I Escola Brasileira de Inteligncia

Artificial e Bioinformtica InBio

So Carlos

Mdulo: Biologia
Molecular

Responsvel: Dr. Flvio Henrique Silva

Uma atividade de difuso do:

- Dezembro de 2001 -

Introduo Biologia Molecular

ndice

Introduo ......................................................................................................................... 2
O cido Desoxirribonuclico DNA............................................................................... 2
O Dogma Central da Biologia Molecular ....................................................................... 5
Perpetuao da informao gentica (replicao) ......................................................... 7
Decodificando o DNA (Transcrio e Traduo)........................................................... 9
Manipulao do DNA ....................................................................................................... 11
Enzimas de restrio e vetores......................................................................................... 11
Amplificao do DNA in vitro: A reao em cadeia da polimerase PCR............. 13
Clonagem ........................................................................................................................... 15
de cidos nuclicos ........................................................................................................... 17
Seqenciamento de DNA.................................................................................................. 18
Utilizao da tecnologia do DNA recombinante ............................................................ 19
Produo de protenas ...................................................................................................... 19
Tipagem -DNA "fingerprint" .......................................................................................... 20
Aplicaes na medicina .................................................................................................... 22
Terapia Gnica .................................................................................................................. 23
Leitura Recomendada ...................................................................................................... 24

Nota: Esta apostila foi elaborada por alunos do curso de Introduo engenharia
gentica da UFSCar (ano de 1999), com superviso, adaptaes e edies do Prof.
Flvio Henrique Silva.

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Introduo Biologia Molecular

Introduo
O cido Desoxirribonuclico - DNA
Foi intuitivamente que o homem comeou a fazer uso da gentica a seu favor.
J em 9000 A.C., mesmo sem compreender alguns conceitos, que seriam descobertos
mais tarde, o homem selecionou as melhores sementes para o plantio e escolheu os
animais mais vigorosos para a reproduo. Os primeiros filsofos da humanidade j
falavam de alguns fenmenos genticos (sem saber a suas causas) e com o desenvolver
da sociedade pessoas de todas as reas como mdicos, matemticos, fsicos, padres e
filsofos, tambm contriburam com idias para o entendimento da hereditariedade.
No sculo XVII, um monge Augustiniano chamado Gregor Mendel, deu o
primeiro grande passo para desvendar a hereditariedade. Atravs da anlise dos
cruzamentos entre ervilhas, Mendel deduziu a presena de fatores hereditrios que eram
propagados de forma estvel de gerao a gerao, sendo responsveis pela formao de
caractersticas individuais.
Com o avano dos estudos de biologia celular, pde-se determinar quais os
principais componentes moleculares da clula. Durante muito tempo as protenas
carregaram o papel de propagadoras da informao hereditria. Em 1928, Frederick
Griffth, um mdico londrino, em experimentos com Pneumococcus, clulas bacterianas
causadoras de pneumonia, descobriu o fenmeno da transformao. Neste experimento
foi mostrado que Pneumococcus patognicos, portadores de cpsulas, quando mortos
por calor e colocados em contato com clulas de uma linhagem no encapsulada, e no
patognica, era capaz de transformar as clulas no patognicas em clulas patognicas
encapsuladas e letais (figura 1).

Figura 1- O experimento que levou Griffith a propor um "Princpio Transformante".

Camundongos que recebiam a mistura de bactrias patognicas mortas e no
patognicas vivas morriam por pneumonia e possuam clulas encapsuladas
(patognicas em seu sangue).
Alguns anos mais tarde, em 1942, Avery e colaboradores, baseados no
experimento de Griffith, separaram o extrato celular em vrias fraes (protenas, DNA,
RNA, lipdeos e carboidratos) e repetiram o experimento com os Pneumococcus.
Apenas a frao contendo DNA recuperou a capacidade das bactrias formarem
novamente a cpsula. A frao de DNA no perdia a sua capacidade transformante
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quando tratada com proteases ou quando era aquecido, todavia, o mesmo no valia para
o tratamento com DNAse.
Outro experimento que ajudou a confirmar que o DNA era o material gentico,
foi o clssico experimento do liquidificador de Alfred Hershey e Martha Chase em
1952. Para esse experimento marcaram-se duas culturas de fagos T2, uma com fosfato
radioativo (32P) e outra com enxofre radioativo (35S), sendo que o fosfato se incorporaria
ao DNA e o enxofre s protenas. De infeces paralelas de E. coli com fagos marcados
com enxofre e fosfato radioativos foram tiradas amostras em diferentes tempos e estas,
foram agitadas em um liquidificador de forma a separar as cpsulas dos fagos das
bactrias. Aps isso, as culturas foram centrifugadas, pois as cpsulas virais ficariam no
sobrenadante e as clulas ficariam no precipitado. Foi constatado que grande parte do
32
P ficava na frao bacteriana, enquanto que a maior parte da frao protica ficava no
sobrenadante. Dessa forma, Hershey e Chase constataram que o que passava para dentro
da bactria, e que era responsvel pela formao dos outros fagos, era o DNA e no as
protenas.

Figura 2- O experimento do liquidificador de Hershey e Chase para ajudar a

confirmar que o DNA o responsvel pela hereditariedade.
Apesar da constatao de que o DNA desempenhava um papel imprescindvel na
hereditariedade, a comunidade cientfica ainda relutava um pouco para consider-lo
como o carregador da informao gentica. Em 1953 James Watson e Francis Crick,
baseados em vrios trabalhos da poca sobre o DNA (Como o trabalho de Chargaff,
sobre a composio do DNA e as propores das bases e os trabalhos de Wilkins com
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difrao de raios-X de molculas de DNA), publicaram na revista cientfica Nature um

trabalho denominado Molecular Structure of Nucleic Acids- A Structure for
Deoxyribose Nucleic Acid (Estrutura molecular dos cidos nuclicos- Uma Estrutura
para o cido Desoxirribonuclico), que descrevia a estrutura do DNA.
Watson e Crick descreveram o DNA como uma dupla fita, enrolada em hlice ao
redor de um eixo, sendo as fitas antiparalelas. O DNA possui uma estrutura peridica
que se repete a cada 10 nucleotdeos. As bases nitrogenadas das duas fitas esto
voltadas para o interior da hlice e pareiam de forma complementar entre si, na qual
Adenina se liga a Timina e Guanina se liga a Citosina (figura 3).

