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UNIVERSIDADE DO ESTADO DA BAHIA (UNEB)

Pró-Reitoria de Pesquisa e Ensino de Pós-Graduação (PPG)

Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais (DTCS)

Programa de Pós-Graduação em Horticultura Irrigada – Mestrado (PPHI)

MARCIA FERREIRA QUEIROZ

OCORRÊNCIA DE Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis NO


BRASIL E ÓLEOS ESSENCIAIS NO MANEJO DA PODRIDÃO-MOLE EM
COUVE-MANTEIGA

JUAZEIRO – BA
2016
UNIVERSIDADE DO ESTADO DA BAHIA (UNEB)

Pró-Reitoria de Pesquisa e Ensino de Pós-Graduação (PPG)

Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais (DTCS)

Programa de Pós-Graduação em Horticultura Irrigada - Mestrado (PPHI)

MARCIA FERREIRA QUEIROZ

OCORRÊNCIA DE Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis NO


BRASIL E ÓLEOS ESSENCIAIS NO MANEJO DA PODRIDÃO-MOLE EM
COUVE-MANTEIGA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-


Graduação em Horticultura Irrigada da Universidade
do Estado da Bahia (PPHI/UNEB/DTCS), como parte
do requisito para a obtenção do título de Mestre em
Agronomia. Área de Concentração: Horticultura
Irrigada

Orientadora: Prof. Dr.ª Ana Rosa


Peixoto

JUAZEIRO - BA

2016
MARCIA FERREIRA QUEIROZ

OCORRÊNCIA DE Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis NO


BRASIL E ÓLEOS ESSENCIAIS NO MANEJO DA PODRIDÃO-MOLE EM
COUVE-MANTEIGA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-


Graduação em Horticultura Irrigada da Universidade
do Estado da Bahia (PPHI/UNEB/DTCS), como parte
do requisito para a obtenção do título de Mestre em
Agronomia. Área de Concentração: Horticultura
Irrigada.

Aprovada em: __/ __/______

Comissão Examinadora

__________________________________________

Prof. Dr.ª Ana Rosa Peixoto

Universidade do Estado da Bahia (DTCS / UNEB)

___________________________________________

Prof. Dr.ª Jane Oliveira Perez

Instituto Federal do Sertão Pernambucano (IF Sertão-PE)

__________________________________________

Prof. Dr. Alexandre Sandri Capucho

Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF)


iii

Aos meus pais, pelo amor


incondicional e por me ajudarem nos
momentos mais difíceis da minha vida.
DEDICO

A maior dádiva divina em minha


vida, o meu filho Samir Lorenzo, e a
minha pequena, porém grande
amiga e “irmã-filha”, Ana Caroline.
OFEREÇO
iv

AGRADECIMENTOS

A Deus, que é a base de todas as coisas em minha vida.

Aos meus pais, José Carlos Queiroz e Ana Paula Mª Ferreira, e irmãos, pelo
simples fato de existirem em minha vida, o que me dá força e determinação
para superar as dificuldades e alcançar meus objetivos, com muito amor
agradeço!

Ao meu filho, Samir Lorenzo, por me permitir sentir um amor incondicional,


tornando os meus dias mais felizes.

A Samuel, por estar ao meu lado em muitos momentos difíceis, pela paciência
e por todo cuidado com o “nosso pequeno”.

A minha orientadora, Ana Rosa Peixoto, não apenas pela orientação, mas pela
amizade, compreensão, paciência e constante apoio desde a graduação, com
muito carinho agradeço!

Aos amigos do curso de Mestrado, em especial, à Ana Karolina, Jaciara e


Vanderléia.

Às alunas do curso de graduação em Agronomia, por toda ajuda e amizade.


Agradeço, com muito carinho, à Jéssica, Gabriela, Ornelle, Cleildes e Josi.
Também agradeço à Meridiana, que muito me ajudou desde a graduação,
estando sempre disponível.

Aos funcionários da UNEB: Sr. Batista, Sr. Bernadino, D. Neuma e D. Lucíola.

À UNEB, pelo apoio institucional e pelas oportunidades no decorrer da minha


formação profissional.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq),


pela concessão da bolsa de estudo e apoio financeiro;

A todos aqueles que de alguma forma contribuíram para realização de mais


uma etapa da minha vida, deixo aqui meus sinceros agradecimentos!
v

SUMÁRIO
pág.

RESUMO GERAL.............................................................................................vii

GENERAL ABSTRACT....………....................................................................viii

1. INTRODUÇÃO.............................................................................................10

2. REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................11

2.1. A cultura da couve...................................................................................11

2.2. Podridão-mole..........................................................................................14

2.2.1. Pectobacterium sp.: características gerais........................................14

2.2.1.1. Aspectos taxonômicos......................................................................18

2.2.2. Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis.............................20

2.2.3. Manejo da podridão-mole.....................................................................21

2.3. Controle alternativo de fitopatógenos mediante o uso de óleos


essenciais........................................................................................................23

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................27

OBJETIVOS......................................................................................................40

CAPÍTULO I......................................................................................................41

OCORRÊNCIA DE Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis EM


COUVE-MANTEIGA, NO BRASIL

RESUMO...........................................................................................................42

DESENVOLVIMENTO.......................................................................................42

REFERÊNCIAS.................................................................................................46

CAPÍTULO II.....................................................................................................49

ÓLEOS ESSENCIAIS NO MANEJO DA PODRIDÃO-MOLE EM COUVE-


MANTEIGA, NO SEMIÁRIDO BRASILEIRO

RESUMO..........................................................................................................50

ABSTRACT......................................................................................................50
vi

INTRODUÇÃO..................................................................................................51

MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................53

RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................68

CONCLUSÃO...................................................................................................65

REFERÊNCIAS.................................................................................................65

CONCLUSÕES GERAIS..................................................................................71
vii

RESUMO GERAL

O gênero Pectobacterium é constituído por espécies heterogêneas, de difícil


controle, responsáveis por quadros de murcha, talo-oco, canela-preta e
podridão-mole em diversas culturas e partes do mundo. Recentemente, uma
nova subespécie nomeada de P. carotovorum subsp. brasiliensis (Pcb) foi
descoberta em cultivos de batata no Brasil. Desde então, a subespécie vem
sendo relatada em diversos países e famílias botânicas, inclusive na
Brassicaceae. No entanto, na couve-manteiga, até o presente não foram
encontrados relatos de ocorrência de Pcb. No presente estudo, visitas a hortas
comunitárias foram realizadas nos municípios de Petrolina-PE e Juazeiro-BA,
onde se coletou plantas de couve-manteiga com sintomas típicos da podridão-
mole. Um isolado de P. carotovorum subsp. brasiliensis (UNEB8) foi
identificado através de testes bioquímicos, fisiológicos, metabólicos e
moleculares como agente causal da podridão-mole em couve-manteiga,
resultando no primeiro relato da ocorrência de Pcb, nesse hospedeiro, no
Brasil. Adicionalmente, avaliou-se o potencial dos óleos essenciais de cravo,
citronela, bergamota, alecrim, palmarosa, sálvia, gengibre, melaleuca, laranja e
capim-limão, e dos compostos majoritários dos óleos de capim-limão e cravo,
citral e acetato de eugenol (AE), respectivamente, quanto a bioatividade sobre
Pcb in vitro e controle da podridão-mole em couve-manteiga, aplicados antes
ou depois da inoculação, em casa de vegetação. Os óleos essenciais de cravo
(0,25%), citronela (0,75%), bergamota (1%), alecrim (1%), palmarosa (0,5%),
sálvia (1%), melaleuca (0,75%) e capim-limão (0,5%) inibiram completamente o
crescimento de Pcb. A CMI do óleo de capim-limão foi de 0,0625% e do citral
foi a menor utilizada, 0,03125%. Para o óleo de cravo a CMI foi de 0,125% e o
AE não apresentou CMI em nenhuma das concentrações utilizadas. De modo
geral, os tratamentos com os óleos essenciais de capim-limão a 0,5% e cravo a
0,25% apresentaram os melhores resultados no controle da doença. O óleo de
capim-limão (0,5%) promoveu uma incidência (INC) de 0%, proporcionando um
percentual de controle da doença de 100%, em ambos os períodos. O óleo de
cravo (0,25%) apresentou menor INC (25%) quando aplicado após inoculação,
promovendo um percentual de controle de 71,42%. Em ensaio in vivo utilizando
diferentes concentrações do óleo de cravo, capim-limão, citral e AE, verificou-
viii

se que o óleo de capim-limão a 0,125% (pós-inoculação) e o citral a 0,125%,


em ambos os períodos, proporcionaram os maiores percentuais de controle da
doença (33,33; 50 e 100%, respectivamente). O óleo de cravo a 0,125% (pós-
inoculação) mostrou maior eficiência que o AE (0,25%), promovendo um
percentual de controle da doença de 16,67%. Dessa forma, os resultados
encontrados neste trabalho mostram a eficácia dos óleos essenciais de capim-
limão e cravo, sugerindo ser o citral o principal responsável pela atividade
bactericida e/ou indutora de resistência do óleo de capim-limão. Para o óleo de
cravo acredita-se que a sua ação esteja relacionada à ação sinérgica de seus
constituintes químicos. Esses óleos mostram-se como opção promissora para o
desenvolvimento de possíveis produtos fitossanitários a serem integrados ao
manejo da podridão-mole, reduzindo o uso de agroquímicos e,
consequentemente, contribuindo para redução de microrganismos resistentes e
preservação do meio ambiente.

Palavras-chaves: Brassica oleracea var. acephala, pectobactéria, controle


alternativo, capim-limão, cravo.

GENERAL ABSTRACT

The genus Pectobacterium consists of heterogeneous species, difficult to


control, responsible for wilting, stem-rot, blackleg and soft-rot in different
cultures and parts of the world. Recently, a new subspecies named P.
carotovorum subsp. brasiliensis (Pcb) was discovered in potato crops in Brazil.
Since then, the subspecies has been reported in several countries and
botanical families, including Brassicaceae. However, no occurrence of Pcb has
been reported in kale till date. In this recent study, visits to community gardens
were carried out in the cities of Petrolina-PE and Juazeiro-BA, where plants of
kale plant with typical symptoms of soft-rot were collected. An isolate of P.
carotovorum subsp. brasiliensis was identified as a causal agent of soft-rot in
kale plant through biochemical, physiological, metabolic and molecular tests,
resulting to the first report of the occurrence of Pcb in Brazil. In addition, the
potential of essential oils of clove, lemongrass, bergamot, rosemary, palmarosa,
sage, ginger, tea tree, orange and lemongrass, and the major compounds of
lemongrass and clove oil, citral and eugenol acetate (EA), respectively were
ix

evaluated where as the bioactivity of Pcb in vitro and control of soft-rot in kale,
applied before or after inoculation, in the greenhouse. The oils of clove (0,25%),
citronella (0,75%), bergamot (1%), rosemary (1%), palmarosa (0,5%), sage
(1%), melaleuca (0,75%) and lemongrass (0,5%) completely inhibited the
growth of Pcb. The MIC lemongrass oil was 0,0625% and that of
citral,0.03125%, was the least used. As for clove oil, the MIC was 0.125% and
EA did not present MIC in any of the concentrations used. In general,
treatments with essential oils of lemongrass at 0,5% and clove at 0.25%
showed the best results in controlling the disease. Lemongrass oil (0,5%)
promoted an incidence (INC) of 0%, providing a percentage of disease control
of 100%, in both periods. The clove oil (0,25%) showed lower INC (25%) when
applied after inoculation, promoting a control percentage of 71,42%. In
experiments in vivo, using different concentrations of clove oil, lemongrass,
citral and EA, it was found that lemongrass oil at 0,125% (post-inoculation) and
citral at 0,125%, in both periods, provided the highest percentages of disease
control (33,33; 50 and 100%, respectively). The clove oil at 0,125% (post-
inoculation) showed higher efficiency than EA (0, 25%), promoting a percentage
of disease control of 16,67%. Thus, the findings of this study show the
effectiveness of essential oils of lemongrass and clove, suggesting that the
citral is primarily responsible for bactericidal activity and / or resistance inducer
of the lemongrass oil. As for clove oil, it is believed that their action is related to
the synergistic action of its chemical constituents. These oils are shown as a
promising option for the development of possible phytosanitary products to be
integrated into the management of soft rot, reducing the use of agrochemicals
and contributing to reduction of resistant microorganisms and preservation of
the environment.

