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Imuno-hematologia

e Imunologia Clínica

Brasília-DF.
Elaboração

Eliseu Frank de Araújo


Julio Cesar Pissuti Damalio

Produção

Equipe Técnica de Avaliação, Revisão Linguística e Editoração


Sumário

Apresentação.................................................................................................................................. 4

Organização do Caderno de Estudos e Pesquisa..................................................................... 5

Introdução.................................................................................................................................... 7

Unidade i
IMUNOHEMATOLOGIA............................................................................................................................ 9

CAPÍTULO 1
Sistema ABO............................................................................................................................ 9

Capítulo 2
Sistema Rh............................................................................................................................. 17

Unidade iI
IMUNOLOGIA CLÍNICA......................................................................................................................... 26

Capítulo 1
Anticorpos.......................................................................................................................... 26

Capítulo 2
Reação de precipitação e aglutinação.......................................................................... 35

Capítulo 3
Quantificação da concentração antigênica ou de anticorpos.............................. 39

Capítulo 4
Identificação de antígenos em células e antígenos..................................................... 52

Capítulo 5
Metodologias com uso de Biologia Molecular........................................................... 62

Capítulo 6
Diagnósticos laboratoriais (Ministério da Saúde).......................................................... 67

Para (não) Finalizar...................................................................................................................... 81

Referências................................................................................................................................... 82
Apresentação
Caro aluno

A proposta editorial deste Caderno de Estudos e Pesquisa reúne elementos que se entendem
necessários para o desenvolvimento do estudo com segurança e qualidade. Caracteriza-se pela
atualidade, dinâmica e pertinência de seu conteúdo, bem como pela interatividade e modernidade
de sua estrutura formal, adequadas à metodologia da Educação a Distância – EaD.

Pretende-se, com este material, levá-lo à reflexão e à compreensão da pluralidade dos conhecimentos
a serem oferecidos, possibilitando-lhe ampliar conceitos específicos da área e atuar de forma
competente e conscienciosa, como convém ao profissional que busca a formação continuada para
vencer os desafios que a evolução científico-tecnológica impõe ao mundo contemporâneo.

Elaborou-se a presente publicação com a intenção de torná-la subsídio valioso, de modo a facilitar
sua caminhada na trajetória a ser percorrida tanto na vida pessoal quanto na profissional. Utilize-a
como instrumento para seu sucesso na carreira.

Conselho Editorial

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Organização do Caderno
de Estudos e Pesquisa
Para facilitar seu estudo, os conteúdos são organizados em unidades, subdivididas em capítulos, de
forma didática, objetiva e coerente. Eles serão abordados por meio de textos básicos, com questões
para reflexão, entre outros recursos editoriais que visam a tornar sua leitura mais agradável. Ao
final, serão indicadas, também, fontes de consulta, para aprofundar os estudos com leituras e
pesquisas complementares.

A seguir, uma breve descrição dos ícones utilizados na organização dos Cadernos de Estudos
e Pesquisa.

Provocação

Textos que buscam instigar o aluno a refletir sobre determinado assunto antes
mesmo de iniciar sua leitura ou após algum trecho pertinente para o autor
conteudista.

Para refletir

Questões inseridas no decorrer do estudo a fim de que o aluno faça uma pausa e reflita
sobre o conteúdo estudado ou temas que o ajudem em seu raciocínio. É importante
que ele verifique seus conhecimentos, suas experiências e seus sentimentos. As
reflexões são o ponto de partida para a construção de suas conclusões.

Sugestão de estudo complementar

Sugestões de leituras adicionais, filmes e sites para aprofundamento do estudo,


discussões em fóruns ou encontros presenciais quando for o caso.

Praticando

Sugestão de atividades, no decorrer das leituras, com o objetivo didático de fortalecer


o processo de aprendizagem do aluno.

Atenção

Chamadas para alertar detalhes/tópicos importantes que contribuam para a


síntese/conclusão do assunto abordado.

5
Saiba mais

Informações complementares para elucidar a construção das sínteses/conclusões


sobre o assunto abordado.

Sintetizando

Trecho que busca resumir informações relevantes do conteúdo, facilitando o


entendimento pelo aluno sobre trechos mais complexos.

Exercício de fixação

Atividades que buscam reforçar a assimilação e fixação dos períodos que o autor/
conteudista achar mais relevante em relação a aprendizagem de seu módulo (não
há registro de menção).

Avaliação Final

Questionário com 10 questões objetivas, baseadas nos objetivos do curso,


que visam verificar a aprendizagem do curso (há registro de menção). É a única
atividade do curso que vale nota, ou seja, é a atividade que o aluno fará para saber
se pode ou não receber a certificação.

Para (não) finalizar

Texto integrador, ao final do módulo, que motiva o aluno a continuar a aprendizagem


ou estimula ponderações complementares sobre o módulo estudado.

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Introdução
Historicamente a Imunologia surgiu como um ramo da microbiologia e conquistou seu espaço com
os estudos das doenças infecciosas e suas respectivas respostas. A nossa capacidade de coexistir
com diversos micro-organismos de nosso ambiente depende de um conjunto de fatores, e um destes
fatores é o Sistema Imune.

O Sistema Imune, por sua vez, é como um conjunto de células de defesa e/ou ataque eficaz que tem
a capacidade de distinguir os sinais de perigo para o organismo e protegê-lo contra estes patógenos
oportunistas. Esta distinção ocorre por comunicação por meio de sinais mediados por citocinas e
receptores. As células do Sistema Imune estão distribuídas por todo organismo, alojadas nos tecidos,
e desempenham o papel de sentinelas e circulando por vasos sanguíneos e linfáticos esperando o
sinal de que o organismo foi invadido.

A Imunologia Clínica tem o objetivo de investigar e orientar o clínico na apuração de diagnósticos das
patogenicidades por meio de resultados de exames laboratoriais. Para tanto é necessário conhecer
as estratégias traçadas pelo Sistema Imune, no que tange ao controle e/ou eliminação dos diferentes
patógenos, além de saber as estratégias de evasão utilizadas pelos patógenos para driblar a defesa e
o ataque do Sistema Imune.

Obviamente, sob o ponto de vista imunológico, um determinado agente infeccioso não precisa
se restringir a uma única estratégia patogênica, de modo que a resposta imune eficiente contra o
determinado micro-organismo pode incluir diversos mecanismos.

Objetivos
»» Reconhecer o sistema ABO e seus componentes: antígenos e anticorpos.

»» Entender a importância do sistema ABO na prática transfusional.

»» Reconhecer do sistema Rh e seus componentes: antígenos e anticorpos.

»» Entender o Teste de Coombs direto e indireto.

»» Conhecer a caracterização da Doença Hemolítica do Recém-Nascido (DHRN) e


suas implicações em gestações de risco. Antígeno D fraco e parcial.

»» Reconhecer os anticorpos: classes e funções das Igs.

»» Reconhecer as aplicações dos testes imunológicos mais utilizados em Análises


Clínicas;

»» Caracterizar diagnósticos laboratoriais de várias doenças, de acordo com o


Ministério da Saúde.

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IMUNOHEMATOLOGIA Unidade i

CAPÍTULO 1
Sistema ABO

É de suma importância a compreensão dos sistemas antigênicos das células sanguíneas. Além das
aplicações práticas da genética da célula sanguínea, como transfusões de sangue, transplantes e
estudos com fins antropológicos, a investigação dos antígenos das hemácias oferece uma visão
ampla de outros aspectos mais básicos da biologia humana.

O conhecimento de antígenos e anticorpos plaquetários e granulocíticos é menos completo.


Foram descritos antígenos específicos de plaquetas e granulócitos, contudo a tipagem para esses
antígenos não está em uso rotineiro. Em contraste, os antígenos de superfície dos linfócitos foram
estudados mais detalhadamente durante as últimas três décadas. Os antígenos do complexo de
histocompatibilidade maior são importantes na moderna prática transfusional, mas o estudo
desse sistema tem um significado mais amplo e levou a um insight dos mecanismos genéticos da
imunorregulação, transplante e doença.

O Sistema do Grupo Sanguíneo ABO

Histórico
Historicamente, a separação dos indivíduos em grupos de acordo com os antígenos presentes
em suas hemácias foi demonstrada pela primeira vez em 1900–1901, pelo médico austríaco Karl
Landsteiner. Ao reagir amostras de sangue de diversas pessoas, isolou eritrócitos fazendo diferentes
combinações entre plasma e hemácias. Encontrou como resultado a presença de aglutinação dos
glóbulos em alguns casos e sua ausência em outros. Dessa forma, Karl Landsteiner classificou os
seres humanos em 3 grupos sanguíneos distintos, a saber, A, B e O, e ainda explicou o fato de
algumas pessoas morrerem depois de transfusões de sangue e outras não. Mais tarde, em 1902, o
grupo sanguíneo AB foi descrito por von Decastello e Sturli.

Destaca-se como importante no Sistema ABO, na prática transfusional, o fato de ser esse o sistema
que possui maior capacidade de provocar a produção de anticorpos, ou seja, é o mais antigênico.
Como os eritrócitos humanos não expressam moléculas HLA de classe I e II, essas moléculas de

9
UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA

superfície altamente polimórficas têm pouca consequência na transfusão sanguínea. A maior


barreira imunogenética se constitui, então, nos polimorfismos estruturais nos carboidratos dos
glicolipídios de superfície das hemácias, cujas diferenças antigênicas são a base do sistema ABO.

Vídeo-aula sobre o sistema ABO

Antígenos de hemácias
A composição antigênica das hemácias é importante na terapia transfusional.

Na prática transfusional rotineira, os testes determinam a compatibilidade entre o doador e o receptor


dos antígenos de grupos sanguíneos de significado clínico. Os anticorpos que reagem com antígenos
de hemácias podem provocar graves problemas clínicos, entre eles as reações transfusionais
hemolíticas, a doença hemolítica do recém-nascido e as anemias hemolíticas autoimunes.

Alguns antígenos já são bem definidos bioquimicamente e dividem-se em 2 grupos: carboidratos


(em que um gene codifica a formação de enzimas que adicionarão açúcares a substratos específicos
– ABO) ou proteicos (decorrentes de ação direta de um gene – Rh).

Constituição dos anticorpos


Os anticorpos do Sistema ABO – usualmente chamados de aglutininas – estão presentes no plasma
de indivíduos, contra os antígenos que eles não possuem em suas hemácias, classificados assim de
anti-A e anti-B.

Esses anticorpos são formados naturalmente contra antígenos que não estão presentes nas
hemácias. Os estímulos são passivos, gerados por bactérias que colonizam o trato intestinal a partir
do nascimento. Geralmente, os anticorpos do Sistema ABO são misturas de IgM e IgG (Unidade
II). Tanto anticorpos ABO classe IgM ou IgG, são capazes de desativar o sistema complemento,
provocando hemólise intravascular em transfusões incompatíveis.

Indivíduos pertencentes ao grupo de sangue tipo AB não tem anticorpos anti-A ou anti-B. Já os
indivíduos portadores de sangue tipo A possuem anticorpos anti-B, os pertencentes ao grupo B
possuem anticorpos anti-A e os indivíduos do grupo O, finalmente, possuem as aglutininas anti-A
e aglutininas anti-B.

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IMUNOHEMATOLOGIA │ UNIDADE I

Determinação do grupo sanguíneo ABO


A determinação do grupo sanguíneo é realizada pela identificação de antígenos nas hemácias, usando
anticorpos anti-A e anti-B. Essa técnica, chamada de tipagem direta, permite que os anticorpos
sejam reconhecidos na superfície das hemácias, dividindo as pessoas em quatro grupos: sangue A,
B, O e AB (Figura 1).

Figura 1 – Determinação do Sistema ABO.

Fonte: Immunohematology (Quinley).

Transfusões sanguíneas no sistema ABO


A divisão das transfusões sanguíneas no Sistema ABO pode ser feita em dois grandes conjuntos:
1) isogrupo, quando doador e receptor são do mesmo grupo de acordo com o sistema ABO, e 2)
heterogrupo, quando o doador e receptor são de grupos sanguíneos diferentes. A escolha do sangue
deve levar em conta que o indivíduo não pode ser transfundido com um sangue que possua um
antígeno que ele não tem, justamente porque o anticorpo presente no seu plasma irá reagir contra
as hemácias transfundidas.

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UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA

O esquema abaixo mostra as transfusões possíveis quanto ao sistema ABO (Figura 2):

Figura 2 – Transfusões do Sistema ABO.

Fonte: imunofarma.blospot.com – abril/2013.

É interessante abordar que o grupo sanguíneo O pode ser doado para todos os grupos existentes;
sendo denominados doadores universais. Entretanto, indivíduos portadores do sangue O não
podem receber sangue de nenhum outro grupo – apenas do seu próprio grupo. O grupo AB, por sua
vez, pode receber sangue de qualquer outro tipo, constituindo-se receptores universais.

Genética
Os antígenos A e B são herdados segundo a Lei de Mendel. O grupo ABO de um indivíduo é
determinado pela presença de um (homozigótico) ou dois (heterozigótico) dos três alelos: A, B e H,
cujo gene está localizado no cromossomo 9 (Tabela 1).

Tabela 1 – Genética do Sistema ABO.

Fenótipo Genótipo Antígenos de hemácias Anticorpos


O OO (H) Anti-A+Anti-B
A AO ou AA A Anti-B
B BO ou BB B Anti-A
AB AB A+B nenhum

Fonte: Métodos de laboratório aplicados à clínica, 2009.

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IMUNOHEMATOLOGIA │ UNIDADE I

Acesse o site http://djalmasantos.wordpress.com/2011/04/30/testes-de-


genetica-35/, publicado pelo Professor Djalma Santos, e observe os vários testes de
genética.

Bioquímica
É importante destacar que os produtos dos genes A e B não são os antígenos A e B por si; as
glicosiltransferases têm como função modificar a membrana celular e levar à síntese dos antígenos
A e B. Existe uma substância precursora na forma de cadeia lateral oligossacarídica associada com
glicoesfingolipídeos e glicoproteínas de membrana. Após conversão dessa substância precursora na
substância H, o precursor imediato dos antígenos A e B está sob influência dos alelos H e h, que
são herdados independentemente do gene determinando o tipo ABO. O H é comum; o h é raro. Em
dose simples ou dupla, o gene H apresenta uma enzima, a H-transferase, que converte a substância
precursora em substância H. A presença de um alelo A ou B determina a atividade da A ou B-transferase
correspondente, que subsequentemente converterá a substância H em antígeno A ou B.

Quando o antígeno A ou B está ausente das hemácias, o anticorpo correspondente está presente no
plasma. Ao nascimento, essas iso-hemaglutininas estão ausentes, mas desenvolvem-se durante os 6
primeiros meses de vida. Elas surgem como produto da exposição dos polissacarídeos semelhantes a
ABO que são vistas em micro-organismos, sementes, plantas e outras fontes exógenas. Substâncias
com atividade antigênica de A, B e H estão amplamente distribuídas nas hemácias, bem como em
secreções e glândulas mucosas dos tratos gastrointestinal, respiratório e genital.

Enzimas
A especificidade A, B ou H de uma hemácia é determinada pela atividade de enzimas geneticamente
determinadas durante o desenvolvimento celular.

Assim, o alelo H determina a expressão de uma H-transferase (α2-L-fucosiltransferase) a qual adiciona


um resíduo de fucose à galactose terminal da substância precursora produzindo substância H.

O alelo A, por sua vez, determina a expressão de A-transferase (α3-N-acetilgalactosaminiltransfera


se), adicionando N-acetilgalactosamina à galactose terminal da substância H.

Por fim, o alelo B determina a B-transferase (α3-D-galactosiltransferase), que transfere uma


molécula de galactose na mesma posição.

A principal diferença entre as hemácias do grupo A e do grupo B é o resultado de diferenças


estruturais entre essas duas moléculas de açúcar.

As hemácias do grupo O não expressam atividade de A-transferase nem de B-transferase. Nos


indivíduos do grupo sanguíneo AB, estão presentes ambos os alelos A e B, com as duas transferases
ativas e os dois sítios antigênicos com as especificidades A e B presentes na mesma molécula.

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UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA

Antígenos ABO
Os antígenos A e B estão localizados na superfície externa da membrana da hemácia.

Vários antígenos têm especificidade A. A mais frequente é A1; 80% dos indivíduos do grupo A são
A1 e 20% são A2. A2 e outras variantes reagem mais fracamente com soros de tipagem anti-A que as
hemácias A1. São conhecidas também variantes mais fracas do grupo A, entre elas A3, Ax, Am, Aend, Ae1
e outros, e elas constituem menos de 1% do fenótipo do grupo A .

Existem também variantes fracamente reativas do antígeno B, como B3, Bx e Bm1, mas elas ocorrem
com menor frequência que as variantes do grupo A.

Anticorpos ABO (Iso-hemaglutininas)


Em adultos, anticorpos IgM anti-A e/ou anti-B, de ocorrência natural e com especificidade
complementar ao seu próprio grupo ABO, estão presente, devido a estímulos oriundos de antígenos
vegetais e também bacterianos. Já em neonatos, os anticorpos IgM estão ausentes nos 3 a 6 primeiros
meses de vida.

O soro do grupo O contém anti-A, anti-A1 e anti-B.