Figura 3 - A ligao entre os nucleotdeos, A com T e C com G, e duas representaes

da estrutura do DNA.
Somente depois do modelo de Watson e Crick o DNA foi considerado o material
gentico, pois sua prpria estrutura j dava fortes indcios de como ocorreria a sua
propagao (Replicao) e como era guardada a informao gentica. No mesmo ano,
Watson e Crick publicaram mais dois trabalhos falando sobre o assunto e em um deles,
devido obviedade do seu modelo, so discutidas as implicaes moleculares do
modelo na gentica, comentando sobre as mutaes e sobre a replicao. O
reconhecimento final do trabalho de Watson e Crick veio em 1963 com o recebimento
do Prmio Nobel.

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Figura 4 Os descobridores da estrutura do DNA: Watson ( direita) e Crick (

esquerda)

O Dogma Central da Biologia Molecular

O dogma central define o paradigma da biologia molecular, em que a
informao perpetuada atravs da replicao do DNA e traduzida atravs de dois
processos: A transcrio que converte a informao do DNA em uma forma mais
acessvel (uma fita de RNA complementar) e atravs da traduo que converte a
informao contida no RNA em protenas (Figura 5).

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Figura 5. O Dogma Central da Biologia Molecular. A exceo a replicao

retroviral, na qual o RNA viral molde para sntese do DNA do provrus.

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Perpetuao da informao gentica (replicao)

A replicao o processo pelo qual uma molcula de DNA se duplica dando
origem a duas molculas idnticas a molcula inicial e envolve um conjunto de
protenas.
O primeiro passo para a replicao do DNA a abertura das fitas, feita pela
enzima helicase. Para manter as fitas desenroladas protenas chamadas SSBP (single
strand binding protein) se ligam nas fitas recm-desenroladas evitando que se associem
de novo. Com o desenrolamento das fitas em um ponto, as regies adjacentes sofrem
um super-enrolamento, o que dificultaria a continuao do processo. As
topoisomerases resolvem esse problema fazendo cortes em uma das fitas de DNA, que
se desenrola, e religando-as, diminuindo a tenso provocada por esse superenrolamento.
A sntese de novas fitas feita pela enzima DNA-polimerase, sendo que esta
enzima no pode sintetizar outra fita a partir de nucleotdeos livres. Dessa forma, a
DNA polimerase precisa de um Primer, que um pedao de RNA sintetizado por
uma RNA polimerase especial chamada Primase (Figura 6).

Figura 6 Esquema mostrando o papel das protenas envolvidas na replicao.

Em bactrias existem trs tipos de polimerases:
A DNA polimerase I, possui baixa capacidade de polimerizao 5 3 e a nica que
possui atividade exonuclesica 5 3em DNA dupla fita.
A DNA polimerase II, possui uma capacidade de polimerizao baixssima e o seu
papel na clula ainda no foi muito bem elucidado.
A DNA polimerase III, a principal responsvel pela sntese das fitas de DNA devido
a sua alta capacidade de polimerizao.

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Aps a sntese do primer de RNA, a DNA polimerase III pode comear a

polimerizao no sentido 5 3. Alm da polimerizao, a DNA-polimertase III
possui atividade exonuclesica 3 5, essa atividade permite que logo aps serem
adicionados, os nucleotdeos sejam retirados e conferido se o seu pareamento est
correto (A com T e C com G). Esta atividade chamada atividade Editorial. Como as
fitas de DNA so antiparalelas, e a DNA polimerase caminha em um sentido no DNA,
apenas uma das fitas ser sintetizada continuamente, e tem o nome de leading strand
(fita contnua) e a outra fita ser sintetizada descontinuamente, chamada lagging
strand(fita descontnua). A sntese da fita lagging feita em pequenas partes. O primer
de RNA sintetizado e a fita lagging sofre um loop de forma que a polimerizao
ocorre na mesma direo que ocorre a polimerizao da fita leading. Desta forma, a fita
complementar fita lagging formada em pequenos fragmentos de aproximadamente
100 bases chamados fragmentos de Okazaki, que possuem esse nome devido ao seu
descobridor, Reiji Okazaki.
Logo aps a sntese das fitas pela DNA-polimerase III, entra em cena a DNApolimerase I, que retira os primers de RNA ( atividade exonuclesica 5 3) e os
substitui por nucleotdeos de DNA (desoxinucleotdeos). Aps a substituio do primer,
o primeiro nucleotdeo do fragmento de Okazaki no est ligado ao ltimo nucleotdeo
do fragmento anterior, ento uma enzima chamada ligase catalisa essa ligao. Dessa
forma, as duas fitas de DNA j esto terminadas e naturalmente se enrolam formando a
dupla hlice.
A replicao em eucariotos segue o mesmo padro, a maior das diferenas est
nas polimerases que so cinco (, , , e ) sendo uma exclusivamente mitocondrial
() e as outras quatro nucleares. As polimerases , e se correlacionam
funcionalmente com as polimerases I, III e II de procariotos respectivamente.