Keywords: Brassica oleracea var. acephala, pectobacteria, alternative control,


lemongrass, clove
1. INTRODUÇÃO

A couve-manteiga pertence à família Brassicaceae, e está entre as


principais folhosas produzidas e consumidas no Brasil, destacando-se devido a
sua importância na nutrição humana, cujo aumento do consumo no país está
associado a sua elevada qualidade nutricional (NOVO et al., 2010).
Em 2012, as 23 principais centrais de abastecimento brasileiras
(Ceasas) comercializaram oito mil toneladas de couve-manteiga (ANUÁRIO
BRASILEIRO DE HORTALIÇAS, 2013). No entanto, a produção de couve-
manteiga pode ser limitada por doenças. Dentre as de origem bacteriana,
destaca-se a podridão-mole causada por bactérias do gênero Pectobacterium
(FILGUEIRA, 2008; HALFELD-VIEIRA; NECHET; ARAÚJO, 2010; TRANI et al,
2015).
As bactérias do gênero Pectobacterium ocasionam doenças em diversas
hortaliças, sendo a espécie P. carotovorum considerada uma das dez bactérias
fitopatogênicas de maior importância científica e econômica do mundo
(MANSFIELD et al., 2012). Essa espécie tem sido dividida em três
subespécies, carotovorum, odoriferum e brasiliensis. Em couve-manteiga, a
podridão-mole é comumente causada por Pectobacterium carotovorum subsp.
carotovorum (Jones) Hauben et al (FILGUEIRA, 2008; LOPES; QUEZADO-
SOARES,1997; MARINGONI, 2005), não havendo relatos de ocorrência das
subespécies odoriferum e brasiliensis na cultura.
P. carotovorum subsp. brasiliensis Duarte et al foi relatada pela primeira
no Brasil em 2004, ocasionando sintomas de canela-preta em cultivos de
batata (Solanum tuberosum L.), sendo considerada um patógeno altamente
agressivo (DUARTE et al, 2004). Desde então, P. carotovorum subsp.
brasiliensis tem sido registrada em diversas famílias botânicas, incluindo
espécies da família Brassicaceae, a exemplo da couve-chinesa (Brassica
pikinensis L.)(LEE et al., 2014).
O controle da podridão-mole é complexo devido à elevada
heterogeneidade das espécies do gênero Pectobacterium envolvidas no
desenvolvimento da doença, que possuem ampla gama de hospedeiros e
distribuição geográfica (LEE et al., 2014), apresentando capacidade de
sobrevivência em restos de cultura, na água, no solo e na rizosfera e filosfera

10
de plantas cultivadas ou invasoras (CHARKOWSKI, 2015; MARINGONI, 2005),
e disseminação por diversos meios (ELPHISTHONE & PÉROMBELON, 1986,
HADAS et al., 2001; MARINGONI, 2005; PÉROMBELON & KELMAN, 1980).
Portanto, a identificação de novos hospedeiros do patógeno é fundamental,
podendo gerar implicações epidemiológicas importantes, que poderão ser
fundamental para o estabelecimento de estratégias de manejo da doença.
O controle de doenças bacterianas deve ser conduzido combinando-se
diversas medidas. Nos últimos anos, a preocupação crescente com as
questões ambientais e saúde da população tem impulsionado a busca por
alternativas de controle sustentáveis que possam ser integradas ao manejo de
doenças de plantas. Nesse contexto, os óleos essenciais têm sido utilizados
em várias pesquisas que validam sua eficácia no controle de fitopatógenos
(AMORIM et al., 2011; GUERRA et al., 2014; SOTELO-BOYÁS et al. 2015; LA
TORRE et al., 2016).
Diante do exposto, os objetivos desse estudo foram: a) realizar
levantamento de bactérias pectinolíticas do gênero Pectobacterium associadas
à podridão-mole em couve-manteiga e b) verificar o efeito de óleos essenciais
no crescimento in vitro de Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis, bem
como no controle da podridão-mole, em plantas de couve-manteiga.

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. A cultura da couve

A couve (Brassica oleracea L. var. acephala D.C) pertence à família


Brassicaceae, na qual também se encontra diversas variedades comerciais,
tais como, couve-flor, repolho, brócolis, rabanete, couve-chinesa e rúcula
(FILGUEIRA, 2008; MARIGONI, 2005).
A cultura é considerada umas das mais importantes hortaliças cultivadas
no ocidente, apresentando seu centro de origem ao longo da Costa do
Mediterrâneo, de onde provavelmente se disseminou por toda a Europa,
dispersando-se para outras partes do mundo, sendo considerada em termos
genéticos a espécie mais próxima do ancestral silvestre (FILGUEIRA, 2008;
LANA et al, 2012). No Brasil, os portugueses foram os responsáveis pela sua
introdução, que a trouxeram com outras hortaliças na época da colonização

11
(MADEIRA; REIFSCHNEIDER; GIORDANO, 2008), sendo popularmente
conhecida no país como couve-manteiga, couve-comum e couve-de-folhas
(TRANI et al, 2015 ).
A couve-manteiga é uma planta herbácea, com caule sublenhoso e
vertical, emite continuamente novas folhas em seu ápice e numerosos brotos
na axila das folhas. A parte comestível são as folhas, que não formam
“cabeça”, sendo distribuídas ao redor do caule, em forma de “roseta” e
apresentam limbo foliar bastante desenvolvido, com pecíolo longo e nervuras
bem destacadas (FILGUEIRA, 2000, 2008; VIERA, 2006). No Brasil, é cultivada
o ano todo, raramente produz pendão floral, apresenta certa tolerância ao
calor, permanecendo produtiva durante vários meses (BEZERRA et al., 2005).
A propagação pode ser realizada por sementes ou por mudas, dependendo da
cultivar, sendo a propagação vegetativa realizada a partir dos brotos que
surgem nas axilas das folhas (TRANI et al., 2015). A colheita é realizada 90
dias aproximadamente após o transplantio, quebrando-se as folhas no pecíolo,
rente ao caule, deixando folhas menores em crescimento (FILGUEIRA, 2008).
O consumo da couve-manteiga no Brasil tem aumentado gradativamente
devido, principalmente, às recentes descobertas da ciência quanto as suas
propriedades nutracêuticas e às novas maneiras de utilização na culinária
(NOVO et al, 2010), podendo ser consumida in natura ou minimamente
processada, também em sucos, salgados e doces, apresentando bons teores
de fibras, vitaminas B1, B2 , B3, ácido ascórbico e minerais, como cálcio, ferro,
fósforo e potássio (Tabela 1), além de compostos bioativos como o
glicosinolato e os bioflavonoides, substâncias consideras preventivas ao câncer
(APAK et al., 2007; SEBRAE, 2008; TACO, 2011).

12
Tabela 1. Composição nutricional da couve-manteiga crua para 100 gramas de
parte comestível.

NUTRIENTE QUANTIDADE (mg*)


Proteína 2900
Fibra alimentar 3100
Cálcio 131
Magnésio 35
Fósforo 49
Ferro 0,5
Potássio 403
Zinco 0,4
Tiamina (B1) 0,2
Riboflavina (B2) 0,31
Niacina (B3) 2,29
Ácido ascórbico 96,7
Piridoxina (B6) 0,06
* miligrama. (Adaptado de Tabela brasileira de composição de alimentos –TACO, desenvolvida
pelo Núcleo de estudos e pesquisas em alimentação (NEPA) da Universidade Estadual de
Campinas-UNICAMP.

A literatura dispõe de poucas informações atuais sobre a produtividade e


comercialização da cultura. No entanto, os dados disponíveis relatam que em
2012, as 23 principais centrais de abastecimento brasileiras (Ceasas)
comercializaram oito mil toneladas de couve-manteiga (ANUÁRIO
BRASILEIRO DE HORTALIÇAS, 2013).
A cultura tem grande importância para os agricultores familiares que,
normalmente, cultivam pequenas áreas com essa variedade ao longo do ano,
tornando-a uma fonte de renda atrativa (SILVA et al., 2012b).
Dentre as principais atividades da agricultura familiar em municípios do
Submédio do Vale do São Francisco destaca-se a produção de hortaliças,
entre elas, a couve-manteiga (FARFÁN, 2008; FARFÁN et al, 2008). No
entanto, as condições ambientais que favorecem a diversidade de hortaliças,
como altas temperaturas e baixa umidade relativa do ar somadas à irrigação
(FARFÁN, 2008), também são favoráveis ao surgimento de problemas
fitossanitários (LIMA, 2001).
A produção de couve-manteiga, assim como as demais espécies da
família Brassicaceae pode ser limitada por doenças. Dentre as de origem
bacteriana, destaca-se a podridão-mole (FILGUEIRA, 2008; HALFELD-VIEIRA;

13
NECHET; ARAÚJO, 2010; TRANI et al, 2015 ), que ocorre principalmente em
cultivos de verão, pois a doença é favorecida por alta temperatura e alta
umidade (LOPES; QUEZADO-SOARES,1997), podendo causar grandes
prejuízos econômicos em espécies dessa família (SILVA et al., 2007).
Segundo Silva et al. (2007), no ano de 2004, em levantamento sobre a
podridão-mole em couve-chinesa nas mesorregiões da Mata e Agreste
pernambucanos, a prevalência da doença foi constatada em 100% das áreas
produtoras, com incidência variando de 1 a 67%.
Nas brássicas, a podridão-mole é comumente causada por
Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (Jones) Hauben et al (Sin,
Erwinia. carotovora subsp. carotovora (Jones) Bergey et al.) (FILGUEIRA,
2008; LOPES; QUEZADO-SOARES,1997; MARIGONI, 2005), subespécie que
é mais disseminada nos solos brasileiros (LOPES; QUEZADO-SOARES,1997).
No entanto, o gênero Pectobacterium é composto por uma diversidade de
espécies e subespécies (DUARTE et al., 2004; HAUBEN et al. 1998; GARDAN
et al. 2003; SAMSON et al., 2005; NABHAN et al., 2013), cuja maioria não tem
especificidade, podendo infectar ampla gama de hospedeiros, e uma mesma
planta pode ser infectada por diferentes espécies ou subespécies do gênero
(MARIANO et al, 2005; SILVA, 2012), como exemplo, P. carotovorum subsp.
odoriferum (Gallois et al.) Hauben et al. (SEO et al., 2004) e P. atrosepticum
(Van Hall) Hauben et al. (DE BOER et al., 1987) já foram relatadas em couve-
chinesa (Brassica pikinensis L.)

2.2. Podridão-mole

2.2.1. Pectobacterium sp.: características gerais

As bactérias do gênero Pectobacterium, comumente denominadas de


bactérias pectinolíticas ou pectobactérias (EL TASSA; DUARTE, 2004;
MARIANO et al, 2005), ocorrem praticamente em todo mundo, sendo
responsáveis por quadros de podridão-mole, talo-oco, canela-preta e murcha
em uma ampla gama de hospedeiros de diversas famílias botânicas, incluindo
tomate (Solanum lycopersicum L.), alface (Lactuca sativa L.), batata (Solanum
tuberosum L.), banana (Musa spp.), cebola (Allium cepa L.), cenoura (Daucus
carota L.) brócolis (Brassica oleracea L. var. italica Plenck), melancia (Citrullus
lanatus L.), quiabo (Abelmoschus esculentus L. Moench), alho (Allium sativum

14
L.), cebolinha (Allium fistulosum L.), chicória (Cichorium spp.), couve-chinesa,
pimentão (Capsicum annuum L.) e couve-manteiga (DANA;
KHODAKARAMIAN; ROUHRAZI, 2015; DUNG; JOHNSON; SCHROEDER,
2012; FILGUEIRA, 2008; GASIC et al., 2013; HALFELD-VIEIRA; NECHET,
2008; HIBAR; DAAMI-REMADI; EL MAHJOUB, 2007; LOPES; QUEZADO-
SOARES,1997; MACAGNAM; ROMEIRO; SCHURT, 2008; MOLELEKI et al.,
2013; NAZERIA et al., 2011; PITMAN; HARROW; VISNOVSKY, 2010;
TEBALDI; MOTA, 2014; WALERON; WALEWRON; LOJKOWKA, 2014),
ocasionando perdas que podem ocorrem no campo durante o desenvolvimento
da cultura e colheita, bem como no transporte e armazenamento de produtos
(VAN DER MERWE et al., 2010; LEE et al., 2014).
Isolados bacterianos do gênero Pectobacterium são gram-negativos,
anaeróbicos facultativos, baciliformes, móveis por flagelos peritríquios e não
formadores de esporos (PÉROMBELON; KELMAN, 1980; KWON et al., 2000;
SCHAAD; JONES; CHUN, 2001). Todas as espécies são oxidase negativas e
catalase positivas, apresentando crescimento ótimo entre 28-30 °C
(SCHAAD; JONES; CHUN, 2001; PÉROMBELON et al., 2002).
Em meio de cultura nutriente-dextrose-ágar a 28-30º C, formam colônias
pigmentadas de coloração creme, opacas, circulares ou ameboides, com
bordos irregulares e de aproximadamente 1,5 a 3,0 mm de diâmetro
(JABUONSKI; TAKATSU; REIFSCHNNEIDER, 1986). Em meio caseína ácida-
peptona-glicose-ágar (CPG), sob iluminação oblíqua, as colônias jovens de
pectobactérias apresentam um aspecto de “vidro quebrado” (KELMAN;
DICKEY, 1995). As colônias também possuem como característica a formação
de uma protuberância no centro, formando o aspecto de um “ovo frito”,
podendo ser melhor visualizadas na lupa (TAKATSU, 2007).
As pectobactérias apresentam como principal fator de patogenicidade e
virulência a produção de uma ampla gama de enzimas capazes de degradar os
componentes da parede celular de plantas (AGRIOS, 2005; DUARTE; EL-
TASSA, 2003; KOTOUJANSKY, 1987; PÉROMBELON; KELMAN, 1980;
PÉROMBELON, 2002), incluindo, celulases, proteases, xilanases e pectinases,
levando ao colapso da parede celular vegetal e liberando nutrientes para o
crescimento da bactéria (AGRIOS, 2005; BARRAS et al., 1994; JANSE, 2005;
PÉROMBELON, 2002).