Determinação dos grupos sanguíneos do sistema ABO


1. Procedimento
TÉCNICA EM LÂMINA
»» Colocar uma gota de sangue homogeneizado, colhido com anticoagulante, em ambas as extremidades da lâmina.
»» Colocar uma gota do soro anti-A sobre a gota de sangue à esquerda da lâmina.
»» Colocar uma gota do soro anti-B sobre a gota de sangue à direita da lâmina.
»» Misturar as gotas com o auxílio de uma pazinha ou ponteira.
»» Fazer a leitura observando se houve ou não aglutinação.
TÉCNICA EM TUBO
»» Tomar 2 tubos de hemólise.
»» Colocar no primeiro tubo uma gota do soro anti-A.
»» Colocar no segundo tubo uma gota do soro anti-B.
»» Em cada um dos tubos adicionar uma gota da suspensão de hemácias a 5% do paciente.
»» Homogeneizar e centrifugar os tubos a 1.500 rpm durante 2 minutos.
»» Fazer a leitura observando se houve ou não aglutinação.
PREPARO DA SUSPENSÃO DE HEMÁCIAS A 5%
»» Em um tubo cônico colocar 1 mL de sangue total homogeneizado colhido com anticoagulante + 9 mL de soro fisiológico (NaCl 0,85%).
»» Centrifugar a 2.500 rpm durante 2 minutos.
»» Desprezar o sobrenadante.
»» Repetir este procedimento mais 2 vezes.
»» A partir do sedimento de hemácias lavadas, preparar uma suspensão a 5% (50µL do sedimento de hemácias + 950 µL de soro
fisiológico).

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IMUNOHEMATOLOGIA │ UNIDADE I

2. Interpretação

Grupo Sanguíneo Anti-A Anti-B


AB + +
A + -
B - +
O - -

Sinal + indica presença de aglutinação


Sinal – indica ausência de aglutinação
3. Significado clínico
Os grupos sanguíneos são determinados pela presença de antígenos na superfície das células, particularmente as hemácias. Estes antígenos
possuem natureza bioquímica variada, podendo ser compostos de carboidratos, lipídios, proteínas ou uma mistura destas biomoléculas.
A determinação dos grupos sanguíneos tem importância em várias áreas da saúde:
»» Hemoterapia; medicina transfusional;
»» Neonatologia;
»» Antropologia;
»» Medicina forense etc.
Os tipos sanguíneos mais frequentes são “O+” e “A+”. O sistema ABO é o mais importante na prática transfusional por ser o mais
imunogênico, seguido pelo sistema Rh.

Testes laboratoriais para tipagem ABO

Testes pré-transfusionais
a. Testes pré-transfusionais realizados com o sangue do doador

É obrigatória, em todas as unidades coletadas, a determinação estrita do grupo ABO,


do tipo Rho (D), do antígeno D fraco (Du) nas Rho (D) negativo e dos testes para a
exclusão das hepatites tipos B e C, doença de Chagas, sífilis, AIDS, anticorpos anti-
HTLV-I/II e anti-HBc. Testes para a pesquisa de anticorpos irregulares e dosagem
de ALT/TOP devem ser realizados de forma complementar. Recomenda-se também
a realização de testes para exclusão de malária, anemia falciforme e detecção de
hemoglobinas anormais.

O sangue total e seus componentes não podem ser transfundidos antes da obtenção
de resultados finais não reagentes, nos testes de detecção para Hepatites B e C, HIV-
1 e HIV-2, Doença de Chagas, Sífilis, HTLV-I e HTLV-II.

b. Testes pré-transfusionais realizados com o sangue do receptor

O tratamento com o sangue do receptor deve ser igualmente considerado e


classificado a fim de averiguar a compatibilidade imunológica entre o doador e o
receptor. Realizam-se os testes para verificação do grupo ABO e Rh.

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UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA

Verifica-se ainda a presença de anticorpos do receptor que potencialmente


inviabilizariam a transfusão. Além disso, realizam-se os testes de Coombs direto e
indireto (ver a seguir) e o teste da prova cruzada.

Incompatibilidade do sistema ABO


As provas de compatibilidade fazem parte dos testes pré-transfusionais, isto é, fazem parte do
procedimento que tem por finalidade verificar in vitro a compatibilidade eritrocitária entre o
doador e o receptor. São executadas em meio de antiglobulina humana (AGH), entre o soro/plasma
do doente e os eritrócitos do doador.

Essas provas identificam incompatibilidades causadas por anticorpos clinicamente significativos,


em especial do sistema ABO, pela gravidade das reações transfusionais que provocam.

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Capítulo 2
Sistema Rh

Na prática transfusional, o sistema do grupo Rh só perde em importância para o ABO, sendo que foi
descrito pela primeira vez por Levine e Stetson, em 1939.

O termo Rh veio dos resultados de Landsteiner e Wiener que, em 1940, demonstraram que coelhos
imunizados com hemácias de macacos rhesus produziam um anticorpo que reagia com hemácias
humanas.

O sistema Rh é um dos mais polimórficos dos grupos sanguíneos humanos. Os genes Rh estão
localizados no cromossomo 1. Até o momento, não tem sua estrutura bioquímica totalmente
elucidada. Trata-se de uma proteína com importante papel na integridade da membrana eritrocitária.

Os vários determinantes antigênicos do sistema Rh são produtos proteicos de um complexo sistema


de genes polimórficos. O conceito de Fisher-Race (DCE) é simples e direto, mas fornece uma
aproximação genética do sistema Rh e é conveniente para fins descritivos e para a interpretação da
maioria dos problemas clínicos relacionados ao Rh.

De acordo com este modelo, três genes intimamente ligados determinam a especificidade das
estruturas antigênicas responsáveis pelo tipo Rh das hemácias. Três alelos codominantes são D e
d; C e c; e E e e, com o complexo gênico inteiro sendo herdado como uma unidade. Os antígenos
resultantes são denominados D, C, c, E e e. Um antígeno com atividade d nunca foi descrito e o alelo
d é considerado amórfico.

A denominação Rh positivo aponta para a presença do antígeno D. A incidência do fenótipo


D (Rh)-positivo entre os brancos é de 85% e os 15% que não possuem o D (e são geneticamente
dd) são considerados Rh negativos. Entre os Rh-positivos, 42% são homozigotos (DD) e 58% são
heterozigotos (Dd).

Anticorpos relacionados com esse antígeno são importantes na prática transfusional, pois o D é
altamente imunogênico; o anti-D pode resultar em graves reações hemolíticas se constituindo uma
importante causa de DHRN grave.

Os anticorpos contra os vários antígenos Rh geralmente se desenvolvem após uma exposição


a hemácias estranhas, como em transfusões ou gestações, mas ocasionalmente podem ocorrer
naturalmente. Esses anticorpos geralmente são da classe IgG (Unidade II), não fixam complemento,
mas podem causar severa hemólise extravascular.

Determinação do fator Rh
O teste mais comum para se determinar o fator Rh é o Teste de Coombs, efetuado com o soro de
mesmo nome. Pode ser direto ou indireto.

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UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA

Teste de Coombs Direto


O teste de Coombs direto é atualmente chamado de teste de antiglobulina direta (TAD). Este teste
avalia se a hemácia do paciente está sensibilizada com anticorpos ou com proteínas do sistema
complemento. Para isso, 50 µL de hemácias a 5% são lavadas três vezes com solução salina 0,9%
e o sobrenadante da última lavagem é totalmente desprezado. Ao botão das hemácias lavadas é
acrescentada duas gotas de soro de Coombs (anti-IgG) ou preferencialmente antiglobulina humana
(AGH). A utilização de AGH na fase de Coombs na pesquisa de anticorpos (direto ou indireto)
possibilita a detecção de proteínas do sistema complemento.

Caso o resultado seja negativo, devem-se acrescentar ao tubo de reação duas gotas de hemácias
humanas sensibilizadas com IgG e verificar se houve aglutinação. A positividade na prova de
Coombs direto indica que a hemácia está sensibilizada e é recomendada a identificação da classe e
do anticorpo. Para identificação de que o anticorpo é contra algum antígeno do sistema eritrocitário,
este deve ser eluído dos antígenos do paciente e do eluato analisado (Figura 4).

Figura 3: Teste de Coombs.

Modificado de: <http://www.biomedicinapadrao.com/2010/11/teste-de-coombs-direto.html>.


Acesso em: 17 abr. 2013.

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IMUNOHEMATOLOGIA │ UNIDADE I

Um teste de Coombs direto utilizando anti-soro contra IgG é quase sempre positivo
em:

»» mulheres com anticorpos anti-D circulantes;

»» recém-nascidos com doença hemolítica de Rh;

»» pacientes com imunodeficiência;

»» pacientes com anemia hemolítica induzida por alfa-metildopa;

»» pacientes com anemia hemolítica autoimune.

Resposta durante o curso, em nossas conversas on-line. Procure textos que te ajudem
a encontrar a resposta!

Teste Direto da Antiglobulina (TDA) ou Coombs Direto


O TDA tem por finalidade a detecção de anticorpos ou componentes do complemento fixados às
hemácias in vivo ou in vitro.

Descrição da técnica:

1. Lavar as hemácias teste de 3 a 4 vezes em salina e preparar uma suspensão de 3 à


5% em salina.

2. Identificar dois tubos (IgG, Poli) e acrescentar 1 gota de suspensão de hemácias em


cada tubo.

3. Adicionar de 1 a 2 gotas do soro antiglobulina correspondente a cada tubo.

4. Misturar e centrifugar de 3.000 a 3.600 rpm por 15-20 segundos.

5. Ressuspender gentilmente e examinar a aglutinação. Registrar os resultados.

Quando o Coombs direto for negativo com a leitura imediata, deixar 15 minutos em temperatura
ambiente, centrifugar e ler novamente.

Os resultados negativos deverão ser confirmados adicionando o controle de Coombs, centrifugando


e observando a aglutinação:

»» controle de Coombs positivo valida o resultado negativo do Coombs direto;

»» controle de Coombs negativo invalida a reação e indica que o resultado do Coombs


direto é falso-negativo. Neste caso é necessário repetir a técnica.

19
UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA

Os testes positivos devem ser encaminhados para laboratório especializado para realização de
estudos. A presença de aglutinação indica que as hemácias podem estar sensibilizadas por anticorpos
ou por componentes do complemento. Para se definir a especificidade do anticorpo devem ser
aplicados testes de eluição.

Teste de Coombs Indireto


A prova de Coombs Indireto é chamada de Pesquisa de Anticorpos Irregulares (PAI) e avalia a
presença de anticorpos irregulares circulantes no soro de doadores de sangue, receptores, gestantes,
pacientes com suspeita de anemias hemolíticas por presença de anticorpos, entre outros (Figura 4).

Figura 4 – Teste de Coombs Indireto.

Fonte: < http://www.biomedicinapadrao.com/2011/02/teste-de-coombs-indireto.html>. Acesso em: 17 abr. 2013.

A pesquisa é realizada rotineiramente no soro de doadores de sangue e receptores, utilizando para


isso hemácias comerciais fenotipadas do grupo O que apresentam os antígenos para os anticorpos
irregulares mais frequentes. Esse teste é obrigatório nos serviços de hemoterapia porque, quando
o doador apresenta anticorpos irregulares, esses estariam presentes na bolsa de hemocomponente,
podendo reagir com suas hemácias do receptor caso encontrassem antígenos correspondentes.

No caso do receptor, é importante o teste, pois, caso esse tenha algum anticorpo irregular, é aconselhável
a identificação por duas razões:

1. é possível direcionar a prova de compatibilidade para bolsas que sejam negativas


para o antígeno, equacionando tempo e custos;

2. caso o paciente seja um candidato a cirurgia, possibilita que o serviço de hemoterapia


providencie com antecedência e tempo hábil as bolsa de sangue compatível.

20
IMUNOHEMATOLOGIA │ UNIDADE I

Sempre que a PAI é positiva, deve-se proceder à identificação da especificidade do(s) anticorpo(s)
irregulares encontrado(s) no soro/plasma. A identificação de anticorpos irregulares deve incluir,
obrigatoriamente, o meio no qual a PAI foi reativa.

A identificação de anticorpos irregulares (IAI) é realizada com o soro do paciente utilizando um painel
de hemácias. Geralmente esse painel apresenta 11 hemácias, em suspensão de 3-5%, numeradas
de 1 a 11. As hemácias do painel são do tipo O e possuem os antígenos contra os anticorpos mais
frequentes em bancos de sangue. Acompanhando o painel vem um diagrama contendo o perfil
fenotípico de cada uma das hemácias. A presença de aglutinação diante dos diferentes eritrócitos
permite a identificação do anticorpo. Como exemplo: houve aglutinação nos tubos 1, 2, 3, 8, 10 e 11.
Basta procurar em cada uma das colunas do diagrama o perfil de aglutinação obtido.

Figura 5 – Painel de hemácias.

Fonte: http://pt.scribd.com/doc/54611627/Controle-Imuno-hematologico-Transfusoes.

O site Biomedicina Padrão traz a técnica e os testes de Coombs Direto e Indireto:

<http://www.biomedicinapadrao.com/2011/02/teste-de-coombs-indireto.html>

<http://www.biomedicinapadrao.com/2010/11/teste-de-coombs-direto.html>

PAI (COOMBS INDIRETO em) Polietilenoglicol – (Bio PEG®) – tubo

Bio PEG® (polietilenoglicol) é uma macromolécula que retira a água do meio de


suspensão das hemácias, permitindo uma maior concentração dos anticorpos ao
redor das hemácias em suspensão e favorecendo a aglutinação.

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UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA:

1. Marcar dois tubos: I e II (ambos devem ser identificados com o número da


amostra teste);

2. Em cada tubo, adicionar 2 gotas de soro do paciente e 1 gota do reagente


de hemácia de triagem I e II, respectivamente;

3. Acrescentar 2 gotas de Bio PEG® , homogeneizar e não centrifugar;

4. Incubar a 37oC por 15 minutos;

5. NÃO centrifugar (pois este potencializador forma um precipitado de


proteínas que impede a observação da aglutinação antes da lavagem);

6. Lavar as hemácias 3 vezes com salina (sempre que desprezar os


sobrenadantes, agitar os tubos para que ocorra o desprendimento total
do botão formado no fundo do tubo; só depois acrescentar novamente
a salina);

7. Decantar completamente o sobrenadante final, desprender o botão


formado e adicionar 1 gota de soro antigamaglobulina anti-IgG;

8. Homogeneizar e centrifugar por 15 segundos a 3.400 rpm;

9. Examinar a aglutinação das hemácias e registrar os resultados de


acordo com ausência ou presença de aglutinação, anotando sempre a
intensidade de aglutinação.

Ao resultado negativo é preciso realizar a validação da reação com controle de


Coombs:

»» Controle de Coombs positivo valida o resultado negativo da PAI.

»» Controle de Coombs negativo invalida a reação e indica que o resultado


da PAI é falso-negativo. Nesse caso é preciso repetir a PAI.

Os testes positivos devem ser encaminhados para laboratório especializado para


realização da identificação do(s) anticorpo(s).

Neste caso, a transfusão de hemácias deve ser célula(s) antígeno(s) – negativo(s)


para o anticorpo identificado.

Não se esquecer

Ao encaminhar as amostras para o laboratório especializado, enviar também o


histórico do paciente (idade, diagnóstico, antecedentes transfusionais, gestação/
aborto, medicação etc.).

Observações: para evitar reações falso-positivas, é melhor utilizar o soro Anti-IgG do


que o soro antiglobulina poliespecífico.

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IMUNOHEMATOLOGIA │ UNIDADE I

Doença hemolítica do recém-nascido


A doença hemolítica do recém-nascido ocorre quando uma mãe de Rh negativo concebe um filho Rh
positivo. Para que a doença ocorra, a mãe necessariamente foi previamente imunizada contra Rh+.
Essa imunização pode ter ocorrido por transfusões incorretas, parto prévio de um bebê Rh positivo,
descolamentos de placenta e outros casos em que a mãe tenha entrado em contato com sangue Rh
positivo. Anticorpos anti-D passam pela placenta e provocam a lise de hemácias, causando uma
anemia séria no bebê. A doença é chamada de eritroblastose fetal, porque, na tentativa de compensar
a anemia, o organismo do feto libera eritroblastos (hemácias não maduras) na circulação (Figura 6).

Figura 6 – Doença hemolítica do recém-nascido.

Fonte: <lucianecantalicebiologia.blogspot.com>.

Há certos procedimentos que a mãe de Rh negativo pode realizar a fim de evitar a doença hemolítica
do neonato. Pode-se destacar o cuidado no contato com sangue de Rh positivo, o diagnóstico do
fator Rh do feto através da técnica denominada Reação em Cadeia de Polimerase, a realização do
Teste de Coombs para saber se a mãe já está imunizada e ainda o uso de medicamentos como o
MATERGAM e RHOGAM, que são imunoglobulinas (IgG) Anti-D usadas profilaticamente na
prevenção de anticorpos contra eritrócitos Rh positivos em pessoas Rh negativas que estão sob risco
de serem sensibilizadas por esses eritrócitos.

Antígeno D fraco (fraca expressão de D)


É sabido que um número muito reduzido de pessoas possui hemácias que não são aglutinadas
diretamente com soro anti-D, contudo reagem positivamente ao teste da anti-globulina. Durante
a incubação com soro anti-D, ocorre sensibilização das hemácias portadoras do fator D fraco.
Acrescentando-se a antiglobulina, esta reagirá com os anticorpos sensibilizando as hemácias
(anti-D), e assim promovendo a aglutinação. O fator D fraco é um alelo do gene D tão imunogênico
quanto o próprio antígeno D.

Normalmente hemácias RhD positivas possuem uma densidade antigênica variando entre 15.000
a 30.000 antígenos/célula, dependendo do haplótipo. Isto não é regra, pois alguns fenótipos foram
identificados com densidade variando entre 70 e 5.200 antígenos RhD sendo denominados de

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UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA

D fracos. Estes são causados pela substituição de aminoácidos nas porções transmembranosas e
intracelulares da proteína RhD devido à mutação no gene RHD. Hemácias com fenótipo D fraco
expressam um antígeno RhD intacto ocorrendo em 0,2% a 1% dos caucasianos.

Hoje em dia temos mais de 40 tipos de D fracos identificados em nível molecular, nos quais o D
fraco tipo 1 e 2 são os mais frequentes. Somado a isso, o fenótipo D fraco carrega o antígeno RhD
intacto, o que diminui a probabilidade de formar aloanticorpo anti-D.

