ANEXO II

DILUIES E SOLUES

1. DILUIES
Diluio o procedimento de adio de uma substncia a outra para reduzir a
concentrao de uma das substncias.
O uso mais comum da palavra diluio ocorre no sentido de que tantas partes de um
material esto sendo diludas em um nmero total de partes do produto final (diluente +
material).
Uma diluio uma expresso de concentrao ou proporo,
no de volume.
Diluio indica a quantidade relativa de substncias em uma soluo.
Em frases de diluio, o menor nmero sempre se refere ao nmero de partes da
substncia que est sendo diluda, enquanto que o maior nmero sempre se refere ao nmero
de partes que constitui a soluo final.
Exemplo:
Frase de Diluio: Fazer uma diluio 1 para 10 de leite em soluo salina peptonada.
Esta frase poderia ser escrita de outras formas, com o mesmo significado:
Fazer uma diluio 1 em 10, de leite em soluo salina peptonada.
Fazer uma diluio 1 para 10, de leite com soluo salina peptonada.
Fazer uma diluio 1/10, de leite com soluo salina peptonada.
Fazer uma diluio 1:10, de leite usando soluo salina peptonada.
Fazer uma diluio de 1 parte de leite e 9 partes de soluo salina peptonada.

1.1 Diluies decimais: Diluies decimais so diluies em que a quantidade de

substncia a ser diluda corresponde unidade, ou mltiplos da unidade e o volume final da
soluo diluda igual a 10 ou mltiplo de 10 (diluies de base 10).

1.2 Diluies decimais seriadas: So diluies decimais preparadas em srie e que

possuem um fator de diluio nico e igual a 10.
Exemplo:
Preparar diluies decimais de uma cultura bacteriana em fase estacionria at 10-3:
a) Preparar uma diluio 1:10 da cultura em fase estacionria em soluo salina
peptonada, isto , misturar 1 mL da cultura em fase estacionria com 9 mL de soluo salina
peptonada (10-1).
b) A partir da diluio 1:10 preparada conforme item 1 deste exemplo, aps
homogeneizao em agitador de tubos, tomar 1 mL e misturar com 9 mL de soluo salina
peptonada, de forma a obter a diluio 1:100 da cultura em fase estacionria (10-2).
c) A partir da diluio 1:100 preparada conforme item 2 deste exemplo, aps
homogeneizao em agitador de tubos, tomar 1 mL e misturar com 9 mL de soluo salina
peptonada, de forma a obter a diluio 1:1000 da cultura em fase estacionria (10-3).

1.3 Clculos de Diluies

1.3.1 Clculo envolvendo uma diluio: Para preparar uma diluio 1:100 de carne em
soluo salina peptonada, devemos misturar uma parte de carne em um volume final de 100
partes, isto , 1 + 99.
Quando necessrio preparar um determinado volume de uma diluio especfica de
uma substncia, o clculo se efetua pelo processo razo-proporo, conforme exemplo abaixo:
Substncia: NaCl
Volume a ser preparado: 130 mL
Diluio: 1:80 (= 1 parte de NaCl em volume final de 80 partes)
1 parte de NaCl = X gramas de NaCl
80 partes de soluo final 130 mL de soluo final
80 X = 130 x 1
X = 130 = 1,625 partes de NaCl/130 mL de soluo
80
ou
Vi x Ci = Vf x Cf
Vi = volume inicial
 Ci = concentrao inicial
Vf = volume final
Cf = concentrao final

1.3.2 Vrias diluies relacionadas: Vrios mtodos laboratoriais indicam o uso de uma
srie de diluies, o que nada mais que um nmero de solues obtidas pela diluio de uma
substncia em um diluente, e fazendo diluies seqenciais a partir das solues resultantes.