Figura 7 - Esquemas mostrando como ocorre a replicao contnua e descontnua e o

produto final da replicao
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Decodificando o DNA (Trancrio e Traduo):

A Trancrio o processo de formao de uma fita de RNA complementar a
uma regio do DNA. Os RNAs formados durante a transcrio podem ser de trs tipos:
o RNAm (mensageiro) que aquele RNA que contm a seqncia que codifica uma
protena; o RNAt (transportador) que carreia os aminocidos at os ribossomos e
possibilita a leitura da informao contida no RNAm durante a traduo e o RNAr
(ribossmico) que faz parte da estrutura dos ribossomos.
A enzima responsvel pela transcrio a RNA polimerase, que nos procariotos
nica, enquanto nos eucariotos elas so em trs (RNA pol I, II e III).
Para iniciar a trancrio, a RNA polimerase deve reconhecer um local especfico
onde comear a sntese. Esse local chama-se promotor. O reconhecimento da RNA
polimerase aos promotores se d graas ao fator sigma, que liga-se RNA polimerase
fazendo com que estas tenham maior afinidade com as seqncias promotoras.
Os promotores contm seqncias consenso localizadas antes do incio da
transcrio, a distncias especficas. Os promotores procariticos geralmente localizamse na regio 10 e 35 do incio da transcrio e as seqncias consenso mais
conhecidas so o TATA box na regio 10 (TATAAT) e a seqncia TTGACA na
regio 35. Existem vrios tipos de promotores e fatores sigma correspondentes e essa
variedade que permite que as funes celulares possam ser reguladas mantendo o
equilbrio das atividades celulares. Nos eucariotos, o processo de iniciao e regulao
da transcrio muito mais complexo, envolvendo um nmero e diversidade maior de
seqncias promotoras e de fatores de transcrio (anlogos ao fator sigma).
A RNA polimerase liga-se ao promotor e inicia a sntese da fita de RNA
complementar a fita molde at parar em uma regio chamada terminador, que tambm
uma seqncia de consenso.
Em procariotos, que no possuem envoltrio nuclear, a transcrio ocorre no
mesmo lugar onde ocorre a traduo, dessa forma, to logo o RNA comece a ser
formado, a traduo j se inicia. Por esse motivo diz-se que a transcrio e a traduo
nos procariotos acoplada. Nos eucariotos a transcrio ocorre no ncleo e a traduo
ocorre no citoplasma. O RNA recm sintetizado nos eucariotos ainda precisa passar por
vrias modificaes antes de estar pronto (retirada dos ntrons, adio de uma cauda de
poli Adenina, adio de 7-Metil Guanosina na primeira base do RNA e outras).
A Traduo converte a informao na forma de trincas de nucleotdeos em
aminocidos, que daro origem a uma protena. A transcrio ocorre em uma estrutura
citoplasmtica chamada ribossomo, formada por vrias protenas e RNAr. O ribossomo
dividido em duas subunidades, uma subunidade menor (30S em bactrias e 40S em
eucariotos) e uma subunidade maior (50S em bactrias e 60S em eucariotos).
Considerando o modelo bacteriano, o incio da traduo se d quando a
subunidade 30S liga-se ao cdon de iniciao AUG (com raras excees, a traduo
sempre comea no cdon AUG, correspondente a uma metionina) e logo em seguida o
met-tRNA e a subunidade 50S ligam-se ao complexo 30S-RNAm, tudo isso com o
auxlio de fatores de iniciao (IFs). O ribossomo reconhece a trinca correta da
metionina, a iniciadora, atravs do pareamento de uma seqncia do RNAr 16S da
subunidade menor com uma seqncia no RNAm que fica prxima ao incio da
traduo chamada seqncia de Shine-Delgarno.
O ribossomo possui dois sitios de entrada da RNAt, o stio P (peptdeo) e o stio
A (aminocido). O primeiro RNAt entra no stio P e o segundo entra no A, algumas
enzimas da subunidade 50S do ribossomo fazem a ligao do primeiro aminocido com
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o segundo, promovendo a ligao peptdica, dessa forma, no stio A ficar o segundo

RNAt com um dipeptdeo. Atravs de um processo chamado translocao o ribossomo
se desloca um cdon a frente de forma que o dipeptdeo-RNAt fica na stio P. A partir
da, esse processo se repete, formando um tripeptdeo no stio A que translocado para
o stio P formando assim sucessivamente a protena.
A traduo termina quando o ribossomo encontra um cdon de terminao, que
no codifica nenhum aminocido, so eles: UGA, UAG e UAA. A estes cdons se liga
um fator para terminao da sntese (RF- Releasing Factor)
Aps a traduo as protenas ainda tm que passar por algumas modificaes
para que possam exercer adequadamente suas funes.

Figura 8 - Esquema mostrando a transcrio e a traduo em eucariotos.