A distinção entre D fraco e D parcial não deve ser feita pela produção de anti-D. Foi proposto o índex
Rhesus para a predição do risco de imunização em indivíduos D fraco. Esse índex foi baseado na
densidade antigênica de diferentes anticorpos monoclonais dependendo da 1) quantidade de sítios
antigênicos; e 2) afinidade do anticorpo e pode teoricamente variar de 1 (risco baixo, exemplo: RhD
normal) a 0 (alto risco exemplo: parcial RhD faltando epítopos ).

Identificação de Antígeno D fraco


Procedimento

»» Preparar uma suspensão de hemácias a 5%.

»» Tomar 3 tubos de hemólise, numerá-los de 1 a 3 e proceder segundo o


esquema abaixo:

Reagentes Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3


(teste) (controle positivo) (controle negativo)
Suspensão de hemácias 5% (teste) 1 gota - 1 gota
Suspensão de hemácias 5% (Rh+) - 1 gota -
Soro anti-D 1 gota 1 gota -
Albumina bovina 22% - - 1 gota

»» Incubar em banho-maria 37º C durante 20 minutos.

»» Lavar 3 vezes com soro fisiológico (2.500 rpm durante 2 minutos).

Reagentes Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3


(teste) (controle positivo) (controle negativo)
Soro de Coombs 2 gotas 2 gotas 2 gotas

»» Homogeneizar e centrifugar a 1.500rpm durante 2 minutos.

»» Observar se houve ou não aglutinação.

Interpretação

D fraco positivo .................... se houve aglutinação

D fraco negativo .................... se não houve aglutinação

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IMUNOHEMATOLOGIA │ UNIDADE I

Antígeno D parcial
O antígeno D é composto de numerosos epítopos e sua expressão parcial foi originalmente definida
por indivíduos D apresentando formação de anti-D. Estudos com anticorpos monoclonais resultaram
em mais de 30 epítopos altamente conformacionais, envolvendo várias alças extracelulares.

Hemácias D parciais são definidas pela ausência de um ou mais epítopos causados pelos rearranjos
dos genes RHD e RHCE. Essa configuração genética possibilita microconversões e trocas
unidirecionais de fragmentos de gene RHD e RHCE, ou parte deles, levando a formação de alelos
RHD-CE-D ou RHCE-D-CE respectivamente. Esses novos alelos aberrantes de Rh não produzem
proteínas híbridas, regiões de RhD unidas com RhCE levando à perda de epítopos de D, gerando
novos antígenos.

Poucos fenótipos D parciais resultam de trocas de um aminoácido apenas. De forma contrária


ao D fraco, o polimorfismo ocorre nos segmentos extracelulares da proteína RhD. Indivíduos D
parciais podem frequentemente produzir anti-D contra aqueles epítopos ausentes quando expostos
à proteína RhD completa.

Quais seriam os outros sistemas sanguíneos e suas funções? Que tal fazer uma busca
e incorporar este conhecimento?

Sugestão de vídeos com aula sobre

Sistema ABO e Rh

http://www.youtube.com/watch?v=1LG5lTkgP0g

http://www.youtube.com/watch?v=mPOIZKCorCI

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IMUNOLOGIA Unidade iI
CLÍNICA

Capítulo 1
Anticorpos

Classes de anticorpos
Anticorpo é caracterizado por uma GLOBULINA sintetizada de linfócitos B e principalmente por
plasmócitos, após receber estímulo de um imunógeno, e que possui propriedade de interagir com
este de maneira específica.

Imunógenos x Antígenos

Imunógenos são moléculas capazes de desencadear uma resposta imune adaptativa


após sua introdução em humanos ou animais, ou seja, é qualquer substância que
possa gerar uma resposta imune específica. Antígenos são substâncias que podem
se ligar a um determinado anticorpo. Logo, todos os antígenos têm o potencial
de induzir anticorpos específicos, no entanto, alguns precisam ligar-se a algum
imunógeno para poder fazer isso. Isso quer dizer que todos os imunógenos são
antígenos, mas nem todos os antígenos são imunógenos. Às vezes o que pode
fazer com que um antígeno não seja um imunógeno é a reação cruzada, definida
como a ligação de um anticorpo com outro anticorpo que não o imunógeno que
desencadeou a resposta imune.

No início da Imunologia, o anticorpo só era reconhecido por suas propriedades, como a de neutralizar
a toxina correspondente ou provocar aglutinação de glóbulos vermelhos e a de promover lise de
bactérias e provocar choque anafilático em pessoas ou animais sensibilizados.

O conhecimento atual nos mostra que as moléculas de anticorpos são constituídas basicamente de
duas subunidades proteicas chamadas cadeias leves (L) e duas subunidades designadas cadeias
pesadas (H) do inglês heavy.

A Organização Mundial da Saúde adotou a designação genérica de imunoglobulinas para todas as


classes ou isotipos (tipos moleculares presentes em todos os indivíduos de uma mesma espécie) de

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IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II

globulinas com a estrutura básica da molécula de anticorpo, usando a sigla Ig seguida das maiúsculas
A, G, M, D e E para as cinco classes até agora conhecidas.

As cinco classes (ou isotipos) diferem entre si (sequência primária de aminoácidos) das cadeias
pesadas, sendo as cadeias leves iguais para todas as classes imunoglobulinas. Há, no entanto, dois
tipos de cadeias leves com diferentes sequências de aminoácidos. As cadeias pesadas, específicas
para cada classe, são também designadas por letras gregas que simbolizam a sua estrutura.

Estrutura básica da molécula de anticorpo


Os primeiros estudos de imunoglobulinas tiveram foco na IgG. Esta é a que apresenta maior
concentração no soro, portanto, sua estrutura pôde ser mais facilmente caracterizada.

A molécula de anticorpos de todas as subclasses é representada por um modelo básico constituído de


duas cadeias polipeptídicas leves de peso molecular aproximado 23 kDa e duas cadeias pesadas com
peso molecular variáveis entre 50 e 75 kDa, dependendo da subclasse a que pertence do anticorpo.

Cada cadeia ou subunidade possui uma porção aminoterminal e na porção oposta é a carboxiterminal.
Cada Molécula de IgG possui dois sítios de combinação específicos para o determinante antigênico
que induziu sua síntese, a sequência de aminoácidos dessas porções é altamente variável e específica
para cada imunógeno, apresentando grupos de aminoácidos, característicos do indivíduo que
sintetiza a molécula (Figura 7).

Figura 7 – Estrutura de uma Imunoglobulina.

Fonte: <http://www.pediatriasaopaulo.usp.br/index.php?p=html&id=253>

Veja mais, no artigo sobre imunidade do feto e do recém-nascido, encontrado no


site: <http://www.pediatriasaopaulo.usp.br/index.php?p=html&id=253>

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UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA

Propriedades gerais das imunoglobulinas

Ligação ao antígeno (Ag)


As imunoglobulinas são ligadas de forma específica a um ou mais antígenos proximamente
relacionados. Cada imunoglobulina liga-se a um determinante antigênico específico. Ligação
a antígeno pelos anticorpos é a função primária dos anticorpos e pode resultar em proteção do
hospedeiro. A valência do anticorpo refere-se ao número de determinantes antigênicos que uma
molécula individual de anticorpo pode se ligar, sendo que é pelo menos duas e em alguns casos mais
(IgM – na forma pentâmera).

Resposta imune adaptativa primária e secundária

Nas respostas imunes de primeiro contato com Antígeno (Ag), encontramos imunoglobulinas
predominantes como IgM e IgD (na superfície da célula B) , que apresenta como principal
característica principal ser mais lenta e menos intensa. Por sua vez, as respostas imunes de segundo
contato com o antígeno (Ag), encontramos predominância de IgA, IgE e IgG, e respostas mais
rápidas, intensas e especifica.

Estrutura

Todos os anticorpos são Igs, mas nem todas as Igs são classificadas como anticorpos: anticorpo
constitui uma ação e um evento que é característico do funcionamento de uma molécula que se
chama Ig. Contudo, também produzimos imunoglobulinas que não tem nenhuma atividade de
anticorpo. Em suma, as Igs fazem parte das proteínas do sangue (são proteínas solúveis no sangue),
embora possamos encontrar Igs em muitos fluidos e líquidos corporais também.

Descobrimento das Igs: foi por meio da análise da mobilidade eletroforética das proteínas do sangue
de acordo com o peso molecular de cada uma delas, onde se verificou a presença de um grupo
de proteínas que correspondem às albuminas e um grupo que corresponde às globulinas. Dentro
das globulinas, proteína que tem forma globosa, existem as globulinas alfa, beta e gama. Assim,
as Igs fazem parte do grupo das Gama Globulinas e, na sua formação, é glicoproteica (proteína +
polissacarídeo).

Produzidas pelas células plasmáticas (LB maduro, únicas células a produzir Ig), esse processo
normalmente é de resposta a um imunógeno. Existem eventos casuais e patológicos em que há
produção de Ig sem a presença de um imunógeno (processos neoplásicos de células B, por exemplo)
e a formação de grupos de células produtoras de Ig sem nenhum estímulo, ou seja, não são moléculas
de anticorpos, são apenas Ig.

As imunoglobulinas estão divididas em cinco classes diferentes, baseadas nas diferenças em


sequências de aminoácidos na região constante das suas cadeias pesadas. A rigor, todas as

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IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II

imunoglobulinas de uma mesma classe têm regiões constantes de cadeia pesada muito similares.
Essas diferenças podem ser detectadas por estudos de sequências ou por meios sorológicos (i.e. pelo
uso de anticorpos dirigidos a essas diferenças) (Figura 8).

IgG

Estrutura: Todas IgGs são classificadas como monômeros (imunoglobulina 7S). As subclasses
diferem no número de pontes dissulfeto e comprimento da região da dobradiça.

Propriedades: É a mais versátil imunoglobulina porque é capaz de realizar todas as funções das
moléculas de imunoglobulinas.

a. IgG é a principal Ig no soro – 75% das Ig do soro são IgG.

b. IgG é a principal Ig em espaços extra vasculares.

c. Transferência placentária – IgG é a única classe de Ig que atravessa a placenta. A


transferência é mediada pelo receptor da região Fc do IgG nas células placentárias.
Nem todas as subclasses atravessam a placenta com a mesma eficiência; IgG2 não
atravessa bem.

d. Fixação do complemento – Nem todas as subclasses fixam com a mesma eficiência;


IgG4 não fixa complemento.

e. Ligação a células – Macrófagos, monócitos, PMNs (células da imunidade inata) e


alguns linfócitos (imunidade adquirida) têm receptores para a região Fc da IgG.
Nem todas as subclasses se ligam com a mesma eficiência; IgG2 e IgG4 não se
ligam a receptores de Fc. Uma consequência direta da ligação a receptores de Fc em
PMNs, monócitos e macrófagos é que a célula pode internalizar melhor o antígeno
processado. O anticorpo cria um microambiente propício para que o antígeno seja
reconhecido e fagocitado pelas células do sistema imune inato. O termo opsonina
é usado para descrever substâncias que aumentam essa fagocitose. IgG é uma boa
opsonina. Ligação de IgG a receptores de Fc em outros tipos de células resulta na
ativação de outras funções.

IgM

Estrutura: IgM é encontrada na sua forma pentâmera (imunoglobulina 19S), mas ela pode também
existir como um monômero. Na forma pentâmera todas as cadeias pesadas são idênticas e todas as
cadeias leves também se apresentam idênticas. Assim, a valência é máxima e teoricamente 10. IgM
tem um domínio extra na cadeia mu (CH4) e ela tem outra proteína covalentemente ligada via uma
ponde S-S chamada cadeia J. Esta cadeia funciona em polimerização da molécula a um pentâmero.

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UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA

Propriedades:

a. IgM é a terceira Ig mais comum no soro.

b. IgM é a primeira Ig a ser feita pelo feto e a primeira Ig a ser feita por uma célula B
virgem quando é estimulada pelo antígeno.

c. Como consequência da sua estrutura pentâmera, IgM é uma boa Ig fixadora do


sistema complemento. Assim, anticorpos IgM são muito eficientes em levar à lise
de microrganismos.

d. IgM também é uma boa Ig aglutinadora, agregando microrganismos para eliminação


eventual para fora do corpo.

e. IgM liga-se a algumas células via receptores de Fc.

f. Ig de superfície de célula B

IgM de superfície existe como um monômero e não tem cadeia J, mas tem 20 aminoácidos extras
na região C-terminal para se ancorar na membrana. Essas Igs funcionam como receptores para
antígeno ou células B e também estão associadas não covalentemente com duas proteínas adicionais
na membrana da célula B (Ig-alfa e Ig-beta). As proteínas adicionais, por sua vez, agem como
moléculas de transdução de sinal, uma vez que a cauda citoplasmática da molécula de Ig por si
mesma é muito curta para transduzir um sinal. O contato entre a superfície da imunoglobulina e
um antígeno é necessário antes da transdução do sinal pelas cadeias Ig-alfa e Ig-beta. Os antígenos
T-independentes realizam contato entre o antígeno e a superfície da imunoglobulina com expressão
suficiente para ativar as células B a se diferenciarem em plasmócitos secretores de anticorpos. Já os
antígenos T-dependentes, é necessário um segundo sinal fornecido pelas células T auxiliares para
ativar as células B.

IgA

Estrutura: Em forma de dímero, uma cadeia J se associa a ela. Por outro lado, se IgA for encontrada
em secreções identificamos outra proteína associada a ela chamada de peça secretora T; sIgA é, às
vezes, referida como imunoglobulina 11S. Ao contrário do resto da IgA que é feito no plasmócito, a
peça secretora é feita nas células epiteliais e é adicionada à IgA à medida que esta passa através das
secreções. A peça secretora ajuda a IgA a ser transportada através da mucosa e também a protege
da degradação nas secreções.

Propriedades:

a. IgA é comum no soro (so perde para IgG).

b. IgA é a principal classe de Ig em secreções – lágrimas, saliva, colostro, muco. Uma


vez que é encontrada em secreções IgA secretora é importante na imunidade local
(de mucosa).

30
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II

c. Normalmente IgA não fixa complemento, a menos que esteja agregada.

d. IgA pode se ligar a algumas células – PMNs e alguns linfócitos.

IgD

Estrutura: IgD existe somente como um monômero.

Propriedades:

a. IgD é encontrada em baixos níveis no soro; seu papel no soro é não está totalmente
estabelecido.

b. IgD encontrada em superfícies de célula B onde funciona como um receptor para


antígeno. IgD na superfície de células B tem aminoácidos extras na região C-terminal
para ancoramento à membrana. Ela também se associa com as cadeias beta de Ig-
alfa e Ig-beta.

c. IgD liga complemento.

IgE

Estrutura: IgE existe como um monômero e tem um domínio extra na região constante.

Propriedades:

a. IgE é a Ig sérica menos comum, uma vez que se liga fortemente com receptores de
Fc em basófilos e mastócitos mesmo antes da interação com o antígeno.

b. Envolvida em reações alérgicas – Como consequência da sua ligação a basófilos e


mastócitos, IgE é envolvida em reações alérgicas. Ligação do alergeno à IGe nas
células resulta na liberação de vários mediadores farmacológicos que resulta em
sintomas alérgicos.

c. IgE também participa em doenças parasitárias por helmintos. Uma vez que os níveis
sorológicos de IgE aumentam em doenças parasitárias, a quantificação dos níveis
de IgE auxilia no diagnóstico de infecções parasitárias. Eosinófilos têm receptores
de Fc para IgE e a ligação de eosinófilos a helmintos cobertos por IgE resulta na
morte do parasita.

d. IgE não fixa complemento.

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UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA

Figura 8 – Classes de Imunoglobulinas.

Fonte: < http://www.rbi.fmrp.usp.br/imunobiol/aulas/t3.htm>

Funções das imunoglobulinas


a. Neutralização de toxinas

O reconhecimento do antígeno é realizado pela interação do determinante


antigênico com o sítio do anticorpo especifico. Em geral, os sítios combinatórios
dos anticorpos são direcionados contra bactérias, fungos, vírus e seus produtos.
Reconhecem também epítopos presentes em parasitas protozoários e metazoários.
A interação entre um antígeno (por exemplo: presente na superfície de uma
bactéria), com o anticorpo por si só não leva necessariamente a sua destruição. Como
exceção, temos a interação entre certas toxinas bacterianas (como a diftérica ou
tetânica) e anticorpo, onde ocorre completa neutralização do produto microbiano.
A neutralização da toxina, nestes casos, é suficiente para impedir os sintomas das
doenças que são mediados pela toxina. A ligação antígeno-anticorpo, em geral,
prepara para a etapa efetora que é mediada por outros agentes.

b. Aglutinação

Os produtos do sistema complemento também alteram a superfície dos organismos


invasores, induzindo-os aderir uns aos outros, promovendo assim a aglutinação
(prendem vários antígenos ao mesmo tempo).

c. Citotoxidade celular dependente de anticorpo

Anticorpos específicos ao interagirem com epítopos de membrana de uma célula-


alvo podem dar origem a um fenômeno denominado ADCC (do inglês antibody

32
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II

dependent cell mediated cytotoxicity), que pode ser mediado por granulócitos. Há
experimentos in vitro que descrevem a morte de esquistossomos após opsonização
por anticorpo IgE e atividade ADCC mediada por eosinófilos.

d. Opsonização por IgG

Na fagocitose é necessário o envolvimento entre componentes da partícula a


ser interiorizada e receptores de membrana da célula fagocitária. Assim, um
microrganismo pode ser reconhecido por células fagocitárias através de receptor
para manose, que reconhece resíduos deste açúcar na superfície da partícula a ser
ingerida, quando a partícula estranha estiver opsonizada por anticorpos específicos
do isotipo IgG. O processo se torna muito mais eficiente em virtude da existência
de receptores de membrana dos fagócitos que reconhecem a região Fc da IgG. A
opsonização por anticorpos IgG não somente aumenta expressivamente a taxa de
fagocitose (número de partículas ingeridas por fagócito) como também pode levar
a um aumento da digestão da partícula ingerida (no fagossomo) por ativação do
metabolismo da célula fagocitária.

e. Lise

Um dos mais importantes produtos da cascata do complemento é o complexo lítico,


que por definição é a combinação de múltiplos fatores do complemento sendo
designado C5b6789. Seu efeito é direto na ruptura das membranas celulares de
bactérias e outros organismos invasores. Enzimas e outros produtos do complemento
atacam as estruturas de alguns vírus tornando-os não virulentos.

f. Quimiotaxia

O fragmento C5a induz a quimiotaxia pelos neutrófilos e macrófagos, promovendo a


migração de grandes quantidades desses fagócitos para o local do agente antigênico.

g. Ativação de mastócitos e basófilos e eosinófilos

Os fragmentos C3a, C4a e C5a ativam os mastócitos e basófilos, induzindo-os a


liberar histamina, heparina e várias outras substâncias para os fluidos locais. Como
consequência, há um aumento no fluxo sanguíneo local, extravasamento de líquido
e proteína plasmática para os tecidos e, de reações teciduais locais que ajudam a
inativar e imobilizar o agente antigênico. Os mesmos fatores desempenham papel
importante na inflamação e na alergia.

h. Efeitos inflamatórios

Além dos efeitos inflamatórios causados pela inflamação dos mastócitos e basófilos,
a ação de vários outros produtos do complemento contribuem para a inflamação
local induzindo o aumento do fluxo sanguíneo já estava aumentado, aumentando
o extravasamento de proteínas a partir dos capilares e a favorecendo a coagulação
de proteínas nos espaços teciduais, evitando assim a movimentação do organismo
invasor através dos tecidos.