1.4 Diluies de alimentos para realizao de anlises microbiolgicas: O processo de

diluio da amostra, bem como o procedimento tcnico utilizado durante esse processo,
constituem fatores importantes de interferncia nos resultados finais da anlise microbiolgica.
Em microbiologia de alimentos, comumente so utilizadas diluies decimais da amostra,
adotando-se rotineiramente dois critrios: massa por unidade de volume (m/v) e volume por
unidade de volume (v/v).
Para a obteno de uma diluio de base 10, homogeneizam-se pores da amostra com
volume de diluente necessrio para completar o volume correspondente a 10 vezes o volume
(ou peso) da amostra.
Assim, a diluio 1:10 de uma amostra de leite pasteurizado pode ser obtida
homogeneizando:
1 mL de leite + 9 mL de diluente, ou
10 mL de leite + 90 mL de diluente, ou
20 mL de leite + 180 mL de diluente, ou
25 mL de leite + 225 mL de diluente, e assim por diante.

Em todos os exemplos acima, a amostra resulta diluda 1:10 (10-1) e, conseqentemente, em

cada mL da diluio teremos uma quantidade de amostra correspondente a um dcimo de mL
(0,1 mL) e 0,9 mL de diluente.

Sempre que necessrio inocular amostras lquidas sem diluir em meios de cultura, considera-se
que a amostra se encontra na diluio 100.
Para produtos slidos h a necessidade de pesar a amostra.
Normalmente utilizam-se alquotas de 10 ou 25 gramas de alimentos slidos. Dez ou
vinte e cinco gramas de alimento no correspondem necessariamente a 10 ou 25 mL
de alimento. O volume vai variar com a densidade e temperatura do alimento em
anlise.
Alimentos slidos, em p ou pastosos sempre tero que sofrer diluio antes do incio da
anlise, usando-se o critrio massa por unidade de volume (m/v).
Normalmente a diluio inicial de amostras slidas, em p ou pastosas, utilizada para
anlises microbiolgicas 1:10. Outras diluies como 1:2, 1:5, ou outras podem ser usadas em
casos especiais.
Antes do incio do procedimento de diluio fundamental que a amostra seja bem
homogeneizada (produtos lquidos em p e pastosos) ou que a alquota para anlise, obtida de
produtos slidos, seja tomada de vrios pontos de forma a representar realmente a amostra.

