Guia prático de bioquímica

Bioquímica Fisiológica I
Unidade Curricular Obrigatória
1º Ano – 1º Semestre
Ano Letivo 2018/2019

Madalena Salema Oom

Carlos Monteiro
BIOQUÍMICA

ÍNDICE

REGRAS GERAIS DE TRABALHO NO LABORATÓRIO ................................................................ 1

AS UNIDADES BASE DO SISTEMA INTERNACIONAL (SI) ......................................................... 2
AS UNIDADES MAIS COMUNS EM BIOQUÍMICA .......................................................................... 3
AS MEDIÇÕES EXPERIMENTAIS ...................................................................................................... 4
DILUIÇÕES ............................................................................................................................................. 5
UTILIZAÇÃO DAS MICROPIPETAS “PIPETMAN P” .................................................................... 6
ESPECTROFOTOMETRIA ................................................................................................................... 8
PROCESSOS DE SEPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS ........................................... 11
EQUILÍBRIO ÁCIDO-BASE E PROPRIEDADES IÓNICAS DOS AMINOÁCIDOS .................. 16
CARGA, PROPRIEDADES DAS PROTEÍNAS ............................................................................... 19
ESTRUTURA DOS GLÚCIDOS ......................................................................................................... 21
ESTRUTURA DOS LÍPIDOS ............................................................................................................. 23
ENZIMAS .............................................................................................................................................. 25
METABOLISMO CELULAR ................................................. ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.

BIOQUÍMICA TÉCNICAS BASE EM BIOQUÍMICA

REGRAS GERAIS DE TRABALHO NO LABORATÓRIO

Os alunos devem assumir uma postura e um comportamento adequado ao bom

funcionamento das aulas práticas cumprindo, escrupulosamente, as normas de
segurança e de arrumação do laboratório.

1. REGRAS GERAIS DE SEGURANÇA

• Usar sempre bata para proteção que não deverá ser usada fora do
laboratório.
• Não comer ou beber ou fumar no laboratório.
• Lavar as mãos, com sabão antes de entrar e depois de sair do laboratório.
• Deve ter o cuidado de manter as mãos longe da boca, nariz, olhos e rosto.
• Nunca pipetar com a boca.
• Usar luvas quando recomendado ou obrigatório dependendo do trabalho.
• Sinalizar qualquer acidente, soluções derramadas ou outro acontecimento não
habitual ao docente presente no laboratório. Todos os derrames de líquidos
devem ser limpos imediatamente. Os derrames de ácido podem ser
neutralizados com carbonato de sódio e as bases com ácido bórico.
• Experiências não autorizadas são estritamente proibidas. Por questões de
segurança, experiências adicionais diferentes daquelas descritas, só devem
ser efetuadas com a aprovação do docente.

2. ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO
• Colocar na bancada de trabalho apenas o material necessário. Os casacos,
carteiras, pastas, livros etc. devem ser colocados em local próprio e nunca em
cima da bancada ou dos equipamentos.
• Verificar, antes de iniciar a execução do trabalho, se tem em cima da bancada
todo o material que irá necessitar.
• No final da aula deixar a bancada arrumada e limpa.
Colocar o material de vidro, em posição vertical, nos alguidares de plástico
depois de passados por água.
Colocar o material descartável contaminado nos caixotes próprios.

3. APARELHOS
• Manusear com cuidado para não danificar. Especial cuidado deve ser tido com
as balanças e aparelhos de pH.
• Cuidado com o manuseamento das micropipetas. Ler atempadamente as
regras de utilização das micropipetas. Qualquer dúvida deverá ser esclarecida
com o docente.
• Seguir as instruções do aparelho e as recomendações do docente responsável.
• Não usar os aparelhos para fins que não sejam os estritamente relacionados
com a execução do trabalho prático em causa.
• No caso de detetar alguma anomalia ou mal funcionamento nos equipamentos,
deve informar o docente de imediato.

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BIOQUÍMICA TÉCNICAS BASE EM BIOQUÍMICA

CADERNO DE LABORATÓRIO
• É obrigatório ter um caderno de laboratório onde deve registar todos os dados
obtidos nas experiências, eventuais alterações feitas ao protocolo, cálculos
efetuados, gráficos, tabelas, resultados e as conclusões e interpretações a que
chegou.
• Nunca faça os seus registos em folhas soltas
• Registe os dados numéricos com o número de algarismos significativos
adequado à exatidão e precisão do sistema de medida.

AS UNIDADES BASE DO SISTEMA INTERNACIONAL (SI)

O Sistema Internacional de Unidades (SI) é um conjunto de definições,

utilizado em quase todo o mundo moderno, que visa uniformizar e facilitar as
medições.