15
As pectinases ou enzimas pectinolíticas são consideradas as mais
importantes enzimas relacionadas ao desenvolvimento da doença, uma vez
que, estão diretamente envolvidas na digestão da pectina presente na lamela
média da parede celular, causando colapso e maceração do tecido, resultando
na morte celular (AGRIOS, 2005; MATSUMOTO et al., 2003). Essas enzimas
podem ser do tipo, pectato liase, pectina liase, poligalacturonase e pectina metil
esterase (AGRIOS, 2005; PÉROMBELON; KELMAN, 1980; TOTH et al., 2003).
As bactérias pectinolíticas penetram na planta através de ferimentos ou
aberturas naturais. Dentro da planta, invadem o sistema vascular, o que
permite que se espalhem rapidamente por toda a planta (KIM et al., 2011;
KUBHEKA et al., 2013 ). As condições ambientais de umidade, temperatura e
disponibilidade de oxigênio exercem uma grande influência no desenvolvimento
da doença e extensão dos danos causados (PÉROMBELON, 2002). Dessa
forma, as infecções permanecem latentes até que as condições ambientais,
incluindo água livre, baixa concentração de oxigênio e altas temperaturas,
tornem-se apropriadas para o desenvolvimento da doença (BABUJEE et al.,
2012, PÉROMBELON; KELMAN, 1980; TOTH et al., 2003). O tecido
colonizado torna-se mole devido à ação de enzimas pectinolíticas excretadas
pelo patógeno (MARINGONI, 2005). Subsequentes fermentações e
concomitante invasão do tecido em colapso por saprófitas ocasionam o
desprendimento de gases com odor desagradável (ROMEIRO, 1995). Essas
bactérias sobrevivem na água, em restos culturais em decomposição, na
rizosfera de plantas cultivadas ou invasoras, epifiticamente na filosfera de
plantas hospedeiras ou invasoras e no solo (KIKUMOTO, 1980;
PÉROMBELON; KELMAN, 1980; MARINGONI, 2005). No entanto, não
sobrevivem no solo por longos períodos na ausência de água livre e restos
culturais (PÉROMBELON; KELMAN, 1980).
A disseminação ocorre por meio de insetos, movimento de solo, tratos
culturais, implementos agrícolas; aerossóis, sementes e respingos de chuva ou
água de irrigação (ELPHISTHONE; PÉROMBELON, 1986; HADAS et al., 2001;
MARINGONI, 2005; PÉROMBELON; KELMAN, 1980; QUINN; SELLS;
GRAHAM, 1980). Nas brássicas, a bactéria penetra por ferimentos nas folhas
normalmente provocados por insetos e por implementos agrícolas (LOPES;
QUEZADO-SOARES, 1997). Em couve-manteiga, também é comum que a

16
doença se inicie a partir dos ferimentos ocasionados pela remoção sucessiva
de folhas (HALFELD-VIEIRA et al., 2010).
Os sintomas da doença variam de acordo com as condições do
ambiente, uma vez que, a concentração de oxigênio e a umidade são fatores
importantes na intensidade da doença (PÉROMBELON; LOWE, 1975; DE
BOER et al., 1987). Também a resistência ou suscetibilidade da cultivar e parte
da planta afetada irão influenciar na sintomatologia (BAIN et. al., 1990; DE
BOER et al.,1987).
Em plantas de couve-manteiga, as folhas infectadas apresentam
manchas encharcadas que se expandem rapidamente (LOPES; QUEZADO-
SOARES, 1997). Sintomas de murcha e apodrecimento são comuns. No caule
é comum a presença de rachaduras externas, internamente, pode ser
observada a desintegração da medula (Figura 1), devido à ação das enzimas
pectinolíticas excretadas pelo patógeno e, muitas vezes, apresenta secreção
de líquido com odor fétido característico desta bacteriose (MARINGONI, 2005;
TRANI et al., 2015).

QUEIROZ, M.F, 2014

Figura 1. Sintomas de podridão-mole em caule de couve-manteiga.

Os isolados do gênero Pectobacterium podem ser identificados por meio


de características bioquímicas e fenotípicas (PÉROMBELON; KELMAN, 1980;
TOTH et al., 2001), no entanto, os resultados são pouco precisos, gerando
dificuldades e impossibilitando a identificação correta destas bactérias
(JABUONSKI, TAKATSU, REIFSCHEIDER, 1986; TOTH et al., 2001). Contudo,
através da biologia molecular é possível caracterizar e identificar seguramente
todos os patógenos de plantas (ASHMAWY et al., 2015; BASSO et al., 2010;

17
MORETTI; AMATULLI; BUONAURIO, 2009; ONKENDI; MOLELEKI, 2014;
PINHEIRO et al., 2011).
A identificação em nível específico de estirpes de Pectobacterium
carotovorum pode ser realizada através de PCR com oligonucleotídeos
iniciadores específicos Y1 (5'-TTACCGGACGCCGAGCTGTGGCGT-3') e Y2
(5' CAGGAAGATGTCGTTATCGCGAGT-3'), que amplificam 434 pares de
bases de parte do gene da pectato liase (pel) (DARRASSE et al., 1994). Além
disso, vários trabalhos vêm realizando a análise filogenética de uma região
conservada do genoma bacteriano denominada rDNA 16S (gene rRNA 16S)
para identificação de espécies, subespécies e estirpes do gênero
Pectobacterium (ASHMAWY et al., 2015; DANA et al., 2015; GARDAN et al.,
2003; HAUBEN et al., 1998; KWON et al., 1997; LEE et al., 2014; ZHU et al.,
2010).
Dessa forma, o gênero tem sido objeto de extensa pesquisa taxonômica
e, consequentemente, dividido em várias espécies e subespécies baseado em
características bioquímicas, diferenças de hospedeiros e, principalmente em
análises moleculares (DUARTE et al., 2004; KWON et al. 1997; HAUBEN et al.,
1998; GARDAN et al., 2003; NABHAN et al., 2013).

2.2.1.1. Aspectos taxonômicos

As espécies de bactérias causadoras de podridão-mole pertencem à


Divisão Eubacteria, Reino Proteobactéria, Família Enterobacteriaceae (HOLT
et al., 1994).
As bactérias pectinolíticas foram inicialmente incluídas no gênero
Erwinia Winslow et al, proposto por Winslow et al em 1917 (WINSLOW et al.,
1917; TOTH et al., 2003), agrupando as bactérias Gram-negativas, não
formadoras de esporos, peritríquias, fermentativas, com forma de bastonete,
pertencentes à família Enterobacteriaceae (KWON et al., 1997; 2000).
O gênero Erwinia, inicialmente foi dividido em três grupos filogenéticos:
Amylovora, Carotovora e Herbicola (DYE, 1969). As espécies do genêro
Erwinia pertencentes ao grupo Carotovora, as quais são capazes de produzir
enzimas pectonolíticas passaram por um processo de reclassificação ao longo
dos anos. Inicialmente, Waldee em 1945 propôs a transferência das Erwinias
pectinolíticas para o gênero Pectobacterium Waldee (WALDEE, 1945). No

18
entanto, essa proposta não foi amplamente aceita, pois apenas a característica
da atividade pecnolítica não foi considerada suficiente para formar um novo
gênero (DUARTE, 1999). Posteriormente, Hauben et al. (1998) com base na
análise de sequência do rDNA 16S de 29 estirpes de bactérias associadas a
plantas, propuseram que as espécies do grupo Carotovora do gênero Erwinia
fossem reunidas no gênero Pectobacterium, sendo então renomeadas: E.
carotovora subsp. atroseptica (van Hall) Dye para Pectobacterium carotovorum
subsp. atrosepticum (van Hall) Hauben et al., E. carotovora subsp.
betavasculorum Thomson et al. para P. carotovorum subsp. betavasculorum
(Thomson et al.) Hauben et al., E. carotovora subsp. carotovora (Jones) Bergey
et al. para P. carotovorum subsp. carotovorum (Jones) Hauben et al., E.
carotovora subsp. odorifera Gallois et al. para P. carotovorum subsp.
odoriferum (Gallois et al.) Hauben et al., E. carotovora subsp. wasabiae Goto e
Matsumoto para P. carotovorum subsp. wasabiae (Goto & Matsumoto) Hauben
et al., E. cacticida Alcorn et al. para P. cacticidum Hauben et al., E.
chrysanthemi Burkholder et al. para P. chrysanthemi (Burkholder et al.) Brenner
et al. e E. cypripedii (Hori) Bergey et al. para P. cypripedii (Hori) Brenner et al.
Em 2003, considerando estudo utilizando hibridação de DNA-DNA, taxonomia
numérica de 120 características fenotípicas, sorologia e nova análise
filogenética de sequências de rDNA 16S, previamente relatadas em base de
dados, P. carotovorum subsp. betavasculorum (Thomson et al.) Hauben et al.,
P. carotovorum subsp. atrosepticum (van Hall) Hauben et al. e P. carotovorum
subsp. wasabiae (Goto & Matsumoto) Hauben et al. foram elevadas ao nível de
espécies e renomeadas em P. betavasculorum (Thomson et al.) Gardan et al.,
P. atrosepticum (van Hall) Gardan et al. e P. wasabiae (Goto and Matsumoto)
Gardan et al, respectivamente (GARDAN et al., 2003). Samson et al. (2005)
baseado em análise filogenética da sequência de genes da região rDNA 16S
de estirpes de P. chrysanthemi propuseram a reclassificação da espécie para
o gênero Dickeya Samson et al.
Em trabalho realizado por Duarte et al. (2004), bactérias isoladas de
cultivos de batata (Solanum tuberosum L.) com sintomas de canela-preta no
Rio Grande do Sul, Brasil, apresentaram perfis bioquímicos, fisiológicos,
sorológicos e genéticos que não se enquadraram em nenhuma das espécies
de Pectobacterium, sobretudo apresentando características diferentes de

19
Pectobacterium atrosepticum, principal agente causal de canela-preta em
batata. No entanto, apresentaram-se semelhantes a P. carotovorum subsp.
carotovorum, levando a sugestão de uma nova subespécie de P. carotovorum,
denominada de P. carotovorum subsp. brasiliensis Duarte et al. Também
Nabhan et al. (2012) através de hibridação DNA-DNA de isolados identificados
em estudos anteriores como P. carotovorum subsp. brasiliensis (DUARTE et
al., 2004; NABHAN et al, 2011), confirmaram a proposta da nova subespécie,
brasiliensis. Adicionalmente, Nabhan et al. (2013) propuseram a inserção de
uma nova espécie causadora de podridão-mole, infectando principalmente
monocotiledôneas: P. aroidearum Nabhan et al.
Diante do exposto, a espécie P. carotovorum tem sido dividida em três
subespécies, carotovorum, odoriferum e brasiliensis.

2.2.2. Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis


P. carotovorum subsp. brasiliensis Duarte et al. (Pcb) causa podridão-
mole e canela-preta em diversas culturas de considerável importância
econômica ( VAN DER MERWE et al., 2010; CHOI; KIM, 2013; KUBHEKA et
al., 2013; LEE et al., 2014).
A subespécie brasiliensis é caracterizada bioquimicamente pela
formação de ácidos a partir de α-metil-glicosídio, D-galacturônico, D-sacarídeo,
L-glutâmico, ácido sucinâmico, crescimento a 37 ºC, produção de substâncias
redutoras de sacarose, como também, por não utilizarem Tween-40 e Tween-
80. O crescimento a 37 ºC é de extrema importância para diferenciar a
subespécie brasiliensis de P. atrosepticum (DUARTE et al, 2004; EL TASSA;
DUARTE, 2004).
Filogeneticamente P. carotovorum subsp. brasiliensis difere das demais
espécies de Pectobacterium, sendo que cerca de 5,4% dos genes de P.
carotovorum subsp. brasiliensis são compartilhados com P. carotovorum subsp.
carotovorum, porém não estão presentes em P. atrosepticum, e 13% dos
genes de P. carotovorum subsp. brasiliensis só são encontrados em seu
próprio genoma (GLASNER et al., 2008).
P. carotovorum subsp. brasiliensis é considerada um patógeno
altamente agressivo (DUARTE et al, 2004), apresentando ampla distribuição
geográfica, sendo relatado em diversos países, como África do Sul, Estados

20
Unidos, Coréia, Canadá, Quênia, Egito, Israel, Holanda, Suíça, Peru, Nova
Zelândia, Síria e Zimbábue (ALI et al., 2013; ASHMAWY et al., 2015; CHOI;
KIM, 2013; DE BOER; LI; WARD, 2012; LEITE et al., 2014; MA et al., 2007;
NABHAN et al., 2011; NGADZE et al.,2012; ONKENDI; MALULEKE;
MOLELEKI, 2014; ONKENDI et al., 2016; PANDA et al., 2012; WERRA et al.,
2015).
No Brasil, essa espécie foi encontrada apenas em cenoura e batata,
nesta é considerada o principal agente patogênico responsável por quadros de
canela-preta (DUARTE et al, 2004; EL TASSA & DUARTE, 2004; MALAVOLTA
JÚNIOR et al, 2008). No entanto, mundialmente P. carotovorum subsp.
brasiliensis tem sido registrada em diversas famílias botânicas, incluindo a
família Brassicaceae, como exemplo, a couve-chinesa (LEE et al., 2014),
tornando provável que essa espécie também esteja presente em cultivos de
brássicas no Brasil, devido a sua ampla gama de hospedeiros e distribuição
geográfica (LEE et al., 2014), o que pode gerar implicações epidemiológicas
importantes, que poderão ser fundamental para o estabelecimento de
estratégias de manejo e controle da doença em couve-manteiga.