33
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA

Anticorpos monoclonais
Por definição anticorpos monoclonais (mAbs, na sigla em inglês) são anticorpos produzidos por um
único clone de um linfócito B parental, sendo idênticos em relação em suas propriedades físicas,
químicas e biológicas. Foi descrito pela primeira vez em 1975, em artigo na revista Nature por
César Milstein e Georges Köhler que dividiram o Prêmio Nobel de Medicina no ano de 1984 com o
dinamarquês Niels Kaj Jerne.

Os mAbs são produzidos em ambiente laboratorial com linfócitos B gerados por camundongos
com sistemas imunológicos estimulados pelos antígenos de interesse. São chamados de anticorpos
murinos que usados de forma continuada durante uma terapia, estimulam uma reação imunológica
ao anticorpo próprio. Dessa forma, o uso dos mAbs ficou limitado durante duas décadas à produção
de kits para diagnósticos ou à pesquisa científica (Figura 9).

Esse problema foi resolvido com a humanização dos anticorpos murinos por modernas técnicas
de engenharia genética. Na técnica, os genes responsáveis pela produção dessas proteínas são
modificados de forma a eliminar essa reação imunológica do organismo humano. O processo de
humanização não deve alterar a afinidade do anticorpo com o respectivo antígeno e possibilita
assim a sua aplicação continuada em procedimentos terapêuticos.

Os mais significativos avanços no uso de mAbs se encontram na área de oncologia, uma vez uma nova
geração de medicamentos em desenvolvimento está baseada na capacidade dos mAbs em reconhecer
antígenos específicos de tumores e induzir uma resposta imune contra as células cancerosas. Mais
ainda, os mAbs podem ser modificados e atuarem como portadores de radioisótopos ou toxinas às
células tumorais ampliando, assim, seu espectro de aplicação terapêutica.

Figura 9 – Mostra a técnica para produção de anticorpos monoclonais a partir de hibridomas.

Fonte: <biologia12eportefolio.blogspot.com>

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Capítulo 2
Reação de precipitação e aglutinação

Título do anticorpo
A produção de anticorpos contra um determinado antígeno pode ser correlacionada às diluições dos
soros utilizadas para a realização do teste, já que os ensaios não são quantitativos. Nestes ensaios, as
partículas antigênicas são misturadas com seriadas diluições do soro do paciente e como resultado
de produção de anticorpos considera-se a maior diluição em que ocorre a visualização (precipitação
ou aglutinação) da reação antígeno-anticorpo. Esta diluição é chamada de título do anticorpo.

Por exemplo, se estudarmos a produção de anticorpos contra espécies de Leishmania, que causam
calazar, em uma população de área endêmica do Brasil é comum ser observada aglutinação de
formas promastigotas de Leishmania até a diluição de 1:600 (título) na maioria das pessoas. Este
resultado é porque a infecção com diversos parasitas (Trypanosoma, Schistosoma, Plasmodium,
Leishmania que causa a forma mucocutânea) induz a produção de anticorpos que apresentam
reação cruzada com Leishmania donovani. De forma contrastante, o soro de pacientes infectados,
que apresentam calazar, aglutina as formas promastigotas até a diluição de 1:6400 (título). Como
pode ser observado, o título de anticorpos contra Leishmania nas pessoas da região endêmica é de
1:600 enquanto nas pessoas infectadas este aumenta mais de dez vezes.

Imunoprecipitação
As técnicas de imunoprecipitação permitem identificar e até quantificar precipitações resultantes
da interação antígeno-anticorpo, ambos inicialmente solúveis. Nessa técnica é necessário que
a molécula antigênica seja multivalente quanto ao numero de epítopos e, preferencialmente, os
anticorpos sejam policlonais. Para anticorpos monoclonais, a especificidade única exige que o
epítopo esteja acessível e presente em quantidade grande na molécula.

Os anticorpos policlonais derivam de diferentes linhagens de linfócitos B, isto é, são


imunoglobulinas com estruturas diferentes, produzidas em resposta a um antígeno
específico, cada uma com especificidade para um epítopo diferente desse antígeno.
Dado que a maioria dos antígenos é muito complexa e possui numerosos epítopos
que são reconhecidos por diferentes linfócitos, cada linfócito é ativado para proliferar
e se diferenciar em plasmócitos resultando em anticorpos com resposta policlonal.

Entre os vários fatores físico-químicos e imunológicos que interferem na quantidade de precipitado


formado, os principais são as concentrações de relativas de antígeno e de anticorpo. O máximo
de precipitação é observado quando as quantidades de antígeno e de anticorpo são equivalentes,
diminuindo na presença de excesso de um ou outro componente.

35
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA

A curva de precipitação clássica pode ser obtida quando ao anticorpo e concentração constante se
adiciona o antígeno em diferentes concentrações apresentando aspecto parabólico (Figura 10). A
precipitação será máxima na zona de equivalência ou de proporções ideais de antígeno e anticorpo,
e à medida que se adiciona mais antígeno, o imunocomplexo se dissolve. A zona de excesso de
anticorpo (ou falta de antígeno) é chamada de pró-zona e proporciona resultado falso-negativo para
a pesquisa de anticorpo. Essa falha é inaceitável, pois justamente quando há mais anticorpos o
resultado será negativo. Para solucionar esse problema, devem ser utilizadas diferentes diluições do
anticorpo diante da concentração fixa do antígeno.

Figura 10. Curva de precipitação: quantidade de precipitação formada na interação antígeno-anticorpo


com concentração fixa de anticorpo (vermelho) e quantidade crescente de antígeno (verde). Na zona
de equivalência se observa o imunocomplexo na sua máxima estrutura de malha, permitindo que o
imunoprecipitado seja visível, especialmente em meio gelidificado. Nas zonas de excesso de anticorpo (pró-zona)
ou de excesso de antígeno (pós-zona) o tamanho molecular dos imunocomplexo não permite sua visualização,
gerando resultados falso-negativos.

Fonte: Imunoensaios cap. 5.

A visualização de precipitados em meio líquido é difícil, pois tanto as amostras de soros com
anticorpos quanto às soluções antigênicas apresentam turvação e coloração próprias e variáveis.

As técnicas manuais de precipitação atualmente e uso são realizadas em meio gelidificado, o que
facilita a leitura e reduz os volumes necessários para a interação. No entanto, requerem períodos de
horas a dias para a migração molecular e a formação do imunocomplexo.

Imunoaglutinação
Fundamento básico das técnicas de aglutinação é similar ao princípio das técnicas de precipitação,
diferindo na adsorção do antígeno ou do anticorpo a micropartículas insolúveis ou células e permitindo
leitura visual e rápida. A técnica não permite discriminar frações dos componentes antigênicos
como a imunoprecipitação, mas permite a utilização de antígenos purificados e complexos fixados a
micropartículas ou células. Além disso, pode ser mais sensível que a imunoprecipitação e permite a
detecção de pequenas quantidades de anticorpos, especialmente nas técnicas de microaglutinação.

36
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II

A característica mais marcante da imunoaglutinação é que seja o anticorpo ou antígeno é apresentado


na forma insolúvel em suspensão, de forma natural em células, ou adsorvido artificialmente a
micropartículas ou células. Pode ser direta ou indireta (Figuras 11 e 12).

Teste de aglutinação ocorre quando há a formação de agregados suficientemente grandes de


micropartículas ou células com múltiplos determinantes antigênicos (ou anticorpos), interligados
por pontes moleculares de anticorpos (ou antígenos). Ocorrem várias interações entre os sítios
combinatórios idênticos (dos anticorpos) simultaneamente com determinantes antigênicos iguais.
Estes agregados facilitam a visualização do imunocomplexo, que pode ocorrer em questão de
minutos ou algumas horas, e a leitura pode ser a olho nu ou lupa.

A execução da técnica pode ser determinada em tubo, lamina ou placa de micro cavidades, sempre
com o envolvimento de diferentes fatores na formação dos agregados, tais como:

»» classe do anticorpo envolvido;

»» concentração iônica e pH do meio;

»» presença de macromoléculas, íons, enzimas e conservantes;

»» tempo e temperatura;

»» padronização adequada da suspensão de micropartículas ou células;

»» concentração ótima do antígeno ou anticorpo a ser fixado nas micropartículas ou


células;

»» estabilidade da ligação do antígeno/anticorpo e acessibilidade dessa molécula nas


micropartículas ou células.

Como vantagens da reação de imunoaglutinação temos:

»» elevada sensibilidade;

»» baixo custo;

»» leitura visual;

»» facilidade de execução;

Podemos ainda listar algumas desvantagens:

»» reprodutibilidade dos lotes de reagentes;

»» acessibilidade molecular para interação antígeno-anticorpo;

»» estabilidade da ligação do antígeno-anticorpo no suporte;

37
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA

Figura 11 – Imunoaglutinação direta.

Modificado de: <http://www.abah.com.br/content/ABAAABM8oAE/imunoprecipitacao#>

Figura 12 – Imunoaglutinação indireta (passiva).

Modificado a partir de: <http://www.abah.com.br/content/ABAAABM8oAE/imunoprecipitacao#>.

38
Capítulo 3
Quantificação da concentração
antigênica ou de anticorpos

Historicamente, os ensaios imunológicos foram e têm sido os principais responsáveis pelo


conhecimento que se tem do sistema imune. Além deste aspecto relacionado ao conhecimento
científico básico, estes ensaios são importantes na clínica para a detecção de infecções, de doenças
autoimunes e de estados de imunodeficiência. Podem ainda ser utilizados para detectar a presença
de antígenos (além de anticorpos), na diferenciação do estágio de uma doença de acordo com a classe
de Ig produzida, na seleção de doadores e receptores de órgãos para transplantes, na avaliação do
prognóstico da doença, no sucesso de um tipo de terapia etc.

A amplitude da realização de ensaios imunológicos permite a utilização de técnicas não quantitativas


que são visualizadas por meio de reações de precipitação e aglutinação; podem, ainda, utilizar
técnicas quantitativas, com a utilização de marcadores enzimáticos (ELISA, imunoperoxidase,
citometria de fluxo) ou radioisótopos (Radioimunoensaio).

Os testes de precipitação e aglutinação são menos sensíveis que os ensaios imunoenzimáticos,


porque os complexos Antígeno-Anticorpo para serem visualizados precisam apresentar um tamanho
adequado. Na prática, os testes de precipitação são utilizados para a detecção de antígenos solúveis
(proteínas, glicoproteínas) enquanto os de aglutinação para a detecção de antígenos particulados
(hemácias, bactérias, células diversas).

Radioimunoensaio (RIA)
O radioimunoensaio é considerado um método de alta sensibilidade na análise quantitativa das
reações antígeno-anticorpo. Ele permite medidas rápidas e precisas mesmo em preparações não
purificadas. Também apresenta limiar de detecção na ordem de nanogramas ou picogramas. Entre
as limitações do ensaio destacam-se o custo do teste, a vida média dos reagentes e o risco operacional.

Na rotina pode ser utilizado para quantificar hormônios, drogas, marcadores tumorais, alérgenos
e anticorpos e antígenos em doenças parasitárias. Encontramos inúmeras variações deste ensaio,
contudo o princípio utilizado é o mesmo, ou seja, a quantidade de reagente marcado (antígeno ou
anticorpo) quantifica o antígeno ou anticorpo não-marcado na amostra (Figura 13).

Radioimunoensaio Direto
No radioimunoensaio direto, coloca-se uma quantidade fixa e limitada de anticorpo que é ligada
a um suporte sólido. Adiciona-se uma quantidade fixa e pequena de antígeno marcado, misturada
com uma amostra em teste ou com as soluções padrão que contêm concentrações conhecidas do
antígeno não-marcado. O antígeno não ligado é removido após um período de incubação e faz-se a

39
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA

medida da radioatividade da fase sólida. A partir da resposta obtida, a concentração do antígeno em


teste é estimada por interpolação na curva.

Radioimunoensaio de competição
No radioimunoensaio de competição, coloca-se uma quantidade fixa do antígeno em um suporte
sólido. Adiciona-se uma quantidade fixa de anticorpo marcado específico, misturada com a amostra
em teste ou uma série de soluções padrão com concentrações variadas do antígeno solúvel. O
anticorpo marcado que não se ligou à fase sólida e o antígeno solúvel é removido por lavagem,
após um período de incubação, e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida. De acordo com a
resposta obtida, a concentração do antígeno em teste é estimada por interpolação na curva.

Radioimunoensaio de captura
No radioimunoensaio de captura, coloca-se uma quantidade fixa de anticorpo imobilizada em um
suporte. A solução teste, com quantidade desconhecida de antígeno, ou as soluções padrão, com
concentrações conhecidas do antígeno são adicionadas. Após um período de incubação remove-se
o antígeno não ligado e adicionam-se anticorpos marcados específicos para o antígeno, com sítio de
ligação diferente do sítio do anticorpo de fase sólida. O anticorpo marcado não ligado é removido
por lavagem e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida. De acordo com a resposta obtida, a
concentração do antígeno em teste é estimada por interpolação na curva.

No radioimunoensaio clássico os reagentes são:

»» o anticorpo;

»» o antígeno marcado;

»» o antígeno frio contido nas amostras e padrões.

Figura 13: Radioimunoensaio

Fonte: Métodos de Laboratório Aplicados à Clínica, capítulo 6.

40
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II

Aplicações

»» Testes que necessitem de alta sensibilidade;

»» triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue;

»» pesquisa;

»» pesquisa de drogas na urina ou soro de atletas

ELISA (Enzyme-Linked Immunoassay)


O ensaio de ELISA é um dos tipos de testes mais empregados nos laboratórios hoje em dia, visto que
oferece simplicidade, sensibilidade e dependendo do kit a especificidade superior a de vários testes. A
metodologia deste ensaio se mostrou tão eficaz, a ponto de substituir os testes de Radioimunoensaio
(RIA), justamente por ser um teste mais estável e permitir o armazenamento do kit por um período
bem maior sem que seus reagentes sofram degradação.

Os testes de ELISA podem ser classificados em testes Homogêneos e Heterogêneos. Nos testes
homogêneos, a atividade enzimática é alterada como parte de uma reação imunológica. Neste tipo
de ensaio não há necessidade de separar o imunocomplexo formado dos imunoreagentes livres. As
técnicas homogêneas são especialmente elaboradas para a dosagem de drogas e haptenos, mas não
tiveram seu uso difundido nos laboratórios de análises clínicas, já que este apresenta problemas
na dosagem de proteínas. Por outro lado, os ensaios heterogêneos são amplamente empregados
na imunologia. Neste tipo de ensaio, a atividade enzimática do imunoreagente marcado não está
diretamente envolvida na reação propriamente dita; no entanto, os reagentes ligados e os reagentes
livres devem ser separados uns dos outros.

Ensaios de ELISA heterogêneos


O princípio básico do ELISA heterogêneo se baseia no uso de um antígeno ou anticorpo conjugado com
uma enzima que, ao reagir com seu substrato, dá origem a um produto colorido, quimioluminescente
ou fluorescente. Se for usado o método colorimétrico, a mudança de cor é monitorada a olho nu
ou com o uso de um espectrofotômetro para determinar a proporção entre a quantidade de cor
produzida e a quantidade de analito presente. Existe uma quantidade enorme de materiais que
podem ser usados como suporte para a colocação do antígeno ou do anticorpo. O mais comum é se
fazer uso de microplacas de poliestireno, pois estas, além de serem pequenas, evitando desperdício
de material, permitem que se faça a análise de uma grande quantidade de amostras (Figura 14).

A técnica de ELISA heterogênea é feita com algumas etapas de lavagem, como forma de separar os
imunoreagentes ligados dos que não estão ligados.

Esta técnica permite ainda se fazer uso de ensaios competitivos e não competitivos, podendo ainda
dosar antígenos ou anticorpos, neste último caso, todos os isotipos de anticorpos podem ser dosados,
tudo depende da especificidade do anticorpo usado.

41
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA

Figura 14: Ensaio de ELISA heterogêneo

fonte: <www.liaccentralsorologica.com.br>.