Tabela 1 – Unidades base do SI

Propriedade Unidade Abreviatura
Comprimento metro m
Massa quilograma kg
Tempo segundo s
Quantidade de matéria mole mol
Temperatura Kelvin K
Corrente elétrica ampere A
Intensidade luminosa candela cd

MÚLTIPLOS E SUBMÚLTIPLOS DAS UNIDADES SI

As unidades base são muitas vezes inconvenientes para expressar

determinada medida. O SI adopta uma série de prefixos que associados às unidades
formam unidades maiores ou menores por uma potência de 10. Os nomes e símbolos
dos múltiplos e submúltiplos decimais para as unidades, abrangem a faixa 1024 a 10-
24
. Os prefixos do SI permitem escrever quantidades sem o uso da notação científica,
de maneira mais clara para quem trabalha em uma determinada faixa de valores. Os
prefixos são apresentados na tabela 2.

REGRAS PARA EMPREGO DOS PREFIXOS SI

- Os símbolos dos prefixos devem ser escritos em caracteres romanos verticais, sem
espaçamento entre o símbolo do prefixo e o símbolo da unidade.
- O conjunto formado pelo símbolo de um prefixo ligado ao símbolo de uma unidade
constitui um novo símbolo inseparável (símbolo de um múltiplo ou submúltiplo dessa
unidade) que pode ser elevado a uma potência positiva ou negativa e que pode ser
combinado com outros símbolos de unidades para formar os símbolos de unidades
compostas.
- Os símbolos não têm plural.
- Os prefixos compostos não devem ser formados pela justaposição de vários prefixos
- Somente o nome da unidade de medida aceita o plural e que ao escrever uma
unidade composta, não deve misturar o nome com o símbolo da unidade:

2
BIOQUÍMICA TÉCNICAS BASE EM BIOQUÍMICA

- O uso do prefixo k: a maioria dos enganos cometidos ao empregar os múltiplos e

submúltiplos decimais do SI referem-se ao uso de K (maiúsculo) no lugar de k
(minúsculo). No SI, K significa Kelvin e k significa 103.

Tabela 2 – prefixos mais comuns do SI. Os mais utilizados em bioquímica estão a

sombreado
Fator de
Prefixo Símbolo Equivalente decimal multiplicação
Notação científica
tera- T x 1 000 000 000 000 1012
giga- G x 1 000 000 000 109
mega- M x 1 000 000 106
quilo- k x 1 000 103
hecto- h x 100 102
deca- da x 10 101
deci- d x 0,1 10−1
centi- c x 0,01 10−2
mili- m x 0,001 10−3
micro- µ x 0,000 001 10−6
nano- n x 0,000 000 001 10−9
pico- p x 0,000 000 000 001 10−12
fento f x 0,000 000 000 000 001 10−15

UNIDADES DERIVADAS
As unidades derivadas resultam da combinação de unidades base, como é o
caso, por exemplo, da unidade de energia. Energia é uma quantidade que mede a
capacidade de realizar trabalho e tem como unidade derivada o kg.m2/s2 usualmente
conhecida como joule (J). Outro exemplo é o da concentração molar (mol/volume). O
volume tem também unidades derivadas (m3) mas também é aceite a unidade litro (l,
L).

AS UNIDADES MAIS COMUNS EM BIOQUÍMICA

Nº de moles = massa da molécula (g) / peso molecular da molécula

Concentração molar (molaridade, M) = Nº de moles / volume (l)

Concentração em massa (g/l) = massa da molécula (g) / volume (l)

Concentração em equivalente-grama (normalidade, N) = número de equivalentes-

gramas de soluto por litro de solução (eq/L)

Concentração em percentagem (%, p/v) = massa da molécula (g) / 100 ml de

volume

Concentração em ppm (1/106) = massa da molécula (mg) / massa do solvente (kg),

Usualmente para soluções aquosas (1 kg ≈ 1 L)

3
BIOQUÍMICA TÉCNICAS BASE EM BIOQUÍMICA

AS MEDIÇÕES EXPERIMENTAIS

ERROS
Todos os resultados de análises ou de medidas feitas em laboratório têm erros
associados mesmo assumindo que foram realizadas com o maior cuidado. Estes erros
são classificados como sistemáticos ou acidentais. Os erros sistemáticos são
causados por limitações do método, dos equipamentos ou mesmo do analista, podem
introduzir no resultado um viés, desvios ao valor real sempre no mesmo sentido, que
torna esse resultado menos exato. Um exemplo é a utilização de um pH ou tempo de
reação errado. Um resultado é exato quando o valor obtido na medição é igual ou
muito semelhante com o verdadeiro valor (erros sistemáticos pequenos ou
inexistentes). Os erros sistemáticos são geralmente difíceis de detectar. Por outro
lado, os erros acidentais são aleatórios, imprevisíveis e acontecem sempre que se
trabalha no laboratório. Aumentando a precaução com que são feitas as medidas e
usando os métodos e aparelhos corretamente e fazendo replicados é possível reduzir
ou eliminar os erros acidentais aumentando a precisão dos resultados. Um resultado
é preciso se as várias repetições apresentarem valores iguais ou muito
semelhantes, pouco dispersos (erros acidentais pequenos ou inexistentes). Os
ensaios de laboratório pretendem-se simultaneamente exatos, ou seja sem
enviesamentos, e precisos.