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Manipulao do DNA
Enzimas de restrio e vetores.
Quando se trata de biologia molecular, as enzimas de restrio e os vetores
sempre estaro presentes, pois so usados em quase todos (se no em todos) os
trabalhos dessa rea.
As enzimas de restrio so enzimas que cortam o DNA em seqncias
especficas. As enzimas de restrio fazem parte de um sistema celular de modificao e
restrio que tem como funo proteger a clula contra DNAs estranhos. O sistema
funciona da seguinte forma: Enzimas especficas metilam algumas bases em algumas
seqncias especficas do DNA da clula e dentro dessa clula existem enzimas de
restrio que reconhecem essas seqncias e clivam o DNA, a no ser que esteja
metilado. Dessa forma, o DNA celular est a salvo das enzimas de restrio e qualquer
DNA estranho que entre na clula e possua a seqncia de reconhecimento das enzimas
de restrio ser clivado.
Depois da descoberta desse sistema vrias enzimas de restrio de vrios
organismos foram identificadas e hoje centenas so comercialmente avaliveis.
A seguir uma tabela com alguns exemplos de enzimas de restrio, sua origem e
seus stio de clivagem: (os espaos entre as bases mostram os pontos de corte).
Tabela 1. Exemplos de enzimas de restrio e organismos de origem
Denominao
Origem
Seqncia de reconhecimento
5 G AATTC 3
Eco RI
Escherichia coli RY 13
3 CTTAA G 5
5 A AGCTT 3
Hind III
Haemophilus influenzae Rd
3 TTCGA A 5
5 GGTAC C 3
Kpn I
Klebsiela pneumoniae
3 C CATGG 5
5 C TCGAG 3
Xho I
Xantomonas hilicola
3 GAGCT C 5
Vetores so o meio pelo qual pode-se artificialmente ou naturalmente, carrear
informaes para dentro de um organismo. Os vetores mais comuns so os plasmdeos,
os bacterifagos, os cosmdeos e os YACs (Yeast Artificial Cromossome - cromossomo
artificial de levedura).
Os plasmdeos so sem dvida, os vetores mais usados. Os plasmdeos so
DNAs circulares, que existem naturalmente em bactrias todavia, plasmdeos foram
manipulados pelo homem com vrias finalidades. Os plasmdeos geralmente possuem
um gene de resistncia a um antibitico, uma regio de clonagem com stios de enzimas
de restrio, para inserir DNAs de qualquer origem e uma origem de replicao para
que esse plasmdeo possa se replicar dentro da clula. Os plasmdeos podem conter
promotores de transcrio fortes para expressar protenas dentro de outros organismos,
sendo chamados assim de plasmdeos de expresso (Figura 9 - Esse assunto ser
tratado com mais detalhes em outra parte dessa apostila) .

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Figura 9. Exemplo de um plasmdeo contendo resistncia ao antibitico Kanamicina. O

plasmdeo em questo utilizado para expresso de protenas heterlogas em
bactrias. A protena expressa sob controle de um promotor viral (fago T7) e em
fuso com a Glutationa S-Transferase, o que facilita processos posteriores de
purificao.
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Os bacterifagos so vrus que infectam bactrias. Para serem utilizados como

vetores do seu material gentico so retiradas determinadas seqncias que so
substitudas pela seqncia de interesse. A molcula recombinante introduzida em
fagos vazios que so ento utilizados para infectar bactrias e propagar o DNA de
interesse.
Os cosmdeos so muito semelhantes a plasmdeos, possuindo porm uma
seqncia de fago, que possibilita seu posterior empacotamento em cpsulas virais.
Diferente de plasmdeos, eles comportam insertos de tamanhos maiores, acima de 20
Kb.
Os YACs so, como o nome j diz, cromossomos artificiais de leveduras e
geralmente so usados quando se quer ter um grande pedao de DNA exgeno dentro de
uma levedura. Possuem seqncias centromricas e telomricas para que funcione
perfeitamente como um cromossomo.
Amplificao do DNA in vitro: A reao em cadeia da polimerase - PCR
O avano das tcnicas de Biologia Molecular tem revolucionado os
conhecimentos sobre o genoma, incluindo o da espcie humana, quanto a sua estrutura,
expresso e funo. Entretanto, um fator limitante sempre foi a pequena quantidade de
material disponvel para o estudo.
O mtodo para anlise de DNA proposto por Saiki e cols. em 1985, o da Reao em
Cadeia da Polimerase (PCR), permitiu um grande avano neste sentido. Este mtodo
tem como princpios bsicos a de oligonucleotdeos (primers) a regies especficas da
molcula de DNA e a ao da DNA polimerase. A partir da tornou-se possvel
amplificar um nmero ilimitado de seqncias alvo, as quais podem ser estudadas por
mtodos convencionais de anlise do DNA.
A tcnica de PCR tem por objetivo amplificar uma seqncia alvo especfica por
meio de uma enzima termoestvel, in vitro. Neste mtodo utiliza-se alm desta enzima,
os quatro nucleotdeos e um par de primers ( aproximadamente 20pb ) que flanqueiam a
regio a ser amplificada. Estes primers so utilizados para direcionar a sntese do DNA,
em ciclos repetidos.
Em cada ciclo, as fitas servem de molde para a gerao de novas fitas, como
ilustra a figura 10.

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Figura 10. Representao esquemtica da amplificao utilizando PCR.

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Cada ciclo se inicia com a desnaturao da dupla-hlice do DNA, elevado altas