2.2.3. Manejo da podridão-mole

Considerando que as bactérias fitopatogênicas do gênero


Pectobacterium são heterogêneas, apresentando ampla gama de hospedeiros
e distribuição geográfica (LEE et al., 2014) capacidade de sobrevivência em
restos de cultura no solo e disseminação por diversos meios, a podridão-mole
é uma doença de difícil controle (ELPHISTHONE; PÉROMBELON, 1986;
HADAS et al., 2001; MARINGONI, 2005; PÉROMBELON; KELMAN, 1980;
QUINN et al., 1980). No entanto, a combinação de algumas medidas é
recomendada para reduzir a incidência da doença, sendo as principais: evitar
ferimentos durante tratos culturais; fazer rotação de cultura com gramíneas;
controlar os insetos; equilibrar a adubação com nitrogênio e boro; eliminar
plantas doentes; controlar a irrigação para não encharcar o solo; plantar em
solos bem drenados; empregar água de irrigação livre de contaminação;
destruir restos de cultura; desinfestar depósitos e armazéns com sulfato de
cobre; não armazenar produtos doentes e sadios conjuntamente; armazenar
produtos em local ventilado, seco e frio; e evitar o excesso de umidade com o

21
maior espaçamento possível entre plantas (LOPES; QUEZADO-SOARES,
1997; MARIANO et al., 2001; MARINGONI, 2005).
Outras medidas também são recomendadas, como o controle biológico
(BARRA et al., 2009; DONG et al., 2004; MANEFIELD et al., 2001; SILVA et al.,
2014), o uso de variedades resistentes (REN; PETZOLDT, DICKSON, 2001),
uso de indutores de resistência (acibenzolar-S-metil) (BENELLI; DENARDIN;
FORCELINI, 2004), tratamento com cálcio (FLEGO et al., 1997; GOMES et al,
2005); aplicação de produtos alternativos (fosfito de cálcio, fosfito de potássio e
extratos vegetais) (SILVA et al., 2012a; SILVA et al., 2014), controle químico
através do uso de antibióticos e fungicidas à base de cobre (ZAMBOLIM;
VALE; COSTA, 1997; CHARKOWSKI, 2015).
O controle químico tem sido considerado pouco eficiente e/ou
economicamente inviável, uma vez que, produtos fitossanitários têm preços
elevados no mercado brasileiro e impactam significativamente o custo de
produção agropecuária (PEREIRA, 2013).
Para uso de antibióticos agrícolas deve-se considerar o custo, registro
para a cultura, período de carência e, principalmente, a interferência no
ecossistema envolvido (MELO et al, 2011). Dessa forma, o baixo número de
agroquímicos registrados para as doenças bacterianas em hortaliças (BERIAM,
2007; CRUZ, 2013) favorece a utilização de produtos em cultura diversa da
indicada no registro (CRUZ, 2013). No Brasil, há registro de apenas um produto
formulado comercial contendo antibiótico de uso agrícola, o Kasumim®
(casugamicina 2,0%) (AGROFIT, 2016). Porém, a utilização repetida e
frequente do mesmo antibiótico leva a seleção de bactérias resistentes aos
princípios ativos fazendo com que estes produtos percam a eficiência
(AGRIOS, 2005; BERIAM, 2007; LOPES; QUEZADO-SOARES, 1997), além
disso, a utilização excessiva de agroquímicos gera uma série de danos
ambientais, bem como para saúde humana e animal (JARDIM; ANDRADE;
QUEIROZ, 2009).
Não há nenhum produto registrado para controle da podridão-mole nas
brássicas (AGROFIT, 2016), tendo em vista que são consideradas culturas
com suporte fitossanitário insuficiente, denominadas “minor crops” (MAPA,
2010), sobretudo para o patossistema couve-manteiga x Pectobacterium
carotovorum subsp. brasiliensis. Nesse contexto, alternativas de controle

22
eficientes, que agreguem sustentabilidade, para serem integradas ao manejo
da podridão-mole tornam-se necessárias.

2.3. Controle alternativo de fitopatógenos mediante uso de óleos


essenciais

A denominação “óleos essenciais” (OEs) define um grupo de


substâncias naturais de variável poder aromatizante, lipossolúveis, de
composição complexa, que fazem parte do metabolismo secundário de
diversas espécies vegetais, das quais é extraído segundo processamento
específico (BAKKALI et al., 2008). De modo geral, são misturas de substâncias
voláteis, com uma densidade geralmente mais baixa do que a da água,
odoríferas e líquidas (DE LA ROSA et al., 2010; MORAIS, 2009; MORAIS et al.,
2009).
Nos vegetais, os OEs desempenham funções importantes, como
proteção contra predadores, agentes antimicrobianos e atração de
polinizadores (BAKKALI et al., 2008).
Os constituintes químicos são variáveis, como hidrocarbonetos
terpênicos, álcoois simples e terpênicos, aldeídos, cetonas, fenóis, ésteres,
éteres, óxidos, peróxidos, furanos, ácidos orgânicos, lactonas, cumarinas e
compostos de enxofre, dentre os quais se destacam os de baixo peso
molecular, como os monoterpenos e sesquiterpenos (SIMÕES; SPITZER,
2000). Esses componentes apresentam-se em diferentes concentrações,
ocorrendo sempre um (SIMÕES; SPITZER, 2000), dois ou três compostos
majoritários (BAKKALI et al., 2008) e outros em menores quantidades
(BAKKALI et al., 2008; SIMÕES; SPITZER, 2000), que são conhecidos por
exercerem atividade antimicrobiana por interferência na parede celular e
membranas citoplasmáticas, aumentando a permeabilidade e perda dos
constituintes celulares, alterando uma variedade de sistemas enzimáticos,
incluindo aqueles envolvidos na produção de energia celular, síntese de
componentes estruturais e inativação ou destruição do material genético
(BAKKALI et al., 2008, KIM et al., 1995; PIPER et al., 2001; RASOOLI et al.,
2006), e atuarem na atividade elicitora de defesa em plantas através da
ativação de vias bioquímicas, induzindo a produção de fitoalexinas,
peroxidades, quitinases e β-1,3-glucanase (LUCAS et al., 2012; SCHWAN-
23
ESTRADA, STANGARLIN & CRUZ, 2003; PEREIRA et al., 2008). No entanto,
a eficiência do óleo essencial depende da espécie envolvida, do tipo de doença
a ser controlada, dos métodos de extração, das condições de cultivo, espécies
e partes de plantas, estações do ano, áreas geográficas (BURT, 2004, SILVA,
PASCHOLATI ; BEDENDO, 2007).
Diversos trabalhos utilizando OEs foram realizados com fungos
fitopatogênicos. Carnelossi et al. (2009) avaliando o efeito in vitro dos OEs de
capim-limão (Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf, eucalipto citridiora (Corymbia
citriodora Hill & Johnson) e menta (Mentha arvensis L.) sobre o fungo
Colletotrichum gloeosporioides (Penzig) Saccardo, observaram total inibição do
crescimento micelial do patógeno. O óleo de capim-limão também foi efetivo na
inibição do crescimento de Alternaria citri Elli & Pierce (COMBRINCK et al.,
2011).
OEs de sálvia (Salvia officinalis L.), capim-limão e carqueja (Bacharis
trimera (Less.) DC, testados em diferentes concentrações, inibiram o
crescimento micelial de Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, agente causal
da podridão de sclerotinia (PANSERA et al., 2012). Recentemente, OEs de
cravo (Eugenia caryophyllata Thunb), tomilho (Thymus vulgaris L.), alecrim
(Rosmarinus officinalis L.) e seus componentes majoritários testados no
controle da murcha de Fusarium em tomateiro foram capazes de reduzir a
doença, sendo o óleo de cravo o mais eficiente (LA TORRE et al., 2016).
A atividade nematicida de OEs também já foi verificada. Neves et al.
(2008) constataram que o óleo de mostarda (Brassica spp.) causa até 100% de
mortalidade dos juvenis de Meloidogyne javanica (Treub) Chitwood.
Os OEs têm apresentando resultados satisfatórios no controle in vitro e
in vivo de diversas fitobacterioses. Pouvova et al. (2008), ao testarem 34 óleos
essenciais contra as bactérias Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus
(Spieckermann & Kotthoff) Davis et al. e C. michiganensis subsp. insidiosus
(McCulloch) Davis et al., verificaram que os OEs de orégano (O. compactum
L.), cravo, absinto (Artemisia absinthium L.), tomilho, pinho da Sibéria (Abies
siberica L.), manjericão (Ocimum basilicum L.) e lima (Citrus aurantifolius
Swingle) foram os mais eficazes contra as duas bactérias.
OEs citronela (Cymbopogon winterianus Jowitt), gengibre (Zingiber
officinale Roscoe) e cravo testados em diferentes concentrações sobre o

24
crescimento de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. e a incidência
do moko em mudas de bananeira inibiram o crescimento de R. solanacearum
em todas as concentrações testadas. Nas mudas de bananeira pulverizadas, o
óleo de citronela proporcionou o melhor resultado, com 100% de controle da
doença (AMORIM et al., 2011).
Santos et al. (2014), avaliando a eficácia do óleo essencial de alecrim
da chapada (Lippia gracilis Schauer) no crescimento in vitro de Xanthomonas
campestris pv. viticola (Nayudu) Dye (Xcv), constataram inibição do
crescimento de Xcv em todas as concentrações, apresentando porcentagens
de inibição variando de 62,67% a 96,50%.
Lima (2016), em ensaio in vitro, verificou que OEs de alecrim, capim-
limão, citronela, cravo, eucalipto e palmarosa (Cymbopogon martin [Roxb.]
Wats) inibiram completamente o crescimento de R. solanacearum. Já in vivo
a população de R. solanacearum no solo foi reduzida pelos óleos de alecrim,
cravo, capim limão, gengibre, melaleuca (Melaleuca alternifolia Maiden &
Betche, Cheel) e palmarosa, destacando-se o cravo com redução de 42,3%.
Sendo que o óleo de cravo reduziu a incidência, o índice de murcha
bacteriana (IMB) e a área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD)
em 90,2; 97 e 98,8, respectivamente, e o seu composto majoritário, o
eugenol, teve os mesmos efeitos na redução da doença.
Existem algumas pesquisas mostrando a eficácia de OEs na inibição de
Pectobacterium carotovorum e controle da podridão-mole. In vitro, Costa et al.
(2008a) observaram que o óleo de alecrim na concentração mínima inibitória
(CMI) de 4% foi efetivo sobre seis isolados de P. carotovorum, com valores
médios de halos de inibição entre 10 e 12 mm de diâmetro. Utilizando óleo de
citronela, Costa et al. (2008b) verificaram que na CMI de 1%, esse óleo inibiu o
crescimento de isolados de P. carotovorum. Também Costa et al. (2009)
observaram que o óleo de manjericão promoveu a formação de halos de
inibição entre 24 e 28 mm, quando na CMI de 2% sobre isolados de P.
carotovorum. Huang e Lakhsman (2010) verificaram o efeito bactericida do
óleo de cravo a 0,5% sobre P. carotovorum subsp. carotovorum.
Em trabalho realizado por Silva et al. (2012a), os óleos de eucalipto
globulus (Eucalyptus globulus Labill) e laranja-doce (Citrus sinensis L.)
reduziram significativamente a severidade da podridão-mole em alface crespa.

25
Já a área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD) foi reduzida pelos
óleos de limão (Citrus limon L.), sálvia-esclaréia (Salvia sclarea L.), eucalipto
globulus, gengibre, erva-doce (Foeniculum vulgare Mill), laranja-doce, eucalipto
citriodora e capim-limão. Mais recentemente, Guerra et al. (2014), avaliando o
efeito de OEs na redução da podridão-mole em couve-chinesa, verificaram que
os OEs de bergamota (Citrus bergamia Risso et Poiteau ), capim-limão,
copaíba (Copaifera officinalis), eucalipto citriodora, eucalipto globulus, erva-
doce, gengibre, hortelã (Mentha piperita L.), laranja-doce, limão e sálvia-
esclaréia reduziram significativamente a severidade e a área abaixo da curva
de progresso da doença.
Na literatura, não foram encontrados trabalhos utilizando óleos
essenciais para o controle da podridão-mole na couve-manteiga, no entanto, os
relatos acima sugerem o potencial dos mesmos para estudos de controle
alternativo nesse patossistema.

