ptico acoplado a um registrador com velocidade do papel de 5 cm/minuto. Preparo das plaquetas formolizadas Coletar o sangue em ACD ou utilizar 1 a 2 bolsas de concentrado de plaquetas dentro do prazo de validade. Centrifugar o concentrado de plaquetas a 1.500 x g por 1 minuto temperatura ambiente para retirada de hemcias contaminantes da bolsa. Centrifugar o concentrado durante 15 minutos a 1.500 x g temperatura ambiente. Durante o tempo de centrifugao, preparar os tampes de lavagem I e II. Descartar o sobrenadante utilizando bomba de vcuo e ressuspender as plaquetas (sem formao de bolhas) no tampo de lavagem do tipo I (30 ml) e manter a 37C por 10 minutos. Centrifugar as plaquetas incubadas no tampo de lavagem do tipo I por 15 minutos a 1.500 x g a 37C. Descartar o sobrenadante e ressuspender o boto plaquetrio no tampo de lavagem do tipo II (20 ml). Obs.. Caso o boto plaquetrio ainda estiver contaminado com hemcias tentar retirlas. Incubar por 10 minutos a 37C. Enquanto as plaquetas estiverem incubadas, preparar a soluo de formaldedo a 2% em tampo Tyrode Plain. Adicionar 20 ml de formaldedo 2% aps os 10 minutos de incubao das plaquetas ressuspensas no tampo de lavagem do tipo II. Incubar a mistura por 60 minutos a 37C (Obs. certificar se o nvel de gua do banhomaria cobre todo o volume da mistura). Aps o tempo de incubao, deixar em geladeira at o dia seguinte. O contedo transferido para dois tubos de 20 ml e, se aps o dia seguinte houver sedimentao de hemcias, tentar desprez-las com o auxlio de ponteira plstica. Completar com Tampo Plain Tyrode at 50 ml. Centrifugar por 15 minutos a 1.500 x g temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante e ressuspender em 50 ml de Tampo Plain Tyrode Incubar por 10 minutos a 37C. Enquanto as plaquetas estiverem incubadas, preparar a soluo de formaldedo a 2% em tampo Tyrode Plain. Adicionar 20 ml de formaldedo 2% aps os 10 minutos de incubao das plaquetas ressuspensas no tampo de lavagem do tipo II. Incubar a mistura por 60 minutos a 37C (Obs. certificar se o nvel de gua do banhomaria cobre todo o volume da mistura). Aps o tempo de incubao, deixar em geladeira at o dia seguinte.

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O contedo transferido para dois tubos de 20 ml e, se aps o dia seguinte houver sedimentao de hemcias, tentar desprez-las com o auxlio de ponteira plstica. Completar com Tampo Plain Tyrode at 50 ml. Centrifugar por 15 minutos a 1.500 x g temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante e ressuspender em 50 ml de Tampo Plain Tyrode Preparo da ristocetina Soluo estoque (50 mg/ml) Ressuspender frasco de 100 mg de monosulfato de ristomicina (>90% ristocetina A balanceada com ristocetina B) em 2 ml de gua destilada. Curva de referncia O plasma referncia deve ser diludo 1:2 (100%), 1:4 (50%), 1:8 (25%), 1:16 (12.5%) e 1:32 (6.25%) com tampo Plain Tyrode O plasma teste deve ser diludo 1:2 ou 1:4 dependendo dos nveis de FVW:Ag Teste 300 l de plaquetas lavadas 100 l das diferentes diluies do plasma referncia ou plasma teste diludo 8 l de ristocetina 50 mg/ml (concentrao final de 1 mg/ml) Tabela 6. Preparo de solues para o teste FvW:RCo Preparo das solues para FvW:RCo Soluo ACD, pH 4.5 Citrato de sdio dihidratado 10 g cido ctrico monohidratado 6 g Dextrose 8 g H2O q.s.p. 400 ml Solues estoques de Tyrode (se mantidas a 4C, podem ser conservadas por 2 meses) Estoque I NaCl 16 g KCl 0.4 g NaHCO3 2 g NaH2PO4 0.1 g H2O q.s.p. 100 ml Estoque II MgCl2.6H2O 2.033 g (0.1M) H2O q.s.p. 100 ml Estoque III CaCl2.6H2O 2.191 g (0.1 M) H2O q.s.p. 100 ml Tampo Plain Tyrode pH 7.35 Soluo estoque I5 ml H2O q.s.p. 100 ml Soluo de albumina bovina (BSA) Albumina bovina 17.5 g Soluo fisiolgica (NaCl 0.9%) 100 ml

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Estocar - 80C em alquotas de 1 ml Creatinina Fosfo Quinase (CPK) tipo I de msculo de coelho - frasco de 500 U (liofilizado) Fosfocreatina (CP) 500 mM Preparar em tampo Tyrode Plain, aliquotar vrios tubos de 500 l e manter a - 20C Mistura de CP + CPK (preparar imediatamente antes do uso) 500 U CPK + 500 l CP Heparina 5.000 U (manter alquotas a - 20C) Formaldedo 37% Tampo de lavagem das plaquetas pH 7.35 (soluo A) Estoque I 2.5 ml Estoque II 0.5 ml Estoque III 1.0 ml Dextrose 0.05 g BSA 17.5%1.0 ml H2O q.s.p. 50 ml HCl 0.5N para o acerto do pH Tampo de lavagem tipo I Soluo A 30 ml Heparina 0.3 ml CP/CPK 0.3 ml Preparar na hora do uso e manter a 37C Tampo de lavagem tipo II Soluo A 20 ml CP/CPK 0.2 ml Preparar na hora do uso e manter a 37C Calibrao do aparelho 0% de transmitncia: 300 l de plaquetas lavadas + 100 l de plasma diludo 100% de transmitncia: 250 l de plaquetas lavadas + 250 l de PT (branco) Cada vez que se adiciona a ristocetina, o aparelho deve ser recalibrado. Velocidade de reao de 5 cm/minuto A curva de referncia deve ser traada em papel semi-logartmo Interpretao O FVW:RCo na DVW tipo 3 indetectvel por todos os mtodos citados devido ausncia ou a baixa quantidade do FVW:Ag. Nos pacientes com estrutura normal do FVW (tipo 1), os valores so proporcionais aos do FVW:Ag. Nveis plasmticos do FVW:RCo desproporcionais em relao aos de FVW:Ag (normalmente encontra-se relao < 0.70) so caractersticos do tipo 2 da doena com exceo do subtipo 2N. A determinao da atividade do cofator de ristocetina um teste imprescindvel para o diagnstico da DVW, pois todos os tipos e subtipos (exceto 2N) apresentam atividade abaixo da normalidade. Teste de ligao do fator de von Willebrand ao colgeno Princpio

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O FVW do plasma teste se liga ao colgeno ligado aos orifcios da microplaca de ELISA que foi previamente sensibilizada. A segunda reao a de ligao dos multmeros do FVW, capturados pelo colgeno, ao anticorpo secundrio anti-FVW conjugado enzima peroxidase. A atividade de ligao determinada por adio do substrato especfico da enzima. A intensidade de cor desenvolvida na reao proporcional quantidade de multmeros de alto peso molecular presente no plasma teste. Mtodo Reagentes e materiais Colgeno tipo I + III Anticorpo de coelho anti-FVW humano conjugado com peroxidase TRIS bsico NaCl Tween 20 Albumina Citrato trissdico Na2HPO4 H3PO4 H2O2 30% H2SO4 3M Orto-diamino- fenileno (1,2-benzenodiamino) OPD Microplaca com 96 orifcios Micropipetas de 1.000 l e 200 l Micropipeta multicanal 200 l Tabela 7. Preparo de solues para o teste FvW:CB Tampo de cobertura para sensibilizao da microplaca de ELISA, pH 7.4 TRIS bsico -------------- 20 mM NaCl ----------------------- 100 mM Albumina ------------------- 5% Tampo de lavagem da placa, pH = 7.4 TRIS HCl ----------------- 20 mM NaCl ----------------------- 100 mM Tween 20 ----------------- 0.1% Tampo de diluio das amostras e plasma calibrador Tampo de lavagem --------- 50 ml Albumina ----------------------- 0.1% Tampo do substrato OPD, pH 5.5 reajustado com H3PO4 Citrato trissdico ----------------- 22 mM Na2HPO4 -------------------------- 50 mM Procedimento 1 - Revestir a microplaca com 110 l da soluo de colgeno (25 g/ml) 2 - Incubar por 18 horas temperatura ambiente 3 - Lavar a placa 3 vezes com o tampo de lavagem 4 Revestir a microplaca com 220 l de tampo de cobertura 5 Agitar a 150 rpm por 1 hora temperatura ambiente

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6 Lavar a microplaca 3 vezes com o tampo de lavagem 7 Preparar as amostras e curva referncia (ver a seguir) Curva de referncia Diluir o plasma referncia com o tampo de diluio 1:50 (10 l do plasma + 490 l de tampo de diluio) 1:100 (100 l 1:50 + 100 l de tampo de diluio) 1:200 (100 l 1:100 + 100 l de tampo de diluio) 1:400 (100 l 1:200 + 100 l de tampo de diluio) 1:800 (100 l 1:400 + 100 l de tampo de diluio) 1:1.600 (100 l 1:800 + 100 l de tampo de diluio) 1:3.200 (100 l 1:1.600 + 100 l de tampo de diluio) Diluio das amostras teste Se os nveis do FVW:Ag da amostra teste forem normais, diluir 1:100 e 1:200 com o tampo de diluio; se os nveis do FVW:Ag da amostra teste forem baixos, diluir 1:50 e 1:100 com tampo de diluio; se os nveis do FVW:Ag da amostra teste forem muito baixos, diluir 1:20 e 1:40 com tampo de diluio; se os nveis do FVW:Ag da amostra teste forem muito altos, diluir 1:200 e 1:400 com tampo de diluio. 8 Adicionar, na microplaca, em duplicata, 100 l de cada diluio do plasma referncia e das amostras teste. 9 Incubar por 2 horas temperatura ambiente. 10 Lavar a microplaca 3 vezes com tampo de lavagem. Preparo do anticorpo secundrio Diluir o anticorpo secundrio com o tampo de diluio (1 g/ml) 11 Adicionar em todos os orifcios 100 l de anticorpo secundrio diludo. 12 Incubar a placa por 1 hora temperatura ambiente sob agitao (a 150 rpm). 13 Lavar a microplaca 3 vezes com tampo de lavagem Preparo do substrato cromognico (no momento do uso) Soluo de OPD 400 g/ml em tampo do substrato cromognico Adicionar 5 l de H2O2 para cada 12,5 ml de soluo de OPD 14 Adicionar 100 l do substrato em todos os orifcios. 15 Incubar a microplaca ao abrigo de luz por aproximadamente 20 minutos. 16 Parar a reao com adio de 50 l de H2SO4 3M em todos os orifcios. 17 Aps 15 minutos fazer a leitura colorimtrica a 492 nm 18 Calcular a percentagem do FVW:CB a partir da curva referncia traada em papel mono-log (atividade versus densidade ptica) Interpretao Os pacientes com mutao no domnio A3 do FVW, apresentam a relao dos testes dos testes FVW:CB/FVW:Ag desproporcional (< 0.7) e proporcionalidade na relao FVW:RCo/FVW:Ag (0.7 1.2). A DVW do subtipo 2A apresenta relao FVW:CB/FVW:Ag e relao FVW:RCo/FVW:Ag menor que 0.7. Isso devido ausncia dos multmeros de alto peso molecular. O subtipo 2M (presena de todos os multmeros) apresenta a relao FVW:CB/FVW:Ag proporcional, porm desproporo na relao FVW:RCo/FVW:Ag. 9.1.4.3 Testes especiais 9.1.4.3.1 Agregao plaquetria com ristocetina A RIPA avaliada por adio de diferentes concentraes de ristocetina ao plasma rico em plaquetas do paciente em investigao. O teste realizado com o auxlio de

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agregmetro de leitura ptica acoplado a um registrador. Os resultados so expressos como a concentrao de ristocetina (mg/ml) capaz de induzir 30% de agregao. Outra forma de avaliao a utilizao de duas nicas concentraes finais de ristocetina (0.6 e 1.2 mg/ml ) para a diferenciao de DVW subtipo 2B , pseudo Von Willebrand ou DVW plaquetria do subtipo 2B Tcnica Materiais e reagentes Tubos plsticos de 10 ml Pipetas automticas de 1.000 l e 20 l Agregmetro acoplado a um registrador Ristocetina 25 mg/ml Rgua de 30 cm Procedimento Para a realizao do teste, o sangue do paciente e do controle do dia deve ser colhido em citrato de sdio 3.2% (1 volume de anticoagulante para 9 volumes de sangue). Aps homogeneizao, o sangue centrifugado a 150 x g por 10 minutos temperatura ambiente para obteno do plasma rico em plaquetas (PRP) e colocado em tubo plstico. O tempo entre a coleta da amostra e a realizao do teste no deve exceder de 3 a 4 horas. O registrador acoplado ao agregmetro deve ser reajustado velocidade de corrida do papel de 2 cm/minuto e o agregmetro calibrado para 100% de transmitncia com plasma pobre em plaquetas (PPP) e 0% com o PRP. Um volume de 400 ul de PRP adicionado no tubo de agregao e em seguida a ristocetina 25 mg/ml em concentraes finais que variam de 0.7 a 1.2 mg/ml para induzir 30% de aglutinao, que em papis convencionais de registrador de agregmetro, corresponde a 4.8 cm. Interpretao A agregao plaquetria dos pacientes que apresentam 30% de agregao com concentraes acima de 1.2 mg/ml so consideradas hipoaglutinantes (a maioria dos tipos e sub tipos da doena). J os que apresentam 30% de agregao com concentraes abaixo de 0.7 mg/ml so consideradas hiperaglutinantes (subtipo 2B e pseudo DVW). A obteno de resposta normal ristocetina no descarta a doena, pois a DVW tipo1 plaqueta normal apresenta agregao normal com ristocetina. 9.1.4.3.2 Diferenciao laboratorial entre DVW 2B e pseudo doena de von Willebrand A DVW subtipo 2B e a pseudo DVW ou DVW tipo plaquetrio so hereditrias com padres fenotpicos e sintomas clnicos semelhantes, mas com diferentes etiologias. A DVW subtipo 2B est associada a mutaes que levam a um ganho de funo do FVW. Essas mutaes aumentam a ligao do FVW ao receptor plaquetrio GpIb, resultando na interao espontnea do FVW a plaquetas, na circulao, o que no ocorre com o FVW normal. J na pseudo DVW ocorre uma maior ligao de FVW normal ao receptor Ib anormal da plaqueta. Ambas as patologias apresentam resposta aumentada de agregao plaquetria induzida pela ristocetina (0.3 a 0.6 mg/ml). A diferenciao laboratorial pode ser feita por teste de agregao plaquetria ou biologia molecular. Teste de agregao plaquetria com 0.5 mg/ml de ristocetina