Ensaios competitivos
Rotineiramente este tipo de ensaio é usado para se dosar antígenos, neste caso eles possuem fixados
ao suporte sólido anticorpos ou antígenos específicos. Estes métodos são também chamados de
métodos de reagente limitados, pois o antígeno e o anticorpo são usados em quantidades limitadas.

Quando o ensaio usa um anticorpo específico fixado na fase sólida, adiciona-se a amostra do paciente
contendo o antígeno mais o antígeno marcado, com isso eles irão competir pelo anticorpo fixado na
fase sólida. Com a dosagem da amostra do paciente procede-se a um controle do reagente, onde se
adiciona apenas o antígeno marcado com um tampão na fase sólida, com isso tem-se o parâmetro
negativo para, assim, poder comparar com o resultado obtido com a amostra do paciente. Isto é
necessário, pois o sinal detectado na amostra do paciente é inversamente proporcional à quantidade
de analito presente na amostra, ou seja, quanto mais analito na amostra, menor o sinal. Existem
variações do ensaio competitivo em que o antígeno é fixado na fase sólida e o ensaio pode ser realizado
em duas etapas. Nesse caso, numa primeira fase adiciona-se o soro do paciente no suporte, incuba-
se, posteriormente procede-se à lavagem para a remoção de tudo que não ficou ligado ao suporte
sólido, e então adiciona-se o conjugado e procede-se à nova incubação. Nesta etapa, o conjugado
irá se ligar ao antígeno livre do suporte sólido, posteriormente, procede-se a uma nova lavagem e
executa-se a fase de revelação e leitura (Figura 15).

Os ensaios competitivos são ideais para dosagem de moléculas relativamente pequenas que podem
ser obtidas com relativa pureza em grandes quantidades, a fim de serem marcadas com uma enzima.
Como os ensaios competitivos requerem pequenas quantidades de anticorpo, eles são ideais para o
uso em sistemas que há pequenas quantidades de anticorpo.

42
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II

Figura 15: ELISA competitivo

Fontes: <http://www.liaccentralsorologica.com.br/noticias_chagas.html> e
<http://www.liaccentralsorologica.com.br/noticias_chagas.html>.

Ensaios não competitivos indiretos


Temos neste tipo de ensaio um dos mais empregados nas rotinas laboratoriais de análises clínicas.
Assim como os ensaios competitivos, eles podem usar antígenos ou anticorpos fixados a fase sólida.
Quando se faz uso de um antígeno fixado a fase sólida, o anticorpo específico presente na amostra
se ligará a este. Posteriormente o anticorpo será detectado com a adição de uma imunoglobulina
marcada específica para o anticorpo em questão. Se compararmos os testes competitivos com
os não competitivos, veremos que estes oferecem maior especificidade e menor sensibilidade;
no entanto, isto é, dependente da afinidade e pureza dos reagentes imunológicos. Para detectar
diferentes isotipos de imunoglobulina, são utilizadas imunoglobulinas marcadas específicas para um
determinado isotipo. Este tipo de ensaio é muito empregado quando se deseja detectar anticorpos
para um determinado agente infeccioso ou autoanticorpos (Figura 16).

Para este tipo de teste, pode-se usar suporte de microplacas de poliestireno, nitrocelulose, esferas
e microesferas.

Quando um anticorpo é ligado à fase sólida, estes ensaios são classificados de ensaios de captura ou
sanduíche, pois o antígeno presente na amostra, que pode ser um anticorpo também, será capturado
pelo anticorpo fixado ao suporte sólido. Posteriormente adiciona-se um anticorpo marcado para um
epítopo diferente do antígeno em questão, que completará o sanduíche. Existem inúmeras variações
deste tipo de ensaio. O antígeno capturado pode ser uma imunoglobulina qualquer, uma proteína
viral ou um antígeno qualquer que tenha, no mínimo, dois epítopos diferentes. Este tipo de ensaio
requer que uma grande quantidade de anticorpo esteja fixada na fase sólida, no entanto, oferece
uma grande sensibilidade.

Os ensaios de ELISA não competitivos podem ser modificados para incorporar camadas adicionais
de reagentes imunes, com isso se obtém o aumento na sensibilidade do ensaio, no entanto, isto acaba
influenciando no custo e no tempo de execução do teste. A aplicação mais comum é o complexo
avidina-biotina, que proporciona um aumento significativo na sensibilidade do teste. O anticorpo

43
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA

biotinilado é normalmente usado como o segundo anticorpo do sanduíche. Ele então é posto para
reagir com uma mistura previamente preparada de avidina e peroxidase biotinilada. Esta peroxidase
pode ser desenvolvida com agentes quimioluminescentes como forma de aumentar a sensibilidade.

Figura 16: ELISA não competitivo

Fonte: http://www.liaccentralsorologica.com.br/noticias_chagas.html
http://www.liaccentralsorologica.com.br/noticias_chagas.html.

Outras variações do ELISA


Uma das variantes do ELISA é a que usa a membrana de nitrocelulose como suporte sólido,
chamada de ensaio Dot Blot. Neste tipo de ensaio, o antígeno ou anticorpo é fixado à membrana.
Normalmente esta reação é observada pela produção de um produto colorido na membrana, este é
apenas um ensaio qualitativo. Os ensaios de Dot Blot podem ser modificados de forma a apresentar
uma maior sensibilidade e podem-se tornar semi-quantitativos desde que se use um densitômetro
para ler a cor da reação.

Problema: solução possível


Densidade ótica do controle do PBS elevado. Aumentar o número de lavagens.

Densidade ótica do controle negativo elevado. Bloquear os sítios da fase sólida que
não

reagiram; aumentar a diluição do conjugado.

Substituir o conjugado por um de maior pureza.

Adicionar de 1 a 5% de soro normal da mesma espécie usada no conjugado ao


tampão de diluição; trocar o tipo de suporte usado.

44
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II

Controle positivo com valores baixos. Tenha certeza de que o suporte usado é o
correto.

Aumente a pureza do anticorpo ou do antígeno de captura; aumente o tempo de ou


a temperatura de incubação, verificando antes se ambas estão corretas.

Quando a amostra está pouco diluída, apresenta um resultado moderado, no


entanto, quando está muito diluída, apresenta um valor fora da escala de leitura do
aparelho.

Dilua mais a amostra.

O ensaio apresenta valores baixos para tudo (amostra e controles).

Verifique a integridade do substrato e do tampão, certifique-se se o pH do tampão


também está correto; verifique o prazo de validade dos reagentes e a forma como
foram estocados.

Resultado da amostra do paciente não condizente com o histórico.

Procure pela presença de anticorpos heterófilos.

Western Blot
Atualmente, a técnica de Western Blot (WB) tem sido utilizada para estudos detalhados de uma
série de microrganismos incluindo bactérias, vírus e protozoários.

Para cada microrganismo há pequenas variações no tocante ao preparo dos reagentes, mas o
fundamento da reação é o mesmo. Encontramos muita semelhança com o ELISA, mudando apenas
o suporte antigênico que é feito em papel de nitrocelulose.

Como padrão, daremos o exemplo da obtenção dos reagentes, montagem e utilização do teste para
Vírus da Imunodeficiência Adquirida (HIV). Com este exemplo, a compreensão do teste ficará bem
clara.

A técnica de Western Blot teve sua origem na metodologia desenvolvida em 1975 por E.M.
Southern, que ao utilizar eletroforese em gel de poliacrilamida realizou a separação de proteínas
por peso molecular em um estudo de hibridização DNA-RNA. Este trabalho foi acompanhado, em
1977, pela demonstração por Van Raamsdork de uma técnica para a detecção de determinantes
antigênicos, em moléculas separadas por peso molecular, em gel de poliacrilamida, através de
um teste imunoenzimático utilizando a enzima peroxidase. Finalmente Harry Towbin, em 1979,
demonstrou a possibilidade de transferir as moléculas separadas em gel de poliacrilamida para
folhas de nitrocelulose, facilitando a manipulação das proteínas em uma matriz mais resistente. A
união destas três metodologias formam a técnica de Enzyme-Linked Immunoelectrotransfer Blot
Assay ou técnica de Western Blot.

45
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA

A técnica de Western Blot é composta de quatro estágios (HIV-1) (Figura 17):

»» 1o estágio – Eletroforese em gel de poliacrilamida

A preparação purificada de HIV-1 é submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida,


havendo a separação por peso molecular dos componentes antigênicos virais que
formam bandas de proteínas na matriz do gel.

»» 2o estágio – Transferência das bandas

O material antigênico viral separado é transferido do gel de poliacrilamida para


folha de nitrocelulose que é, então, cortada em tiras, contendo os componentes do
vírus separados em bandas.

»» 3o estágio – Reação antígeno-anticorpo

As tiras de nitrocelulose, contendo os antígenos virais, são colocadas em contato


com os soros dos pacientes e soros controles. Os anticorpos séricos específicos para
os componentes virais irão reagir com as respectivas bandas, formando complexos
antígeno-anticorpo macromoleculares, que ficam retidos nas tiras de nitrocelulose.

»» 4o estágio – Revelação dos complexos antígeno-anticorpo

A revelação dos complexos antígeno-anticorpo é realizada através da utilização


de um conjugado constituído de anti-imunoglobulina humana marcada com uma
enzima e o substrato enzimático.

Figura 17: Western Blot HIV. .

Fonte: <www.virology.ws>, modificado.

46
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II

Imunoeletroforese
Este ensaio é a combinação da eletroforese de dupla difusão em gel de agar, que se realiza em duas
etapas. Neste particular aplica-se uma corrente elétrica no sistema (Figura 18).

Na primeira etapa separam-se os componentes de determinado antígeno, graças às diferenças de suas


cargas elétricas. Numa 2a etapa faz reagir estas frações já separadas com um antissoro específico. Este
método permite caracterização de uma substância, simultaneamente, para três parâmetros:

a. Saber suas características eletroforética;

b. difusibilidade;

c. especificidade imunoquímica.

Este é um método que foi utilizado em larga escala em todos os ramos da Biologia, por seu alto poder
de resolução, bastando mencionar que a eletroforese do soro do indivíduo nos permite evidenciar
30 componentes. Há uma combinação de sensibilidade e de poder de identificação dos diferentes
componentes.

Por outro lado, a quantidade de soro é mínima, com apenas 5 μl, pode-se fazer uma análise ampla do
material a ser identificado. No soro humano encontramos, pela eletroforese, 5 componentes: albumina,
alfa 1, alfa 2, beta e gamaglobulina. Estas frações se separam de acordo com as cargas elétricas.

Em uma 2ª fase, aplicando um soro imune específico paralelo a cada uma das frações e fazendo
atuar a corrente elétrica, teremos uma combinação de cada fração antigênica com o soro. Ocorre
uma combinação de cada fração antigênica com o anticorpo correspondente e, por sua vez, dá-se
a separação de outros componentes antigênicos e sua a respectiva combinação com os anticorpos
específicos de cada subfração.

Nesta nova fase podemos proceder à análise de grande quantidade de subfrações combinadas com
os seus anticorpos específicos.

Em Análises Clínicas, a imunoeletroforese foi substituída por uma série de testes modernos, mais
eficientes e de fácil realização, como os testes de imunoenzimático, fluorimétricos e outros que
permitem separação dos componentes como a cromatografia em gel de acrilamida.

Figura 18: Imunoeletroforese.

Fonte: <http://www.docstoc.com/docs/97365543/Reacoes-antigeno-anticorpo>, modificado.

47
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA

Imunodifusão
A metodologia de imunodifusão é realizada em meio semi-sólido, geralmente o ágar ou agarose,
permitindo uma difusão mais homogênea que em meio líquido, mas que tem o inconveniente de
demorar entre 18 e 24 horas para que seja observada a precipitação. A difusão dos imunoprecipitados
no gel depende do tamanho destes; quando são grandes ficam maiores que o diâmetro dos poros, o
que impede a sua difusão. A imunodifusão pode ser simples ou dupla; sendo que é simples, quando
ou o antígeno ou o anticorpo é fixado a um suporte e o outro componente se difunde no meio, até
ocorrer precipitação; é dupla, quando os dois componentes migram um em direção ao outro.

A imunodifusão dupla é realizada numa lâmina de microscópio revestida de ágar, contendo orifícios
onde são colocadas concentrações de Ag e Ac. Quando o antígeno e os anticorpos específicos
encontram-se, em concentrações correspondentes à zona de equivalência, são formados complexos
precipitantes (Figura 19).

Figura 19 – Imunodifusão dupla.

Fonte: http://dc399.4shared.com/doc/VshpHDGY/preview.html.

Na figura acima, observa-se que o antígeno X precipitou próximo ao orifício onde ele foi depositado,
sendo que os antígenos Y e Z precipitaram na região média entre os orifícios onde foram depositados
o antígeno e o anticorpo. O efeito observado com o antígeno X pode ser explicado: 1) o antígeno
pode estar em baixas concentrações e a zona de equivalência ocorreu próximo ao orifício onde foi
depositado ou, 2) o peso molecular ou a carga do antígeno interferiu na sua capacidade de migração.

Imunodifusão dupla segundo Ouchterlony


A utilização deste método permite identificar um antígeno comparando-o a outros já conhecidos.
Podem-se usar lâminas ou placas de Petri, revestidas de ágar, nas quais são feitos orifícios adjacentes.
Logo em seguida, colocamos o soro em um destes orifícios e nos outros orifícios o antígeno de origem
conhecida e aquele a ser identificado (Figura 20). Como pode ser vista na Figura 20, observamos
a existência de três padrões de resultados de acordo com a relação estrutural entre o antígeno
conhecido (padrão) e o que se queria analisar.

48
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II

Encontramos similaridade na análise se antígeno conhecido – Albumina Sérica Humana (HSA) –


é correspondente ao analisado (Antígeno A). Dessa forma, os anticorpos e os antígenos migram,
formando uma linha de precipitação contínua, com concentração correlacionada à zona de
equivalência (Figura 20A). Se os antígenos são semelhantes, mas não idênticos, forma-se um esporão;
já na Figura 20B, por exemplo, os anticorpos reconhecem o antígeno padrão (HSA) e o A2 (Albumina
Sérica Bovina – BSA), que são similares; no entanto, o esporão corresponde aos determinantes
antigênicos, reconhecidos pelos anticorpos anti-HSA, presentes apenas no HSA. Na medida em que
os anticorpos reconhecem os dois antígenos, mas estes são distintos (HSA e HGG – Gamaglobulina
Humana), podemos observar duas linhas que se cruzam, formando dois esporões, demonstrando
então que determinantes antigênicos diferentes presentes nestes antígenos são reconhecidos pelos
anticorpos (Figura 20C). A presença de mais de uma linha de precipitação significa que os anticorpos
estão reconhecendo outros componentes e que a solução antigênica não está purificada.

Em resumo, o método é semiquantitativo, pouco sensivel, mais usado para caracterizar antígenos
em infecções ou anticorpos em doenças autoimunes. O tempo longo requerido para a obtenção dos
resultados (praticamente um dia inteiro) é um fator limitante da técnica, além de detectar apenas
reações Ag-Ac nas quais há formação de precipitados. Os ensaios imunoenzimáticos têm substituído
com frequência os testes de imunodifusão.

Figura 20 – Imunodifusão de Ouchterlony.

Fonte: <http://dc399.4shared.com/doc/VshpHDGY/preview.html>.

Imunodifusão radial simples


O ensaio de imunodifusão radial simples, introduzido por Mancini, em 1965, além de ser uma
técnica de fácil realização e de baixo custo, é quantitativa (Figura 21). É realizada em placas ou
lâminas revestidas de ágar, no qual é incorporado um antissoro específico para a molécula a ser
quantificada (Figura 21B). No gel de ágar são feitos orifícios onde são depositadas pelo menos três
concentrações conhecidas da molécula estudada (solução padrão) e as amostras de concentração
desconhecida. Estas moléculas difundem-se no ágar e quando reagem com o anticorpo, na
concentração correspondente à zona de equivalência, forma-se a linha de precipitação, o que ocorre

49
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA

entre 48-72 horas. O diâmetro do halo que se forma ao redor do orifício onde foram depositadas as
amostras corresponde à concentração da molécula, de acordo com a curva padrão obtida (Figura
21A). Para a obtenção da curva-padrão são utilizadas concentrações conhecidas da solução padrão
e após reação com os anticorpos presentes no ágar, os halos são medidos.

Por exemplo, ao dosar as concentrações de IgM do soro de pacientes para a obtenção da curva
padrão deve-se ter uma solução contendo IgM purificada de concentração conhecida.

Esta técnica é utilizada para quantificar as imunoglobulinas IgG, IgM e IgA e moléculas do sistema
Complemento.

Figura 21 – Imunodifusão Simples

Fonte: <http://dc399.4shared.com/doc/VshpHDGY/preview.html>

Reação de microaglutinação passiva – reação de


VDRL (Veneral Diseases Research Laboratory)
A reação de microaglutinação passiva é rotineiramente utilizada para o diagnóstico sorológico da
sífilis, por meio de uma técnica de microaglutinação passiva feita em placa escavada (Figura 22).

Pacientes com sífilis desenvolvem uma resposta de anticorpos contra um hapteno ubiquitário
existente nos tecidos dos mamíferos. Trata-se de um fosfolipídio, que pode ser extraído em alto
grau de pureza do coração de bovino e é denominado cardiolipina.

Anticorpos para antígenos cardiolipínicos são conhecidos como anticorpos de Wasserman ou


reagínicos.

Infecções pelo Treponema pallidum (sífilis) levam à liberação nos fluídos orgânicos de cardiolipina,
a qual faz parte normalmente da membrana mitocondrial, e à produção de anticorpos. Cardiolipina
sozinha, entretanto, somente se liga a anticorpos, mas não estimula sua produção, isto é, atua como
um hapteno. Para tornar-se imunogênica a cardiolipina deve se ligar a uma proteína carreadora.