26
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39
OBJETIVOS

Os objetivos desse estudo foram: a) realizar levantamento de bactérias


pectinolíticas do gênero Pectobacterium associadas à podridão-mole em
couve-manteiga e b) verificar o efeito de óleos essenciais no crescimento in
vitro de Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis, bem como no controle
da podridão-mole, em plantas de couve-manteiga.

40
CAPÍTULO I

Ocorrência de Pectobacterium carotovorum subsp.


brasiliensis em couve-manteiga, no Brasil

Artigo formatado com base nas normas para publicação na revista


“JOURNAL OF PLANT PATHOLOGY”, para a qual será submetido.

41
1 COMUNICAÇÕES CIENTÍFICAS

2 Ocorrência de Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis em


3 couve-manteiga, no Brasil
4 M. F. Queiroz1, A. R. Peixoto1, G. M.R. Albuquerque2, M.A.S. da Gama2, J.B.
5 Souza1, C. D. da Paz1, R. L. R. Mariano2

6 1
Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais, Universidade do Estado da Bahia,
7 Juazeiro, BA, Brasil
8 2
Departamento de Agronomia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, PE,
9 Brasil
10

11 RESUMO

12 Doenças bacterianas são comuns em cultivos de couve-manteiga, entre elas,


13 a podridão-mole causada por bactérias do gênero Pectobacterium. Sintomas de
14 podridão-mole foram observados em plantas de couve-manteiga cultivadas em
15 hortas comunitárias em Juazeiro, BA e Petrolina, PE (Brasil). Realizou-se isolamento
16 parcialmente seletivo para Pectobacterium em meio CPG, obtendo-se colônias de
17 bordos irregulares, opacas, com característica de "vidro quebrado", protuberância no
18 centro, formando o aspecto de “ovo frito” quando visualizadas em microscópio
19 estereoscópico. O teste de patogenicidade foi realizado em mudas de couve-
20 manteiga e em folhas destacadas de couve-manteiga e couve-chinesa, sendo os
21 sintomas observados após 12-24 h de incubação. O isolado UNEB8 foi positivo para
22 maceração em tubérculos de batata, resistente a eritromicina, cresceu a 37 °C,
23 Gram-negativo, utilizou melibiose, gentibiose, trealose, ácido galacturônico e ácido
24 glucônico, e não utilizou dextrina, sorbitol e maltose. Baseado nas análises
25 moleculares produziu 434 pb para o gene pel, 1249 pb para o gene 16S rRNA. De
26 acordo com o Blast foi 99,9% similar a Pcb C18 e filogenicamente relacionou-se com
27 os isolados A17 e 8 de Pcb. Este é o primeiro relato de Pectobacterium carotovorum
28 subsp. brasiliensis como agente causal da podridão-mole em couve-manteiga, no
29 Brasil.
30
31 Palavras-chaves: Brassica oleraceae var. acephala; Podridão-mole,
32 Sequenciamento

33 A couve-manteiga (Brassica oleraceae L. var. acephala DC) é amplamente


34 cultivada por agricultores familiares no Brasil, e está presente entre as hortaliças

42
35 mais consumidas no mercado nacional, sobretudo pelo seu alto valor nutricional
36 (Novo et al., 2010). Infecções bacterianas são comuns em cultivos de couve-
37 manteiga, muitas das quais são limitantes para o desenvolvimento da cultura, entre
38 elas, encontram-se as ocasionadas por bactérias do gênero Pectobacterium,
39 responsáveis por sintomas de podridão-mole (Filgueira, 2008).
40 Em visitas realizadas em hortas comunitárias nos municípios de Juazeiro, BA
41 e Petrolina, PE, foram observadas plantas de couve-manteiga com sintomas de
42 podridão-mole (Figura 1). A partir do tecido infectado foi realizado o isolamento
43 parcialmente seletivo para Pectobacterium carotovorum utilizando-se frutos de
44 pimentão verde (Takatsu et al., 1981). Após 48 h, realizou-se o isolamento em meio
45 CPG (caseína hidrolisada 1 g, peptona 10 g, dextrose 10 g, ágar 18 g, água
46 destilada 1000 mL) a partir de frutos de pimentão sintomáticos. Colônias com bordos
47 irregulares, opacas, com característica de "vidro quebrado" (Duarte & El Tassa,
48 2003), protuberância no centro, formando o aspecto de “ovo frito” visualizadas em
49 microscópio estereoscópico (Takatsu, 2007) foram preservadas em água destilada
50 esterilizada (ADE) e mantidas em temperatura ambiente (Mariano & Silveira, 2005).
51 O teste de patogenicidade foi realizado em mudas de couve-manteiga (T de 30°C ±2
52 e UR de 62% ± 2) e folhas destacadas de couve-manteiga e couve-chinesa (T de
53 28°C ± 2 e UR de 65% ± 2), empregando-se o método de injeção da suspensão
54 bacteriológica A530 = 0,36 (1x109 UFC. mL-1) dos isolados com 48 h de incubação
55 (Mariano & Silveira, 2005). Os sintomas de podridão-mole foram observados após
56 12-24 h de incubação, procedendo-se o reisolamento do patógeno, completando-se
57 os postulados de Koch.

58
59 Figura 1. Sintomas de podridão-mole (Pectobacterium carotovorum subsp.
brasiliensis) em caules de couve-manteiga.

43
60 Um dos isolados (UNEB8) foi submetido à identificação bioquímica e
61 fisiológica por meio dos seguintes testes: maceração em tubérculos de batata,
62 crescimento a 37 °C, sensibilidade à eritromicina (Hyman et al., 2002) e reação de
63 Gram (KOH 3%) (Mariano & Assis, 2000). A caracterização metabólica foi realizada
64 por meio do sistema Biolog, Inc (Hayward, Estados Unidos) utilizando-se
65 microplacas Biolog GenIII, contendo 71 fontes de carbono. As avaliações foram
66 realizadas visualmente observando-se a mudança de coloração dos poços para
67 púrpura (positivo). A identificação específica foi realizada por meio de PCR utilizando
68 os oligonucleotídeos iniciadores Y1 (5’-TTA CCG GAC GCC GAG CTG TGG CGT-
69 3’) e Y2 (5’-CAG GAA GAT GTC GTT ATC GCG AGT-3’) de parte do gene da
70 pectato liase (pel) de acordo com Darrasse et al. (1994) e os iniciadores universais
71 yf1 (5’-TGATGGAGGGGGATAACTACTGGA-3’) e yr1 (5’
72 CCCCTACGGTTACCTTGTTACGAC-3’) de parte do gene 16S rRNA (Hauben et al.,
73 1998). A sequência parcial do gene 16S rRNA obtida, a qual foi sequenciada pela
74 Macrogen®, foi comparada com outras oriundas do GenBank utilizando-se a
75 ferramenta Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). A análise filogenética foi
76 realizada com o programa MEGA versão 4.0, utilizando o método “Neighbor-Joining”
77 e modelo de substituição de nucleotídeos Kimura-2-parâmetros com “bootstrap” de
78 2000.
79 UNEB8 foi positivo para maceração em tubérculos de batata, resistente a
80 eritromicina, cresceu a 37 °C e apresentou células Gram-negativas. A caracterização
81 metabólica mostrou a sua capacidade em utilizar melibiose, gentibiose, trealose,
82 ácido galacturônico e ácido glucônico, bem como a não utilização de dextrina,
83 sorbitol e maltose. Os produtos da amplificação do DNA pela PCR com os
84 iniciadores específicos (Y1/Y2) para P. carotovorum produziram uma banda de 434
85 pb. A amplificação com os iniciadores yf1/ yr1 gerou uma sequência de
86 aproximadamente 1249 pb do gene 16S rRNA. A sequência parcial do gene 16S
87 rRNA foi 99,9% similar a Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis C18 (N°
88 acesso JF926718.1).
89 Filogenicamente o isolado UNEB8 relacionou-se com os isolados A17 e 8 de
90 Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis (Figura 2). Os resultados baseados
91 em testes fisiológicos, bioquímicos, metabólicos e moleculares permitiram identificar
92 o isolado UNEB8 como Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis.
93

44
94
95 Figura 2. Árvore filogenética baseada na sequência 16S rRNA de isolados de
pectobactérias relacionadas ao isolado UNEB8. A barra da escala indica o número de
96 alterações esperadas por sítio.

97 Na couve-manteiga, a podridão-mole é comumente causada por


98 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (Filgueira, 2008; Lopes &
99 Quezado-Soares,1997; Maringoni, 2005), subespécie que é mais disseminada nos
100 solos brasileiros (Lopes & Quezado-Soares,1997). No entanto, o gênero
101 Pectobacterium é composto por uma diversidade de espécies e subespécies (Duarte
102 et al., 2004; Hauben et al. 1998; Gardan et al., 2003; Samson et al., 2005; Nabhan et
103 al., 2013), sendo que a maioria não tem especificidade, podendo infectar uma ampla
104 gama de hospedeiros, e uma mesma planta pode ser infectada por várias espécies
105 ou subespécies do gênero (Mariano et al, 2005; Silva, 2012).

45
106 Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis foi relatada pela primeira vez
107 em cultivos de batata no Brasil em 2004 (Duarte et al., 2004), desde então, sua
108 ocorrência vem sendo registrada em diversos países, como África do Sul, Estados
109 Unidos, Coréia, Canadá, Quênia, Egito, Israel, Holanda, Suíça, Peru, Nova Zelândia,
110 Síria e Zimbábue (Ali et al., 2013; Ashmawy et al., 2015; Choi e Kim, 2013; De Boer
111 et al., 2012; Leite et al., 2014; Ma et al., 2007; Nabhan et al., 2011; Ngadze et al.,
112 2012; Onkendi et al., 2014; Onkendi et al., 2016; Panda et al., 2012; Werra et al.,
113 2015). No Brasil, essa espécie foi encontrada apenas em cenoura e batata no
114 Estado do Rio Grande do Sul (Duarte et al., 2004; Malavolta Júnior et al., 2008).
115 Portanto, este é o primeiro relato de Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis
116 como agente causal da podridão-mole em couve-manteiga no Brasil.
117
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48
CAPÍTULO II

Óleos essenciais no manejo da podridão-mole em couve-


manteiga, no Semiárido brasileiro

Artigo formatado com base nas normas para publicação na revista “ACTA
SCIENTIARUM. AGRONOMY”, para a qual será submetido.
49
1 Óleos essenciais no manejo da podridão-mole em couve-manteiga, no
2 semiárido brasileiro

3 Marcia Ferreira Queiroz1*, Ana Rosa Peixoto*1, Meridiana Araújo Gonçalves Lima2,
4 Josineide Edinalva Pereira, Cristiane Domingos da Paz1
5
1
6 Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais, Universidade do Estado da Bahia,
7 CEP 48900-000, Juazeiro, BA, Brasil. 2 Departamento de Agronomia, Universidade
8 Federal Rural de Pernambuco, 52171-900, 5 Recife, PE, Brasil.3 *Autores para
9 correspondência: E-mail: marcyabioagro@gmail.com; arpeixoto@gmail.com
10
11 RESUMO. Os óleos essenciais (OEs) de cravo a 0,25%, capim-limão e palmarosa a
12 0,5%, citronela, melaleuca e laranja a 0,75%, bergamota, alecrim, sálvia e gengibre
13 a 1%, bem como capim-limão, cravo, citral e acetato de eugenol (AE) em diferentes
14 concentrações foram avaliados na inibição de Pectobacterium carotovorum subsp.
15 brasiliensis (Pcb) e controle da podridão-mole em couve-manteiga, pulverizados 72
16 horas antes ou sete horas após a inoculação. Os óleos de cravo, citronela,
17 bergamota, alecrim, palmarosa, sálvia, melaleuca e capim-limão inibiram
18 completamente o crescimento de Pcb. O óleo de capim-limão (0,5%) promoveu uma
19 incidência (INC) de 0%, proporcionando um percentual de controle da doença de
20 100%, em ambos os períodos. O óleo de cravo (0,25%) apresentou menor INC
21 (25%) quando aplicado após inoculação, promovendo um percentual de controle de
22 71,42%. A CMI foi de 0,03125, 0,0625 e 0,125% para o citral, capim-limão e cravo,
23 respectivamente. O AE não apresentou CMI. O óleo de capim-limão a 0,125% (pós-
24 inoculação) e o citral a 0,125%, em ambos os períodos, proporcionaram os maiores
25 percentuais de controle da doença (33,33; 50 e 100%, respectivamente). O óleo de
26 cravo a 0,125% (pós-inoculação) mostrou maior eficiência que o AE (0,25%),
27 promovendo um percentual de controle da doença de 16,67%. OEs de capim-limão
28 e cravo destacaram-se na eficiência de controle da podridão-mole em couve-
29 manteiga.