temperaturas (91-95 C), por aproximadamente 1 minuto. Esta etapa seguida da dos
primers ao DNA molde, a temperaturas que variam de 53-65o C por 1 a 2 minutos,
posteriormente ocorre a elongao de cadeia por ao da polimerase, em geral entre
temperaturas de 65-72o C durante 2 a 5 minutos. O nmero de ciclos varia de acordo
com o objetivo e condies utilizadas.
At 1987, a tcnica da PCR era limitada principalmente devido instabilidade
trmica da enzima, cuja atividade diminua com o calor, se fazendo necessrio sua
reposio ao trmino de cada ciclo. Este problema foi solucionado com a utilizao de
uma outra polimerase descoberta em Thermus aquaticus, a Taq DNA polimerase, que se
apresenta extremamente estvel em altas temperaturas, dispensando novas adies a
cada ciclo.
Clonagem
Uma das contribuies mais valiosas da tecnologia gentica para a pesquisa
biolgica consiste na possibilidade de clonagem de seqncias de DNA. Para isto, um
fragmento de DNA de qualquer origem incorporado em um plasmdeo pequeno, com
o qual o hospedeiro (em geral a bactria Escherichia coli) ser transformado. Este
plasmdeo, incluindo o fragmento de DNA nele incorporado, se reproduz no hospedeiro,
originando um certo nmero de cpias de si e conseqentemente do DNA estranho.
O uso de enzimas de restrio um dos passos essenciais desta tcnica; com
elas o preparado de DNA em questo cortado em fragmentos precisamente definidos.
Se a enzima de restrio usada for do tipo que corta as duas fitas do dplex
assimetricamente, os fragmentos por ela originados possuiro extremidades em fita
nica, com seqncias complementares idnticas. Em temperaturas fisiolgicas, os
cortes realizados pela enzima de restrio nas fitas de DNA, mesmo que deslocadas
algumas bases, causam uma quebra irreparvel no dplex: as poucas pontes de
hidrognio restantes no so o bastante para manter os fragmentos juntos. Em
temperaturas mais baixas, quando o movimento trmico das molculas menor,
algumas poucas pontes de hidrognio j so suficientes para manter a unio da estrutura.
A conseqncia prtica disso que os fragmentos, s por resfriamento se colam uns
aos outros devido a renaturao das curtas extremidades em fita nica (resultado da
clivagem por enzimas de restrio). Por intermdio da enzima ligase, a continuidade
dessas fitas pode ser restaurada juntando dessa forma duas fitas de DNA de origens
diferentes. Quando junta-se um pedao qualquer de DNA a um plasmdeo, mantendo a
possibilidade de se propagar indefinidamente este DNA, d-se o nome de clone,.
Nem sempre a eficincia com que o DNA a ser clonado incorporado ao
plasmdeo satisfatria. Por isso desenvolveram-se diferentes sistemas seletivos para as
situaes desejadas. Por exemplo, pode-se escolher como veculo de clonagem um
plasmdeo contendo um fator de resistncia a um antibitico, de modo que, em meio
contendo o antibitico em questo, somente os hospedeiros que aceitaram o plasmdeo
com o fator de resistncia podem formar colnias. O plasmdeo com o fator de
resistncia para ser interessante neste caso tem que estar carregando o DNA a ser
clonado. Para se distinguir entre veculos com ou sem o DNA exgeno, lana-se mo de
um outro fator no plasmdeo localizado no ponto de ao da enzima de restrio. Se a
estrutura anelar do plasmdeo for restaurada e o gene indicador voltar a sua funo
normal, ento o veculo est sem o DNA estranho; porm se o fragmento de DNA tiver
sido inserido nesse ponto, o gene indicador perde sua funo. Para este segundo
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indicador pode-se utilizar outra resistncia a antibiticos: as colnias crescidas no

primeiro meio seletivo podem ser transferidas para outro meio, pela tcnica de carimbo,
testando assim sua resistncia ao segundo antibitico. Hoje vrios outros mtodos foram
desenvolvidos para se confirmar a presena de um fragmento inserido em um
plasmdeo, todavia, a maioria se baseia nesse princpio de possuir um gene indicador no
stio de restrio onde ser feita a clonagem. Recentemente tm-se utilizado genes
suicidas, os quais, se no forem interrompidos por um DNA clonado, produziro
protenas txicas para a clula. Portanto, apenas sero viveis colnias portando
plasmdeos recombinantes.
A primeira clonagem foi feita no ano de 1973 por Stanley Cohen e Herbert
Boyer, e inicialmente as clonagens eram feitas usando-se como inserto fragmentos de
DNA resultantes de clivagem de DNAs totais, dessa forma, o rendimento das clonagens
era muito baixo. A tcnica de PCR veio como um grande aliado para a clonagem, pois
com ela, pode-se clonar amplificaes, aumentando assim o rendimento (devido ao
aumento no nmero de insertos) e a confiabilidade do experimento.
Vrias tcnicas utilizam essa ferramenta, entre elas pode-se citar o
seqnciamento de DNA e a produo de protenas em laboratrio, que sero explicadas
em outros captulos dessa apostila.

Figura 11 Esquema mostrando a clonagem de um fragmento de DNA em um

plasmdeo usando-se a enzima Eco RI.
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Hibridao de cidos nuclicos

DNAs com seqncias de bases especficas podem ser identificados por uma
tcnica desenvolvida por Edwin Southern conhecida como Southern Blotting. Essa
tcnica baseia-se em fazer uma eletroforese em gel, e transferir o DNA, na forma de fita
simples, do gel de eletroforese para uma membrana de nitrocelulose ou nylon (que
possui afinidade por DNA), que ser uma rplica do gel. Essa transferncia feita em
meio alcalino para desnaturar o DNA, deixando-o assim em fita simples. Essa
membrana, que contm o DNA desnaturado, ento colocada em contato com
fragmentos de DNA, complementares a seqncia alvo, marcados com fsforo
radioativo ou fosfatase alcalina. Esses fragmentos marcados, chamados sondas,
hibridaro nas suas regies complementares e quando a membrana for lavada, apenas as
sondas hibridadas permanecero na membrana. Essa membrana ento colocada em
contato com um filme fotogrfico, que apresentar marcas na altura das bandas que
contiverem a seqncia alvo, devido as sondas que emitem radiao (no caso das
marcadas com fsforo radioativo) ou algum outro comprimento de onda capaz de
marcar o filme fotogrfico (outros tipos de marcao de sondas).
Seqncias de RNAs podem tambm ser detectadas por uma tcnica, que usa o
mesmo princpio chamada Northern Blotting; assim como protenas que podem ser
detectadas usando-se seus anticorpos como sonda na tcnica chamada Western
Blotting ou Imunoblotting.
A Hibridao uma tcnica muito utilizada em laboratrios de biologia
molecular. Suas aplicaes vo desde tipagem de indivduos (teste de paternidade,
identificao de criminosos) at a descoberta de novos genes envolvidos nos mais
diversos processos celulares.

Figura 12 Esquema mostrando o procedimento da tcnica de Hibridao.