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1 Verificar se as plaquetas do paciente em investigao no apresentam agregao espontnea. Caso haja agregao espontnea, as duas doenas esto descartadas. 2 Centrifugar o sangue do paciente e de um indivduo normal a 120 x g por 10 minutos para a obteno do PRP, que deve ser mantido a temperatura ambiente. 3 O restante do sangue, tanto do paciente quanto do indivduo normal, deve ser centrifugado a 1.200 x g para a obteno do PPP. 4 - Transferir os PRPs com auxlio de pipeta plstica para dois tubos cnicos distintos e ajustar o pH a 6.4 com cido ctrico 0.2 M 5 Retirar 1 ml de PRP, tanto do paciente quanto do indivduo normal, lavar 3 vezes por centrifugao a 1.200 x g com tampo Tyrode pH 6.4 (8.0 g NaCl; 0.2 g KCl; 0.065 g; NaH2PO4.2H2O; 0.415 g MgCl2. 6H2O; 1.0 g NaHCO3) 6 Cuidadosamente ressuspender as plaquetas lavadas do paciente em 1 ml de plasma do indivduo normal e as plaquetas lavadas do indivduo normal em 1 ml do plasma do paciente 7 Repetir a agregao plaquetria com ristocetina na concentrao final de 0.5 mg/ml, tanto das plaquetas ressuspensas no plasma do indivduo normal quanto s plaquetas do indivduo normal ressuspensas no plasma do paciente Tabela 8. Diferenciao laboratorial de doena de Von Willebrand subtipo 2B e pseudo doena de von Willebrand por agregao plaquetria com ristocetina na concentrao final de 0.5 mg/ml PRP paciente + PPP paciente POSITIVO POSITIVO Plaquetas lavadas do paciente + PPP do indivduo normal NEGATIVO POSITIVO Plaquetas lavadas do normal + PPP do paciente POSITIVO = DVW 2B

NEGATIVO = PSEUDO DVW Abreviao: DVW, doena de von Willebrand; PRP, plasma rico em plaquetas; PPP, plasma pobre em plaquetas 9.1.4.3.3 Ligao do fator de von Willebrand ao fator VIII Princpio A avaliao da ligao do fator VIII:C ao FVW realizada por mtodos imunolgico e cromognico. O teste realizado em duas microplacas distintas. Na primeira determinado o FVW:Ag e na segunda avaliada a ligao do fator VIII:C ao FVW. O teste de ligao fator VIII:C-FVW se inicia pela captura do FVW do paciente atravs de anticorpo policlonal, na microplaca. Em seguida, o fator VIII:C endgeno removido e substitudo por fator VIII recombinante em concentrao definida. A quantidade de fator VIII recombinante pode ser determinada por mtodo cromognico. Os nveis de fator VIII recombinante que foram ligados ao FVW so relacionados com a quantidade de FVW:Ag do paciente. Tcnica 1 Preparo das microplacas para as reaes

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Dia 1 Revestir duas microplacas (1 e 2) de ELISA com anticorpo anti-FVW (7 a 10 g/ml) Pipetar 125 l do anticorpo em cada orifcio, na microplaca 2 deixando as duas ltimas colunas vazias. Manter a microplaca em geladeira a 4 C at o dia seguinte Dia 2 Lavar a microplaca 3 vezes com o tampo de lavagem (1), o mesmo utilizado para determinao do FVW:Ag Pipetar 250 l do tampo de cobertura, o mesmo utilizado na determinao do FVW:Ag adicionado de 3% de albumina bovina Incubar 3 horas temperatura ambiente Lavar a microplaca 3 vezes com o tampo de lavagem (1) Diluir as amostras (1/25) e o plasma referncia para a execuo da curva de calibrao em tampo de diluio utilizado na determinao do FVW:Ag 1/25; 1/50; 1/100; 1/200; 1/400; 1/800; 1/1600 o que corresponde a 100%; 50%; 25%; 12,5%; 6,25%; 3,15% e 1.07%, respectivamente Dia 3: determinao de FVW:Ag e ligao FVIII:C FVW Na placa 1 fazer a determinao do FVW:Ag Na placa 2 adicionar 100 l de CaCl2 0,35M Incubar temperatura ambiente por 60 minutos sob agitao a 100 rpm Lavar a microplaca com tampo de lavagem (1) 6 vezes Adicionar 125 l de anticorpo de coelho anti-FvW humano na concentrao de 0.43 mg/ml de protena diludo em tampo de diluio de anticorpo, o mesmo utilizado na determinao do FVW:Ag Incubar a microplaca sob agitao a 370C por 30 minutos Lavar a microplaca com o tampo de lavagem (1) 3 vezes Adicionar 100 l de fator VIII recombinante de concentrao de 1 U/ml diludo 1:400 em PBS contendo albumina a 2% e 0.1% de Tween 20 Incubar a microplaca por 2 horas a 370 C Lavar a microplaca 3 vezes com tampo de lavagem (1) Adicionar 25 l do tampo de diluio de amostra que acompanha o kit de determinao de fator VIII:C por substrato cromognico Nas duas ltimas colunas, que at ento estavam vazias, adicionar 25 l, em duplicata, das seguintes diluies do plasma referncia no mesmo tampo de diluio das amostras: 1/5; 1/10; 1/20; 1/40; 1/80; 1/160; 1/320 e 1/640. Reservar dois orifcios para o branco (somente tampo de diluio) A seqncia de determinao deve ser seguida de acordo com o kit comercial cromognico de determinao do fator VIII:C Interpretao Os pacientes com DVW 2N apresentam nveis normais de FVW:Ag e FVW:RCo e estrutura multimrica normal, porm baixos nveis de fator VIII:C. O fentipo semelhante ao da hemofilia A, mas a herana gentica no ligada ao cromossomo X, sendo autossmica recessiva. 9.1.4.3.4 Padro multimrico do fator de von Willebrand

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O FVW composto por subunidades dimricas ligadas entre si por pontes disulfeto formando complexos multimricos de baixo, intermedirio e alto peso molecular variando de 8 x 105 a 15 x 106 daltons. A separao eletrofortica em gel de agarose dos multmeros do FVW e a visualizao so utilizadas para distinguir os diferentes subtipos da doena, principalmente os subtipos 2A, 2B e 2M. Princpio O estudo do padro multimrico do FVW realizado por diferentes metodologias complexas com utilizao de equipamentos sofisticados e reagentes caros, tornando-o vivel apenas aos laboratrios especializados. De forma geral, o padro multimrico avaliado atravs de eletroforese utilizando gel de agarose de 1% a 3% na presena de sulfato de dodecil sdico (SDS). Os multmeros so separados, inicialmente, de acordo com o peso molecular. Em seguida so transferidos para uma membrana de PVDF ou nitrocelulose, onde ser realizada a reao com anticorpo primrio (coelho anti-humano) e secundrio (anti-FVW conjugado com peroxidase). At h pouco tempo, os multmeros eram visualizados diretamente no gel de corrida com a adio de anticorpo radioativo, mas atualmente esta tcnica est sendo abandonada, e substituda por substratos cromognicos para enzimas conjugadas (luminol). O padro multimrico normal apresenta uma srie de bandas divididas em grupos de baixo, intermedirio e alto peso molecular. Reagentes, materiais e equipamentos utilizados para anlise do padro multimrico Reagentes Agarose SeaKem HGT (P) HGT SDS (sulfato de duodecil sdico EDTA Citrato de sdio Fosfato dissdico Glicerol TRIS base Glicina Metanol Tween 20 NaCl Azul de bromofenol Glicerol Iodoacetamina ECL Western blotting detection 1 e 2 (Amerrsham Life Science Ltda) Anticorpo de coelho anti-humano Anticorpo de camundongo (ou equino) anti-coelho conjugado com peroxidase Leite desnatado Equipamentos Cuba de eletroforese com refrigerao Fonte de eletroforese Cuba de transferncia (horizontal) com refrigerao Agitador orbital de placa

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Materiais Membrana de PVDF 0.45 (polyvinylidene fluoride) Cassete para autoradiografia Papel filtro 3 mm Tcnica Krizek DR e Rick ME descrevem um mtodo de visualizar os multmeros do FVW que, segundo os autores, rpido em relao aos mtodos descritos anteriormente. Interpretao Tipo 1 presena de todos os pesos moleculares, porm com quantidades reduzidas Tipo 2 ausncia dos multmeros de alto peso molecular, exceto no subtipo 2M, que apresenta padro multimrico normal Tipo 3 ausncia ou reduo significativa de todos os pesos moleculares Consideraes Vrios fatores podem alterar os nveis plasmticos do FVW e conseqentemente dificultar o diagnstico da doena. Um deles o grupo sanguneo ABO. Indivduos com tipo sanguneo O apresentam nveis plasmticos de FVW:Ag, fator VIII:C e FVW:RCo reduzidos em aproximadamente 25% em relao aos dos outros tipos sanguneos e, muitas vezes, so equivocadamente diagnosticados como DVW do tipo 1. O maior determinante do diagnstico, nesses casos, a manifestao hemorrgica. Situaes como estresse, cirurgia, exerccio fsico, processo inflamatrio, gravidez, uso contraceptivos orais, podem aumentar os nveis plasmticos do FVW mascarando seus valores basais. Foi tambm demonstrado que os nveis de FVW variam com o ciclo menstrual e valores mais baixos so detectados entre os dias 1 a 4 do ciclo. Diante das possveis variaes do FVW, a repetio dos testes laboratorial quase uma constante, principalmente nos casos em que o paciente apresenta sinais e sintomas caractersticos da doena. Alm disso, as etapas pr-analticas como, coleta e processamento do sangue, podem comprometer significativamente os resultados. 9.1.5 Recomendaes para coleta e processamento da amostra para os teste de diagnstico de doena de von Willebrand. 1 Condies de flebotomia: A flebotomia deve ser a menos traumtica possvel e com garroteamento por at um minuto. Isto limita a liberao de fator tecidual no stio de puno e, conseqentemente, a ativao dos fatores de coagulao e liberao de FVW. 2 Estresse do paciente: crianas que se debatem, choram durante a coleta de sangue ou adultos ansiosos podem apresentar nveis falsamente elevados de FVW e fator VIII:C. Alm das etapas pr-analticas que podem alterar os resultados, os testes laboratoriais utilizados no diagnstico da DVW tambm apresentam variabilidades considerveis. O teste FVW:RCo apresenta um coeficiente de variao (CV) de 20 a 30%, sendo este ainda maior quando a atividade do FVW estiver entre 12%-15%. Altos CV tambm so detectados nos testes de determinao do FVW:Ag e FVIII:C (10 20%). As vrias condies do paciente que podem levar a nveis aumentados de FVW e fator VIII:C associadas aos possveis erros de coleta e processamento da amostra e aos altos CV das determinaes desses fatores, podem dificultar o diagnstico da DVW assim como na sua tipagem e subtipagem.

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9.2. Hemofilia A hemofilia uma doena hemorrgica hereditria caracterizada pela deficincia dos fatores VIII (hemofilia A) ou IX (hemofilia B). Da totalidade dos casos, as hemofilias A e B compem 70%-85% e 15%-30% dos casos, respectivamente. Os genes que codificam os fatores VIII e IX esto localizados no cromossomo X. Desta forma, a doena afeta quase que exclusivamente indivduos do sexo masculino, enquanto que a mulher portadora habitualmente assintomtica. A apresentao clinica semelhante para as duas deficincias e caracterizada por sangramento intra-articular (hermatrose), hemorragia muscular ou em outros tecidos ou cavidades e sistema nervoso central. De acordo com os nveis circulantes dos fatores VIII ou IX, se <1%, 1-5% ou >5 a >40%, a hemofilia classificada como grave, moderada ou leve, respectivamente. Uma complicao que pode ser decorrente do tratamento da hemofilia o desenvolvimento de anticorpos neutralizantes da funo coagulante do FVIII ou FIX. A presena destes anticorpos, conhecidos como inibidores, dificulta a induo de hemostasia teraputica com concentrado de fatores prejudicando o tratamento do paciente. A prevalncia de inibidores varia de 1% a 5% entre pacientes com hemofilia B e de 10% a 30% entre pacientes com hemofilia A. Pacientes com hemofilia e inibidor apresentam sangramento mais duradouro e potencialmente de maior gravidade, alm de requerer o uso de concentrados de fatores do tipo bypassing, que so mais onerosos. A determinao dos inibidores deve ser realizada em todos os pacientes com hemofilia ao diagnstico, antes e depois de procedimentos cirrgicos e com periodicidade mnima a cada 6 meses se o paciente estiver em tratamento com reposio de concentrado de fatores ou hemocomponentes. 9.2.1. Diagnstico laboratorial da hemofilia O diagnstico laboratorial das hemofilias A e B consiste na realizao dos testes. TTPA (teste de triagem), determinao de FVIII: C e/ou FIX: C, pesquisa e quantificao de inibidor. Os testes seguem caractersticas especficas que sero abordadas em tpicos distintos a seguir. 9.2.1.1. Tempo de Tromboplastina Parcial Ativado Como j descrito na sesso 8.2, o teste de TTPA consiste na recalcificao do plasma na presena de grande quantidade de fosfolipdio e de um ativador do sistema de contato. Desta forma um teste de triagem universalmente aceito para identificar anomalias no sistema intrnseco da coagulao, e, portanto, para o diagnstico das hemofilias A e B. 9.2.1.2. Determinao da atividade coagulante dos fatores VIII e IX A determinao dos nveis de FVIII: C ou FIX: C fundamental para o diagnstico das hemofilias. A determinao dos nveis permite a classificao de gravidade das hemofilias, que orientar o acompanhamento e tratamento. Para a determinao do FVIII:C h atualmente dois mtodos disponveis: (1) o mtodo de um estgio, conhecido como coagulomtrico e (2) mtodo de dois estgios, substitudo pelo mtodo cromognico. Para o FIX: C encontra-se disponvel apenas o mtodo (1). O mtodo cromognico o mais recomendado para o diagnstico de hemofilia devido a sua melhor reprodutibilidade quanto ao limite inferior da curva. Este mtodo no depende de substrato deficiente de fator, eliminado, assim, possveis interferncias de