30 Palavras-chaves: Controle alternativo, P. carotovorum subsp. brasiliensis, Brassica


31 oleracea var. acephala, capim-limão, cravo, citral

32 Essential oils on the management of soft rot of cabbage, Brazilian semiarid

33 ABSTRACT. Essential oils (EOs) of clove at 0,25%, lemongrass and palmarosa at


34 0,5%, citronella, tea tree and orange at 0,75%, bergamot, rosemary, sage and ginger

50
35 at 1%, and lemongrass, clove, citral and eugenol acetate (EA) at different
36 concentrations were evaluated in the inhibition of Pectobacterium carotovorum
37 subsp. brasiliensis (Pcb) and control of soft rot in kale, sprayed 72 hours before or
38 seven hours after inoculation. Clove, lemongrass, bergamot, rosemary, palmarosa,
39 sage, tea tree and lemongrass oils completely inhibited the growth of Pcb.
40 Lemongrass oil (0,5%) promoted an incidence (INC) of 0%, providing a percentage of
41 disease control of 100%, in both periods. The clove oil (0,25%) showed lower INC
42 (25%) when applied after inoculation, promoting a control percentage of 71,42%. The
43 MIC was 0,03125, 0,0625 and 0,125% for citral, lemongrass and clove, respectively.
44 The EA did not present MIC. Lemongrass oil at 0,125% (post-inoculation) and citral
45 at 0,125%, in both periods, provided the highest percentages of disease control (33,
46 33; 50 and 100%, respectively). The clove oil at 0,125% (post-inoculation) showed
47 higher efficiency than EA (0,25%), promoting a percentage of disease control of
48 16,67%. EOs of lemongrass and clove were highlighted in the efficiency control of
49 soft rot in kale.

50 Keywords: Alternative control, P. carotovorum subsp. brasiliensis, Brassica oleracea


51 var. acephala, lemongrass, clove, citral

52 INTRODUÇÃO

53 No Brasil, a couve-manteiga (Brassica oleracea L. var. acephala DC) é


54 cultivada o ano todo, permanecendo produtiva durante vários meses, o que a torna
55 uma fonte de renda atrativa, principalmente para os agricultores familiares, que a
56 cultivam em pequenas áreas ao longo do ano (Silva, Garcia, Silva, Oliveira & Tosta,
57 2012b). Dentre os fatores que podem comprometer a produção da cultura
58 encontram-se as fitobacterioses, entre elas, a podridão-mole causada por bactérias
59 pectinolíticas do gênero Pectobacterium (Filgueira, 2008; Maringoni, 2005).
60 A espécie P. carotovorum é considerada uma das dez bactérias
61 fitopatogênicas de maior importância científica e econômica do mundo (Mansfield et
62 al., 2012). Na couve-manteiga, a podridão-mole é comumente causada por P.
63 carotovorum subsp. carotovorum (Jones) Hauben et al (Pcc) (Maringoni, 2005). No
64 entanto, o gênero Pectobacterium é composto por uma diversidade de espécies e
65 subespécies (Duarte, De Boer, Ward & Oliveira, 2004; Hauben et al. 1998; Gardan,
66 Gouy, Christen & Samson, 2003; Samson et al., 2005; Nabhan, Solke, De Boer,

51
67 Maiss & Wydra, 2013), sendo que a maioria não tem especificidade, podendo
68 infectar uma ampla gama de hospedeiros, e uma mesma planta pode ser infectada
69 por várias espécies ou subespécies do gênero (Mariano, Silveira, Alvarado & Silva,
70 2005). Em 2004, uma nova subespécie, altamente agressiva, nomeada de P.
71 carotovorum subsp. brasiliensis Duarte et al (Pcb) foi caracterizada em cultivos de
72 batata no Brasil (Duarte et al., 2004). Desde então, a subespécie vem sendo
73 relatada em diversos países e famílias botânicas, incluindo a Brassicaceae, a
74 exemplo da couve-chinesa (Brassica pikinensis L) (Lee, Kim, Lim, Han & Heu, 2014).
75 Na couve-manteiga, até o presente não foram encontrados relatos de ocorrência de
76 Pcb.
77 A podridão-mole é uma doença de difícil controle devido à heterogeneidade
78 das espécies do gênero Pectobacterium, que possuem ampla gama de hospedeiros
79 e distribuição geográfica (Lee et al., 2014), apresentando capacidade de
80 sobrevivência em restos de cultura, no solo e na rizosfera de plantas cultivadas ou
81 invasoras (Charkowski, 2015; Kikumoto, 1980; Pérombelon & Kelman, 1980;
82 Maringoni, 2005), e disseminação por diversos meios (Elphisthone & Pérombelon,
83 1986, Hadas, Kritzman, Gefen & Manulis, 2001; Maringoni, 2005; Pérombelon &
84 Kelman, 1980). No entanto, algumas medidas de controle integradas envolvem: o
85 plantio em solos bem drenados, controle de insetos, eliminação de plantas doentes,
86 rotação de culturas (Mariano et al., 2001; Maringoni, 2005), controle biológico
87 (Dong, Zhang, Xu & Zhang, 2004; Silva, Carvalho, Silva, Lins & Oliveira, 2014), uso
88 de indutores de resistência (acibenzolar-S-metil) (Benelli, Denardin & Forcelini,
89 2004), utilização de fosfito de cálcio, fosfito de potássio e extratos vegetais (Silva et
90 al., 2012a; Silva et al, 2014) e controle químico através do uso de antibióticos e
91 fungicidas à base de cobre (Zambolim, Vale & Costa,1997; Charkowski, 2015). No
92 entanto, não há nenhum produto registrado para controle da podridão-mole nas
93 brássicas (Agrofit, 2016).
94 Os óleos essenciais têm sido muito estudados nos últimos anos, mostrando-
95 se promissores no manejo alternativo de doenças de plantas, devido às suas
96 propriedades antimicrobianas. O potencial de óleos essenciais foi verificado no
97 controle da podridão-mole, causada por Pcc, em couve-chinesa (Guerra, Guerra,
98 Souza & Mariano, 2014) e alface (Lactuca sativa L.) (Silva et al., 2012a). Também
99 resultados positivos in vitro de óleos essenciais foram obtidos para Pcc (Costa,

52
100 Santos, Barros, Agra & Farias , 2008a; 2008b; Fernández et al., 2014; Jeong et al.,
101 2009; Salem, Abdel-Mageed & Ali, 2014; Sotelo-Boyás et al., 2015).
102 Dessa forma, o presente trabalho foi realizado com os objetivos de avaliar o
103 efeito in vitro e in vivo de óleos essenciais em diferentes concentrações na inibição
104 do crescimento de Pcb e controle da podridão-mole, em couve-manteiga.

105 MATERIAL E MÉTODOS

106 Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Fitopatologia e casa de


107 vegetação do Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais (DTCS), da
108 Universidade do Estado da Bahia-UNEB, Campus III, Juazeiro-BA, Brasil e
109 Laboratório de Fitobacteriologia (LAFIBAC) da Universidade Federal Rural de
110 Pernam buco - UFRPE, Recife- PE, Brasil.

111 Obtenção, identificação e cultivo do isolado bacteriano pectinolítico

112 Plantas de couve-manteiga com sintomas de podridão-mole, cultivadas em


113 hortas comunitárias dos municípios de Juazeiro- BA e Petrolina-PE foram coletadas
114 em sacos plásticos etiquetados e, posteriormente, transportadas ao laboratório de
115 Fitopatologia da UNEB para realização da diagnose da doença. As áreas visitadas
116 que apresentaram sintomas da doença (Tabela 1) foram georeferenciadas
117 utilizando-se o aparelho GPS portátil Garmin eTrex 10.

118 Tabela 1. Isolados bacterianos pectinolíticos obtidos de couve-manteiga cultivada


119 em hortas comunitárias dos municípios de Juazeiro-BA e Petrolina- PE.
COORDENADAS GEOGRÁFICAS
ISOLADO LOCAL DE COLETA
LATITUDE LONGITUDE

UNEB5 Juazeiro-BA 09°28.282' 040°30.085'


UNEB8 Juazeiro-BA 09°28.314' 040°30.076'
UNEB11 Petrolina-PE 09°21.654' 040°32.456'
UNEB18 Petrolina-PE 09°21.647' 040°31.939'
UNEB20 Petrolina-PE 09°16.204' 040°35.755'
UNEB31 Petrolina-PE 09°21.247' 040°29.267'
UNEB34 Petrolina-PE 09°10.362' 040°33.782'
UNEB39 Juazeiro-BA 09°25.247' 040°31.563'
120
121 Em laboratório, o material sintomático foi submetido ao isolamento seletivo
122 para Pectobacterium carotovorum utilizando-se frutos de pimentão verde (Capsicum
123 annuum L.) previamente desinfestados (álcool 70%; NaOCl 1%) e lavados com água
53
124 destilada esterilizada (ADE). Posteriormente, palitos de madeira esterilizados foram
125 introduzidos no material sintomático e, em seguida, no fruto de pimentão verde, o
126 qual foi mantido em câmara úmida por 36 h a 28 °C ± 2 ºC (Takatsu, Mello & Garcia,
127 1981). Após esse período, na lesão do fruto de pimentão, a alça de platina foi
128 encostada no tecido de transição entre a parte sintomática e a sadia e, em seguida,
129 plaqueada pelo método de estrias (Mariano & Silveira, 2005) em meio CPG (caseína
130 hidrolisada 1 g, peptona 10 g, dextrose 10 g, ágar 18 g, água destilada 1000 mL). As
131 placas com as culturas bacterianas foram incubadas a 28 °C ± 2 por 48 h.
132 Posteriormente, colônias com bordos irregulares, opacas, com característica de
133 "vidro quebrado" (Duarte & El Tassa, 2003), protuberância no centro, com o aspecto
134 de “ovo frito” visualizada em microscópio estereoscópico (Takatsu, 2007), foram
135 preservadas em ADE (Mariano & Silveira, 2005).
136 O teste de patogenicidade foi realizado em mudas de couve-manteiga (T de
137 30°C ± 2 e UR de 62% ± 2) e folhas destacadas de couve-manteiga e couve-chinesa
138 (T de 28°C ± 2 e UR de 65% ± 2), empregando-se o método de injeção de
139 suspensão bacteriológica (1x 109 UFC. mL-1) dos isolados com 48 h de incubação
140 (Mariano & Silveira, 2005). Após o aparecimento dos sintomas típicos da doença,
141 realizou-se o reisolamento do patógeno completando-se os postulados de Koch.
142 Com base em resultados preliminares de caracterização epidemiológica, o
143 isolado UNEB8 mostrou-se agressivo, apresentado os valores mais significativos
144 para período de incubação (PI), incidência (INC), severidade (SEV) e área abaixo da
145 curva de progresso da doença (AACPD) (dados não apresentados), sendo, utilizado
146 nos experimentos posteriores.
147 O isolado UNEB8 foi submetido à identificação bioquímica, fisiológica,
148 metabólica e molecular conforme descrito no capítulo 1.
149 Para utilização nos experimentos, o isolado UNEB8 foi cultivado em meio
150 CPG a 28 ± 2°C, por 48h. Após este período, a suspensão foi preparada por meio da
151 adição de ADE à placa de Petri contendo o crescimento bacteriano. A concentração
152 da suspensão bacteriana foi determinada em fotocolorímetro (Analyser 500, Brasil)
153 para A530 = 0,36 (1x109 UFC mL-1).

154 Óleos essenciais (OEs)

155 Foram utilizados óleos vegetais 100% puros e naturais (marca Phytoterápica -
156 Solua Comercial Ltda) de cravo (Eugenia caryophyllata Thunb), citronela
54
157 (Cymbopogon winterianus Jowitt), bergamota (Citrus bergamia Risso et Poiteau),
158 alecrim (Rosmarinus officinalis L.), palmarosa (Cymbopogon martin [Roxb.] Wats),
159 sálvia (Salvia sclarea L.), gengibre (Zingiber officinale Roscoe), melaleuca
160 (Melaleuca alternifolia Maiden & Betche, Cheel), laranja (Citrus aurantium L.) e
161 capim-limão (Cymbopogon citratus Stapf).

162 Teste de fitotoxidade de óleos essenciais em plantas de couve-manteiga

163 Plantas de couve-manteiga com 60 dias foram utilizadas em todos os


164 experimentos. A semeadura foi realizada em bandejas de polietileno contendo
165 substrato comercial. Após 18 dias as mudas foram transplantadas para vasos com
166 capacidade de 1000 mL contendo a mistura de solo argiloso e areia 2:1 (v/v),
167 previamente esterilizada em autoclave por 2 h, repetindo o procedimento após 24 h.
168 A irrigação foi realizada conforme necessidade.
169 Para determinação de uma possível fitotoxidade e escolha das concentrações
170 a serem utilizadas os 10 OEs foram previamente testados nas concentrações 0;
171 0,25; 0,5; 0,75% e 1%, obtidas por meio de diluições em ADE. Após as diluições
172 realizou-se a pulverização das plantas de couve-manteiga até completo molhamento
173 da superfície foliar. A avaliação da fitotoxidade foi realizada através da observação
174 do surgimento de anormalidades no desenvolvimento ou na coloração das plantas
175 até 48 horas após a aplicação dos tratamentos (Guerra et al., 2014). O delineamento
176 experimental foi inteiramente casualizado em arranjo fatorial 10 x 5, constituídos por
177 10 óleos essenciais e cinco concentrações. Cada tratamento teve cinco repetições,
178 cada repetição representada por uma planta.