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Seqenciamnto de DNA
Antes de 1975, pensar em tentar seqenciar cromossomos era praticamente
inconcebvel. Na melhor das hipteses, era uma tarefa trabalhosa requerendo muitos
anos de trabalho. No final de 1976, o cromossomo inteiro do fago X174, de 5.387
nucleotdeos tinha sido seqenciado. Hoje possvel obter as seqncias de
nucleotdeos de genes de cromossomos eucariticos inteiros, e estes dados so
armazenados em bancos de dados em computadores para referncia posterior.
Foi desenvolvido nesta poca, quase que simultaneamente, duas tcnicas que
promoveram uma revoluo na "arte" de seqenciar DNA. O desenvolvimento de outras
tcnicas, como a descoberta de enzimas de restrio (uso na preparao de segmentos
especficos de cromossomos); o aperfeioamento da eletroforese em gel at o ponto em
que fragmentos de DNA que diferem em comprimento por um nico nucleotdeo
pudessem ser resolvidos, e o desenvolvimento de tcnicas de clonagem de genes
(preparao de grandes quantidades de um determinado gene ou seqncia de DNA de
interesse) viabilizaram o seqenciamento.
Em 1975, F. Sanger e colaboradores desenvolveram um mtodo enzimtico com
terminadores de cadeia especficos, para gerar quatro populaes de fragmentos que
terminam em As,Gs, Cs e Ts, respectivamente.
O mtodo de Sanger utiliza de terminadores de cadeia chamados de 2'3'didesoxinucleotdeos trifosfatos. As DNA polimerases necessitam de um OH- 3' livre na
fita de DNA iniciadora. Se um 2' 3' didesoxinucleotdeo adicionado extremidade de
uma cadeia, ele ir bloquear a extenso subseqente desta cadeia, uma vez que os 2' 3' dideoxinucleotdeos possuem um grupo OH- 3' trocado por um H.
O seqenciamento feito da seguinte maneira:
Quatro reaes so feitas em paralelo, cada uma delas contendo um dos quatro
terminadores de cadeia 2', 3'-didesoxi: ddGTP,ddATP, ddCTP e ddTTP. As quatro
reaes contm: uma fita molde (simples fita), a seqncia de nucleotdeos a ser
determinada, uma fita iniciadora com uma hidroxila 3 livre (normalmente obtida por
sntese qumica), os quatro precursores de DNA: dGTP, dATP, dTTP e dCTP, um deles
pelo menos radioativo (32P -dCTP ), e o "fragmento Klenow"da DNA polimerase I de
E. Coli. O "fragmento Klenow"representa 2/3 DNA polimersica I de E.Coli produzido
por clivagem com enzima proteoltica tripsina. O fragmento possui as atividades
polimersica 5' 3' e exonuclesica 3' 5' da DNA polimerase I, mas no possui
atividade exonuclesica 5' 3'. Esta atividade exonuclesica 5' 3' critica para a
tcnica, pois se esta atividade estiver presente, ela ir reduzir a fita iniciadora a partir da
extremidade 5'.
O importante nesta tcnica de seqenciamento usar a relao correta do
didesoxirribonucleosdeo trifosfato normal (por exemplo, dGTP na reao 1) e de
didesoxirribonucleosdeo trifosfato terminador (por exemplo ddGTP na reao 1),de
modo a obter uma populao de cadeias nascentes terminando em todas as posies de
nucleotdeos possveis (por exemplo,em todos os Cs de fita-molde na reao 1). A
relao de 100 desoxirribonucleosdeos trifosfatos para 1 didesoxirribonucleosdeo
trifosfato normalmente d a freqncia de terminao desejada em cada stio potencial
de terminao.
Os produtos das quatro reaes so ento separados por eletroforese em gel de
poliacrilamida e as posies dos produtos de reao radiativos (cadeias nascentes de
DNA) so determinadas por autorradiografia. Uma vez que as cadeias menores migram
distncias maiores no gel, a seqncia de nucleotdeos definida pelas cadeias nascentes
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dada pela leitura na direo 5 3 , a partir da parte de baixo (anodo) at o topo (catodo)
do gel.

Figura 13 - Esquema mostrando como feito o seqnciamento de DNA pelo mtodo dos
desoxirribonucleotdeos desenvolvido por Sanger
Atualmente no so utilizados nucleotdeos radioativos. Os didesoxinucleotdeos so
marcados com substncias fluorescentes que emitem em comprimentos de onda diferentes.
Desta forma, os fragmentos que incorporam estes nucleotdeos podem ser identificados aps
excitao com laser e identificao de cada fluorescncia. Isso possibilita que a reao seja
feita em um nico tubo. Alm disso, so utilizadas enzimas termoestveis em substituio
Klenow e T7 DNA polimerase. A reao, que no uma amplificao, apenas extenso,
realizada de forma cclica. Isso faz com que possam ser obtidas seqncias a partir de uma
quantidade menor de DNA e tambm auxilia no seqenciamento de regies que possuem
estruturas que, em temperaturas mais baixas, impedem a ao das polimerases. A utilizao
de temperaturas mais altas (70oC) evita este problema. Atualmente so utilizados
seqenciadores automticos que permitem a realizao de seqncias em larga escala.