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fator VIII residual. Alm disso, o teste no influenciado pela presena de anticoagulante lpico e pode ser utilizado para distinguir entre inibidor de fator VIII e anticoagulante lpico em pacientes com deficincia de fator VIII adquirido. Por ltimo, o teste no sofre influncia de reagentes especficos do mtodo coagulomtrico, tal como o TTPA. Aproximadamente 30% de pacientes com hemofilia A leve causada por mutao missense apresentam discrepncia de resultado quando os dois mtodos so comparados. Normalmente, a atividade de fator no mtodo cromognico menor comparada com o resultado no mtodo de um estgio. Pelo menos 17 mutaes diferentes foram identificadas em associao com esta discrepncia entre os testes. Contudo, os reagentes para teste cromognico do fator VIII tm um custo maior quando comparado ao mtodo de um estgio. Assim, o teste de um estgio ainda o mtodo mais amplamente utilizado para a determinao dos nveis do FVIII:C. Para que se possa diminuir todas as interferncias do teste, pontos relevantes para uma melhor qualidade da anlise sero abordados a seguir. O mtodo de um estgio baseado na habilidade de uma amostra do paciente diluda encurtar o tempo de coagulao em um meio que adiciona plasma deficiente em fator VIII ou IX, reagente para TTPA (fosfolipdio e ativador de contato) e clcio. Devido a todos os fatores estarem em excesso em relao ao fator VIII ou IX, o tempo de coagulao desta mistura principalmente afetado pela atividade de fator VIII ou IX. Neste caso, o tempo de coagulao reflete o resultado em uma linha linear entre o tempo de coagulao (escala linear) e diluio do plasma padro (escala logartmica). Um importante pr-requisito para este ensaio o paralelismo das diluies do calibrador com as diluies do plasma do paciente. O no-paralelismo pode indicar a presena de um inibidor ou a presena de algum fator que no faz parte da reao normal. Neste caso, o resultado desta anlise no deve ser considerado. Conseqentemente, o resultado do FVIII:C deve ser realizado em pelo menos trs diluies diferentes para anlise deste paralelismo. Muitas variveis podem influenciar este ensaio e contribuir para um indesejvel alto coeficiente de variao e um desacordo na exatido do teste. Para a minimizao deste problema, deve-se avaliar: A- Plasma de referncia A atividade do FVIII: C lida atravs de uma curva de calibrao de um plasma de referncia, que representa a correlao entre o tempo de coagulao e o FVIII:C. A atividade de FVIII:C no plasma expressa em UI dL-1, onde 100 UI definido como atividade que presente em 1 dL de pool de plasma normal. A estimativa pode alterar o verdadeiro nvel de FVIII:C. Por isso, fortemente recomendado a calibrao do plasma de referncia contra um padro internacional de fator VIII da Organizao Mundial de Sade, que pode ser obtido atravs do NIBSC. A calibrao deve ser realizada por uma leitura paralela do plasma padro (NIBSC) e plasma padro local em pelo menos quatro diluies. A potncia do padro local pode ser derivada destes ensaios quando as duas curvas mostram paralelismo. B- Plasma deficiente Uma importante caracterstica do teste de FVIII:C a qualidade do plasma deficiente de fator VIII. No passado, plasmas de pacientes com hemofilia grave forambastante utilizados para este fim. Atualmente, o fator VIII pode ser removido do plasma por procedimentos qumico ou imunolgico. A primeira condio, e a mais importante para o plasma substrato deficiente, a absoluta certeza da ausncia de fator VIII. Alguns estudos indicam que o processo de retirada imunolgica pode conter maior quantidade

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de fator residual, sendo esta, portanto, uma das causas da dificuldade de se identificar a hemofilia A grave. H uma forte recomendao para que se analise o FVIII:C residual do plasma deficiente e se rejeite os fabricantes com FVIII: C residual igual ou maior que 1 UI dl-1. O segundo requerimento a presena de excesso de todos os outros fatores, exceo feita ao fator para o qual se deseja que o substrato seja deficiente. A falta de um ou outro fator pode influenciar as informaes do resultado e levar a uma curva no paralela entre o plasma referncia e o plasma do paciente. A cada novo lote de reagente, deve-se testar estes dois reagentes. Mtodo Manual. Neste manual optou-se em descrever a tcnica manual para a realizao do teste, pois entende-se que a mesma deve ser o teste principal para a validao dos processos realizados no laboratrio. Desta forma, a automao deve seguir a mesma caracterstica da tcnica manual. Material: Tubos de vidro; Banho - Maria a 37C; Micropipetas automticas de 100 l, 200 l e 1.000 l; Cronmetro. Reagentes: Plasma deficiente em fator VIII ou IX; Cefalina (com slica como ativador); Cloreto de clcio 0,025 M; Tampo imidazol, ph 7,4 ou tampo Veronal ou NaCl 0,9% (o tampo utilizado dever ser o mesmo para a curva padro e pacientes) Curva de calibrao: A curva de calibrao deve ter o mesmo tempo de validade que o lote do reagente utilizado. Ao se abrir um novo lote de cefalina ou de plasmas deficientes, ou ainda, se os controles normais e patolgicos no estiverem dentro dos valores esperados, uma nova curva de calibrao deve ser realizada. Procedimento do teste 1. Diluir o plasma padro de referncia com tampo de escolha. A diluio inicial especfica para cada fabricante do reagente de fator VIII. Sendo assim, antes de se proceder diluio, deve-se consultar as determinaes do fabricante. Veja o exemplo na tabela 9 para uma diluio inicial 1:5 recomendada por um fabricante. Tabela 9. Calibrao para dosagem de fator VIII Tubos 1 2 3 4 Tampo 0,8 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml Calibrador 0,2 ml Misture e 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml transfira Diluio 1:5 1 : 10 1 : 20 1 : 40 100% Atividade do 50% 25% 12,5% fator

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5 0,5 ml 0,5 ml 1 : 80 6,25%

6 0,5 ml 0,5 ml 1 : 160 3,12%

7 0,5 ml 1 : 320 1,5%

A atividade de fator da diluio inicial ser correspondente a da bula do calibrador (plasma padro de referncia). 2. Pipetar 0,1 mL de cada diluio do calibrador em um tubo; 3. Adicionar 0,1 mL do plasma deficiente de fator VIII ou IX e 0,1 mL de cefalina. Misturar e incubar por 3 minutos a 37C; 4. Adicionar 0,1 mL de cloreto de clcio 0,025 M pr aquecido a 37 C e disparar, simultaneamente, o cronmetro; 5. Observar a formao do cogulo e parar o cronmetro ao primeiro sinal de formao da fibrina. O teste dever ser realizado em duplicata; 6. Colocar o valor encontrado (mdia da duplicata) no grfico, em papel mono-log, com as percentagens das diluies na abscissa e o tempo em segundos na ordenada; 7. Marcar os pontos, traando uma reta. Esta ser a curva de calibrao. 8. Para a amostra teste realizar as trs primeiras diluies (1/5, 1/10, 1/20) e proceder conforme os passos anteriores. A amostra teste, como j descrito, dever ser realizada em triplicata, sendo elas em diferentes diluies. 9. Resultados: o valor obtido das trs diluies da amostra teste dever ser interpolado na curva de calibrao obtida. Um paralelismo entre os pontos calibrador x paciente dever ser encontrado. Ento, deve-se calcular a mdia dos resultados em percentagem, respeitando um coeficiente de variao de 5% entre as diluies. A Figura 3 ilustra um exemplo de curva de calibrao e o paralelismo. Figura 3. Curva de calibrao-paralelismo na determinao de fator especfico

Adaptado do Diagnosis of haemophilia and other bleeding disorders: a laboratory manual - World Federation of Hemophilia, 2000 - com permisso 9.2.1.3. Inibidores Os testes de triagem/determinao de inibidor devem, sempre que possvel, ser realizados quando os nveis plasmticos de fator estiverem mais baixos, isto , de

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preferncia, aps pelo menos trs dias da ltima infuso de concentrado de fator. Altos nveis de fator podem mascarar a deteco do inibidor. Uma vez constatada a presena de inibidor, para confirmao diagnstica, imprescindvel uma segunda dosagem, que dever ser realizada dentro de 3-4 semanas aps a primeira dosagem. O sangue a ser colhido para o teste NO deve ser proveniente de veia heparinizada, cateter ou de sistemas de infuso tipo porth-a-cath. Para que se determine se o paciente desenvolveu um inibidor de baixa ou alta resposta de suma importncia que se faam titulaes do inibidor mensalmente ou, pelo menos, a cada trs meses. Esta conduta particularmente importante quando o tratamento do paciente envolve a infuso de concentrado de fator VIII ou IX. A existncia de um laboratrio capacitado para realizao de testes de triagem e de titulao de inibidores essencial para que o acompanhamento e tratamento de pacientes com hemofilia. 9.2.1.3.1. Tcnicas de deteco de inibidor So trs as tcnicas que podem ser realizadas para a deteco de inibidor em pacientes com hemofilia: teste de mistura, pesquisa de inibidor (ambos testes de rastreamento) e quantificao de inibidor 9.2.1.3.1.1 Deteco do inibidor pelo teste de mistura Inibidores da coagulao que afetam o teste TTPA podem ter uma ao imediata ou ser tempo-dependente. O plasma-teste, que contm um inibidor de ao imediata, quando misturado com plasma normal (pool de plasma normal), apresenta pouca ou nenhuma correo do tempo de coagulao. No caso de inibidores tempo-dependente, que so a maioria dos inibidores em pacientes com hemofilia A congnita, a incubao por 2 horas a 37C antes da realizao do teste de mistura fundamental para confirmao ou excluso da presena do inibidor. Uma boa correo (em segundos) do TTPA, aps a mistura com plasma normal, dever ser maior que 50% da diferena entre o TTPA do paciente pr-mistura e o TTPA do pool de plasma normal, conforme o exemplo da Tabela 10. Valores limtrofes podem requerer repetio do teste, pesquisa e/ou quantificao de inibidor, alm de anlise conjunta com os dados clnicos. Tabela 10. Exemplo de clculo da correo do TTPA pela mistura com pool de plasma normal Amostra Pool de plasma normal (A) Plasma Teste pr-mistura (paciente) (B) Plasma teste aps mistura (C) TTPA em segundos 35 segundos 60 segundos 42 segundos

Clculo Correo em segundos B C 60-42=18 Diferena entre B e A 60-35=25 Anlise: correo em segundos (18s) deve 18 > (25/2=12,5), ser maior que 50% da diferena entre B e A Concluso. correo eficaz Adaptado do Diagnosis of haemophilia and other bleeding disorders: a laboratory manual - World Federation of Hemophilia, 2000

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9.2.1.3.1.2 Deteco do Inibidor pelo teste de pesquisa de inibidor Neste tipo de teste, o pool de plasma normal e o plasma-teste so incubados separadamente a 37C por 2 horas, assim como a mistura (volume/volume) do pool de plasma normal com o plasma-teste. O TTPA ento determinado: (1) no pool de plasma normal, (2) no plasma-teste, (3) na mistura incubada e (4) em uma nova mistura com partes iguais de plasma-teste e do pool de plasma normal (volume/volume) preparada depois da incubao (mistura imediata). A no correo do TTPA nas misturas 3 ou 4 sugere a presena de um inibidor que poder ser de deteco imediata (mistura 4) ou tempo-dependente (mistura 3). Mtodo 4 tubos plsticos so preparados: A, B, C e D. Adicionar um volume de plasma normal (pool) no tubo A, um volume de plasma-teste no tubo B e uma proporo (volume/volume) de cada tubo (A e B) no tubo C. Incubar por 2 horas a 37C. Fazer uma nova mistura (volume/volume) do plasma do tubo A e B adicionando esta mistura ao tubo D (Mistura imediata). Realizar o TTPA em duplicata no material dos tubos A, C, D e B (nesta seqncia). Resultados e Interpretao Tendo em vista os possveis resultados, alguns exemplos esto descritos na Tabela 11. Tabela 11. Exemplos de resultado de testes para deteco de presena de inibidores Amostra (tempo em segundos) Exemplo 1 Exemplo 2 Exemplo 3 A- Plasma Normal (pool) 40 40 40 B- Plasma Teste 90 90 90

C- Plasma teste e plasma normal (mistura 45 70 70 incubada) D- Plasma teste e plasma normal (mistura 45 48 70 imediata) Adaptado do Diagnosis of haemophilia and other bleeding disorders: a laboratory manual - World Federation of Hemophilia, 2000 Exemplo 1: Houve correo na mistura incubada e na mistura imediata. Isto sugere deficincia de fatores da via intrnseca ausncia de inibidor. Exemplo 2: Houve correo na mistura imediata, mas no houve correo na mistura incubada. Isto sugere presena de inibidor tempo e temperatura dependente presena de inibidor. Exemplo 3: No houve correo em nenhuma das misturas. Isto sugere presena de um inibidor de ao imediata presena de inibidor. Obs. Para anlise dos resultados, os captulos 9.2.1.3.1.1 podero ser utilizados. 9.2.1.3.4 Quantificao de inibidor

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Uma vez detectada a presena do inibidor pelos testes de rastreamento relatados na sesso anterior, torna-se imperativa a quantificao do mesmo. Vrios mtodos tm sido descritos para se realizar a quantificao de inibidor em hemofilia. No entanto, o mtodo de Bethesda, inicialmente descrito por Kasper e cols. em 1975 e recentemente modificado pelo protocolo de Nijmegen (Verbruggen et al., 1995) o mais utilizado e o recomendado pela Federao Mundial de Hemofilia. 9.2.1.3.4.1 Mtodo Bethesda A verso original ou o mtodo clssico de Bethesda envolve a mistura da amostra do paciente com um mesmo volume de pool de plasma normal (plasma com nvel de fator VIII conhecido). Como a maior parte dos anticorpos associados a hemofilia A congnita so tempo e temperatura dependentes, a mistura deve ser incubada por 2 horas a 37C antes de se realizar a dosagem de fator VIII. Simultaneamente, o mesmo volume do pool de plasma normal (plasma com nvel de fator VIII conhecido) misturado com o tampo diluente para uma anlise em paralelo (Figura 4 A). Figura 4. Ilustrao esquemtica dos testes de Bethesda (A) e Bethesda modificado por Nijmegen (B).
A

Fonte: Hemofilia Congnita e Inibidor - Manual de Diagnstico e Tratamento de Eventos Hemorrgicos, Ministrio da Sade, 2008.