179 Sensibilidade in vitro de Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis a


180 óleos essenciais

181 A sensibilidade de Pcb aos diferentes OEs in vitro foi determinada por meio
182 da contagem de colônias por placa (Paret, Cabos, Kratky & Alvarez, 2010). O
183 volume de 100 mL de meio CPG foi utilizado para cada tratamento. Foram
184 misturados ao meio 250 μL, 500 μL, 750 μL e 1000 μL dos óleos para atingir as
185 concentrações finais de 0,25, 0,5, 0,75 e 1 % (v/v), respectivamente. O óleo de cravo
186 foi utilizado a 0,25%, os óleos de capim-limão e palmarosa a 0,5%, citronela, laranja
187 e melaleuca a 0,75% e os demais a 1%. O meio misturado a cada óleo emulsionado
188 com tween 20 (1:1), em sua respectiva concentração foi adicionado em placas de

55
189 Petri e resfriado em câmara de fluxo laminar por 20 min. Em seguida, 100 μL da
190 suspensão bacteriana de Pcb, previamente diluída em ADE até 10-4 UFC/mL foi
191 espalhada sobre o meio. As placas foram incubadas a 28 °C por 48 h.
192 Posteriormente, foi realizada a contagem do número de colônias por placa e cálculo
193 da UFC/mL. O meio com adição de 1 mL de tween 20 representou a testemunha. O
194 experimento foi constituído por 11 tratamentos (10 óleos essenciais + testemunha)
195 com quatro repetições e três parcelas, sendo cada parcela representada por uma
196 placa de Petri.

197 Óleos essenciais no controle da podridão-mole em couve-manteiga

198 Os OEs foram pulverizados nas plantas de couve-manteiga conforme já


199 descrito, em diferentes períodos: antes da inoculação- pré (óleos aplicados 72 horas
200 antes da inoculação) ou depois da inoculação- pós (óleos aplicados sete horas após
201 a inoculação). As plantas foram inoculadas no pecíolo pelo método da picada,
202 adaptado de Ren, Petzoldt & Dickson (2001), no qual o tecido da planta é penetrado
203 com a inserção realizada de um alfinete entomológico na profundidade de 1mm,
204 seguindo-se a deposição de 10 µL da suspensão bacteriana com auxílio de
205 micropipeta. Em seguida, as plantas foram submetidas à câmara úmida por seis
206 horas, permanecendo em condições de casa de vegetação (T de 29,5°C ± 2 e UR
207 de 65% ± 2). A Incidência (INC), expressa pela porcentagem de plantas doentes, foi
208 avaliada 48 h após inoculação (No experimento em que os óleos foram aplicados
209 antes da inoculação) ou 48 h após aplicação dos óleos essenciais (No experimento
210 em que os óleos foram aplicados depois da inoculação).
211 O delineamento foi inteiramente casualizado, e cada experimento foi
212 constituído de 11 tratamentos, sendo 10 óleos essenciais e a testemunha (tratada
213 com ADE, inoculada com Pcb). Cada tratamento teve quatro repetições, sendo cada
214 repetição constituída por uma planta, com três folhas inoculadas.

215 Determinação da concentração mínima inibitória (CMI) dos óleos essenciais de


216 capim-limão, cravo e de seus componentes majoritários

217 Os OEs de capim-limão e cravo com seus componentes majoritários, citral e


218 acetato de eugenol, respectivamente, foram inicialmente emulsionados em 0,05 mL
219 de Tween 20 e diluídos em ADE para obtenção da solução-padrão de concentração
220 inicial de 1% para capim-limão e citral, e 0,5% para cravo e acetato de eugenol.
56
221 A CMI foi determinada por meio da técnica de macrodiluição em caldo
222 modificada (CLSI, 2015). Tubos de ensaio esterilizados foram utilizados para a
223 realização das diluições seriadas, nos quais foram inseridos 400 μL de meio CPG
224 sem ágar e, posteriormente 600 μL da suspensão bacteriana de Pcb, previamente
225 diluída em ADE até 10-4 UFC/mL. Em seguida, inseriu-se 1mL da solução-padrão do
226 óleo essencial ou componente majoritário para obtenção da concentração inicial de
227 0,5% para o óleo de capim limão e citral, e 0,25% para o óleo de cravo e acetato de
228 eugenol. As concentrações subsequentes foram obtidas por diluição seriada,
229 transferindo-se 1mL do conteúdo ao tubo subsequente. Para o óleo de capim-limão
230 e citral as concentrações obtidas foram: 0,5; 0,25; 0,125; 0,0625 e 0,03125%. Para o
231 óleo de cravo e acetato de eugenol as concentrações obtidas foram: 0,25; 0,125;
232 0,0625; 0,03125 e 0,015625%. Para o acompanhamento do crescimento de Pcb,
233 não foram adicionados os óleos essenciais e componentes majoritários. Já para o
234 controle de esterilidade, adicionou-se apenas o meio de cultura aos tubos, os quais
235 foram incubados a 28 °C por 48 h. A CMI correspondeu à última diluição na qual não
236 foi verificada presença de precipitado bacteriano.
237 O experimento teve delineamento inteiramente casualizado com 22
238 tratamentos, representados pelos óleos essenciais de capim-limão e cravo, e
239 componentes majoritários, citral e acetato de eugenol, em cinco concentrações, mais
240 o controle do meio e do crescimento de Pcb, com quatro repetições, cada uma
241 representada por um tubo de ensaio.
242 Para confirmação da atividade bactericida dos OEs e componentes
243 majoritários, alíquotas de 100 μL das diluições correspondentes a CMI foram
244 semeadas em meio CPG. Posteriormente, as placas de Petri foram incubadas a 28
245 °C por 48 h. Os resultados foram analisados descritivamente de acordo presença ou
246 não do crescimento bacteriano.

247 Efeito da CMI dos óleos essenciais de capim-limão e cravo e de seus


248 componentes majoritários no controle da podridão-mole em couve-manteiga

249 Os OEs de capim-limão e cravo com seus componentes majoritários, citral e


250 acetato de eugenol, respectivamente, foram pulverizados antes ou após inoculação
251 do patógeno nas plantas de couve-manteiga conforme metodologia já descrita. A

57
252 inoculação e as avaliações da INC foram realizadas conforme descrito
253 anteriormente.
254 Os experimentos tiveram delineamento inteiramente casualizado com oito
255 tratamentos cada, constituídos por óleo de cravo (uma concentração); óleo de
256 capim-limão (duas concentrações); acetato de eugenol (uma concentração); citral
257 (três concentrações) e testemunha (tratada com ADE, inoculada com Pcb). Cada
258 tratamento teve quatro repetições, sendo cada repetição constituída por uma planta,
259 com três folhas inoculadas.

260 Análises estatísticas


261
262 Todos os experimentos e testes apresentados foram realizados em duplicata.
263 As análises estatísticas foram realizadas com o auxílio dos programas STATISTIX®
264 (versão 9.0, Analytical Software, Tallahassee) e Assistat (versão 7.6). O nível de
265 significância de 5% foi adotado em todos os procedimentos estatísticos.

266 RESULTADOS E DISCUSSÃO

267 O isolado UNEB8 foi identificado como Pectobacterium carotovorum subsp.


268 brasiliensis (vide Capítulo 1).
269 No ensaio realizado em casa de vegetação para determinação das
270 concentrações fitotóxicas dos OEs, verificou-se que os óleos de alecrim, sálvia,
271 bergamota e gengibre não causaram fitotoxidade em nenhuma das concentrações
272 testadas, já os óleos de citronela, melaleuca e laranja a 1% foram fitotóxicos, bem
273 como os óleos de capim-limão e palmarosa nas concentrações de 0,75 e 1%, e o
274 óleo de cravo, nas concentrações de 0,5; 0,75 e 1%. Os sintomas de fitotoxidez
275 caracterizaram-se pelo surgimento de manchas foliares, sendo que o óleo de cravo
276 em concentrações superiores a 0,25% ocasionou seca foliar e morte da planta.
277 OEs empregados no controle de fitopatógenos, em geral, são utilizados em
278 concentrações que variam de 0,1 a 1% (Alves, Santos, Santos, Souza & Mariano,
279 2014; Huang & Lakshman, 2010; Guerra et al., 2014; Silva et al., 2012a). Essas,
280 quando maiores podem causar fitotoxidez, inviabilizando a utilização no controle
281 alternativo de doenças de plantas. Dessa forma, utilizou-se a maior concentração
282 não fitotóxica de cada óleo essencial em experimentos posteriores.
283 Considerando a sensibilidade de Pcb aos OEs, notou-se que os de alecrim,
284 bergamota, sálvia a 1%, citronela, melaleuca a 0,75%, capim-limão, palmarosa a

58
285 0,5% e cravo a 0,25% inibiram completamente o crescimento do patógeno (P≤0,05),
286 após 48 h de incubação a 28 °C. Já os OEs de gengibre a 1 % e laranja a 0,75%
287 não inibiram significativamente o crescimento bacteriano em relação à testemunha
288 (Tabela 2).
289 Tabela 2. Sensibilidade in vitro de Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis a
290 óleos essenciais, determinada por meio da contagem de colônias por placa de Petri
TRATAMENTOS CONCENTRAÇÕES (%) Log(UFC/mL+1)
Alecrim 1 0 a1
Bergamota 1 0a
Capim-limão 0,5 0a
Citronela 0,75 0a
Cravo 0,25 0a
Melaleuca 0,75 0a
Palmorosa 0,5 0a
Sálvia 1 0a
Gengibre 1 8,53 b
Laranja 0,75 8,47 b
Testemunha - 8,62 b
291 1
Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem entre si de acordo com o teste de Tukey
292 (P≤0,05).
293
294 A atividade antimicrobiana in vitro de OEs vem sendo comprovada por
295 diversos autores, inclusive para bactérias fitopatogênicas. Paret et al. (2010)
296 verificaram que os óleos de palmarosa e capim-limão a 0,07 e 0,14% inibiram
297 completamente o crescimento de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.
298 (Rs). Também Amorim et al.(2011) testando diferentes concentrações (1,25; 3,5,
299 3,75 e 5%) de OEs sobre o crescimento de Rs observaram que os óleos de citronela
300 e cravo inibiram o crescimento bacteriano em todas as concentrações testadas.
301 Lucas, Alves, Pereira, Perina e Souza (2012a) verificaram o efeito tóxico direto dos
302 OEs de citronela, cravo, capim‑limão, eucalipto, melaleuca, tomilho (Thymus
303 vulgaris L.) e canela (Cinnamomum zeylanicum Blume) a 10% sobre Xanthomonas
304 vesicatoria (ex Doidge) Vauterin et al. Já Silva, Martins e Alves (2014) constataram
305 que os óleos de citronela, capim-limão, canela e eucalipto (Corymbia citriodora Hill &
306 Johnson) a 1%, tomilho e cravo a 10% foram eficientes na inibição do crescimento
307 de Pseudomonas syringae pv. tomato (Okabe) Young, Dye & Wilkie. Esses
308 resultados reforçam o potencial antibacteriano dos óleos essenciais de palmarosa,
309 capim-limão, citronela, cravo e melaleuca também verificados neste trabalho.
310 Embora não tenham sido encontrados trabalhos que comprovem a atividade
311 inibitória de OEs sobre Pcb, alguns autores relataram o potencial antibacteriano de
59
312 OEs sobre Pcc. O óleo essencial de citronela a 1% e alecrim a 4% apresentaram
313 elevada inibição sobre seis isolados de Pcc obtidos de Brassica oleraceae L. var.
314 capitata DC e Lactuca sativa L (Costa et al., 2008a; 2008b). Também Jeong et al.
315 (2009) comprovaram a atividade inibitória do óleo de capim-limão sobre três isolados
316 de Pcc, observando-se completa inibição a 0,5%. Esse resultado corrobora com o
317 encontrado neste trabalho, em que o óleo de capim-limão a 0,5% inibiu
318 completamente o crescimento de Pcb.
319 Outros óleos essenciais têm apresentado eficiência sobre Pcc. Fernández et
320 al. (2014) constataram que o óleo essencial de tomilho a 0,1% inibiu completamente
321 o crescimento de Pcc, enquanto Sotelo-Boyás et al. (2015) observaram atividade
322 inibitória sobre Pcc do óleo de tomilho a 2,8 % e lima (Citrus aurantifolia (Cristm.)
323 Swingle) a 11,2%.
324 A ação bactericida dos OEs de alecrim, citronela, melaleuca, palmarosa,
325 cravo e capim-limão verificada neste trabalho pode estar relacionada aos seus
326 complexos constituintes químicos, como os monoterpenos e sesquiterpenos.
327 Os componentes dos OEs são altamente citotóxicos, exercendo atividade
328 antimicrobiana por interferência na estrutura da parede celular e membranas
329 citoplasmáticas, aumentando a permeabilidade e a perda dos constituintes celulares,
330 alterando uma variedade de sistemas enzimáticos, incluindo aqueles envolvidos na
331 produção de energia celular, síntese de componentes estruturais e inativação ou
332 destruição do material genético (Bakkali, Averbeck, Averbeck & Idaomar, 2008; Burt,
333 2004, Kim, Marshall, Cornell, Prestom & Wel, 1995). Como exemplo, Huang e
334 Lakshman (2010) sugeriram que os componentes do óleo de cravo foram os
335 principais responsáveis por suas propriedades antibacterianas sobre Pcc, Rs,
336 Rhizobium rhizobacter (Beijerinck and van Delden) Young et al., Xanthomonas
337 hortorum pv. pelargonii (Brown) Vauterin et al., Streptomyces spp. e Rhodococcus
338 fascians (Tilford) Goodfellow).
339 No presente estudo, os OEs de gengibre e laranja não apresentaram
340 resultados satisfatórios. No entanto, alguns trabalhos já verificaram a bioatividade do
341 óleo de gengibre sobre Rs (Amorim et al., 2011), Staphylococcus aureus e
342 Escherichia coli (Silva, Ushimaru, Barbosa, Cunha, Fernandes Junior, 2009 ).
343 Provavelmente, algumas células bacterianas de Pcb permaneceram viáveis e foram
344 capazes de multiplicar-se, mesmo na presença desses óleos. Lucas et al. (2012a)
345 constataram através de microscopia eletrônica de transmissão que os óleos