1.5 Pontos crticos do processo de diluio de amostras de alimentos

1.5.1 Homogeneizao da amostra e suas diluies: A homogeneizao inadequada da
diluio inicial, e das subseqentes, poder acarretar diferenas muito grandes na contagem das
colnias e resultados incoerentes quando do uso de duas ou mais diluies sucessivas.
Para a obteno de resultados corretos de contagem de microrganismos em amostras de
alimentos, a homogeneizao de todas as diluies ponto fundamental.
A homogeneizao da diluio inicial (amostra/diluente) dever ser realizada em
stomacher entre 30 segundos a 2 minutos, dependendo do tipo de amostra.
A homogeneizao das diluies subseqentes dever ser realizada com o auxlio de
agitador de tubos, por um perodo de tempo no superior a 1 minuto.
Evitar a homogeneizao manual das diluies, pois o processo manual resulta a cada
vez em diferentes graus de homogeneidade.
1.5.2 Diluies a utilizar x Intervalo de preciso e repetibilidade
Considerando que o intervalo de preciso e repetibilidade poder variar de 15 a 150, de
20 a 200, de 25 a 250 e ainda de 30 a 300, dependendo da metodologia analtica empregada,
caber ao analista estabelecer diluies que possibilitem a contagem de colnias nesses
intervalos de preciso.
Dessa forma, para alimentos com expectativa de crescimento bacteriano baixo, devido
ao seu processo de fabricao e de conservao, as inoculaes devero ser efetuadas a partir
da diluio inicial 100 para lquidos ou 10-1 para slidos ou pastosos, com no mnimo, duas
diluies sucessivas.
Por outro lado, para alimentos que se desconhece o nmero aproximado de
microrganismos existentes, as diluies a serem preparadas devero garantir condies de
realizao das contagens.
Usualmente, nesses casos, utilizam-se as diluies 10-1 a 10-6.
1.5.3 Tempo desde a primeira diluio at a inoculao em meios de cultura
O tempo gasto para a execuo das diluies de uma amostra de alimentos at sua
inoculao em meios de cultura dever ser de, no mximo, 20 minutos, de forma a no permitir
a multiplicao dos microrganismos contidos nas diferentes diluies, o que acarretaria a
obteno de resultados falsos para a contagem de microrganismos.
1.5.4 Possveis contaminaes acidentais: Ao retirar as pipetas dos cartuchos ou ao
desenrolar o papel que envolve individualmente cada uma delas, tomar o mximo de cuidado
para no tocar com a pipeta a superfcie externa do cartucho, as mos, as bordas externas dos
tubos ou dos recipientes. Esses mesmos cuidados devero ser tomados quando se estiver
efetuando as inoculaes nas placas ou nos tubos de ensaio. Caso tal situao ocorra, despreze
a pipeta e reinicie o procedimento corretamente.
1.5.5 Aderncia do lquido s paredes da pipeta: No inserir a ponta da pipeta mais do
que 2,5 cm abaixo da superfcie do lquido dentro dos tubos ou dos recipientes contendo as
diluies das amostras, diminuindo assim, a superfcie de contato da pipeta com a amostra
diluda.
Dispensar lentamente o inculo, permitindo a drenagem total
at a marca final da pipeta por um perodo de 4 a 6 segundos, nos
casos em que o mesmo corresponda ao volume total da pipeta. Preferentemente, usar pipetas
que no sejam de esgotamento total.
Quando da dispensa de parte do contedo de uma pipeta, deixar que o lquido escorra
lentamente. O procedimento de expulso rpida do lquido contido na pipeta acarreta a reteno
de um maior volume de lquido aderido s paredes.
1.5.6 Tipo e capacidade das pipetas: Sempre utilizar pipetas com marcao ntida de
volume e, preferencialmente, que permitam a pipetagem do volume desejado sem que seja
necessria a expulso da ltima poro da pipeta. Quando esse tipo de pipeta no estiver
disponvel no laboratrio, para a pipetagem de 1 mL, recomendvel a utilizao de pipetas
com capacidade de 2 mL, com graduao de 1/10 ou 1/100, aspirando o inculo at o volume
total da mesma e dispensando a primeira poro (1 mL) no interior da placa ou do tubo.
As pipetas utilizadas no devero ter capacidade superior a 10 vezes o volume a ser
medido, para assegurar que o inculo dispensado seja o requerido. Por exemplo, se o inculo for
de 0,1 mL, utilizar uma pipeta de 1 mL com graduao de no mnimo 1/10, aspirando o inculo
at o volume total da mesma e dispensando a primeira diviso no interior da placa ou do tubo.
1.5.7 Preciso dos volumes dos inculos; Manter a pipeta sempre na posio vertical e
inclinar o tubo at posio que forme um ngulo de 45 em relao pipeta, facilitando, desta
forma, a leitura na pipeta do "menisco" do volume a ser dispensado.
1.5.8. Uso de pipetas: Sempre utilizar uma pipeta para cada diluio.
No tocar com a pipeta de uma determinada diluio no diluente da diluio seguinte.
NUNCA enxaguar a pipeta com o diluente da diluio subseqente.
A mesma pipeta poder ser utilizada para a semeadura de diluies de amostras, desde
que se parta da maior diluio (amostra mais diluda) para a menor diluio (amostra menos
diluda).