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9.2.1.3.4.2 Mtodo Nijmegen (Bethesda modificado) A variao de Nijmegen do mtodo de Bethesda envolve duas modificaes (Figura 4B): (1) o pool de plasma normal tamponado e estabilizado com imidazol e (2) o plasma controle misturado com o plasma deficiente em fator VIII ao invs de tampo com o pool de plasma normal tamponado. Estas modificaes, alm de diminuir a possibilidade de falso positivo, reduzem o coeficiente de variao, em comparao com o teste clssico de Bethesda, melhorando, assim, a confiabilidade do teste. Adicionalmente, estudos mostraram que as diferentes maneiras de se obter o substrato de fator VIII comercial (por meio imunolgico ou qumico), quando utilizado nesta tcnica, tm influncia significativa nos valores obtidos de ttulos de inibidor. Sendo assim, foi demonstrado que o substrato de fator VIII pode ser substitudo por uma soluo a 4% de soro de albumina bovina (BSA, Sigma-fraction V). A mesma tcnica poder ser utilizada para a determinao do inibidor de fator IX, mas o tempo de incubao para esta determinao poder ser de apenas 10 minutos, uma vez que o inibidor de fator IX no apresenta carter tempo-dependente. Tcnica para realizao do teste Bethesda Modificado por Nijmegen Preparo do plasma Controle (mistura 2) Preparar o pool de plasma normal tamponado (reagente A): adicionar imidazol slido (Merck, Damstadt, Germany) ao pool de plasma normal na concentrao final de 0.1 M. Ajustar para o pH 7.4 com adio lenta de HCl 1 N em constante agitao do plasma a 4C. Mistura 2: misturar 1 parte do pool de plasma normal tamponado (reagente A) com 1 parte de plasma deficiente em FVIII ou soluo a 4% de BSA (reagente B) (volume/volume). Preparo da amostra-teste (mistura 1): Mistura 1: misturar 1 parte do plasma do paciente (reagente C) com 1 parte de pool de plasma normal tamponado (reagente A) (volume/volume) Repetir o procedimento anterior a fim de obter diluies 1:2, 1:4, 1:8 do plasma do paciente. Estas diluies devem ser realizadas com o plasma deficiente em fator VIII quando este for utilizado no controle (reagente B) ou a soluo de 4% BSA quando esta for utilizada como controle (reagente B). Caso haja suspeita de inibidor de alto ttulo, estas diluies podem ser aumentadas. Exemplo: Tubo 1: 1 volume do plasma teste diludo 1:2 com plasma deficiente em fator VIII ou soluo a 4% de BSA + 1 volume do pool tamponado (reagente A). Tubo 2: 1 volume do plasma teste diludo 1:4 com plasma deficiente em fator VIII ou soluo a 4% de BSA + 1 volume do pool tamponado (reagente A). Tubo 3: 1 volume do plasma teste diludo 1:8 com plasma deficiente em fator VIII ou soluo a 4% de BSA + 1 volume do pool tamponado (reagente A). Anlise: Incubar a mistura 1 com as suas possveis diluies (exemplificadas acima como tubo 1, tubo 2, tubo 3) e a mistura 2 por 2 horas a 37C. Realizar a dosagem da atividade de FVIII:C de cada diluio (exemplificadas acima como tubo 1, tubo 2, tubo 3) Clculo da Quantidade de Inibidor:

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Clculo da atividade de fator residual: o valor da atividade de fator VIII de cada diluio (mistura 2) dever ser dividido pelo valor da atividade de fator VIII encontrado no plasma controle (mistura 1) e multiplicado por 100. A atividade residual de fator VIII versus a unidade Bethesda plotada em papel mono log em uma escala aritmtica (ver Anexo 3). Por definio, uma unidade Bethesda corresponde quantidade de inibidor capaz de neutralizar 50% da atividade de fator VIII plasmtico, aps incubao por 2 horas a 37C. A atividade residual de 100% o mesmo que 0 unidade Bethesda, sendo possvel ter um grfico que tenha correlao entre atividade de fator VIII residual e o ttulo de inibidor. importante notar que o ttulo de inibidor dever ser plotado em um grfico quando a atividade de fator residual estiver entre 25 e 75% (Figura 5). Para o clculo final de unidades Bethesda, deve-se considerar a diluio cujo fator residual estiver mais prximo de 50%. Os pontos so plotados em um grfico log - linear com valores prximos de 100%, 50% e 25% de atividade residual, correspondendo a 0, 1 e 2 Unidades Bethesda, respectivamente. No exemplo anterior, o plasma A testado nas diluies 1:10, 1:20 e 1:40 (estas diluies, assim como da figura a seguir so apenas um exemplo, podendo ser realizadas as diluies 1:2, 1:4, 1:8, conforme descrito anteriormente). O ttulo final obtido multiplicando-se o valor obtido pelo fator de diluio correspondente. Notar que as amostras evidenciaram unidades semelhantes de inibidor nas diversas diluies. Este resultado o mais freqentemente encontrado. No entanto, como a cintica de reao dos anticorpos pode ser varivel, ttulos muito diferentes de inibidores podem ser obtidos numa mesma amostra. A Figura 6 demonstra esse cenrio. Figura 5. Exemplo 1 do clculo da atividade residual do fator VIII

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Adaptado do Diagnosis of haemophilia and other bleeding disorders: a laboratory manual - World Federation of Hemophilia, 2000 - com permisso Em casos como este, o resultado deve ser baseado na menor titulao, isto , 1:10. Valores menores que 0,6 UB por ml de plasma so considerados negativos. No entanto, importante que se estabelea o valor de referncia negativo em cada laboratrio, atravs da determinao plasmtica de inibidor de fator VIII em um nmero representativo de indivduos normais.

Figura 6. Exemplo 2 do clculo da atividade residual do fator VIII

Adaptado do Diagnosis of haemophilia and other bleeding disorders: a laboratory manual - World Federation of Hemophilia, 2000 - com permisso Observao sobre os volumes usados nas reaes: Vrios fatores influenciam o volume a ser usado nas reaes descritas acima, entre eles mtodo (manual x automatizado), volume de plasma disponvel (adulto x criana), etc. Desta forma, o volume deve ser definido em cada laboratrio, devendo ser respeitada a proporo volume a volume. Em geral, volumes na ordem de 0,2 a 1 ml so adequados para os testes. 9.3. Coagulopatias raras A anlise dos resultados dos testes de triagem orienta a escolha do teste de diagnstico (dosagem especfica de fator) a ser realizado subsequentemente, conforme descrito na Tabela 12.

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Tabela 12. Correlao do teste de triagem com a dosagem especfica de fator Deficincias TP TTPA Teste da Mistura Via Extrinseca Deficincia de fator VII Via Intrnseca Deficincias de fator VIII, IX ou XI Anticorpo antifosfolipdeo Anticorpos anti-VIII ou IX Via Comum Deficincias Congnitas Fatores X, V ou protrombina A/Hipo/Disfibrinogenemia Hepatopatia/carncia de vitamina K Moderada Grave Anticoagulantes Heparina Antivitamina K Superdosagem de Heparina/antivitamina K prolongado Normal no se aplica

Normal Freqentemente Normal Normal

prolongado prolongado

prolonga do prolonga do prolonga do prolonga do prolonga do

Corrige No h correo Pode ou no haver correo

Corrige Corrige -------Corrige

prolongado prolongado Normal prolonga do Normal prolongado prolongado prolonga do Normal

---------------------

prolonga do Abreviaes: TP, tempo de protrombina; TTPA, tempo de tromboplastina parcial ativada; TTPA (1/2), Teste da Mistura Neste captulo, as deficincias de fatores consideradas raras sero abordadas de forma sucinta, evidenciando os mtodos laboratoriais disponveis para seu diagnstico. 9.3.1. Deficincia de fator VII A deficincia hereditria de fator VII uma doena rara, transmitida de forma autossmica recessiva, resultando em uma doena hemorrgica de gravidade varivel. A suspeita da deficincia de fator VII levantada pelo prolongamento do TP com TTPA normal.

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O nvel de fator VII pode ser avaliado por meio de ensaios funcionais, como o mtodo por coagulao em uma etapa. A leitura minuciosa das orientaes do fabricante dos reativos importante para a realizao do procedimento de acordo com as BPLC. Mtodo funcional. Tcnica em uma etapa: Fundamento: Consiste em medir o TP em uma mistura contendo a diluio do plasma a testar, um plasma substrato deficiente em fator VII, com concentrao normal de todos os demais fatores da coagulao, na presena de fosfolpides e clcio. Pode ser realizada em banho-maria a 37C pelo mtodo manual, bem como, em equipamentos semi e totalmente automatizados. Realiza-se uma curva de calibrao com diluies sucessivas do pool de plasma de referncia em tampo. O tipo de tromboplastina pode influenciar no resultado do teste. 1.2 Material e mtodos Plasma Substrato deficiente em fator VII Tromboplastina clcica Tampo Imidazol, ou Veronal, ou Owren Plasma de referncia Amostra teste Deve-se reconstituir o reativo de tromboplastina de acordo com as indicaes do fabricante e pr-aquec-lo a 37C; Curva de calibrao: deve-se realizar diluies seriadas do plasma de referncia, em tampo, partindo de uma diluio de 1/5 ou 1/10 (de acordo com o fabricante), equivalendo a 100%. aconselhvel que a curva de calibrao possua no mnimo 6 pontos. Os tubos com as diluies para a curva de calibrao e as do paciente a testar no devem permanecer alm de 30 minutos a temperatura ambiente, podendo ser mantidos em banho de gelo. Colocar em tubo de vidro a 37C. Cada diluio .........................................100 l Substrato deficiente em fator VII.............100 l Misturar e incubar por 1 minuto a 37C e adicionar: Tromboplastina clcica pr aquecida a 37 C............................200 l Medir o tempo para formao do cogulo. Realizar testes em duplicata. Resultados Plotar a percentagem da diluio na abscissa em papel di-logaritmo, e o tempo em segundo na ordenada. Valores de referncia O valor de referncia deve ser estabelecido localmente. 9.3.2. Deficincia de fator V A deficincia do fator V foi descrita em 1947, por Owren. uma deficincia rara, transmitida de forma autossmica recessiva, com prevalncia de 1:1.000.000 casos. O quadro clnico varivel. A condio heterozigtica geralmente no apresenta sintomatologia clnica, enquanto, a homozigtica apresenta sintomas leves, moderados

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ou graves. O diagnstico suspeitado pelo prolongamento do TP e do TTPA. O nvel de fator V avaliado em um laboratrio por meio de ensaio funcional, como o mtodo por coagulao em uma etapa, semelhante ao TP e por mtodo imunolgico. Mtodo funcional: Tcnica em uma etapa: 1.1 Fundamento: Consiste em medir o TP em uma mistura contendo a diluio do plasma a testar, um plasma substrato deficiente em fator V, com concentrao normal de todos os demais fatores da coagulao, na presena de fosfolpides e clcio. realizada em banho-maria a 37C por mtodo manual, bem como, em equipamentos semi e totalmente automatizados. Realiza-se uma curva de calibrao com diluies sucessivas do plasma de referncia em tampo. O tipo de tromboplastina pode influenciar no resultado do teste. A leitura minuciosa das orientaes do fabricante dos reativos importante para a realizao do procedimento de acordo com as BPLC. 1.2 Material e mtodos - Plasma Substrato deficiente em fator V - Tromboplastina clcica - Tampo Imidazol, ou Veronal, ou Owren - Plasma de referncia - Amostra problema: plasma citratado pobre em plaquetas Antes da realizao dos testes, caso as amostras plasma de referncia e problema estejam congeladas, devem ser descongeladas rapidamente a 37C, principalmente em se tratando dos fatores VIII e V, que so fatores da coagulao termolbeis. Deve-se reconstituir o reativo de tromboplastina de acordo com as indicaes do fabricante, e pr-aquec-lo a 37C. Curva de calibrao: deve-se realizar diluies seriadas do plasma de referncia, em tampo, partindo de uma diluio de 1/5 ou 1/10 (de acordo com o fabricante), equivalendo a 100%. aconselhvel que a curva de calibrao possua no mnimo 6 pontos. Os tubos com as diluies para a curva de calibrao e as do paciente a testar no devem permanecer alm de 30 minutos a temperatura ambiente, podendo ser mantidas em banho de gelo. Colocar em tubo de vidro a 37C. Cada diluio ...........................................100 l Substrato deficiente em fator V................100 l Misturar e incubar por 1 minuto a 37C, e adicionar. Tromboplastina clcica pr aquecida a 37 C.......................200 l Medir o tempo para formao do cogulo. Realizar em duplicata. Resultados Plotar a percentagem da diluio na abscissa em papel di-logaritmo, e o tempo em segundo na ordenada. Valores de referncia O valor de referncia deve ser estabelecido localmente. 9.3.3. Deficincia de fator X

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O fator X ocupa uma posio nica na cascata da coagulao como a primeira enzima envolvida no mecanismo comum de formao do cogulo. O fator X foi identificado na dcada de 50 por dois grupos independentes. Em 1956, Teifer et al. descreveram uma tendncia a sangramento em uma mulher de 22 anos de idade. Ela apresentou um tempo alterado do teste de gerao de tromboplastina e TP prolongado. Aps um ano, Hougie et al. descreveram parmetros anormais da coagulao em um homem de 36 anos, que apresentava TTPA prolongado, teste de gerao da tromboplastina alterado e prolongamento do teste do veneno da vbora Russell. um distrbio raro, de herana autossmica recessiva, com uma incidncia de 1:1.000.000 na populao geral. Vrios polimorfismos, que parecem no afetar os nveis do fator, foram identificados no gene que codifica o fator X. H pouca correlao entre a atividade de fator X e o risco de sangramento. Classicamente, o TP e o TTPA apresentam-se prolongados. O nvel de fator X pode ser determinado por 5 diferentes exames. Exames baseados no TP, de 1 etapa, ou no TTPA so suficientes para o diagnstico. Mtodo Funcional Tcnica em uma etapa Este o mtodo mais utilizado para dosagem de fator X, que consiste na determinao do tempo de coagulao, na presena de tromboplastina, em um sistema no qual todos os fatores esto presentes, constantes e em excesso, com exceo do previsto na amostra a testar. Material Plasma substrato deficiente em fator X Tromboplastina clcica Tampo Imidazol, ou Veronal, ou Owren Plasma de referncia Amostra problema: plasma citratado pobre em plaquetas Reconstituir o reativo de tromboplastina de acordo com as indicaes do fabricante e pr-aquec-lo a 37C; Curva de calibrao: realizar diluies seriadas do plasma de referncia, em tampo, partindo de uma diluio de 1/5 ou 1/10 (de acordo com recomendao do fabricante), equivalendo a 100%. aconselhvel que a curva de calibrao possua no mnimo 4 pontos. Colocar em tubo de vidro a 37C. Cada diluio...........................................100 l Substrato deficiente em fator X................100 l Misturar e incubar por 1 minuto a 37C e adicionar: Tromboplastina clcica pr aquecida a 37 C...........................200 l Medir o tempo para formao do cogulo. Realizar teste em duplicata. Resultados Os resultados se expressam em unidades/ml (U/ml) ou em %. A cada lote de reativos deve ser realizada uma nova curva de calibrao com diluies de plasma de referncia em tampo. Plotar a percentagem da diluio na abscissa em papel di-logaritmo e o tempo em segundo na ordenada.