Utilizao da tecnologia do DNA recombinante

Produo de protenas
A produo de protenas em laboratrio uma tcnica que vem sendo cada vez mais
utilizada. Essa produo feita atravs de uma tcnica chamada expresso heterloga, que
consiste em produzir em um organismo protenas originrias de outros (Ex: produo de
hormnios humanos em leveduras).
Para modificar esses organismos, normalmente utiliza-se de plasmdeos como vetores.
Esses vetores devem possuir algumas caractersticas desejveis: um promotor de transcrio
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forte, especfico para o organismo que produzir a protena, que funcionar somente na
presena de alguma substncia indutora (IPTG, Metanol, Celulose, Arabinose, etc); um gene
de seleo, que confere uma caracterstica diferencial entre as clulas com e sem o vetor
(crescimento em meio mnimo, resistncia a antibiticos, etc) e um stio para clonagem.
Em um sistema bastante utilizado, a fase aberta de leitura do gene que codifica a
protena a ser produzida clonada no vetor, aps o promotor forte e uma seqncia de 18
(dezoito) nucleotdeos que codificam 6 (seis) histidinas, que serviro para futura purificao
em coluna de afinidade. Esse vetor recombinante servir para transformar o organismo que
produzir a protena. Esse vetor pode ficar na clula de duas formas: como uma estrutura
circular de replicao autnoma (plasmdeo), ou pode integrar-se no genoma do organismo
atravs de uma recombinao homloga.
As clulas transformadas so crescidas at ficarem bem vigorosas e ento adiciona-se
a substncia indutora que promover a transcrio e traduo do gene de interesse em grandes
quantidades.
A protena de interesse estar ento em grande quantidade na clula, todavia, para t-la
na forma pura precisa-se separ-la das outras protenas celulares. Foi pensando nisso que as 6
(seis) histidinas foram adicionadas protena, pois essa cauda de histidina possui afinidade
por nquel. Desta forma, aps separao de todas as protenas celulares por uma coluna com
uma resina complexada com nquel, as protenas que possurem a cauda de histidina (somente
a de interesse) ficaro grudadas na resina e as outras passaro direto. Para retirar a sua
protena da coluna de nquel, s passar um tampo que reduza a afinidade das histidinas ao
nquel, geralmente contendo um competidor.
A tcnica de expresso pode apresentar muitas variaes, desde o promotor usado at
o organismo produtor. Cada um desses fatores confere vantagens e desvantagens em relao a
outro. Como exemplo pode-se comparar a expresso em fungos e em bactrias: As bactrias
possuem crescimento muito mais rpido, todavia geralmente apresentam problemas ao
expressar protenas muito grandes (formao de corpos de incluso), alm disso, no realizam
modificaes ps-traducionais, enquanto que os fungos, apesar de crescerem mais lentamente
possuem mecanismos que possibilitam que a protena fique na sua forma ativa e com
modificaes ps-traducionais. So desvantagens destes ltimos a difcil manipulao e a
presena de proteases.
Em ultima escala, a transformao pode ser feita em organismos inteiros, criando os
organismos transgnicos. H toda uma discusso tica por trs dos transgnicos, todavia, os
transgnicos podem em muitos casos ser a soluo para vrios problemas mundiais como a
fome e a falta de espao.
A produo de protenas em laboratrio um grande avano para a cincia, graas a
ela, facilitou-se muito a determinao da estrutura de protenas, que podem estar envolvidas
em doenas, possibilitando a fabricao de drogas para bloquear ou controlar a sua ao ou as
protenas purificadas podem ser usadas diretamente no tratamento de doenas como diabetes
(insulina), nanismo (Hormnio de Crescimento) entre outras.
Tipagem -DNA "fingerprint"
DNA "fingerprint" um termo utilizado para referir-se ao teste de identificao de
indivduos atravs do exame de DNA. Este termo impresso digital nada tem a ver com o
recurso datiloscpio tradicional. Mas foi adotado porque no h, tambm, duas estruturas de
DNA iguais entre as pessoas. Trata-se de um mtodo revolucionrio para a identificao de
indivduos, a partir do qual possvel estabelecer, com preciso absoluta, vnculos genticos
para efeito de investigao de paternidade, casos de crianas trocadas na maternidade ou
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seqestradas, construo de rvores genealgicas para estabelecimento de direito a heranas e

esclarecimentos de crimes.
O cientista ingls, Allec Jeffreys, na Universidade de Leicester, descobriu que certas
regies do DNA humanos podiam ser examinadas atravs de ferramentas de engenharia
gentica.
At o final da dcada de oitenta a Cincia Mdica dispunha dos testes clssicos,
envolvendo os antgenos eritrocitrios e o exame do HLA (Human Leukocyte Antigen). O
advento do exame de DNA proporcionou um avano significativo em certas eventualidades,
principalmente quando as probabilidades de paternidade, calculadas atravs de testes
convencionais, eram baixas ou de magnitude insuficiente para que a paternidade biolgica
fosse claramente estabelecida. Deve-se ter em mente que o exame de DNA exclui,
praticamente, 100% dos falsos pais biolgicos, e possibilita o clculo da probabilidade de
paternidade sempre em valores acima de 99,9%. O exame de DNA j se encontra padronizado
em seus procedimentos tcnicos (American Association of Blood Banks 1990) e se encontra
validado pela justia e plenamente aceito em vrios pases. De posse desta ferramenta de alta
tecnologia e poder de resoluo sem precedentes , ento, possvel a elucidao de casos
complexos de investigao de paternidade, inclusive aqueles em que o suposto pai encontra-se
falecido ou no se encontra disponvel para o teste.
Em humanos, apenas 5% do genoma total contm informao de aproximadamente
50.000 a 100.000 genes que governam funes celulares. Os restantes 95% de DNA, no
codificam protenas e onde se encontram as regies repetitivas, que so seqncias que se
repetem vrias vezes. Existem dois tipos de repeties no genoma, uma quando as seqncias
repetidas ocorrem uma ao lado da outra (em "tandem") e a outra quando as repeties
ocorrem de forma aleatria no genoma. Vrias classes de seqncias repetitivas de DNA tm
sido escritas e caracterizadas em vrias espcies de animais e vegetais. Estas diferem no
nmero e na composio dos nucleotdeos. A diferena entre dois indivduos pode ser
determinada atravs do polimorfismo dessas regies repetitivas do DNA, que diferem de
tamanho (nmero de repeties) dentro de uma populao.
A caracterizao pode ser feita de duas formas: por PCR ou por hibridao. Por PCR
utiliza-se primers que flanqueiam as regies repetitivas, amplificando-as. Dependendo do
tamanho da regio repetitiva, os fragmentos podero ser maiores ou menores e podero ser
diferenciados atravs de eletroforese em gel. A limitao dessa tcnica por PCR est no
tamanho da regio repetitiva que no pode ser muito grande, dessa forma, o nmero de alelos
geralmente menor. A caracterizao por consiste em cortar o DNA com enzimas de
restrio, correr em gel de agarose, transferi-lo para uma membrana e usar como sondas a
seqncia cerne da repetio. A Hibridao permite identificar regies repetitivas maiores
(algumas vezes de dezenas de milhares de bases), que possuem um maior polimorfismo e so
mais confiveis.
O resultado de cada uma dessas regies e dado por um padro de duas faixas (bandas)
representando os dois alelos daquele loco (j que o ser humano diploide). Com a anlise de
vrias regies repetitivas, pode-se ento obter um padro (quase) individual.
Nos casos de criminalstica, o DNA do criminoso obtido na cena do crime
comparado com o DNA dos suspeitos, podendo-se dessa forma, identificar com grande
confiabilidade se algum dos suspeitos o criminoso. A extrao de DNA pode ser feita de
sangue, fios de cabelo (bulbo), plos, manchas de sangue ou esperma, ossos, pedaos de pele
e at de insetos hematfagos (carrapatos e caros).
Nos casos de paternidade, o padro do filho colocado em comparao com o do
suposto pai e com o da me, um dos alelos (bandas) do filho vem da me, o outro, vem do pai
verdadeiro. Analisando-se vrias regies pode-se ento incluir o pai com grande grau de
certeza (aprox. 99,99%) ou exclui-lo da paternidade do filho.
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O diagrama abaixo mostra um caso de identificao de paternidade.