2. SOLUES
Solues so misturas homogneas unifsicas constitudas de duas ou mais substncias
miscveis. So formados por dois compostos, o soluto e o solvente.
O soluto a substncia que est dissolvida no solvente e, conseqentemente, o solvente
a substncia que dissolve o soluto.
Nas solues, os dois componentes no se encontram quimicamente combinados.
 2.1 Solues saturadas: So solues que contm a quantidade mxima possvel de um
soluto, em uma determinada temperatura e presso, perfeitamente dissolvido no solvente.
Por exemplo, em solues de Cloreto de sdio, a saturao ocorre quando h
aproximadamente 360 g do sal por litro de gua.

2.2 Concentrao de solues; Concentrao o quociente entre a quantidade do soluto

e a do solvente ou da prpria soluo. Para determinar esse quociente alguns autores referem-
se ao ttulo de uma soluo.
A concentrao de uma soluo pode ser expressa de 3 maneiras:

a) Massa por unidade de massa (m/m);

b) Massa por unidade de volume (m/v);
c) Volume por unidade de volume (v/v).

A forma mais precisa de se estabelecer a concentrao o de massa por unidade de

massa (m/m), porm, nos laboratrios de microbiologia, onde se trabalha rotineiramente com
produtos slidos que necessitam ser diludos durante a anlise, o sistema mais freqentemente
usado o de massa por volume (m/v).
Para amostras lquidas, o sistema usado o de volume por volume (v/v), que o menos
preciso dos trs, fato que se deve s variaes de volume em funo das temperaturas do soluto
e do solvente (amostra e diluente).

2.2.1 Relao de massa com massa

C=M

Onde:
C = Concentrao
m = Massa do soluto
M = Massa do solvente

Neste caso a concentrao toma dois nomes particulares:

* Molaridade: a relao entre o nmero de moles do soluto e 1000g do solvente. A
concentrao expressa em molaridade utilizada em ebuliometria e criometria.
* Porcentagem de peso: a relao entre a massa do soluto e 100g da soluo.
Exemplo:
Preparar uma soluo de sulfato de sdio a 10% em peso significa que em 100g da
soluo existem 10 g do sulfato de sdio e 90 g de gua.

Relao de volume com volume

C=V
V1
Onde:
C = concentrao
V = Volume do soluto
V1 = Volume da soluo

Neste caso, a concentrao toma o nome de Porcentagem em volume, desde que o volume da
soluo seja tomado como 100 mL.

aplicada para as solues lquido/lquido e gs/gs. Assim o lcool a 90% em volume

significa que em 100 mL da soluo existem 90 mL de lcool.
Relao de massa com volume

C=M
V
Onde:
C = concentrao
m = massa do soluto
V = volume da soluo

Neste caso, a concentrao toma diversos nomes conforme a massa do soluto. Pode ser
expressa em unidades qumicas de massa (o mol e o n de equivalentes) ou em unidades fsicas
de massa (o grama); e o volume da soluo pode ser expresso em litro ou, no caso particular da
porcentagem, em 100 mL.

Desta forma, podemos fazer o seguinte resumo:

a) Unidades Qumicas A.Mol/litro = Molaridade (M)

B.Equivalente-gram/litro = Normalidade( N)
b) Unidades fsicas A. Gramas/litro = ttulo (T)
B. Gramas/100 mL = Percentagem (%)

2.3 Partes: Estabelece uma relao em que a mesma unidade de medida, ou mltiplos
da unidade, usada ao longo de todas as pores relacionadas do processo.
Partes no se limita a uma nica unidade de medida.
Concentraes de partes por milho ou ppm so freqentemente usadas para
aditivos de meios de cultura e solues de antibiticos.
Exemplo:
Uma parte por milho (1 ppm) de cloridrato de tetraciclina possui uma parte do princpio
ativo dissolvido em 1 milho de partes da soluo.
Medidas que correspondem a 1 ppm so:
- grama por tonelada (g/ton);
- miligrama por quilo (mg/kg);
- micrograma por grama (/g);
- mililitro por litro (mL/L);
- microlitro por mililitro (L/mL).