60
346 essenciais de cravo, capim-limão, citronela e melaleuca a 0,1% causaram danos à
347 estrutura das células de X. vesicatoria, no entanto, não foram capazes de inibir o
348 crescimento bacteriano, indicando que algumas células permanecem viáveis e
349 promovem a multiplicação das bactérias. Adicionalmente, outros fatores podem
350 influenciar a bioatividade dos OEs, entre eles, o patógeno a ser controlado e a
351 composição química dos OEs. Esta poderá ser determinada pelas condições de
352 cultivo, clima, método de extração, época de colheita da planta e órgão colhido (Burt,
353 2004; Faleiro et al, 2003), sendo que composição química diferente pode pressupor
354 propriedades bioativas distintas (Torras, Grau, López & Heras, 2007). Guerra et al.
355 (2014) e Silva et al. (2012a) não verificaram efeito direto do óleo de laranja doce
356 (Citrus sinensis L.) na concentração de 0,5% sobre Pcc. Estes resultados
357 corroboram com obtidos para o óleo de laranja azeda a 0,75%, neste estudo.
358 Plantas de couve-manteiga tratadas com o óleo de capim-limão, antes ou
359 depois da inoculação, apresentaram INC de 0%, representando um percentual de
360 controle da doença de 100%, diferindo significativamente dos demais tratamentos
361 quando aplicado antes da inoculação. No entanto, quando aplicado após inoculação
362 não diferiu do óleo de cravo que proporcionou um percentual de controle de 71,42%
363 (P≤0,05) (Tabela 3).
364 Tabela 3. Efeito de óleos essenciais na redução da incidência da podridão-mole
365 causada por Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis, em couve-manteiga,
366 em condições de casa de vegetação.
Tratamentos/ INC* % de controle4
Concentrações (%) Pré2 Pós3 Pré Pós
Capim Limão (0.5) 0,00a1 0,00a 100 100
Cravo (0.25) 50 b 25 ab 42,85 71,42
Citronela (0.75) 75 b 62,5 bc 14,28 28,57
Melaleuca (0.75) 75 b 62,5 bc 14,28 28,57
Palmarosa (0.5) 75 b 50 bc 14,28 42,85
Bergamota (1) 62,5 b 62,5 bc 28,57 28,57
Laranja (0.75) 62,5 b 87,5 c 28,57 0,00
Gengibre (1) 62,5 b 75 bc 28,57 14,28
Alecrim (1) 62,5 b 50 bc 28,57 42,85
Sálvia (1) 75 b 62,5 bc 14,28 28,57
Testemunha 87,5 b 87,5 c NA NA
CV(%) 22,76 23,75 NA NA
367 1
Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Duncan (P≤0,05).2
368 Aplicação dos tratamentos antes da inoculação. 3 Aplicação dos tratamentos após inoculação.
*Dados transformados pela equação √(x+0,5) para melhor atender aos pressupostos da análise de
variância (ANOVA). Incidência (INC), expressa pela porcentagem de plantas doentes; 4 Em relação a
testemunha; Não aplicável (NA).
61
369 Os óleos essenciais são conhecidos por sua ação antimicrobiana direta e
370 atividade indutora de resistência em plantas (Lucas et al.,2012a; Lucas, Alves,
371 Pereira, Zacaroni & Perina, 2012b; Aminifard & Mohammadi, 2013; Pereira et al.,
372 2008; Pereira, Lucas, Perina, Ribeiro Jr. & Alves, 2012; Schwan – Estrada,
373 Stargarlin, & Cruz 2003). O óleo de capim-limão em ambos os períodos de
374 aplicação foi eficiente na redução da incidência da doença, o que provavelmente
375 está relacionado à sua ação direta e atividade elicitora de defesa. Resultado
376 semelhante foi encontrado por Lucas et al. (2012a) em que o óleo de capim-limão a
377 0,1% aplicado em pré e pós- inoculação promoveu redução significativa da mancha
378 bacteriana do tomateiro. Também Guerra et al. (2014) avaliando o potencial de
379 diferentes óleos essenciais na redução da severidade da podridão-mole em couve-
380 chinesa causada por Pcc constatou que o óleo de capim-limão a 0,5% reduziu
381 significativamente a severidade em relação a testemunha, atribuindo esse resultado
382 a possível atividade indutora de resistência.
383 Os óleos de cravo, citronela, melaleuca, palmarosa, bergamota, alecrim e
384 sálvia não apresentaram os resultados esperados de acordo com a eficaz
385 bioatividade dos mesmos apresentados nos ensaios in vitro. No entanto, testes in
386 vitro nem sempre são representativos, pois os patógenos se comportam de forma
387 diferente quando estão interagindo com as plantas e exposto às variáveis
388 ambientais. Em geral, as concentrações inibitórias observadas in vitro devem ser
389 elevadas quando aplicadas in vivo para que se mantenha a mesma eficácia (Burt,
390 2004). Contudo, o óleo de cravo promoveu um maior percentual de controle da
391 doença de 71,42% quando aplicado pós-inoculação, evidenciado a sua maior
392 eficiência na ação antibacteriana direta. Resultados positivos utilizando o óleo de
393 cravo no controle de doenças de plantas já foram verificados. Huang e Lakshman
394 (2010) verificaram que o óleo de cravo a 0,5% proporcionou um controle de 100% da
395 murcha bacteriana do tomateiro. Também Amorim et al. (2011) observaram
396 eficiência de 25% no controle da moko da bananeira utilizando o óleo de cravo a
397 3,75%.
398 Nos ensaios in vitro com os óleos essenciais de capim-limão e cravo e seus
399 componentes majoritários verificou-se que os mesmos apresentaram diferenças
400 quanto a concentração mínima inibitória do crescimento de Pcb (Tabela 4). O óleo
401 essencial de capim-limão inibiu completamente o crescimento de Pcb a 0,5; 0,25;
402 0,125; 0,0625%, enquanto o seu componente químico citral promoveu inibição total

62
403 em todas as concentrações testadas. Já o óleo de cravo promoveu inibição completa
404 apenas nas maiores concentrações (0,25 e 0,125%) e seu componente químico
405 acetato de eugenol não foi eficaz na inibição de Pcb em nenhuma das
406 concentrações testadas.
407 Tabela 4. Concentrações mínimas inibitórias (CMI) dos óleos essenciais de capim
408 limão e cravo e de seus componentes químicos majoritários frente à
409 Pectoctobacterium carotovorum subsp. brasiliensis.
ÓLEO DE ACETATO DE ÓLEO DE CITR
CONCENTRAÇÕES (%)
CRAVO EUGENOL CAPIM-LIMÃO AL
0,5 NA NA1 -2 -
0,25 - +3 - -
0,125 - + - -
0,0625 + + - -
0,03125 + + + -
0,015625 + + NA NA
CONTROLE DE CRESCIMENTO + + + +
CONTROLE DO MEIO - - - -
410 1
(NA) Não aplicável, 2(-) Ausência de crescimento, 3(+) Crescimento microbiano

411 In vivo, o óleo de capim-limão a 0,125% aplicado após inoculação e o


412 componente químico citral a 0,125% aplicado antes ou após inoculação
413 proporcionaram os maiores percentuais de controle da doença (33,33; 50 e 100%,
414 respectivamente). Sendo que, as plantas tratadas com citral a 0,125% após
415 inoculação apresentaram INC 0%, diferindo significativamente dos demais
416 tratamentos (P≤0,05), exceto, do tratamento com citral 0,125% antes da inoculação,
417 que apresentou INC de 37,5%. A INC nos tratamentos com óleo de cravo 0,125% e
418 acetato de eugenol a 0,25% não diferiram da testemunha (P≤0,05). No entanto, o
419 óleo de cravo a 0,125% aplicado após inoculação mostrou maior eficiência que seu
420 componente majoritário, promovendo um percentual de controle da doença de
421 16,67% (Figura 1).

63
422
423 Figura 1. Efeito dos óleos essenciais de capim-limão e cravo e seus componenetes majoritários
(citral e acetato de eugenol) sobre a podridão-mole causada por Pectobacterium carotovorum
424
subsp. brasiliensis, em couve-manteiga. TESTE (Testemunha); CR0,125(óleo de cravo a 0,125%);
425 EU0,25 ( acetato de eugenol a 0,25%); CL0,0625 (capim-limão a 0,0625%); CL0,125 (capim-limão
a 0,125%); CT0,03125 (citral a 0,03125%); CT0,0625 (citral a 0,0625%); CT0,125 (citral a 0,125%);
426 Pré (aplicação dos tratamentos antes da inoculação); Pós (aplicação dos tratamentos após
inoculação). Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si pelo teste de Duncan (P≤0,05).
427
428 O óleo de cravo apresenta como componente químico majoritário o eugenol
429 (Costa et al., 2011; Scherer, Wagner, Duarte & Godoy, 2009), enquanto o óleo de
430 capim-limão tem em sua composição majoritariamente o citral (mistura isomérica de
431 neral e geranial) (Guimarães, Cardoso, Sousa, Andrade & Vieira, 2011).
432 Usualmente, o mecanismo de ação dos óleos essenciais estão associados
433 aos seus componentes químicos majoritários (Bakkali et al., 2008), que apresentam
434 amplo espectro de ação atuando diretamente sobre as estruturas do patógeno
435 (Lucas et al., 2012a; Nazzarro et al., 2013), assim como ativando vias bioquímicas
436 de defesa da planta, tais como o incremento da atividade de peroxidases e
437 quitinases ( Pereira et al., 2008)
438 Considerando os resultados obtidos, pode-se inferir que o citral é o
439 componente responsável pela atividade bactericida do óleo de capim-limão sobre
440 Pcb e controle da podridão em couve-manteiga, nos ensaios realizados.
441 Diferentemente, o acetato de eugenol, não mostrou ser responsável pela eficácia do
442 óleo de cravo, pois mesmo em concentração maior que o óleo de cravo apresentou
443 resultados insatisfatórios. Isto sugere que a ação do óleo de cravo é dada pelo efeito
444 sinérgico dos seus constituintes. De acordo com Burt (2004) e Bakalli et al. (2008) o
445 sinergismo é observado quando o efeito das substâncias combinadas é maior do

64
446 que os efeitos individuais, uma vez que, os óleos essenciais são misturas complexas
447 de numerosas moléculas.

448 CONCLUSÃO

449 Os óleos essenciais de capim-limão e cravo mostram-se como opção


450 promissora para o desenvolvimento de possíveis produtos fitossanitários a serem
451 integrados ao manejo da podridão-mole, reduzindo o uso de agroquímicos e,
452 consequentemente contribuindo para redução de microrganismos resistentes, dos
453 riscos a saúde de produtores e consumidores e preservação do meio ambiente.

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CONCLUSÕES GERAIS

1. Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis (Pcb) foi registrada pela primeira


vez, no Brasil, como agente causal da podridão-mole em couve-manteiga

2. Os óleos essenciais de cravo a 0,25%, capim-limão e palmarosa a 0,5%,


citronela, melaleuca e laranja a 0,75%, bergamota, alecrim, sálvia e gengibre a 1%
não causam fitotoxidade em plantas de couve-manteiga;

3. Os óleos de cravo (0,25%), capim-limão e palmarosa (0,5%), citronela, melaleuca


(0,75%) e bergamota, alecrim e sálvia (1%) apresentam atividade bactericida, in vitro
sobre Pcb; e os óleos de laranja e gengibre não inibiram o crescimento do patógeno,
nas mesmas condições.

3. O óleo de capim-limão, aplicado antes ou após a inoculação, controla a podridão-


mole, em couve-manteiga, em 100%.

4. O óleo de cravo aplicado após inoculação resultou em uma eficiência de 71,42%


no controle da doença.

5. Provavelmente o citral é o componente responsável pelo controle da podridão-


mole, obtido com o óleo de capim-limão;

6. O acetato de eugenol, componente do óleo de cravo, não apresenta efeito direto


sobre Pcb.

7. Óleos essenciais de capim-limão e cravo mostram-se como opção promissora


para serem integrados ao manejo da podridão-mole em couve-manteiga.

71