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Valores de referncia O valor de referncia deve ser estabelecido localmente. 9.3.4 Deficincia de fator XI A deficincia de fator XI, tambm chamada de doena de Rosenthal, transmitida por herana autossmica recessiva, afetando assim, homens e mulheres. Muito mais rara que as hemofilias A e B, apresenta incidncia de 5% na populao de judeus Ashkenazes da Europa Central. Geralmente apresenta um quadro hemorrgico de moderada gravidade, podendo ser diagnosticado somente durante interveno cirrgica, mediante sangramento per ou psoperatrio. Mtodo Funcional Tcnica em uma etapa Baseia-se na tcnica do TTPA cujo principio medir o tempo de coagulao de uma mistura de ativador, substrato deficiente em fator XI, plasma a testar, fosfolpides e clcio. Materiais e mtodos: Plasma deficiente em fator XI Tampo Imidazol, pH 7,3 Reativo para realizao de TTPA Cloreto de Clcio 0.025 M Plasma de referncia Amostra problema: plasma citratado pobre em plaquetas Curva de calibrao: realizar diluies seriadas do plasma de referncia, em tampo imidazol, partindo de uma diluio de 1/10, que equivale a 100%. aconselhvel conservar estes tubos em banho de gelo at a realizao do procedimento. Colocar em tubo. Substrato deficiente em fator XI 50 l Plasma do paciente diludo 1/10 50 l Reativo para realizao de TTPA. 100 l Incubar a 37C por 1 minuto e adicionar: Cloreto de Clcio 0.025 M pr aquecida a 37 C.........................100 l Valores de referncia O valor de referncia deve ser estabelecido localmente. 9.3.5 Deficincia de fator XII A deficincia de fator XII um distrbio autossmico recessivo cujas implicaes clnicas continuam controversas. Apesar de esta deficincia resultar em TTPA prolongado, os pacientes no apresentam hemorragia, nem risco hemorrgico. Existem relatos de associao desta deficincia com trombose. Mtodo Funcional:

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Tcnica em uma etapa: Materiais e mtodos Plasma deficiente em fator XII Tampo Imidazol, pH 7,3 Reativo para realizao de TTPA Cloreto de Clcio 0.025 M Plasma de referncia Amostra problema: plasma citratado pobre em plaquetas Curva de calibrao: realizar diluies seriadas do plasma de referncia em tampo imidazol, partindo de uma diluio de 1/10, equivalendo a 100%. aconselhvel conservar estes tubos em banho de gelo at a realizao do procedimento. Colocar em tubo Substrato deficiente em fator XII 50 l Plasma do paciente diludo 1/10 50 l Reativo para realizao de TTPA 100 l Incubar a 37C por 1 minuto e adicionar: Cloreto de clcio 0.025M pr aquecida a 37 C. 100 l Valores de referncia O valor de referncia deve ser estabelecido localmente. 9.3.6 Deficincia de fator XIII A deficincia congnita de fator XIII um distrbio raro da coagulao, primeiramente descrito por Duckert et al., em 1960. O fator XIII responsvel pela estabilizao do cogulo. A deficincia de fator XIII est associada a sangramento clnico. Nos casos graves, com menos de 5% de atividade do fator, os pacientes podem apresentar sangramento de coto umbilical ao nascimento e hemorragia intracraniana, sendo ambas as manifestaes caractersticas da forma grave da doena. O modo de herana gentica parece ser autossmica recessiva, com prevalncia de 1 caso para cada 1-5 milhes de habitantes. Os resultados dos testes de TP, TTPA, fibrinognio e contagem de plaquetas esto dentro dos parmetros de normalidade. A mensurao indireta do fator XIII atravs do mtodo do princpio da solubilidade em soluo de uria 5 M ou soluo de cido actico a 1% aceitvel como um teste de triagem simples e especfico, embora de metodologia demorada. Alm disso, estes testes so de baixa sensibilidade, estando alterados somente nas deficincias graves de fator XIII. Assim, desejvel que testes enzimticos de maior sensibilidade sejam realizados para confirmao, deteco de casos leves/moderados da deficincia e estudos familiares. O quadro hemorrgico aparece somente em pessoas homozigotas com atividade de fator XIII inferior a 5%, enquanto que as heterozigotas so assintomticas. Procedimento teste de solubilidade do cogulo em uria 5 M ou cido actico 1% Fundamento A fibrina formada, na ausncia de fator XIII, se dissolve em uria 5 M ou em cido actico 1%. Colocar em um tubo de Kahn: Plasma do paciente ....................................200 l

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Soluo de cloreto de clcio 0.025 M........ 200 l Trombina (10 UI/ml) ...................................100 l Misturar e incubar por 30 minutos a 37C. Retirar do banho e adicionar: Soluo de uria 5 M ou cido actico 1%......3 ml Estas solues devem ser preparadas no momento do uso. Aps tampar os tubos, misturar por inverso para favorecer que o cogulo se desprenda da parede do tubo, deixando-o em seguida em temperatura ambiente. Observar a dissoluo do cogulo aps 30 minutos, 1, 2, 4 e 24 horas, aps a dissoluo do cogulo. Em se tratando da soluo de cido actico, observar o cogulo aps 10 e 30 minutos. O tempo de dissoluo diretamente proporcional a concentrao de fator XIII presente no plasma. Este tempo de observao no deve exceder 24 horas aps adio das solues citadas. 9.3.7. Deficincia de fibrinognio (fator I) Alteraes na molcula de fibrinognio comprometem a fase final da coagulao. Estas alteraes podem ser de natureza quantitativa ou qualitativa. A hipofibrinogenemia e a afibrinogenemia so relacionadas com uma alterao quantitativa de fibrinognio. So doenas hereditrias raras transmitidas de modo autossmico recessivo. A disfibrinogenemia, anomalia qualitativa que resulta na produo de fibrinognio anormal, mais freqente. A classificao da deficincia facilitada aps a comparao dos resultados obtidos pelo mtodo de Clauss, que determina a quantidade de fibrinognio funcional. Este o mtodo mais utilizado, estando disponvel para determinao manual ou automatizada. Mtodo de Clauss Fundamento Em presena de um excesso de trombina, o tempo de coagulao de um plasma diludo de forma adequada inversamente proporcional concentrao de fibrinognio plasmtico. O tempo de coagulao obtido comparado posteriormente com uma preparao de fibrinognio padronizada. Material e mtodo Plasma citratado pobre em plaquetas Tampo de Owren pH 7.35 Calibrador para fibrinognio Trombina Plasma diludo (calibrador ou paciente) ...200 l Incubar a 37C por 2 minutos Acionando o cronmetro, adicionar a trombina .........................200 l Registrar e plotar os valores em segundos encontrados em papel di-log das diluies da amostra, do calibrador e do paciente. As diluies da curva de calibrao devem ser escolhidas de forma que o tempo de coagulao obtido fique compreendido entre 8 e 25 segundos. Este intervalo freqentemente obtido em diluio 1:10 do calibrador em tampo Owren pH 7,35, equivalente a uma concentrao de fibrinognio de 1,5 a 4 g/l. Caso a concentrao de fibrinognio do paciente seja inferior ao tempo de 8 segundos ou superior a 25 segundos, deve-se repetir o teste utilizando diluies de 1:20 e 1:5, respectivamente, fazendo os ajustes em funo dos fatores de concentrao. Valores de referncia O valor de referncia deve ser estabelecido localmente.

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9.3.8 Deficincia de fator II (protrombina) A deficincia de fator II transmitida de modo autossmico e recessivo, sendo a forma grave muito rara. A deficincia pode ser quantitativa, na qual concentrao e atividade so comparveis, tal como na hipoprotrombinemia ou qualitativa com concentrao normal e atividade diminuda, tal como na disprotrombinemia. O diagnstico da deficincia sugestivo a partir de um prolongamento do TP, discreto prolongamento do TTPA e TT normal. O diagnstico realizado com a determinao do TP e a dosagem imunolgica da protrombina, que permite distinguir uma hipoprotrombinemia do quadro de uma disprotrombinemia. Material e Mtodo Plasma substrato deficiente em fator II Tromboplastina clcica Tampo Michaelis pH 7.35 Plasma de referncia Amostra problema: plasma citratado pobre em plaquetas Antes da realizao dos testes, caso as amostras, plasma de referncia e plasma teste, estejam congelados, as mesmas devem ser descongeladas rapidamente a 37C. Reconstituir o reativo de tromboplastina de acordo com as indicaes do fabricante e pr-aquec-lo a 37C. Curva de calibrao: realizar diluies seriadas do plasma de referncia, em tampo, partindo de uma diluio de 1/5 ou 1/10, equivalendo a 100%. aconselhvel que a curva de calibrao possua no mnimo 6 pontos. Os tubos com as diluies para a curva de calibrao e as do paciente a testar no devem permanecer alm de 30 minutos a temperatura ambiente, sendo aconselhvel manter em banho de gelo. Colocar em tubo de vidro a 37C. Cada diluio 100 l Substrato deficiente de fator II 100l Misturar e incubar por 1 minuto a 37C e adicionar: Tromboplastina clcica pr aquecida a 37 C 200 l Medir o tempo para formao do cogulo. Realizar teste em duplicata. Resultados Plotar a porcentagem da diluio na abscissa em papel di-logaritmo, e o tempo em segundos na ordenada. Em coagulmetros automatizados, os volumes utilizados so diferentes, alguns aparelhos realizam diluies das amostras automaticamente e a padronizao depende dos mesmos. Valores de referncia: O valor de referncia deve ser estabelecido localmente.

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10. Plaquetopatias 10.1. Introduo As plaquetas so fragmentos citoplasmticos, anucleados, derivados dos megacaricitos. Circulam na periferia do vaso na forma discide com dimetro que varia de 2 a 4 e com espessura de 0.9 . Quando ativadas emitem pseudpodes e mudam para a forma esfrica. No sangue perifrico, o nmero dessas clulas pode variar de 150.000 a 450.000/mm3. No mecanismo hemosttico, as plaquetas participam tanto da hemostasia primria (adeso, agregao e secreo) quanto da hemostasia secundria, fornecendo fosfolpides de membrana para o ancoramento e ativao dos fatores de coagulao. Adeso plaquetria Quando o vaso lesado ocorre exposio dos componentes subendoteliais (colgeno, fibronectina e laminina). O FVW circulante facilita a adeso inicial se ligando ao complexo glicoprotico plaquetrio Ib/IX/V, em condies de alta fora de cisalhamento. Essa interao favorece outras ligaes ao colgeno subendotelial atravs dos receptores GPIa IIa e GPVI que tambm promovem a ativao plaquetria. Agregao plaquetria A resposta da ativao plaquetria inclui mudanas da forma (esferide) com emisso de pseudpodes e exposio de fosfolpides de carga negativa na superfcie plaquetria, facilitando a interao com as protenas da coagulao. Alm disso, h a exposio do stio ligante do complexo GP IIb-IIIa ao fibrinognio e a interao plaquetafibrinognio-plaqueta e plaqueta-FVW-plaqueta (em local de alta fora de cisalhamento) resultando na agregao plaquetria. Secreo plaquetria Durante o processo de ativao, o contedo dos grnulos alfa, densos e lisossomais plaquetrios so secretados, amplificando o recrutamento e ativao de outras plaquetas circulantes para o local prximo leso. A partir dos grnulos alfa so liberados FVW, fatores de coagulao tais como fibrinognio, fator V, fator XI, fator XIII, a protena de adeso P-seletina, fator plaquetrio 4, -tromboglobulina, fatores de crescimento derivados de plaquetas, inibidor do plasminognio, vitronectina e trombospondina. Dos grnulos densos so liberados ADP, ATP, ons clcio e serotonina e dos lisossomos as glicosidases e proteases, enzimas crticas para a funo plaquetria. Concomitantemente, liberado o cido araquidnico ligado fosfatidilcolina da membrana plaquetria, por ao da fosfolipase A2. O cido araquidnico livre metabolizado pela enzima ciclo-oxigenase (COX) tendo como produto o eicosanide tromboxano A2 (TXA2), potente agente agregante e quimiottico para outras plaquetas e leuccitos. Esse produto, assim como o contedo dos grnulos, secretado para fora da plaqueta atravs do seu sistema canicular aberto. Outros processos bioqumicos envolvidos na agregao e secreo plaquetria O ADP liberado, a trombina gerada no incio da cascata da coagulao, colgeno e TXA2 se ligam aos receptores transmembrana especficos das plaquetas circulantes. O sinal de ativao para o interior da clula (transduo de sinal) transmitido pelas protenas G (mensageiros primrios) que ativam outras enzimas envolvidas na via metablica, tal como a fosfolipase C e protena C quinase, resultando na elevao citoplasmtica de ons clcio e fosforilao de protenas. A ativao enzimtica leva a mudanas no citoesqueleto favorecendo a emisso de pseudpodes, reao de liberao

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dos contedos intragranulares, ativao da fosfolipase A2 e produo do TXA2, exposio da membrana pr-coagulante e do complexo glicoprotico IIb-IIIa . Alteraes na funo plaquetria ou do nmero de plaquetas causam desequilbrio nas fases iniciais do sistema hemosttico, resultando em manifestaes hemorrgicas ou trombticas de varivel gravidade na dependncia do grau e tipo de alterao Alteraes plaquetrias quantitativas (plaquetopenias e plaquetoses) Plaquetopenias As plaquetopenias so classificadas de acordo com o nmero de plaquetas circulantes, sendo leve, moderada e grave se contagem for acima de 50.000/mm3, entre 20.000 e 50.000/mm3 e abaixo de 20.000/mm3, respectivamente. As plaquetopenias podem ser de causa adquirida ou hereditria.