50
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II

A cardiolipina, somada a doses adequadas de colesterol e de lecitina, constitui excelente antígeno


para a detecção da reagina sifilítica, seja em testes de aglutinação passiva, nos quais o hapteno é
adsorvido a superfície de cristais de colesterol (reação de floculação de Kline, VDRL etc), seja
em testes de fixação do complemento (reação de Wasserman).

Figura 22. Reação de microaglutinação passiva – reação de VDRL.

Fonte: <drugline.org>, modificado.

51
Capítulo 4
Identificação de antígenos em células
e antígenos

Imunofluorescência
O ensaio de imunofluorescência nos permite detectar e localizar antígenos em células e tecidos
utilizando anticorpos específicos, marcados com fluorocromos, facilitando a localização dos
antígenos por estes estarem visíveis ao microscópio de fluorescência (Figuras 23 e 24).

O método é baseado na capacidade de as moléculas de anticorpo ligarem-se covalentemente a


fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o antígeno.

De acordo com o mesmo princípio, podemos detectar e localizar anticorpos em fluidos biológicos
usando seu antígeno correspondente.

A imunofluorescência é considerada:

»» Teste qualitativo/semi-quantitativo.

»» Método de alta sensibilidade e alta especificidade.

Fluorocromos
Fluorocromos são substâncias que absorvem luz ultravioleta e emitem luz visível, ou seja, ficam
fluorescentes. Em 1941 foi a primeira vez que anticorpos foram conjugados com fluorocromos.

Fluorocromos mais utilizados


Isotionato de fluoresceína (FITC) e compostos da rodamina são os fluorocromos mais usados para
conjugação com anticorpos para torná-los fluorescentes sob condições adequadas de iluminação.

Isotionato de fluoresceína (FITC): se excita com luz azul a 490 nm e emite a 514 nm. Seu
rendimento quântico é de 0,5. Produz Quenching.

Observação: Quenching refere-se a qualquer processo que diminui a intensidade de fluorescência


de uma dada substância. Uma variedade de processos pode resultar em extinção, tais como reações
de estado animado, a transferência de energia, formação de complexos e extinção de colisão.
Como consequência, extinguindo muitas vezes é fortemente dependente da pressão e temperatura.
Oxigênio molecular e o íon iodeto de supressores químicos comuns.

52
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II

Compostos da rodamina: Rodamina é um nome genérico para uma família de compostos


orgânicos, corantes chamados fluoronas. Por exemplo, temos a Rodamina 6G e Rodamina B.
Elas são usadas como corantes e como corantes que podem ser estimulados por laser como meio
amplificador. São oferecidas como corantes traçantes para determinação de vazão e direção de
fluxos d’água. Os corantes de rodamina fluorescem e sua medição é por meio de fluorímetros. Como
rotina usamos em aplicações biotecnológicas tais como a microscopia de fluorescência, citometria
de fluxo e os testes do tipo ELISA.

Figura 23. Ensaio de Imunofluorescência.

Fonte: <www.virtual.epm.br>.

Figura 24 – Visualização de ensaio de Imunofluorescência. .

Fonte: <iiisite.wordpress.com>, modificado

Microscópio de epifluorescência
A reação imunofluorescente que é desencadeada no microscópio de epifluorescência ocorre através
da emissão de luz de cor quando o fóton é excitado por luz de curto comprimento de onda (UV).

53
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA

A epifluorescência é um conjunto de óptica para um microscópio fluorescente no qual a objetiva


é usada tanto para focalizar a luz ultravioleta sobre o espécime, como para captar a luz fluorescente
do espécime. Ela  é mais eficiente do que a fluorescência transmitida, na qual uma lente ou
condensador é empregado para focalizar a luz ultravioleta no espécime. A epifluorescência também
possibilita que a microscopia fluorescente seja combinada com outro tipo no mesmo microscópio
(Figura 25).

Figura 25 – Epifluorescência

Fonte: <http://www.docstoc.com/docs/97365543/Reacoes-antigeno-anticorpo>, modificado.

Imunofluorescência direta
1. O anticorpo específico marcado com Fluorocromo (conjugado) é adicionado e se
fixa ao antígeno, formando um imunocomplexo estável.

2. O anticorpo não ligado é removido por lavagens.

3. O preparado é observado em microscópio de fluorescência.

Vantagens

»» Alta especificidade e sensibilidade.

»» Possibilidade de detecção de proteínas intracelulares e de sua localização.

54
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II

Desvantagens

»» Alto custo do microscópio de fluorescência.

»» Necessidade de um conjugado para cada antígeno que se deseja identificar ou


localizar.

»» Subjetividade da leitura.

Aplicações: Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de


tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais.

Imunofluorescência indireta
A reação da imunofluorescência indireta, ou técnica de dupla camada (Figura 26), é realizada por
antígenos fixados em uma lâmina, onde se aplica primeiro um anticorpo específico não fluorescente
e por último coloca-se um anticorpo fluorescente com especificidade marcada contra determinantes
antigênicos do primeiro anticorpo utilizado para reagir com o antígeno. Esta técnica apresenta
como vantagem a possibilidade de se ter uma fluorescência mais evidente, pelo fato do anticorpo
fluorescente se ligar apenas aos anticorpos primários.

Outra vantagem é que por esta técnica pode-se trabalhar com vários anticorpos primários específicos
para diferentes tipos de antígenos e pode-se identificar qual a classe que o anticorpo pertence.

Figura 26 – Ensaio de Imunofluorescencia direta, indireta e sanduíche

Fonte: <http://www.docstoc.com/docs/97365543/Reacoes-antigeno-anticorpo>, modificado.

55
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA

Para a pesquisa de antígenos

1. Incuba-se a célula ou tecido em que se quer pesquisar o antígeno com o anticorpo


específico obtido em animal ou um monoclonal, levando à formação de um
imunocomplexo.

2. Realiza-se lavagem para retirada do anticorpo não ligante excedente.

3. A preparação é incubada com um conjugado anti-imunoglobulina, marcado com


fluorocromo, produzido em outra espécie de animal.

4. O preparado é observado em microscópio de fluorescência.

Para a pesquisa de anticorpos

1. Antígenos padronizados são fixados a lâminas de vidro.

2. O soro do paciente é diluído, colocado sobre o antígeno e incubado para permitir a


formação do complexo antígeno-anticorpo.

3. Realizam-se lavagens para a retirada dos anticorpos não ligados.

4. A preparação é incubada com o conjugado fluorescente e, se houver anticorpo no


soro, o conjugado reage com o anticorpo específico para o antígeno.

5. Observa-se o preparado em microscópio de fluorescência.

Vantagens

»» Especificidade.

»» Reprodutibilidade.

»» De simples padronização e execução.

»» O mesmo conjugado pode ser usado em sistemas diferentes.

»» Para determinar as classes e subclasses de anticorpos são utilizados conjugados


específicos.

»» Sensibilidade.

Desvantagens

»» Necessidade de microscópio de fluorescência.

»» Subjetividade na leitura.

»» Não automação.

56
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II

Aplicações: Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença de Chagas, a


SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças auto-imunes.

Citometria de fluxo

História
O nível atual da citometria de fluxo (CF) resultou: 1) da evolução tecnológica que se seguiu à primeira
descrição feita por Coulter, em 1956, de um aparelho que contava e media o tamanho de células
que passavam em corrente através dum feixe de luz; 2) da produção e marcação de anticorpos
monoclonais com fluorocromos, que começou na década de 1970; e 3) dos progressos feitos na
tecnologia dos computadores, os quais permitem a análise e manipulação de toda a informação
eletrônica que o método fornece.

Princípio
A amostra observada em CF é constituída por uma suspensão de células ou de partículas, as quais,
incluídas na corrente em fluxo laminar de um líquido condutor, serão forçadas a passar uma a uma
através da câmara de fluxo. Esta câmara é atravessada por um feixe de raios laser com comprimento
de onda preestabelecido. Sempre que o raio laser choca com uma célula, a radiação vai sofrer
desvios que, depois de convertidos pelo citômetro em sinais electrônicos, vão ser reconhecidos pelos
sensores.

Um dos sensores é designado por Forward Angle Light Scatter (FS ou FSC), porque se encontra
colocado no sentido da direção do feixe luminoso. Outro situa-se sensivelmente a 90º dessa direção,
designando-se por isso Ortogonal ou Side Scatter (SS ou SSC). Simplificadamente poderá dizer se
que o sensor FS dá informação sobre o tamanho da célula, baseado na difração e refração da luz,
enquanto o sensor SS, que mede a luz dispersada, avalia a granulosidade intracelular, constituída
pelo núcleo, cromossomos, mitocôndrias e outras organelas ou partículas.

Os citômetros de fluxo possuem ainda um número variável de sensores especializados em medir


fluorescência, nomeadamente a que provém de fluorocromos como o FITC, o PE e outros que vão
ser acoplados a anticorpos monoclonais. Filtros ópticos colocados previamente a esses sensores
permitem separar os diversos componentes do espectro de emissão (Figura 27).

Com as informações provenientes dos variados sensores, a parte informática do citômetro, de


acordo com as características das próprias células, agrupa-as em histogramas virtuais semelhantes
ao representado na Figura 28.

57
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA

Figura 27 – Representação de um citômetro de fluxo (esquema).

Fonte: <http://www.labmed.pt/NotasTecnicas05.asp>.

Figura 28 - Histograma de células do sangue periférico, obtido em função da positividade CD45 lida no scatter SS

Fonte: <http://www.labmed.pt/NotasTecnicas05.asp>.

Circunscrevendo-se no histograma uma determinada população celular (gating) podemos realizar


a imunofenotipagem.

A citometria de fluxo é um método multiparamétrico (número de parâmetros analisados) utilizado


na fenotipagem de células provenientes de variadíssimos tecidos, incluso de tumores sólidos.
Contudo, o seu grande campo de aplicação em clínica é o sangue periférico, cujas células apresentam
na membrana exterior antigênicos específicos habitualmente classificados com um número
correspondente ao seu Cluster of Differentiation (CD).

58
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II

Exemplos de algumas aplicações da


citometria de fluxo

Imunodeficiência adquirida (AIDS)


O vírus causador da imunodeficiência humana (HIV) que tenha entrado na circulação mostra
especial predileção em infectar as células que exibem na sua membrana uma glicoproteína que
funciona como antígeno CD4. Embora este antígeno se encontre em células de variados tecidos
hematopoieticos ou não, existe fundamentalmente na membrana dos linfócitos T. Estes, por sua
vez, constituem o principal alvo do HIV e o seu local privilegiado de replicação (Figura 29).

Figura 29 - Após fusão com o receptor CD4 da membrana, o HIV entra no linfócito T onde, por ação de uma
transcriptase reversa, o seu RNA é convertido em DNA, que vai integrar-se no DNA nuclear. Esta célula ficará
infectada durante o seu período de vida e será a fornecedora da energia gasta com a reprodução do HIV. O DNA
viral passa de novo a partículas de RNA, que se agrupam para originar novos vírus. Estes vão reentrar em circulação
aptos a infectar mais linfócitos T, e a célula de onde saíram ou morreu ou morrerá mais tarde ou mais cedo.

Fonte: Imunoensaios, capítulo 12.

Sugestão de vídeos sobre a transmissão do HIV:

< https://www.youtube.com/watch?v=ZeyEYymuacg>

Fenotipagem da população linfocitária por


citometria de fluxo
Antes de proceder a essa fenotipagem, é preciso separar a população linfocitária dos restantes
leucócitos do sangue circulante.

Como todos os leucócitos apresentam nas suas membranas o antígeno CD45, começa por se incubar
o sangue total com um anticorpo marcado específico para esse antígeno, que de maneira geral existe
em maior quantidade nas membranas dos linfócitos. Após passagem do sangue pelo citômetro,

59
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA

os variados tipos de leucócitos vão ser agrupados virtualmente num histograma semelhante ao
representado na Figura 28 (gating eletrônico).

Os linfócitos assim agrupados (gated) vão ser agora separados nas suas variadas subpopulações,
após incubação com um painel adequado de anticorpos marcados.

Embora para o estadiamento da infecção por HIV, como veremos, tenha interesse quantificar,
sobretudo, os linfócitos T CD4+ e CD8+, é prática frequente em muitos laboratórios utilizar também
anticorpos contra os antígenos CD3, CD5, CD14, CD16, CD19 e CD56.

Com esta prática, além de se excluírem monócitos que porventura se encontrem entre as células
estudadas, podem-se separar e quantificar especialmente os linfócitos T, os linfócitos B e as
células Natural Killer (NK). Se a soma T+B+NK (no seu conjunto designada por imunossoma)
for aproximadamente igual a 95%, temos a garantia de que não se perderam durante a separação
quantidades significativas de células linfocitárias.

Monitorização laboratorial da infecção por HIV


Antígeno p24 (Figura 30A) – Poucos dias após o contágio, detecta-se no sangue circulante, por
exemplo, por quimiluminescência, o antígeno p24 específico do HIV. Este marcador virulógico, que
já pode ser positivo uma semana antes da resposta sorológica, atinge um pico por volta dos 20 dias
e costuma negativar ao fim de um mês. Um subsequente aumento dos seus níveis séricos é sinal de
mau prognóstico.

Resposta Sorológica (Figura 30 A) – Consiste na produção pelo organismo infectado de


imunoglobulinas M e G específicas para o HIV. A IgM desaparece da circulação a breve trecho,
enquanto que a IgG sobe progressivamente e mantém-se com níveis séricos elevados até muito
tarde na progressão da doença.

Quantificação das populações linfocitárias (Figura 30B) – Após a soroconversão, os linfócitos T


CD8+ aumentam quantitativamente para, juntamente com os CD3+ diminuírem numa fase tardia da
doença.

Pelo contrário, o número de linfócitos T CD4+, fundamentais na reação imunológica contra agentes
infecciosos, desce progressivamente, por razões já referidas, após a entrada do HIV no organismo.
Quando atingem as 400-500 células por µL ou menos, o doente, que se manteve durante meses ou
anos assintomático, tem maior probabilidade de adquirir uma ou mais doenças oportunistas que
definem a AIDS (Figura 30C).

60
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II

Figura 30 – Comportamento laboratorial da infecção pelo HIV

Figura 30A

Figura 30B

Figura 30C

Fonte: <http://www.labmed.pt/NotasTecnicas05.asp>.

61
Capítulo 5
Metodologias com uso de biologia
molecular

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)


A técnica de PCR utiliza os princípios de hibridização específica, orientação definida, desnaturação
e restauração ao estado nativo para aumentar uma sequência específica de um gene. Na técnica de
PCR, para amplificação de um segmento específico de DNA, primers (oligonucleotídeos sintéticos)
ou sondas alelo-específicas são utilizados na reação de cadeia. Cada ciclo de amplificação consiste de:

1. desnaturação da dupla fita de DNA por aquecimento;

2. hibridização dos primers com a utilização de uma sequência específica de


nucleotídeos da fita de DNA complementar (anelamento);

3. extensão dos primers pela ação da Taq DNA polimerase através da adição de
nucleotídeos livres complementares à fita de DNA original. A seguir, a nova dupla
fita de DNA formada serve como fita original para os subsequentes ciclos, gerando
assim uma escala geométrica de amplificação.

Análises moleculares
A genotipagem molecular pode ser realizada sempre que a sequência de um gene for conhecida
e que as mutações responsáveis por um antígeno ou fenótipo de grupo sanguíneo tenham sido
determinadas.

Os protocolos de PCRs comumente utilizados na determinação de antígenos de grupos sanguíneos


são: primers alelo-específicos (AS-PCR) e PCR seguido por análises dos fragmentos com enzimas de
restrição (PCR-RFLP).

Atualmente tem merecido destaque também a técnica de Microarray ou tecnologia Chip, por
possuir uma plataforma rápida de genotipagem (diversas amostras ao mesmo tempo) com excelente
descriminação alélica, redução no número de procedimentos isolados (execução de um único PCR
multiplex) e resultado altamente automatizado.

Técnica de PCR alelo-específica


Nesta técnica de PCR alelo-específica, são utilizados dois diferentes primers, o que nos leva a
ter duas amplificações independentes. Dessa forma, torna-se importante monitorar a eficiência

62
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II

da amplificação, realizando-se como um controle interno uma sequência não relacionada. A


amplificação de um controle interno mostra a ausência de substância inibidora no tubo da reação
(Figura 31).

Eles podem não ser eficientes quando dois alelos diferem em apenas um nucleotídeo. Este método
tem grande aplicação na tecnologia Chip.

Figura 31: Produto de PCR alelo específico após eletroforese em gel agarose

Fonte: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0365-05962008000300002>

Técnica de PcR-RflP
Já a técnica de PCR-RFLP é adequada quando a mutação polimórfica estiver associada à produção
ou remoção de um sítio de enzima(s) de restrição. A vantagem deste procedimento é possibilitar a
amplificação ao mesmo tempo de ambos alelos com um único par de primers. Assim, uma reação
positiva (produto de PCR amplificado) é observada com ambos os alelos, que servem como um
controle interno. A diferenciação dos alelos é feita depois da digestão do produto de PCR com uma
enzima de restrição, capaz de identificar a mutação de ponto e, após eletroforese, para a melhor
visualização do tamanho dos fragmentos (Figura 34).

Figura 32 – Diferenciação dos alelos pelo tamanho dos fragmentos em gel de


poliacrilamida após digestão enzimática.

Fonte: <http://www.ufpe.br/biolmol/aula7_PCR-RAPD-aplicar.htm>,modificado.

63
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA

Painel A

Representação esquemática das sequências amplificadas dos alelos FY B e FY A. Os tamanhos dos


fragmentos obtidos na diferenciação dos dois alelos após digestão com a enzima de restrição Ban I.
As localizações dos sítios comuns presentes apenas no alelo FY A estão representadas por uma caixa
sobre a barra representando a sequência.