2.4 Hidratos; Os sais utilizados no laboratrio de microbiologia podem se apresentar na

forma anidra ou na forma de um ou mais hidratos, em que uma ou mais molculas de gua
esto ligadas molcula do sal.
Quando se necessita preparar uma soluo cuja composio indique o uso de um sal na
forma anidra, e somente est disponvel no laboratrio um hidrato, deve-se determinar quanto
do hidrato corresponde quantidade da forma anidra estabelecida na formulao.
Para esse clculo necessrio considerar os pesos moleculares e, por regra de trs,
estabelecer o peso correspondente.

Exemplo:
Preparar uma soluo 10% de CuSO4. Somente est disponvel no laboratrio
CuSO4.H2O.
Sol. 10% = 10 g/100 mL
Peso molecular do CuSO4 = 160
Peso molecular do CuSO4.H2O = 178
10 g (CuSO4) = 160

X g (CuSO4.H2O) = 178
X = 10 x 178 = 11,125 g
160
Ento, para preparar a soluo 10% de CuSO4 usando a forma monohidratada, seria necessrio
dissolver 11,125 g de CuSO4.H2O em quantidade de gua suficiente para completar 100 mL.
O mesmo raciocnio utilizado para os casos em que a formulao indica o uso da forma
hidrato e somente est disponvel a forma anidra.

2.5 Potncia de antibiticos: A potncia de um antibitico se refere quantidade de

princpio ativo, biologicamente ativo, contido no produto.
Poder estar expressa em Unidades (U), em porcentagem (%) ou em miligramas de
princpio ativo por grama de produto (mg/g).

Exemplos:
Sulfato de Polimixina B 7600 U/mg;
Tetraciclina 80%;
Sulfato de estreptomicina 780 mg/g.

As solues de antibiticos, usadas como padres referenciais nas provas de

determinao de resduos de antibiticos em alimentos e como aditivos de alguns meios de
cultura, podem estar expressas em U/mL, ppm ou ainda em microgramas por mL ).

Para preparar uma soluo de antibitico proceder conforme abaixo:

a) Sempre verificar a potncia no frasco do produto que est se usando.
b) Quando, no frasco, a informao disponvel for apenas do total de U no frasco, verificar o
peso total contido no mesmo e determinar quantas U existem por mg do produto.
c) Quando a potncia estiver expressa em U/mg, preparar a soluo em U/mL ou
calcular a converso para obter solues em ppm ou g/mL.
d) Se a potncia se apresenta na forma de porcentagem, converter para mg (um
antibitico com potncia de 80% possui 0,8 mg de princpio ativo por mg do produto).
e) Pesar uma quantidade mnima de 10 mg do antibitico em balana analtica (quanto
menor a quantidade pesada, maior ser o erro possvel de ocorrer).
f) Multiplicar o peso obtido pela potncia e dividir pela concentrao final desejada para
obter o volume de diluente a ser adicionado.

Volume de diluente a adicionar = Peso x Potncia

Concentrao final desejada

Para obter a soluo 4000U/ml, baste dissolver as 23,7mg de sulfato de poliximina em
45,03mLde tampo
Exemplo 1:
Preparar uma soluo 4000 U/mL de sulfato de polimixina B em tampo fosfato pH 8.
Potncia do produto usado: 7600 U/mg
Peso 23,7 mg (quantidade pesada)
Volume = 23,7 x 7600 = 45,03 mL
4000

Para obter a soluo 4000U/mL, basta dissolver as 23,7 mg de sulfato de polimixina em