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Plaquetopenias adquiridas Uma das principais causas de plaquetopenia adquirida devida a condio conhecida como pseudoplaquetopenia, plaquetopenia laboratorial ou plaquetopenia factcia, que acomete at 2% dos pacientes hospitalizados. A diminuio do nmero de plaquetas devido presena de plaquetas aglutinadas, que formam grumos e no so, ento, reconhecidas (contadas) pelos contadores eletrnicos. A confirmao pode ser realizada atravs de contagem das plaquetas em cmara de Neubauer ou esfregao de sangue em lmina. Esse fenmeno deve-se a modificao antignica na superfcie plaquetria ocasionada pelo anticoagulante EDTA. Na maioria das vezes, a coleta de sangue com citrato de sdio, ao invs do EDTA, evita a aglutinao plaquetria com a normalizao na contagem. Se colhidas em EDTA e processadas imediatamente aps a coleta, o efeito de agregao plaquetria in vitro pode no ser observado. Outra reao imunolgica, o satelitismo em que ocorre a adeso das plaquetas aos leuccitos, tambm cursa com contagem plaquetria bastante reduzida quando avaliada por contadores eletrnicos. Assim, mediante um resultado de contagem de plaquetas evidenciando plaquetopenia, deve-se sempre repetir a contagem atravs de coleta de sangue em EDTA com processamento rpido aps a coleta, coleta de sangue em citrato e/ou contagem de plaquetas em cmara ou esfregao de sangue perifrico. Caso o novo resultado evidencie plaquetas normais, o diagnstico sugestivo de pseudoplaquetopenia. Mediante manuteno do nmero reduzido, deve-se investigar outras causas de plaquetopenia. Outras causas de pseudoplaquetopenia so: a coagulao do sangue devido coleta inadequada levando ao aumento do consumo de plaquetas, presena de crio aglutininas e presena de plaquetas gigantes que, em equipamentos eletrnicos, so confundidas com leuccitos. As plaquetopenias adquiridas podem tambm estar presentes em doenas autoimunes, coagulao vascular disseminada, esplenomegalia, em doenas que levam a supresso da medula ssea por infeces (virais e bacterianas), drogas, infiltrao medular (leucemia, linfoma, neoplasia metasttica), em doenas que levam a reduo de produo de plaquetas pela medula ssea (anemia aplstica), por efeito dilucional (como por exemplo, aps transfuso de grande volume de concentrado de hemcias ou sangue total), dentre outras.

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Plaquetopenias hereditrias Embora raras, as plaquetopenias hereditrias so classificadas tendo-se como base o tamanho da plaqueta ou geneticamente, atravs da determinao da mutao gentica que ocasionou sua reduo. Alm de apresentarem nmero reduzido, algumas plaquetopenias tambm apresentam funo alterada. Plaquetas pequenas: podem estar presentes na sndrome de Wiskott-Aldrich (pool de estoque diminudo) e trombocitopenia relacionada ao cromossomo X. Plaquetas de tamanho normal: podem estar presentes na trombocitopenia amegacarioctica congnita e anemia aplstica de Fanconi. Plaquetas gigantes: podem estar presentes na sndrome de Bernard Soulier, pseudoDVW, anomalias relacionadas ao gene MYH9 (May-Hegglin, sndromes de Sebastian, Fechtner e Epstein) e sndrome da plaqueta cinza (ausncia de grnulo ). Plaquetoses A plaquetose a presena de nmero aumentado de plaquetas no sangue perifrico. Pode ser primria (tambm denominada de essencial e relacionada a doena mieloproliferativa) ou reativa que freqentemente assintomtica, mas pode causar trombose em alguns pacientes. 10.2. Testes laboratoriais para a quantificao das plaquetas e caracterizao de plaquetopenias hereditrias 1 - Contagem do nmero de plaquetas do sangue perifrico 2 - Anlise microscpica de esfregao de sangue em lmina corada com Leishman ou corantes especiais como May Grunwald, no caso de investigao de plaqueta cinza. 3 - Testes especiais (moleculares e bioqumicos) Contagem de plaquetas Mtodos manuais - Cmara de Neubauer - Mtodo de Fnio

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Mtodo de Fnio ou mtodo indireto Princpio As plaquetas so contadas em esfregao de sangue em lmina e posteriormente so relacionadas com o nmero de eritrcitos por mm3 de sangue. Alm quantificar o nmero, o mtodo de Fnio possibilita a avaliao da morfologia da plaqueta. Entretanto, este no um mtodo com boa exatido. Tcnica 1 Coletar o sangue com EDTA 2 Fazer o esfregao de sangue em lmina e cor-la com o corante apropriado 3 Contar as plaquetas existentes em, no mnino 10 campos que contenham cerca de 200 eritrcitos por campo 4 Contar o nmero absoluto de eritrcitos e relacionar com o nmero de plaquetas. Interpretao Alteraes morfolgicas das plaquetas Plaquetas gigantes e macroplaquetas: a presena de macroplaquetas no sangue perifrico sugere um turnover acelerado de plaquetas. Esto presentes quando ocorre destruio perifrica exagerada, como na prpura trombocitopnica imunolgica e tromboses extensas. J as plaquetas gigantes so encontradas nas sndromes de Bernard Soulier, plaqueta cinza, anomalia de May-Hegglin, sndromes de Sebastian, Fechtner e Epstein. Anisocitose plaquetria. plaquetas pequenas, normais e grandes sem predomnio de tamanho. encontrada em situaes nas quais existe acelerao do processo de produo de plaquetas, tal como nas sndromes mieloproliferativas e mielodisplsicas. Mtodo eletrnico Atualmente um grande nmero de equipamentos eletrnicos tem sido empregado na rotina de contagem plaquetria, sendo que a maioria deles utiliza o mtodo de impedncia eltrica ou sinal ptico. Os mais modernos, so baseados na deteco imunolgica por citometria de fluxo como auxlio de fluorocromos conjugados com o monoclonal CD61. Alm da acurcia na contagem, os mtodos eletrnicos permitem a avaliao de alguns parmetros plaquetrios, tal como o volume plaquetrio mdio (VPM) e a amplitude de distribuio das plaquetas (PDW) ou ndice de anisocitose plaquetria. O VPM tem sido utilizado para distinguir as plaquetopenias por reduo da sobrevida das plaquetas (VPM alto) das causadas por deficincia de produo medular (VPM baixo). Apesar da sensibilidade dos equipamentos eletrnicos, os de leitura por impedncia apresentam limitaes quanto descriminao de plaquetas de outras partculas de mesmo tamanho como o caso de plaquetas gigantes. Alm disso, estes equipamentos podem apresentar erros em contagens plaquetrias abaixo de 30.000/mm3. Alteraes plaquetrias qualitativas (plaquetopatias) As plaquetopatias podem ser de causa hereditria ou adquirida, sendo que as ltimas so mais freqentes. 10.3. Plaquetopatias hereditrias

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As plaquetopatias hereditrias podem ser diagnosticadas de acordo com alteraes de funo: -Defeitos primrios na interao plaqueta-parede de vaso (doenas de adeso): estas so a DVW e sndrome de Bernard Soulier (diminuio ou ausncia do complexo glicoprotico plaquetrio Ib/IX/V) Defeitos primrios na interao plaqueta-plaqueta (doena de agregao): estas so a afibrinogenemia (ausncia de fibrinognio plasmtico) e trombastenia de Glanzmann (alterao do complexo glicoprotico plaquetrio IIb-IIIa) Defeitos de estoque dos grnulos, secreo e transduo de sinal: A- Doena de pool de estoque - grnulo , densos ou ambos - doena de Quebec (estoque aberrante de ativador do plasminognio tipo uroquinase degradando o contedo dos grnulos ) B - Doena de secreo plaquetria e transduo de sinal - defeitos de interao plaqueta agonista devido a anormalidades nos receptores de TXA2, ADP e colgeno - alterao da metabolizao do cido araquidnico e sntese de TXA2, devido diminuio da liberao do cido araquidnico, deficincia das enzimas cicloxigenase ou tromboxano sintetase - defeito na ativao das protenas G (mensageiras primrias) - defeito no metabolismo do fosfatidilinositol ligado membrana celular - defeito na mobilizao de clcio intra citoplasmtico - deficincia da protena C quinase C- Doena de funo procoagulante - defeito na membrana fosfolipdica sndrome de Scott - fator V plaquetrio anormal (fator V New York) D- Defeitos na estrutura e componentes do citoesqueleto plaquetrio - doenas relacionadas com o gene MYH9 - sndrome de Wiskott-Aldrich - esferocitose plaquetria A prevalncia das doenas plaquetrias hereditrias na populao geral no est bem estabelecida. Contudo, em indivduos com ditese hemorrgica (por exemplo menorragia), a DVW, alterao de secreo e sinalizao plaquetria so mais comuns que as deficincias de grnulos, defeitos na produo de TXA2 e outras. 10.4. Plaquetopatias adquiridas Ao contrrio das plaquetopatias hereditrias, que so raras, as doenas de funo plaquetria adquiridas so comumente encontradas na prtica hematolgica. Algumas doenas sistmicas e vrias drogas podem estar envolvidas. Entre as doenas destacamse mieloma mltiplo, insuficincia renal, doenas mieloproliferativas, cirrose heptica, lpus eritematoso sistmico e situaes como a circulao extra-corprea. Quanto s drogas cita-se os antinflamatrios no esteroidais como o cido acetil saliclico (AAS), ibuprofeno, acetominofeno, anti-inflamatrios esteroidais, clopidogrel, ticlopidina, antibiticos em altas doses, anestsicos, tranquilizantes fenotiaznicos e outros. Os principais mecanismos associados disfuno plaquetria induzida por medicamentos so a inibio da sntese das prostaglandinas, aumento dos nveis de AMP cclico (cAMP) plaquetrio, e interferncia com a funo receptora da membrana plaquetria. Porm, a disfuno plaquetria secundria a doenas sistmicas est mais relacionada presena de protenas plasmticas anormais (por exemplo, paraprotenas

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do mieloma), protenas como produtos de degradao da fibrina (PDFs) e diminuio do contedo intragranular. 10.5. Testes laboratoriais Os testes laboratoriais, alm de auxiliar no diagnstico da disfuno plaquetria, so empregados para monitorao de drogas antiplaquetrias, de terapia pr-hemostticas, preveno de trombose ou sangramento e no controle de qualidade de plaquetas estocadas para transfuso. Testes iniciais ou de triagem 1- Contagem de plaquetas 2- TS Testes especficos 1- Agregao plaquetria por sistema ptico 2- Agregao plaquetria por impedncia Testes especiais 1- Avaliao da secreo do contedo intragranular ( e densos) 1.1 - Determinao plasmtica de fator plaquetrio 4 1.2 - Determinao plasmtica de -tromboglobulina 1.3 - Captao de serotonina plaquetria 1.4 - Luminescncia (liberao de ATP) 2- Citometria de fluxo para deteco das glicoprotenas de membrana plaquetria 3- Microscopia eletrnica 4- Estudos moleculares 5- Estudos de fosforilao de protena, expresso de receptor e outros At os anos 80 eram utilizados, na prtica clnica, apenas os testes tradicionais de funo plaquetria como. TS, agregao plaquetria por sistemas ptico e impedncia, alm de alguns testes bioqumicos. Desde o ltimo manual do Comit Britnico de Padronizao em Hematologia (BCSH) de 1988, uma variedade de novos testes de funo plaquetria foram desenvolvidos que incluram a citometria de fluxo e outros equipamentos. Novos equipamentos Os novos equipamentos utilizam pequenos volumes de sangue total, so rpidos, permitem a avaliao da funo plaquetria beira do leito do paciente e alguns deles simulam a alta fora de cisalhamento in vitro. Com exceo dos analisadores de funo plaquetria, a maioria dos equipamentos no est completamente validada. So equipamentos disponveis: - Analisador de funo plaquetria (ex, PFA-100) - VerifyNow utilizado exclusivamente para monitorao de antiagregantes - Impact R avalia a adeso e agregao sob alta fora de cisalhamento - Tromboelastgrafos avaliam a funo plaquetria interrelacionada coagulao - Plateletworks 10.5.1. Testes de triagem Contagem de plaquetas: vide sesso 10.2 TS Ivy O princpio e tcnica do TS foram discutidos no captulo 9.1.4.1.1.