Padro

Me

Filho

Suposto Pai

Figura 14- Esquema mostrando resultado de um teste de paternidade para um loco. Um alelo
do filho vem da me (verde) e o outro (azul) tem que vir do pai biolgico. Esse um caso de
incluso no qual o suposto pai o pai da criana (ao menos considerando esse loco).

Aplicaes na medicina
O primeiro trabalho documentado sobre as aplicaes dos produtos da PCR data de
1985 e relata a mutao que causa a anemia falciforme.
Nos dias de hoje, a biologia molecular tem contribudo muito com a medicina,
principalmente no que diz respeito a diagnsticos de doenas. Distrofia muscular do tipo
Duchene e do tipo Becker, fibrose cstica do pncreas e AIDS so apenas alguns exemplos de
doenas que podem ser diagnosticadas por tcnicas de biologia molecular.
O PCR a tcnica mais usada para diagnsticos de doenas. Por PCR, pode-se
tambm detectar mutaes em oncogenes (p53, K-ras e BRCA 1 e 2); detectar a causa de
infeces atravs de marcadores moleculares especficos, canalizando o tratamento de forma
eficiente; verificar tendncia genticas a enfarto atravs da tipagem do gene ACE (enzima
conversora de angiotensina) e fazer vrios diagnsticos pr-natais.
Como exemplo de um diagnstico feito por PCR, pode-se citar o diagnstico da
Distrofia muscular de Duchene (DMD). Essa doena caracteriza-se por uma degenerao
progressiva e irreversvel dos msculos esquelticos. determinada por um gene do
cromossomo X, e o padro de herana recessivo ligado ao X, afetando apenas indivduos do
sexo masculino.
O gene da DMD foi clonado em 1987 e possui 2,5 milhes de pares de bases, de onde
cerca de 99% so ntrons.
A identificao da deleo em pacientes com suspeita de DMD/DMB extremamente
importante para o prognstico clnico e o aconselhamento gentico.

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Figura 15 Eletroforese em gel de agarose mostrando 4 resultados de diagnsticos de

DMD, C representa o controle (indivduo sem delees); os indivduos 2 e 3 no
apresentam deleo para nenhum dos xons testados; o indivduo 1 apresenta deleo do
xon 48 e o indivduo 4 apresenta deleo nos xons 45 e 48 (Figura retirada do Captulo 7
do livro de cidos Nuclicos, captulo escrito pelas Dras Maria Rita Passos Bueno e
Mayana Zatz. O livro foi organizado pelo Dr. Francisco J. S. Lara)

Terapia Gnica
Alm do diagnstico a biologia molecular proporciona tambm procedimentos para
correo de doenas genticas. Desta forma, genes defeituosos podem ser substitudos por
genes normais utilizando vetores especficos (retrovrus, adenovrus, etc...) para carrear estes
genes. Isso j foi feito com sucesso para corrigir a Sndrome da Imunodeficincia Congnita,
causada por mutaes no gene que codifica a enzima Adenosina Deaminase (ADA) e tambm
para a Fibrose Cstica, causada por mutaes na CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane
Regulator). Embora alguns sucessos j tenham sido obtidos, faz-se necessria ainda muita
pesquisa, principalmente relativa ao desenvolvimento de vetores seguros para transporte dos
genes de interesse.
Alm disso, este tipo de terapia ainda muito cara, tornado-a
impraticvel nos moldes atuais.

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Leitura Recomendada

Francisco J.S. Lara - de cidos Nuclicos (1995) - Sociedade Brasileira de Gentica

Lodish et al., Molecular Cell Biology (1999) W.H. Freeman and Company, New York, 4th
Ed
Watson et al., Recombinant DNA (1992) Ed. Scientific American Books, New York, 2nd
Ed
Strachan and Read , Human Molecular Genetics (2000) - BIOS Scientific Publishers Ltd,
2nd Ed
Ninfa and Ballou, Fundamental Laboratory Approaches for Biochemistry and
Biotechnology (1998) - Fitzgerald Science Press, Inc., Bethesda, Maryland, USA
Lubert Stryer, Bioqumica (1996) Guanabara Koogan S.A., RJ, Brasil, 4a Ed.
Benjamin Lewin, Genes VII (2000) Oxford University Press, Inc., New York
Voet and Voet, Biochemistry (1997) John Wiley & Sons, New York, 2nd Ed.

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