Painel B

Fotografia de um gel de poliacrilamida após eletroforese do produto de PCR submetido à digestão


enzimática.

Pista 1

»» Marcador molecular (100 pb ladder).

Pista 2

»» O produto amplificado não tratado com a enzima Ban I.

Pista 3

»» Padrão observado do produto amplificado de amostra homozigota para FY A (FY A/


FY A) tratado com a enzima Ban I.

Pista 4

»» Padrão observado do produto amplificado de amostra homozigota para FY B (FY B/


FY B) tratado com a enzima Ban I.

Pista 5

»» Padrão observado do produto amplificado de amostra heterozigota (FY A/FY B)


tratado com a enzima Ban I.

Técnica de Microarray
A técnica de Microarray utiliza um PCR multiplex que possibilita a análise de vários polimorfismos
simultaneamente e sondas de oligonucleotídeos depositadas em uma placa (vidro, sílica ou outros
suportes) marcadas com fluorescência e hibridizadas com DNAs alvo (amplificados através do PCR
multiplex), gerando um espectro de cor (caso haja a hibridização) que é detectado e interpretado
por um sistema automatizado capaz de avaliar a intensidade das hibridizações e fornecer resultados
que podem ser visualizados na forma de gráficos ou tabelas de genótipos (Figura 33).

A rapidez e a confiabilidade de resultados proporcionados por esta tecnologia aumentarão a exatidão


da compatibilidade entre doador e receptor, bem como a segurança das transfusões.

64
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II

Figura 33 – Esquema do Microarray

Fonte: <http://www.biotools.eu/arrays.html>.

Aplicações clínicas da genotipagem molecular


1. Identificação de risco na Doença Hemolítica Perinatal (DHPN) – Testes
de hemaglutinação, incluindo a titulação de anticorpos anti-eritrocitários, dão
apenas uma indicação indireta da possibilidade de ocorrência da DHPN. Este fato
ocorre particularmente nos casos de mães com anticorpos dirigidos a antígenos do
sistema Kell. Apesar de o genótipo fornecer informações diretas, os critérios para
obtenção dos amniócitos devem ser bem estabelecidos. A genotipagem é indicada
nos casos em que a mãe possui um anticorpo da classe IgG clinicamente significante
e o pai heterozigoto para o antígeno em questão ou desconhecido. Atualmente é
possível realizar a genotipagem fetal através da amostra de plasma materno (método
não invasivo para o feto), pois foi demonstrado que o DNA fetal livre encontrado
na circulação materna, cuja concentração aumenta durante a gestação, pode ser
utilizado para realização da genotipagem de grupos sanguíneos.

A possibilidade de realizar genotipagem RHD fetal através do plasma materno terá


um grande impacto na identificação das gestantes RhD-negativo que necessitam de
imunoglobulina Rh e também no monitoramento da gestação de mães sensibilizadas
pelo antígeno RhD que estão gerando um feto RhD positivo.

2. Teste direto da antiglobulina positivo – Nas situações em que as hemácias


estão revestidas com anticorpos da classe IgG, a genotipagem tem um papel
importante na determinação dos antígenos de grupos sanguíneos, pois a maioria
dos anti-soros utilizados para a fenotipagem são reativos pelo teste da antiglobulina.
A utilização da genotipagem nestes casos pode auxiliar na determinação do perfil
antigênico do paciente e possibilitar a realização de transfusão fenótipo compatível.

3. Pacientes com transfusão recente – Estudos mostram que a presença de


leucócitos nos produtos de sangue transfundidos não interfere na genotipagem

65
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA

de grupos sanguíneos. Assim, pacientes politransfundidos com transfusão recente


podem ser genotipados para determinação do seu perfil antigênico, possibilitando
transfusões fenótipo compatível.

4. Processo de identificação de anticorpos – A genotipagem pode ser um método


de auxílio na identificação de anticorpos de pacientes politransfundidos, pois através
dela é possível deduzir o fenótipo e confirmar a suspeita do aloanticorpo presente.

5. Confirmação de discrepâncias ABO e Rh – Algumas situações clínicas e a


utilização de diferentes anti-soros nas rotinas de Imunohematologia podem levar
a discrepâncias nos fenótipos ABO e Rh. Estas discrepâncias podem atualmente
ser facilmente solucionadas através dos testes moleculares que independem da
disponibilidade de soros para a confirmação do fenótipo presente.

6. Determinação da zigozidade do antígeno RhD – A zigozidade do antígeno


RhD, impossível de ser determinada sorológicamente, pode ser realizada por
técnicas moleculares. Esta genotipagem tem sido de grande auxílio na identificação
da zigozidade RhD em pais de fetos gerados por mães RhD-negativo e na constituição
dos painéis de hemácias.

7. Determinação de antígenos fracos – Antígenos fracamente expressos


na membrana eritrocitária como Fyx, evar e outros podem ser seguramente
determinados pela genotipagem.

8. Confirmação dos antígenos D fraco e D parcial – A genotipagem tem sido


de grande auxílio na confirmação dos antígenos D fraco e D parcial, bem como na
determinação dos tipos de D fraco e tipos e categorias de D parcial, muitas vezes
impossível de identificar sorologicamente.

9. Determinação de microquimerismo em pacientes transplantados –


É possível selecionar um marcador genético de grupos sanguíneos através da
genotipagem eritrocitária em doadores e receptores de transplante de medula óssea
e avaliar o quimerismo após o transplante.

10. Testes em medicina legal – Paternidade e testes forenses podem ser realizados
através da genotipagem molecular com maior chance de resolução.

11. Disponibilidade de sangue para pacientes dependentes de transfusão


– A genotipagem molecular tem sido utilizada para identificar pacientes com
fenótipo Fy(b–) que podem ser transfundidos com hemácias Fy(b+) sem o risco
de desenvolverem anticorpos anti-Fyb. Dois terços da população Africana com
fenótipo Fy(a–b–) possuem o gene FYB com uma mutação no promotor eritroide
(GATA-1) que leva a ausência de expressão da proteína Duffy e, consequentemente,
do antígeno Fyb na superfície das hemácias. No entanto, a proteína é expressa em
outros tecidos, como por exemplo, nas células do endotélio de vasos sanguíneos.

66
Capítulo 6
Diagnósticos laboratoriais
(Ministério da Saúde)

Doença de Chagas

Aspectos clínicos
Destacam-se por sua importância epidemiológica as formas agudas (indício de transmissão ativa),
indeterminadas (mais frequentes), cardíacas e digestiva (gravidade clínica). Estima-se que as formas
agudas aparentes se manifestam em 3% dos casos em área endêmica; as formas indeterminadas em
50%; as formas cardíacas em 30%; e as digestivas em 7 a 8%.

Diagnóstico laboratorial

Parasitológico

»» Exame a fresco

»» Gota espessa

»» Esfregaço corado

»» Creme leucocitário

»» Xenodiagnóstico

»» Métodos Imunológicos:

›› Hemaglutinação indireta

›› Imunofluorescência

›› ELISA

Todos os métodos parasitológicos acima destacados, na prática, são utilizados para diagnóstico da
fase aguda, quando a parasitemia é intensa. As sorologias que detectam IgM (imunofluorescência e
hemaglutinação) também são utilizadas para diagnóstico da fase aguda, entretanto só deve firmar
diagnóstico de forma aguda com o encontro de parasitas no sangue periférico. Já na fase crônica,
utilizam-se mais com mais frequência os métodos de detecção de anticorpos circulantes (IgG) e os
métodos imunológicos (ELISA, a imunofluorescência e a hemaglutinação indireta).

67
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA

HIV/AIDS

Diagnóstico laboratorial

O diagnóstico laboratorial do HIV é realizado por meio da utilização de métodos que permitam
investigar anticorpos anti-HIV, antígenos, material genético ou que possam isolar o vírus em cultura.

Para os infectados menores de 18 meses de idade, investiga-se o DNA ou RNA viral, uma vez que
poderia haver reação cruzada com os anticorpos maternos nas crianças. Desta forma, as técnicas
utilizadas são o PCR para DNA viral e RT-PCR para RNA viral.

Os indivíduos com mais de 18 meses de idade, utilizam testes que pesquisam os anticorpos como os
métodos de ELISA, Western Blotting, Imunofluorescência Indireta.

No entanto, deve ser levado em consideração que os anticorpos anti-HIV somente serão detectáveis
em torno de 30 dias após a infecção em indivíduos imunologicamente competentes.

Esse intervalo entre a infecção pelo patógeno e a detecção dos anticorpos por metodologias
laboratoriais é denominado janela imunológica. Nesse período, podemos encontrar provas
sorológicas falso-negativas e por isso, há a necessidade de realizar testes em tempos diferentes.

Na rotina, o método de ELISA é usado amplamente como teste inicial para a detecção de anticorpos
anti-HIV no sangue dos pacientes. Se o resultado for positivo, o indivíduo deverá realizar outros
testes adicionais confirmatórios como a Imunofluorescência Indireta e Western Blot.

Febre amarela

Diagnóstico sorológico

Existem vários testes empregados no diagnóstico sorológico de febre amarela, sendo os mais
frequentemente utilizados:

»» Reação imunoenzimática de captura de IgM (MAC - ELISA)

»» Inibição da Hemaglutinação (IH)

»» Teste de Neutralização (N)

»» Fixação de Complemento (FC)

»» O MAC-ELISA é um dos métodos mais úteis para o diagnóstico de infecção


recente e para diagnóstico dos casos onde existem reações cruzadas para flavivírus
nos outros testes. É uma prova simples e rápida, baseada na detecção de anticorpos
da classe IgM específicos de febre amarela. Pode fornecer um resultado presuntivo
utilizando apenas uma amostra de soro. Esta deve ser coletada a partir do 5º dia de

68
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II

doença, quando o organismo já começa a responder com a produção de anticorpos.


A duração dos anticorpos IgM é desconhecida e parece ser bastante variável. Em
pessoas vacinadas com a cepa 17D, os anticorpos IgM neutralizantes estão presentes
até 18 meses após a imunização.

Na infecção primária, anticorpos IgG específicos são encontrados regularmente e anticorpos IgM
são altamente específicos e usualmente presentes.

»» A Inibição da Hemaglutinação (IH) é um teste sensível, de fácil execução e


requer equipamentos simples, porém é a menos específica. É ideal para inquéritos
sorológicos, uma vez que os anticorpos IH persistem por um longo período de
tempo, talvez pela vida inteira e são usualmente detectados em casos de resposta
primária, a partir da primeira semana da doença. Em casos de resposta secundária,
altos títulos de anticorpos IH podem ser precocemente detectados (2 a 3 dias após
o início da febre). Às vezes, podem ocorrer reações cruzadas com outros flavivírus,
dificultando a interpretação. A IH não é boa para avaliar resposta à vacina e é
frequentemente negativa em pessoas que demonstram soro conversão pelo teste
de neutralização. A limitação deste teste deve-se à necessidade de coletar duas
amostras com intervalo de 15 dias. Considera-se positivo quando há soro conversão,
representada pelo aumento de pelo menos quatro vezes os títulos de anticorpos em
relação à primeira amostra.

»» O Teste de Neutralização é o mais específico. Detecta anticorpos neutralizantes


que aparecem tão precocemente quanto os anticorpos IH, durante a primeira
semana da doença e permanecem por muitos anos, provavelmente por toda a vida.
Os anticorpos neutralizantes são protetores e se caracterizam pela capacidade de
reduzir ou eliminar a infectividade do vírus. As técnicas usadas para detecção dos
anticorpos neutralizantes incluem a redução em placa em cultura celular e o teste
de proteção de camundongos. Atualmente, a redução em placa é a técnica padrão
para avaliar resposta à vacina antiamarílica.

»» A Fixação de Complemento é um teste mais específico que a IH. A presença


de anticorpos é indicativo de infecção recente. Os anticorpos detectados aparecem
durante a 5ª semana após o início dos sintomas e declinam rapidamente a baixos
níveis, 6 a 12 meses após a infecção. No entanto, em alguns estudos os anticorpos
podem persistir em títulos moderados ou elevados por períodos mais prolongados
(até 2 anos).

As provas sorológicas produzem resultados bem definidos quando realizados em um paciente


exposto pela primeira vez a um flavivírus. Os anticorpos específicos surgem nos primeiros dias,
alcançando níveis elevados em comparação aos anticorpos heterólogos. No entanto, quando
a pessoa foi exposta anteriormente a outro flavivírus, a reação é rápida e intensa em função da
memória imunológica prévia. Sendo assim, os anticorpos heterólogos são iguais ou mais elevados
que os específicos. Estas interpretações nos permitem entender a dificuldade no entendimento das
reações sorológicas em casos de exposição anterior a outros flavivírus.

69
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA

Definição de caso
Caso suspeito

Paciente com quadro febril agudo (há menos de 7 dias), de início súbito,
acompanhado de icterícia e que apresente pelo menos um dos seguintes achados
clínicos e/ou laboratoriais ou paciente com quadro (há menos de 7 dias), de início
súbito, procedente de área endêmica para febre amarela silvestre e/ou de ocorrência
de casos de febre amarela:

»» sinal de Faget;

»» manifestações hemorrágicas (epistaxe, gengivorragia, hematúria,


hematêmese e melena);

»» dor abdominal alta;

»» albuminúria;

»» oligúria.

Caso confirmado por critério clínico-laboratorial

Todo caso suspeito que tenha pelo menos uma das seguintes condições:

»» detecção de anticorpos do tipo IgM pela técnica de MAC ELISA;

»» isolamento do vírus amarílico;

»» laudo histopatológico compatível, com vínculo epidemiológico


(procedência de área endêmica e/ou de transição para febre amarela
silvestre);

»» detecção do genoma viral;

»» demonstração de um aumento de 4 vezes ou mais nos títulos de


anticorpos IgG através da técnica de IH.

Caso confirmado por critério clínico-epidemiológico

É o caso suspeito de febre amarela que evoluiu para óbito em menos de 10 dias,
sem confirmação laboratorial, no curso de surto ou epidemia em que outros casos já
tenham sido comprovados laboratorialmente.

Caso descartado

Caso suspeito com diagnóstico laboratorial negativo, desde que se comprove que
as amostras foram coletadas e transportadas adequadamente, ou caso suspeito com
diagnóstico laboratorial de outra doença.

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IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II

Leptospirose
A leptospirose humana é considerada uma antropozoonose (em que a participação humana no ciclo
do parasito é apenas acidental) de distribuição mundial, com maior incidência em áreas pobres ou
regiões afetadas por catástrofes naturais.

As leptospiras são mantidas em animais vertebrados e invertebrados que se tornam portadores e


excretam a bactéria na urina. O contato da pele ou da mucosa íntegra ou lesada com a bactéria viável
inicia a infecção. No meio urbano, os ratos são o principal foco de disseminação da leptospirose para
o homem, por contato com esgotos contendo urina de ratos. A mordedura de ratos também pode
transmitir a infecção.

Os sintomas da leptospirose humana são pleomórficos, muitas vezes brandos, parecendo uma gripe.
A Leptospira produz toxinas e enzimas responsáveis pelos quadros mais graves, depois à icterícia.
Dores musculares geralmente estão presentes.

O diagnóstico tem importância para que a terapêutica antimicrobiana seja instituída, reduzindo a
morbidade e a letalidade da doença.

Os critérios laboratoriais preconizados de diagnostico indicativo são:

1. Isolamento da Leptospira (de sangue, urina ou liquido cefalorraquiano) em


cultivo; ou

2. Aumento de duas a quatro vezes do titulo de anticorpos aglutinantes observado em


amostras coletadas na fase aguda (inicio dos sintomas) e convalescença (duas a três
semanas depois)

Além de requererem laboratório especializado para cultivo e manutenção de cepas de leptospiras,


são desvantagens desses critérios:

1. O isolamento microbiológico é muito demorado;

2. A necessidade de segunda coleta de sangue e demora para confirmar o diagnostico.

A pesquisa de anticorpos específicos utilizando testes mais sensíveis pode contornar essas
dificuldades. Vale lembrar que o período curto de incubação da infecção aos sintomas mantém a
maioria dos pacientes na janela imunológica por até uma semana já apresentando sintomas. Testes
de detecção de anticorpos IgM por ELISA ajudam a reduzir esse período de janela.

Malária

Diagnóstico laboratorial da malária

O diagnóstico da malária é realizado por meio da identificação do parasita no sangue do paciente


principalmente pelo método de gota espessa ou esfregaço com coloração de Giemsa.

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UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA

Entre as metodologias para a detecção de anticorpos consideradas válidas na rotina laboratorial


estão os métodos de ELISA e de Imunofluorescência Indireta.

Raiva

Diagnóstico laboratorial da raiva

De acordo com dados clínicos e epidemiológicos, a suspeita da doença se instala e, assim, faz-se
necessária a confirmação laboratorial.

As principais metodologias utilizadas para a identificação de antígenos ou anticorpos específicos da


doença são as Imunofluorescências Direta e Indireta das amostras de saliva, sangue e impressão da
córnea (extremamente doloroso para o paciente).

No caso da raiva, por ser uma doença de período de incubação curto, ou seja, apresenta um intervalo
de tempo curto entre a infecção e o aparecimento da doença, também é realizado o diagnóstico pós-
morte através da análise de fragmentos do cérebro pela técnica de Imunofluorescência Direta.

Hepatites A-E
No Brasil, as hepatites virais mais comuns são as causadas pelos vírus A, B, C e D. Existe, ainda, o
vírus E, contudo é mais frequente na África e na Ásia. Milhões de pessoas no Brasil são portadoras
dos vírus B ou C e não sabem, portanto, correm o risco de as doenças evoluírem (tornarem-se
crônicas) e causarem danos mais graves ao fígado como cirrose e câncer. Por isso, é importante ir ao
médico regularmente e fazer os exames de rotina que detectam a hepatite.