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Interpretao O TS est prolongado na: - plaquetopenia (com plaquetas abaixo de 100.000/mm3) - sndrome de Bernard Soulier - trombastenia de Glanzmann - DVW (alguns tipos e subtipos) - plaquetopatias adquiridas: uremias, mielomas, hipo ou disfibrinogenemias, drogas. O teste apresenta vrias desvantagens, motivo pelo qual est sendo descontinuado na prtica clnica como teste de triagem das plaquetopatias. invasivo, pode formar cicatriz e quelide, pouco reprodutvel, dependente do operador, apresenta baixa sensibilidade disfuno leve e pouca correlao com a tendncia a sangramento. O TS influenciado por vrios fatores como, idade, sexo, temperatura, elasticidade da pele, hematcrito, local e a direo da inciso. H vrios anos o TS vem sendo substitudo pelos analisadores de funo plaquetria. Analisador de funo plaquetria Princpio O sangue total aspirado por um sistema fechado a vcuo atravs de um capilar de 147 m de abertura. Esse sistema simula a alta fora de cisalhamento alterando a estrutura do FVW. Para o funcionamento, o equipamento requer cartuchos contendo colgeno e ADP (CADP) ou colgeno e epinefrina (CEPI). As plaquetas interagem com o FVW modificado e aderem espontaneamente ao colgeno presente na membrana e agregam por estmulo de ADP ou adrenalina. O equipamento mede o tempo de ocluso, tempo esse requerido para o agregado plaquetrio obstruir a abertura e cessar o fluxo de sangue. Interpretao O tempo de ocluso (TO) prolongado, na maioria dos pacientes com disfuno plaquetria hereditria ou adquirida. Defeitos nos receptores de membrana das plaquetas como GPIIb-IIIa (trombastenia de Glanzmann) e GPIb (sndrome de Bernard Soulier) esto associados a um prolongamento do TO tanto no CADP quanto no CEPI. Na DVW, o analisador de funo plaquetria tem grande sensibilidade em detectar particularmente os tipos 2 e 3. Porm, nas doenas hemorrgicas leves e moderadas tais como doena de estoque e defeitos de secreo, a sensibilidade diminui consideravelmente. Outra indicao de uso do equipamento para monitorao de drogas antiagregantes como cido acetil saliclico. 10.5.2. Testes especficos Agregao plaquetria por sistema ptico O teste de agregao plaquetria por sistema ptico ou turbidimtrico considerado o mtodo padro ouro para a avaliao da funo plaquetria. Utiliza um equipamento capaz de detectar a transmisso luminosa atravs do plasma rico em plaquetas em suspenso. medida que as plaquetas se agregam por adio de um agente agregante ocorre diminuio da turbidez e um aumento proporcional da transmisso de luz que captada por um registrador acoplado ao equipamento. A agregao plaquetria por sistema ptico revela as diferentes fases da cintica de agregao quando o agonista adicionado ao plasma rico em plaquetas. Agregao plaquetria por sistema de impedncia

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O mtodo de impedncia eltrica permite a avaliao da funo plaquetria em condies fisiolgicas, quando realizada em sangue total. Baseia-se na quantificao do aumento progressivo da impedncia eltrica entre dois eletrodos introduzidos no tubo contendo sangue total ou plasma rico em plaquetas. Na medida em que as plaquetas se aderem aos eletrodos por adio do agente agregante, estas ativam e recrutam outras clulas para o local (outras plaquetas, leuccitos e eritrcitos) aumentando da resistncia eltrica. Diferente do sistema ptico, na agregao plaquetria por impedncia no h distino de primeira e segunda onda. Protocolo de coleta, processamento e execuo de agregao plaquetria por mtodo ptico As variveis pr-analticas e analticas determinam a confiabilidade dos resultados. A manipulao inadequada das plaquetas leva uma maior ativao in vitro com a perda do contedo intragranular com muita facilidade. A qualidade, o armazenamento e as concentraes dos agentes agregantes so muito importantes para o diagnstico das doenas plaquetrias. Coleta Puno e agulhas Para a coleta de sangue importante que o flebotomista tenha muita experincia, pois o excesso de manipulao da agulha danifica o tecido ocasionando uma maior exposio do subendotlio, liberao de fator tecidual e ativao plaquetria. recomendvel o uso de agulhas de calibre 21 para os adultos, por promoverem menor leso tecidual e hemlise. Para crianas recomenda-se o de nmero 23 devido ao calibre da veia. No caso de veia de difcil acesso, deve ser adotada a tcnica de duas seringas para facilitar o descarte dos trs primeiros mililitros de sangue. Alternativamente, se o sangue for colhido em tubo a vcuo, o primeiro tubo deve ser descartado. Tubos Os tubos de coleta devem ser de plstico ou de vidro revestido com silicone para evitar a adeso e ativao das plaquetas promovida pela carga negativa da superfcie do vidro. Aps a realizao de vrios testes foi demonstrado que o uso de tubos a vcuo no ativa as plaquetas, portanto podem ser utilizados. Anticoagulante O citrato de sdio 3.2% na proporo de 1 volume de anticoagulante para 9 volumes de sangue deve ser o anticoagulante utilizado para a coleta dos testes de agregao plaquetria. Nos casos em que o hematcrito estiver acima de 55%, faz-se necessrio a correo do volume de anticoagulante tal como descrito na sesso 6.1.1.1. Aps a coleta, mesmo em tubos a vcuo, deve-se homogeneizar as amostras delicadamente, sem a formao de espuma, de 4 a 5 vezes para evitar a ativao da coagulao e hemlise. Alm do hematcrito anormal, vrios medicamentos podem interferir na funo plaquetria, principalmente as drogas contendo cido acetil saliclico, antiinflamatrios no esteroidais, corticides, antihistamnicos, antibiticos, antidepressivos e outros. Nos casos em que o paciente no fizer uso contnuo, principalmente de medicamentos contendo cido acetil saliclico, a droga deve ser suspensa nos 10 dias que antecedem a coleta. Caso contrrio, o laboratrio deve ser informado para melhor interpretao dos resultados.

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Envio e processamento da amostra Aps a coleta, o material deve ser identificado e enviado imediatamente ao laboratrio temperatura ambiente. Se for colhido em local distante ao laboratrio, com necessidade de transporte motorizado, deve ser envolvido em plstico bolha e enviado temperatura ambiente com o mnimo de agitao. A agitao do sangue leva a ativao das plaquetas com perda do contedo intra-granular e conseqentemente uma resposta com resultado hipoagregante. O tempo entre a coleta da amostra e a realizao do teste no deve exceder 3 a 4 horas. Preparao do plasma rico em plaquetas Aps a coleta, o sangue centrifugado a 200 x g por 10 a 15 minutos temperatura ambiente (sem a opo brake da centrfuga para evitar a ressuspenso das plaquetas) para a obteno do PRP. Nota importante: os tubos devem ser centrifugados com tampa para a manuteno do pH entre 7.7 8.0. O PRP removido cuidadosamente com auxlio de pipeta plstica e colocado em tubo de polipropileno ou tubo siliconizado para evitar a ativao das plaquetas. Deve-se evitar tambm a formao de espuma e contaminao com eritrcitos e leuccitos, uma vez que a contaminao com eritrcitos pode levar a valores falsamente baixos. Uma pequena alquota deve ser retirada para a contagem das plaquetas do PRP, devendo o tubo ser tampado novamente. O PRP com nmero de plaquetas inferior a 150.000/ mm3 pode apresentar resposta diminuda. A concentrao de plaquetas por centrifugao no recomendvel por induzir a ativao. Nesses casos, deve-se reajustar o nmero de plaquetas do controle normal para o mesmo da amostra teste e comparar o padro de resposta. O reajuste do nmero de plaquetas do PRP com o PPP autlogo aceito por alguns centros e rejeitado por outros. De acordo com alguns autores, a resposta de agregao sofre pouca influncia quando o nmero de plaquetas do PRP varia entre 200.000/mm3 a 600.000/mm3. Porm, acima desses valores aconselha-se o reajuste para 300.000/mm3. Cattaneo e colaboradores mostraram que durante a centrifugao da amostra em alta velocidade, para a obteno do PPP, ocorre a ativao das plaquetas decorrente da liberao de ADP por eritrcitos e pelas prprias plaquetas, portanto em nenhuma hiptese deve-se reajustar o nmero de plaquetas com o PPP autlogo. Reajuste do nmero de plaquetas do plasma rico em plaquetas com o plasma pobre em plaquetas Aps a obteno do PPP do paciente, o reajuste do nmero de plaquetas deve ser calculado atravs de regra de trs. Exemplo: PRP = 800.000 plaquetas/mm3 para chegar a 300.000 plaquetas/mm3 800.000 300.000 = 2.6 Portanto, o PRP dever ser diludo 2.6 vezes 1 volume de PRP + 1.6 volumes de PPP Se o volume obtido do PRP for 4 ml 1 ml de PRP ----------------------------- 1.6 ml de PPP 4 ml de PRP ------------------------------ X ml de PPP X = 6.4 ml Portanto, a adio de 6.4 ml de PPP a 4 ml de PRP reajustar o nmero de plaquetas para 300.000/mm3

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Tempo A resposta plaquetria aos agonistas se altera com o tempo. Logo aps a preparao do PRP, as plaquetas so hiporresponsivas, provavelmente devido a desensibilizao dos receptores de ADP, que liberado por plaquetas e eritrcitos durante a centrifugao do sangue total. A verdadeira resposta se inicia aps 15 minutos, aumenta aos 30 minutos e permanece estvel at a terceira hora aps o preparo do PRP. Aps esse tempo, a resposta diminui novamente em conseqncia da exausto da reserva de energia da plaqueta. Portanto, a agregao plaquetria por sistema ptico deve ser realizada entre 15 a 30 minutos aps a preparao do PRP e finalizada dentro de 2 a 3 horas. Agentes agregantes plaquetrios O teste de agregao plaquetria, tanto por sistema ptico como por impedncia, emprega vrios agentes agonistas para o diagnstico de plaquetopatias e para o controle de drogas antiagregantes. Os agentes mais empregados so. ADP (adenosina 5 difosfato), epinefrina ou adrenalina (ADR), colgeno, cido araquidnico (AA), ristocetina e plasma bovino ou crioprecipitado. Embora as concentraes finais dos agonistas adicionadas s plaquetas sejam de extrema importncia no esclarecimento da alterao da plaqueta, at hoje no existe nenhuma padronizao internacional referente s doses que devem ser empregadas rotineiramente. Quanto escolha dos agonistas, deve ser dependente da suspeita clnica. Um exemplo a investigao laboratorial de trombastenia de Glanzmann que apresenta diminuio ou ausncia do complexo glicoproteco IIb-IIIa plaquetrio. Para seu diagnstico, os agonistas empregados so ADP, ADR, AA e colgeno cuja agregao dependente do complexo GPIIb-IIIa. O teste de agregao com ristocetina no indicado neste caso, pois o seu mecanismo de ao modificar a estrutura do FVW para melhor interagir com a glicoprotena Ib da plaqueta. Esse agonista utilizado nos diagnsticos laboratoriais de sndrome de Bernard Soulier (deficincia ou ausncia do complexo GPIb-IX-V), DVW e pseudoDVW. Concentraes dos reagentes As solues estoque devem ser mantidas conforme instrues do fabricante. ADP - as concentraes da soluo estoque so variveis. So dependentes da marca do reagente e equipamento utilizado. Vrios laboratrios utilizam, para uma maior estabilidade, a soluo estoque de ADP na concentrao de 3 mM. A soluo deve ser mantida a 200C e descongelada na hora do uso para posterior diluio com soluo fisiolgica 0,9%. Concentraes finais de 1 M a 10 M, em indivduos normais, promovem duas ondas distintas de agregao. A primeira onda representa a interao do ADP com os seus receptores especficos (P2Y12 e P2Y1) e a presena das glicoprotenas IIb-IIIa; a segunda onda se refere a resposta de liberao endgena de ADP e metabolizao do cido araquidnico em TXA2, potente agente agregante. Concentraes finais abaixo de 1 M induzem a primeira onda de agregao e segunda onda reversvel (desagregao). Concentraes finais entre 5 M a 10 M, em indivduos normais, promovem a fuso da fase primria e secundria. Concentraes finais de ADP recomendadas: 10 M (dose alta); 0,7 M (dose baixa) importante a utilizao de pequenos volumes do agonista (at 20 l) para no ocorrer diluio do PRP durante a reao de agregao plaquetria.

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Adrenalina ou epinefrina - as doses de adrenalina empregadas na agregao plaquetria variam de 5 M a 10 M. A adrenalina interage com os receptores adenrgicos e, assim como o ADP, dependente do complexo GPIIb-IIIa. A curva de agregao clssica com adrenalina consiste de uma primeira onda curta seguida de uma grande resposta secundria. Concentraes finais de adrenalina recomendadas: 5 M (dose alta); 1 M (dose baixa) Colgeno a suspenso mais estvel derivada de tendo de eqino (1 mg/ml) e deve ser estocado a 40C. As concentraes finais de uso variam entre 1 /ml a 5 g/ml. O colgeno na concentrao final de 1 g/ml utilizado na monitorao de inibio da cicloxigenase promovida pelo cido acetil saliclico, como antiagregante. J a concentrao de 5 g/ml avalia a via da fosfolipase C plaquetria. A resposta plaquetria in vitro ao colgeno definida inicialmente por interao com os receptores plaquetrios (GPIa/IIa; GPVI) que promove um aumento de densidade ptica devido mudana de forma seguida a uma fase de latncia, onde as plaquetas se aderem s fibras do colgeno e posteriormente com intensa agregao. Concentraes finais de colgeno recomendadas: 5 g/ml (dose alta); 1 g/ml (dose baixa) cido araquidnico (AA) - o reagente deve estar na forma de sal sdico para melhor solubilidade e a diluio deve ser com carbonato de sdio 0.1 M. A soluo estoque (50 mM) deve ser protegida da luz, no ter contato com oxignio para preveno de oxidao e mantida a -200C. Quando as plaquetas so estimuladas com o agonista AA em concentraes finais de 0.5 mM a 1 mM avaliada a via enzimtica da cicloxigenase. Ocorre uma rpida metabolizao deste composto pela cicloxigenase a endoperxidos cclicos e TXA2, com formao de uma nica onda de agregao. Alm de ser empregado para o diagnstico laboratorial de deficincia hereditria da cicloxigenase e trombastenia de Glanzmann (deficincia ou ausncia do complexo GPIIb-IIIa), utilizado no controle teraputico do antiagregante plaquetrio, cido acetil saliclico (AAS) na concentrao final de 1 mM. Concentraes finais de cido araquidnico recomendadas: 0.5 mM (dose alta); 0.06 mM (dose baixa) Ristocetina um antibitico que atua como cofator da ligao FVW plasmtico GIb plaquetrio. Para investigao da DVW, as concentraes finais de ristocetina devem ser: 0.6 mg/ml e 1.2 mg/ml. A ristocetina tambm utilizada na investigao da sndrome de Bernard Soulier. Devido a deficincia ou ausncia do complexo GPIb/IX plaquetrio, a resposta ristocetina diminuda na concentrao final de 1.2 mg/ml. Para a diferenciao laboratorial de DVW e sndrome de Bernard Soulier adicionado um volume de 15 l de plasma bovino ou crioprecipitado (ricos em FVW) a 400 l de PRP. Se houver agregao plaquetria, significa que no plasma teste havia deficincia de FVW, presente no plasma bovino. Caso contrrio, se caracteriza que a ausncia ou deficincia da GPIb/IX para interagir com o FVW. Agregao espontnea: deve ser realizada para todos os pacientes. O mesmo volume de PRP, que utilizado para os agonistas plaquetrios, colocado no agregmetro sem nenhum estmulo. Se positiva (> 15%), revela hiperagregao plaquetria mesmo se com os outros agentes agonistas a resposta for diminuda. Nesse caso indica que as plaquetas estavam sensibilizadas por contato prvio na circulao com os agonistas. A

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Figura 7 mostra as curvas caractersticas de agregao plaquetria com os agentes agonistas ADP, adrenalina, colgeno e cido araquidnico.