45,3 mL de tampo. Cada mL desta soluo oferecer uma soluo de sulfato de polimixina de
4000U.
OBS: Para que no seja necessrio adicionar volumes fracionados de diluente, conforme
o exemplo acima, pode-se estabelecer, de forma inversa, qual a quantidade de antibitico a ser
pesado para um volume de diluente pr-determinado, procedendo conforme indicado no item
2.5.1.
Exemplo 2
No meio SFP h a indicao da adio de 3 mg/L de sulfato de polimixina e de 12 mg/L
de canamicina.
Quando as quantidades do aditivo so to pequenas quanto estas, preparar soluo-
me. Adicionar ao meio final, volumes das solues-me que ofeream uma concentrao fina,
por litro de meio, correspondente ao indicado pelo fabricante.
No caso deste exemplo (meio SFP) preparar:
a) soluo de sulfato de polimicina a 3mg/L. (potencia 7600 U/mg)
Pesar 300mg de sulfato de polimicina e diluir para 100mL, com gua destilada. Esta
soluo ter concentrao de 3mg de polimicina B com potncia de 7600U/mg por mL.
Neste exemplo seria usado 1 mL desta soluo por litro d meio.

b) Kanamicina 12mg/mL.
Potncia 80%
1mg do produto contm 0,8 mg de princpio ativo.
Pesar mais de 100mg do antibitico (por exemplo 158mg)
Multiplicar o peso obtido pela potncia e dividir pela concentrao final desejada para
obter o volume de diluente a ser adicionado.

X = 158 x 0.8 = 10,58mL

12

OBS: Para que no seja necessrio adicionar volumes fracionados de diluentes, conforem o exemplo
acima, pode-se estabelecer, de forma inversa qual a quantidade de antibitico a ser pesado para um volume
de diluente pr-determinado, procedendo conforme indicado no item 2.5.1.
Cada mL desta soluo conter 12mg de kanamicina
2.5.1. Determinao do peso do peso de antibitico para preparao de solues,
priorizando o volume.
Nos exemplos 1 e 2 acima os volumes de diluentes a serem adicionados resultaram em
nmeros quebrados, o que certamente leva a erros na concentrao final do antibitico.
Para evitar volumes fracionados, fazer o clculo inverso, pr estabelecendo o volume de diluente
a ser utilizado e calculando a quantidade de antibitico a ser pesado, usando a mesma frmula:

Peso = Vol. De diluente a adicionar x Conc. Final desejada.

Potncia

Supondo que se dispes de um balo volumtrico de 25mL para a preparao da soluo

do exemplo 2, acima, proceder conforme segue:

Peso = 25x12 = 375mg

0,8

A quantidade de antibitico a ser pesada neste caso seria de 375mg, que sero diludas
em 25mL de diluente para a obteno de uma soluo com 12mg/mL

2.6 Concentrao por Centrifugao: Em microbiologia, o processo de centrifugao

freqentemente usado para a concentrao de clulas ou esporos em processos de lavagem ou
purificao.
O processo de centrifugao promove a sedimentao de partculas mais densas por
meio da aplicao de fora centrfuga obtida pela rotao em alta velocidade.
As unidades usadas para indicar centrifugao so Rotaes por minuto (RPM) e fora
gravitacional (g).
Para calcular g se utiliza a seguinte frmula:
g = 0,0000118 x raio do rotor (cm) x (rpm)2

3. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
CAMPBELL, J.M.; CAMPBELL, J.B. Diluies. In.: Matemtica de Laboratrio - Aplicaes
Mdicas e Biolgicas. 3.ed. Editora Roca. So Paulo, SP. 1986. p. 77-88.
CAMPBELL, J.M.; CAMPBELL, J.B. Solues. In.: Matemtica de Laboratrio - Aplicaes
Mdicas e Biolgicas. 3.ed. Editora Roca. So Paulo, SP. 1986. p. 93-118.
COOPER, T.G. The tools of Biochemistry. John Wiley & Sons, New York. 1977. 422p.
FELTRE, R. Solues. In.: Qumica - Fsico-Qumica. 2.ed. So Paulo, SP. Editora Moderna.1983. p.
1-75.
SWANSON, K.M.J.; PETRAN, R.L.; HANLIN,J.H. Culture methods for enumeration of
microorganisms In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed.
Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.),
2001. p.53-62.