A progressão das hepatites varia conforme o tipo de vírus. Os vírus A e E apresentam apenas formas
agudas de hepatite (não possuindo potencial para formas crônicas). Isso nos leva a apontar que,
após uma hepatite A ou E, o indivíduo pode recuperar-se completamente, eliminando o vírus de
seu organismo. Já as hepatites causadas pelos vírus B, C e D podem apresentar formas agudas e
crônicas de infecção, que é o quadro de a doença persistir no organismo por mais de seis meses.

Hepatite A

Diagnóstico laboratorial

Exames:

»» Anti-HAV IgM (Anticorpos IgM contra o Vírus da Hepatite A)

»» Anti-HAV IgG (Anticorpos IgG contra o Vírus da Hepatite A)

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IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II

Hepatite A Resultados 
Condição Anti-HAV IgM Anti HAV IgG
Aguda + - ou +
Imunidade - +
Obs: (-) = Não reagente (+) = Reagente  

Hepatite B

Diagnóstico laboratorial

Exames:

»» Anti-HBcT (Anticorpos Totais contra o corion do vírus da Hepatite B)

»» Anti-HBcM (Anticorpos IgM contra o corion do vírus da Hepatite B)

»» Anti-HBcG (Anticorpos IgG contra o corion do vírus da Hepatite B)

»» HBsAg (Antígeno de superfície do vírus da Hepatite B)

»» Anti-HBs (Anticorpo contra o Antígeno de superfície do vírus da Hepatite B)

»» HBeAg (Antígeno “e” do vírus da Hepatite B)

»» Anti-HBe (Anticorpo contra o Antígeno “e” do vírus da Hepatite B)

»» HBV DNA (DNA do Vírus da Hepatite B)

Hepatite B Resultados
Condição Anti-HBcT Anti-HBcM Anti-HBcG HBsAg Anti-HBs  HBeAg Anti-HBe HBV DNA
Incubação - - - + - + - +
Aguda + + - ou + + - + - +
Crônica + - + + - - ou + - - ou +
Portador + - + + - - + -
Recuperação + - + - + - + -
Imunização - - - - + - - -
Infecção pregressa + - + - + - - ou + -
Obs: (-)=Não reagente (+)=Reagente            

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UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA

Hepatite C

Diagnóstico laboratorial

Exames:

»» Anti-HCV (Anticorpos contra o vírus da Hepatite C)

»» HCV RNA (RNA do Vírus da Hepatite C)

Hepatite C Resultados 
Condição Anti-HCV HCV RNA
Aguda + +
Crônica + - ou +
Obs: (-) = Não reagente (+) = Reagente  

Hepatite D

Diagnóstico laboratorial

Exames:

»» Anti-HDV (Anticorpos contra o vírus da Hepatite D)

Hepatite D Resultados
Condição Anti-HDV
Ausência de Infecção -
Infecção +
Obs: (-) = Não reagente (+) = Reagente

Hepatite E

Diagnóstico Laboratorial

Exames:

»» Anti-HEV IgM (Anticorpos IgM contra o Vírus da Hepatite E)

»» Anti-HEV IgG (Anticorpos IgG contra o Vírus da Hepatite E)

Hepatite E Resultados 
Condição Anti-HEV IgM Anti HEV IgG
Aguda + - ou +
Imunidade - +
Obs: (-) = Não reagente (+) = Reagente

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IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II

Sífilis

Diagnóstico laboratorial

Devido à ausência de manifestações clínicas evidentes, ou mesmo quando presentes, mas


proteiformes (muda de forma com frequência), o diagnóstico da sífilis baseia-se na evidenciação do
Treponema pallidum nas lesões, quando cancro primário, ou mais frequentemente, na detecção de
anticorpos produzidos após a infecção.

Pesquisa de Treponema

Existem alguns meios de pesquisar o treponema tanto para casos de sífilis congênita como em
situações recentes e tardias da doença.

Pesquisa em campo escuro

Faz-se a coleta adequada, retirando-se a camada de material que recobre a lesão com cuidado para
que não sangre e, em seguida, coloca-se uma lâmina em contato com a superfície de ulceração para
coletar a gota de exsudato (líquido com alto teor de proteína resultante de processo inflamatório)
que aí se forma. Então, a lâmina é observada por microscopia logo após a coleta do material.

À observação direta, a fresco, o Treponema pallidum é delgado, com 6 a 8 espiras regulares,


movimentando-se continuamente para frente e para trás por rotação contínua.

Pesquisa após a coloração

Seco e fixado ao calor brando, o material pode ser corado pela prata. Para material de lesões mucosas
da boca é preferível uma coloração por imunofluorescência, pois podem existir neste material
treponemas que não são patogênicos, mas que possuem uma morfologia semelhante àqueles que
provocam a doença.

(imunofluorescência) (fluorescência)

Pela técnica direta, a lâmina é incubada com anticorpo conjugado à fluorescência e específico para
T. pallidum. Na falta deste anticorpo, pode-se proceder à técnica indireta utilizando-se um soro
reagente bem concentrado de um paciente com sífilis. Este soro reagente servirá para provocar,
mais tarde, uma reação no material que se deseja analisar, sendo o resultado dessa reação uma
confirmação ou não da presença do treponema.

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UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA

A coloração por imunofluorescência, ou por técnica imuno-histoquímica com anticorpo marcado


por enzima, também pode evidenciar o treponema em cortes de tecidos.

Pesquisa de DNA e teste de infectividade em coelhos

A partir do soro ou do líquido cefalorraquidiano (LCR), o T. pallidum pode ser isolado por inoculação
em testículo de coelho. Além disso, ele pode ser evidenciado através da identificação de seu segmento
de DNA em tecidos, soros ou líquido cefalorraquidiano.

Testes sorológicos
São divididos em dois tipos, de acordo com os reagentes antigênicos empregados: testes de
cardiolipina e testes treponêmicos.

a. Testes de cardiolipina

Utilizam como antígeno o fosfolipídeo cardiolipina, princípio ativo dos extratos de


coração de boi, para a pesquisa das reaginas, anticorpos que em infecções por sífilis
atingem altos níveis no organismo. Apesar de possuir especificidade limitada, a
cardiolipina é bastante utilizada na sorologia da sífilis, pois os testes lipídicos possuem
alta sensibilidade, resposta rápida, custo reduzido e simplicidade de execução.

Estes testes consistem basicamente em suspensões de cristais de colesterol, em


meio aquoso contendo lecitina, que são aglutinados em presença de soro reagente.
De alta sensibilidade, mas sujeitos a resultados falso-positivos, assim como a
resultados falso-negativos especialmente na sífilis tardia, os testes de cardiolipina
devem ter seus resultados confirmados pelos testes treponêmicos.

Obs.: Para maior entendimento dos testes de cardiolipina, veja o tópico avançado
sobre testes sorológicos na página inicial ou clique em sorologia.

b. Testes treponêmicos

Os testes sorológicos são realizados com Treponema pallidum ou com seus


antígenos, obtido a partir de testículos de coelhos infectados.

Toxoplasmose

Diagnóstico laboratorial

Classicamente, tem-se baseado na pesquisa de anticorpos contra o parasito (IgG, IgM, IgA, IgE )

I. Pesquisa do parasito ou de seus componentes

1. Isolamento do Toxoplasma

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IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II

Os materiais suspeitos são semeados em culturas de células, como fibroblastos


humanos. O desenvolvimento dos toxoplasmas no interior das células pode ser
evidenciado com facilidade por imunofluorescência em prazos curtos.

2. Pesquisa de antígenos

3. Reação em cadeia da polimerase (PCR)

O toxoplasma pode ser identificado pela detecção de segmentos caraterísticos de


seus ácidos nucleicos, depois de ampliados pela reação em cadeia da polimerase
(PCR).

Dispendioso e exigido controles rigorosos para evitar resultados falsos, este vem
se tornando mais prático, atualmente podendo ser completados em menos de
48 horas.

A pesquisa pode ser realizada no líquido amniótico ou no sangue de cordocentese


de recém-nascidos, em sangue venoso, em material de biópsia cerebral ou no
líquido cefalorraquiano, em material de lavagem brônquio-alveolar.

II. Testes sorológicos

1. Teste imunoenzimáticos - ELISA

Extratos ou frações antigênicas do toxoplasma fixados sobre suportes inertes,


como cavidades de placas ou microesferas, são incubados com diluições dos
soros a serem testados e, em seguida, com conjugado enzimático antiglobulina.
Em seguida é feita a incubação com produto capaz de, sob a ação da enzima,
desenvolver cor (ou fluorescência) cuja intensidade é diretamente proporcional
a quantidade de anticorpos antitoxoplasma no soro.

2. Testes de ELISA de captura

Usados para eliminar os resultados falsos por interferência de fatores reumatoides


e fator antinuclear (FAN).

3. Testes de hemaglutinação

Outros testes: a reatividade de anticorpos para diferentes componentes


antigênicos do Toxoplasma pode ser evidenciada pelos testes de IMMUNOBLOT.

Perfis e marcadores sorológicos


O aparecimento de anticorpos para o Toxoplasma, assinalado pela soroconversão dos testes
sorológicos, de negativos para positivos, traduz a resposta humoral à infecção recém-adquirida.

Na vigência da parasitemia, observada nas primeiras semanas da primo-infecção, surgem anticorpos


específicos representados por isotipos IgM, IgA, IgG e IgE. Numa primeira fase (perfil I – fase

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UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA

aguda) observa-se a presença de IgM, IgG de baixa avidez, IgA e IgE. Posteriormente, evidencia-se o
declínio da IgM, a IgA e da IgE e o aparecimento da IgG de alta avidez (perfil II – fase intermediária).
A terceira fase, caracteriza-se pela presença de IgG de alta avidez em concentração constante (perfil
III – fase crônica).

Dengue

Diagnóstico laboratorial

Os métodos de diagnostico laboratorial empregados hoje em dia para diagnóstico de dengue são
o isolamento viral em culturas celulares (C6/36), o MAC-ELISA, o ELISA de inibição e a inibição
da hemaglutinação. Seja qual for o método, o isolamento viral deverá ser feito até o quinto dia de
doença e a sorologia após este período, sempre com acompanhamento dos órgãos de Saúde.

Tuberculose
É uma doença bacteriana, causada pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis que, ao se instalar
no organismo (por meio da inalação de gotículas de saliva expelidas pela tosse ou espirro de um
indivíduo com a doença), aloja-se nos alvéolos pulmonares iniciando sua multiplicação no interior
dos macrófagos alveolares, que são as células com função fagocítica.

A doença é caracterizada pelo desenvolvimento de granulomas (formação celular envolvendo a


bactéria) e lesões teciduais graves, normalmente nos pulmões (cerca de 85% dos casos), embora a
doença possa se desenvolver em outros órgãos, como rins, ossos e meninges, dentre outros.

Diagnóstico clínico e laboratorial

O diagnóstico da tuberculose é inicialmente feito com a pesquisa dos bacilos álcool-ácido-resistentes


(BAAR) em materiais biológicos (principalmente o escarro). Como esse teste de BAAR não é
suficiente, pois outras bactérias podem dar o mesmo resultado, configurando um falso positivo,
temos que recorrer à cultura celular permite definir o agente etiológico.

Métodos sorológicos
Em geral apresentam problema de baixa sensibilidade e especificidade. Pessoas não infectadas que
foram vacinadas ou que já ficaram doentes, uma vez podem ser confundidas com aquelas realmente
infectadas pela presença de anticorpos no seu sangue.

O método ELISA tem-se mostrado promissor para o diagnóstico da tuberculose em líquidos


cefalorraquidianos e secreções, com altos índices de sensibilidade e especificidade, porém, ainda não
é o método mais utilizado por ser um dos mais novos. Cabe lembrar também que se devem levar em
consideração as informações sobre a população estudada, como incidência da doença, vacinação etc.

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IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II

Avanços no diagnóstico
Não vimos alterações significantes nas últimas décadas no que tange ao diagnóstico exclusivo
da tuberculose, já que os sintomas e os exames clássicos eram suficientes para o tratamento dos
pacientes. Contudo, surgiu a necessidade de técnicas mais avançadas com o crescimento da
associação HIV-tuberculose, e a tuberculose multi-resistente (TBMR). Isto se deve por encontrar
em pacientes portadores do HIV espécies outras de Mycobacterium sp como aquelas do complexo
Mycobacterium avium que também podem ser responsáveis pela manifestação da doença. O uso
de técnicas como o PCR permite que sequências de DNA presentes em poucas cópias possam ser
amplificadas in vitro e quantidades amplificadas de material genético possam ser visualizadas e
identificadas.

Doenças associadas ao ASLO (Anticorpo


antiestreptolisina O)
A bactéria mais importante deste grupo é o Streptococcus pyogenes. Estas bactérias estreptococos
beta hemolítico do grupo A são responsáveis pelo aparecimento de diversas doenças como amigdalite,
escarlatina (infecção de garganta associada a uma erupção de pele), septicemia (infecções do
sangue), erisipela (infecção do tecido abaixo da pele, geralmente nas pernas), febre reumática e
glomerunefrite (inflamação renal) aguda; podendo inclusive levar ao óbito em aproximadamente
um mês.

A presença de estreptolisina é característica neste grupo de bactérias. A estreptolisina contém


hemolisinas capazes de causar hemólise total, ou seja, promover ruptura total dos eritrócitos do
hospedeiro.

Tal fenômeno ocorre através da interação destas hemolisinas com seus anticorpos, ou seja,
anticorpos antiestreptolisina O (ASLO) presentes no organismo do hospedeiro, no caso, no homem.

A elevação de anticorpos antiestreptolisina séricos, na faixa de 166 UI/mL a 200 Ul/mL, é indicador
de um contato prévio com a bactéria estreptococo beta hemolítico do grupo A, atingindo os seus
valores máximos entre quatro a seis semanas. Embora na tuberculose o ASLO também possa se
elevar, neste caso, não está associado à bactéria estreptococo beta hemolítico do grupo A.

Para um correto diagnóstico o ASLO deve ser dosado logo após o jejum de oito horas e a sua detecção
se faz indiretamente por meio de provas que mostram a elevação de anticorpos contra a enzima
estreptolisina O.

A amostra sérica do ASLO é diluída em uma preparação comercial de estreptolisina O e incubada.


É adicionada hemácias de coelho ou humanas e, após isso, o tubo é reincubado e examinado
visualmente.

A dosagem deste anticorpo pode ser realizada por nefelometria cujo principio está baseado na leitura
da intensidade da luz dispersa (espalhada) pela amostra em ângulo de 90° usando como referência
a direção da luz incidente. Em suma, em reações de precipitação entre antígeno e anticorpo em

79
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA

soluções diluídas verificamos aumento da reflexão da luz, que pode ser medida de forma direta pela
dispersão da luz incidente.

A quantidade e a natureza da dispersão dependem tanto da forma como tamanho das partículas, e
mais ainda da concentração, comprimento de onda da luz e do índice de refração do meio.

As substâncias são medidas pela adição de quantidades constantes de anticorpos puros e opticamente
claros a concentrações crescentes da substância em análise. O feixe de luz incide sobre os complexos
formados na solução do tubo ou cubeta e a intensidade de luz dispersada é medida por uma célula
fotométrica como densidade óptica.

Podemos apontar vantagens da nefelometria como:

a. é totalmente automatizada;

b. de fácil realização, rápida e precisa;

c. tem a capacidade de utilizar pequenos volumes de amostra;

d. tem uma sensibilidade adequada para a medida de proteínas de significado clínico.

No entanto, como esta técnica tem sido realizada hoje em dia, mais manualmente, a dosagem do
ASLO tem sido realizada também por ELISA, turbidimetria, neutralização da toxina entre outros.

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Para (não) Finalizar

O estudo da disciplina Imunohematologia e Imunologia Clínica apresentado neste caderno é


de grande importância não só para o aluno, mas também  para os professores que estiveram
empenhados neste trabalho. A elaboração de conteúdos que estimulem a busca de conhecimento
que invariavelmente se tornarão aplicados na rotina daqueles que trabalham na área de saúde são
cruciais no modelo educacional. Neste momento de formação, a capacidade autônoma é de grande
relevância, considerando as habilidades crítica e criativa, desenvolvidas durante este  período
de aprendizado. O fator que se torna mais motivante neste processo é saber que este caderno
dá subsídios para uma busca mais aprofundada de informações, atualização de conhecimento e
principalmente o compartilhar desse universo todo da ciência que tanto amamos. 

O entendimento dos sistemas sanguíneos apresentados neste caderno (ABO e Rh) é importante por
serem os mais conhecidos na prática de transfusão de sangue. Sendo assim, bancos de sangue, que
lidam rotineiramente com estes processos, necessitam de profissionais habilitados e conhecedores
da prática e, sobretudo, do fundamento teórico embutido nas análises. Lembramos que existe uma
infinidade de outros sistemas sanguíneos, cada qual com sua importância, o que nos leva a motivá-
lo a não estreitar seu centro de conhecimento do assunto. Da mesma forma, entender as implicações
de doenças associadas a reconhecimento de antígenos como a DHRN é importante na análise e
orientação de gestações de risco e se constitui uma ferramenta poderosa, que pode ajudar nos
exames de rotina laboratorial, bem como na correlação com outros exames laboratoriais. 

O conhecimento da Imunologia Clínica no que tange à relação antígeno-anticorpo se torna essencial


na rotina das Análises Clínicas, principalmente pelo considerável tipo de ensaios propostos e sua cada
vez mais rápida precisão tecnológica de equipamentos e reagentes. Esse fato no permite aumentar
a investigação de doenças consideradas graves, sejam de cunho agudo sejam de cunho crônico,
que afetam a população que depende de eficiente diagnostico laboratorial para um tratamento
preventivo e até mesmo curativo.

Portanto, fica claro o objetivo deste caderno de estudos no sentido de aprimorar e consolidar os
conhecimentos em Imunohematologia e Imunologia Clínica e auxiliar também nas boas práticas de
rotina laboratorial.

81
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