(A)ADP5M (duas ondas distintas) ADP

ADP (C) adrenalina 5 M (D) colgeno 5 g (E) cido araquidnico 0.5 M (B) ADP 10 M (duas ondas fundidas)

(A)

(B)

adrenalina

colgeno

(E)

fase de latncia

cido araquidnico

Figura 7. Curvas de agregao plaquetria por sistema ptico com os agonistas ADP, (D) (C) adrenalina, colgeno e cido araquidnico

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Tcnica de agregao plaquetria por sistema ptico O volume de PRP e dos agentes agregantes so variveis e dependem do equipamento utilizado. Porm, a concentrao final dos reagentes deve ser padronizada. Interferncias e limitaes: O teste sofre interferncia da presena de lpides, quanto s limitaes, o sistema ptico perde a sensibilidade se o nmero de plaquetas for inferior a 100.000/mm3. Resultados: Os resultados de agregao plaquetria por sistema ptico podem ser expressos em amplitude de agregao (%), com estabelecimento prvio da variao normal de amplitude para cada agente e concentrao ou qualitativos (normoagregante, hipoagregante, ausncia de agregao ou hiperagregante). Interpretao: Devido ao grande nmero de fatores interferentes, os resultados de agregao plaquetria requerem certa cautela quanto interpretao. Os medicamentos que contm aspirina no devem ser ingeridos durante 10 dias que antecedem a prova, a no ser que seu efeito sobre as plaquetas esteja sendo investigado. Alm da aspirina outras substncias podem interferir na funo plaquetria como outros antiinflamatrios no esteroidais e esteroidais, antihistamnicos, antibiticos, antidepressivos, diurticos, vasodilatadores, beta-bloqueadores e bloqueadores de canal de clcio. Alguns componentes que fazem parte da dieta normal quando ingeridos em excesso como lcool, cebola, alho, gengibre podem diminuir a agregao plaquetria. A tabela 13 lista vrias drogas, alimentos e complementos que interferem na funo plaquetria. Tabela 13. Drogas, alimentos e complementos que intereferem na funo plaquetria
AGENTE Abciximab (ReoPro) Ticlopidina , clopidogrel Epoprostenol MECANISMO DE AO Inibio GPIIb-IIIa Inibio receptores de ADP Ativao da adenil ciclase

Anti-inflamatrios no esteroidais (AAS) Inibio da gerao de TXA2 Bloqueadores de canais de clcio Antidepressivos tricclicos, fluoxetina Estatinas Anestsicos Avaliao Inibio dos canais de clcio Inibio da captao de serotonina Interferncia na via de sinalizao

Diminuio da agregao qualitativa de agregao plaquetria por sistema ptico Avaliando-se qualitativamente os resultados de agregao plaquetria, quando Fenotiaznicos Diminuio da agregao empregados os agentes agonistas ADP, adrenalina e cido araquidnico considera-se resposta normal quando as plaquetas apresentam a primeira de TXA2 primria) e leos de peixe Reduo da gerao (resposta segunda (resposta secundria) onda de agregao com as doses mais altas e apenas a primeira onda nas doses mais baixas do agonista. Quanto a resposta ao colgeno, devese valorizar a fase de latncia e a presena da segunda onda nas doses finais de 1 g/ml a 5 g/ml.

Avaliao quantitativa da agregao plaquetria por sistema ptico A avaliao por amplitude de agregao deve estabelecer previamente os valores normais para cada agente e as suas respectivas doses. Se a amplitude de agregao plaquetria do paciente estiver dentro dos valores estabelecidos, considerada normal.

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importante observar o perfil das curvas de agregao, sendo possvel que a amplitude de agregao esteja dentro dos valores de referncia, mas com a ausncia da segunda onda de agregao. A resposta hipoagregante, tanto para o ADP, adrenalina, cido araquidnico e colgeno resultado da ausncia da segunda onda de agregao plaquetria com altas doses do agonista. Em relao amplitude de agregao, os resultados esto abaixo do valor normal estabelecido pelo laboratrio. A ausncia da segunda onda de agregao pode ser devido a vrios fatores como deficincia de grnulos ou de seu contedo, deficincias de cicloxigenase, tromboxano sintetase, contedo granular, outras alteraes relacionadas com o metabolismo plaquetrio e drogas, sendo este o mais freqente. Alguns estudos mostram que cerca de 16% da populao normal apresenta hipo ou ausncia de agregao plaquetria com adrenalina. A ausncia de agregao plaquetria pode ser decorrente deficincia ou ausncia de receptores especficos como P2Y12 e P2Y1 (alterao dos receptores de ADP), GPIaIIa e GPIV (receptores de colgeno), GPIIb-IIIa (receptor de fibrinognio de FVW Trombastenia de Glanzmann), deficincia das protenas G e transduo de sinal. A agregao plaquetria com ristocetina diminuda na DVW (tipos 2A, 2M e 3) e tambm na sndrome de Bernard Soulier. J na DVW do tipo 2B (FVW apresenta grande afinidade pelo receptor GPIb) e pseudoDVW (plaquetas com grande afinidade pelo FVW) as baixas doses de ristocetina (0.6 mg/ml) promovem intensa agregao plaquetria. A agregao plaquetria com plasma bovino normal na DVW e ausente na sndrome de Bernard Soulier. A resposta hiperagregante detectada quando se utiliza baixas doses do agente agonista. Enquanto que as plaquetas normais apresentam apenas uma pequena onda primria de agregao, as plaquetas hiperagregantes secretam normalmente. Agregao plaquetria por sistema de impedncia A agregao por sistema de impedncia no requer processamento do sangue total, portanto as plaquetas no so ativadas. Em casos de hematcrito normal, o sangue total diludo 50% com soluo fisiolgica. Se o hematcrito estiver abaixo de 25% recomenda-se utilizar a amostra sem diluio. Esse mtodo favorece a investigao da agregao em crianas devido ao pequeno volume de sangue utilizado, bem como a interao das plaquetas com eritrcitos e leuccitos. Diferentemente ao sistema ptico apresenta apenas uma onda de agregao plaquetria. Concentrao dos reagentes ADP a agregao em sangue total requer concentraes finais de 5 M e 10 M. Alm de auxiliar no diagnstico de plaquetopatias hereditrias, o agonista de escolha para monitorao teraputica das tienopiridinas (clopidogrel e ticlopidina). Adrenalina no utilizada em sangue total por ser um agonista muito fraco. cido araquidnico da mesma forma que no sistema ptico, utilizado no controle teraputico do AAS, na concentrao final de 0.5 M. Colgeno quando utilizado em baixas concentraes (1 a 2 g ml), inibido por AAS e em concentraes mais altas (5 g/ml), a agregao plaquetria com colgeno no afetada. Trombina apesar de ser um agente agonista forte, mais utilizado na investigao de secreo plaquetria. Na rotina laboratorial de agregao plaquetria pouco utilizada por induzir a formao de fibrina.

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Ristocetina - na concentrao final de 1.0 mg/ml, indivduos normais apresentam impedncia eltrica maior que 5 ohms e tempo de latncia < que 70 segundos. J os pacientes com DVW tipo 2B, apresentam impedncia eltrica maior que 20 ohms, em baixas concentraes (0.5 e 0.25 mg/ml) de ristocetina. Interferncias e limitaes. A agregao em sangue total por impedncia sofre interferncias de drogas que atuam no metabolismo plaquetrio, hematcrito baixo e limitada em amostras contendo plaquetas abaixo de 50.000/mm3 Resultados: a amplitude de agregao expressa em Ohms Interpretao Cada laboratrio deve estabelecer os seus valores de referncia para cada um dos agentes agregantes em diferentes concentraes. Consideraes finais sobre agregao plaquetria - O tempo entre a coleta e execuo do teste deve ser de no mnimo 15 minutos (tempo suficiente degradao de prostaciclina liberada na coleta de sangue) e no mximo 3 horas (acima desse tempo, o citrato de sdio retira clcio intracelular) - O tempo de reao deve ser no mnimo de 5 minutos - Os reagentes devem ser mantidos em banho de gelo durante a reao - Tanto o PRP quanto o sangue total devem ser mantidos temperatura ambiente - O PRP deve ser adicionado no tubo de reao imediatamente antes da reao - A resposta de agregao plaquetria alterada deve ser repetida outras vezes para a confirmao do diagnstico - A agregao plaquetria do paciente deve ser sempre comparada ao pool de PRP de indivduos normais sem uso de medicamentos - O diagnstico laboratorial das alteraes de funo plaquetria dependente das variveis pr-analticas e analticas - O perfil de curva de agregao plaquetria por sistema ptico deve ser sempre considerado. - At hoje no h CQE de agregao plaquetria com o uso de plaquetas frescas no teste. Para tal, deve-se utilizar, como controle, em paralelo ao teste do paciente, um pool de PRP de indivduos normais (n=10), obtido nas mesmas condies. 10.5.3. Testes especiais Esses testes so complementares para o diagnstico, porm so realizados apenas em centros especializados. Avaliao de secreo plaquetria Para dar continuidade investigao das plaquetopatias, principalmente em pacientes que apresentam sangramento e ausncia de segunda onda de agregao, a avaliao da secreo plaquetria torna-se necessria para o diagnstico. Pode-se avaliar a secreo dos grnulos atravs da determinao plasmtica do fator plaquetrio 4 (PF4) e tromboglobulina (TG) por kits comerciais de reao por ELISA. Outro marcador, que amplamente utilizado a P-seletina, que pode ser determinada no plasma como P-seletina solvel ou ligada membrana plaquetria por citometria de fluxo. Para avaliao da secreo dos grnulos densos podem ser utilizados dois marcadores distintos, a serotonina e o ATP. A serotonina um agonista plaquetrio natural e rapidamente seqestrada pelos grnulos densos. O mtodo se baseia na incubao das plaquetas em sangue total ou em PRP durante 30 minutos com serotonina marcada com carbono14. Posteriormente, as plaquetas so ativadas e radioatividade medida na secreo.

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Por utilizar material radioativo, essa metodologia, embora bastante sensvel, tem sido evitada. O mtodo alternativo de avaliao de secreo de grnulo denso a liberao do nucletdeo ATP em paralelo agregao plaquetria. O mtodo emprega o agregmetro de luminescncia e o sistema enzimtico, luciferina/luciferase, podendo ser realizado tanto em PRP como em sangue total. O ATP liberado dos grnulos densos, em resposta a um agonista, reage com luciferina na presena da enzima luciferase emitindo luz que rapidamente captada. A resposta comparada a um padro de ATP de concentrao conhecida. Os agonistas utilizados para a avaliao de secreo de ATP so. o ADP (5 M e 10 M), colgeno (2 g/ml e 5 g/ml) e trombina (1 U/ml). A ausncia ou diminuio da secreo de ATP de plaquetas estimuladas principalmente com trombina indica doena de estoque de grnulos densos. Em casos em que a liberao de ATP normal somente em concentraes muito altas do agente agregante, sugere defeito de liberao. Citometria de fluxo A citometria de fluxo tem sido amplamente utilizada tanto na confirmao de plaquetopatias hereditrias quanto na avaliao de funo plaquetria em diferentes condies clnicas. Para a investigao so utilizados anticorpos monoclonais marcados com fluorescncia direcionados a antgenos glicoproticos de membrana plaquetria ou a protenas que so liberadas durante a ativao, tais como P-seletina (grnulo ) e granulofisina (grnulos lisossomais). Alm de anticorpos, outras substncias fluorescentes, como a mepacrina, podem utilizadas para a avaliao do contedo dos grnulos densos. Anticorpos monoclonais utilizados GIIb- IIIa: CD41a para investigao de trombastenia de Glanzmann GPIb: CD42b para investigao de sndrome de Bernard Soulier P-seletina: CD 62P para investigao da doena de estoque de grnulo e avaliao de ativao plaquetria Granulofisina: CD63 (ausente na sndrome de Hermansky-Pudlak e aumentada na ativao plaquetria) Anexina V: para avaliao da atividade pr-coagulante das plaquetas e pesquisa de sndrome de Scott Avaliao do contedo dos grnulos densos: mepacrina Microscopia eletrnica A metodologia bastante sofisticada e somente disponvel em centros altamente especializados. til no diagnstico de investigao de secreo plaquetria, revelando a presena ou ausncia de grnulos e o seu contedo. Concluses - O diagnstico laboratorial das alteraes de funo plaquetria dependente das variveis pr-analticas e analticas - Os testes de agregao plaquetria no esto padronizados, principalmente no que refere s doses dos agonistas - O perfil de curva de agregao plaquetria por sistema ptico deve ser sempre considerado - As disfunes plaquetrias encontradas por agregao plaquetria devem ser sempre repetidas para a confirmao do diagnstico

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