Os erros podem ser calculados, em valor absoluto (Ex) pela diferença entre o
valor e o valor exato, E! = 𝑥 − 𝑥!"#$% ou em valor relativo pelo quociente entre o erro
absoluto e o valor medido ou o real. O valor relativo é frequentemente expresso em
percentagem.

Na maior parte dos casos, para garantir maior precisão num resultado, isto é
obter o valor mais provável para esse resultado, são usadas medições repetidas
(replicados) e calculada a média aritmética, 𝑥 (valor mais provável) e o desvio padrão
da amostra (s). O desvio padrão é uma medida da dispersão, da flutuação dos valores
obtidos entre replicados, expresso nas mesmas unidades do resultado do ensaio. O
desvio padrão reflete a precisão do resultado que é frequentemente expresso como 𝑥
± dp (n= nº de replicados). O desvio padrão também pode ser expresso em
percentagem designando-se de desvio padrão percentual ou coeficiente de variação.

ALGARISMOS SIGNIFICATIVOS
Os ensaios de laboratório pretendem-se simultaneamente exatos, ou seja sem
enviesamentos, e precisos, contudo isso é praticamente impossível de conseguir
devido as limitações inerentes aos métodos e equipamentos. De facto, todas as
medições estão sujeitas a erros e é importante ter isso em consideração na
apresentação dos resultados. Para evitar falsas exatidões os resultados devem incluir
apenas os algarismos significativos que são os algarismos permitidos pela exatidão do

4
BIOQUÍMICA TÉCNICAS BASE EM BIOQUÍMICA

sistema de medida ou seja aqueles que são medidos com certeza e o último que é
estimado (arredondado).
A lembrar:
Os zeros à esquerda do número não são significativos
Os zeros no centro, ladeados por outros algarismos, são sempre significativos
Os zeros à direita são significativos quando é o número é decimal.
As conversões, baseadas em alteração do prefixo, não são considerados na
determinação dos algarismos significativos pois são números exatos (1kg=1000g)
Ao expressar números muito grandes ou muito pequenos utilize a notação
científica, pois é mais fácil de os escrever e de os compreender. Para isso fixe no
coeficiente o nº de algarismo significativos que pretende.

RECOMENDAÇÕES PARA EFETUAR CÁLCULOS

Arredonde os resultados para o nº de algarismo significativos que pretende
apenas após realizar os todos os cálculos intermédios.

Se os cálculos envolvem somas ou subtrações utilize no resultado apenas as

casas decimais significativas isto é o mesmo número de casas decimais que o do valor
com menor número destas. Arredonde o número antes de desprezar dígitos.

Se os cálculos envolvem multiplicações, divisões ou raiz quadrada, utilize

no resultado o mesmo número de algarismo significativos que o do valor com menor
número destes. Arredonde o número antes de desprezar dígitos.

DILUIÇÕES

Uma técnica muito utilizada em Bioquímica é a diluição de soluções a partir de

outras mais concentradas usualmente designadas de soluções stock. Para fazer uma
diluição deve saber antecipadamente qual a concentração final (Cf) e o volume (Vf)
dessa solução que pretende obter, e depois calcular qual o volume (Vi) que deve usar
de uma solução stock (Ci) usando a seguinte relação:

CiVi = CfVf

Esta relação indica que a quantidade da substância contida no volume que

é retirado da solução stock (nº de moles inicial) é igual a que se encontra na
solução final obtida (nº de moles final). O que varia é a concentração ou seja a
quantidade de solvente onde esta está dissolvida. Em alguns casos a concentração
inicial é muito superior à que pretendemos o que pode tornar os volumes a medir (Vi)
muito pequenos. Quando assim é, podem ser feitas diluições seriadas isto é, em vez
de fazer logo uma diluição com um fator de diluição (Cf/Ci) muito elevado fazem-se
duas ou mais diluições sucessivas com um fator de diluição menor.

5
BIOQUÍMICA TÉCNICAS BASE EM BIOQUÍMICA

UTILIZAÇÃO DAS MICROPIPETAS “PIPETMAN P”

INTRODUÇÃO
Em Bioquímica é muitas vezes necessário medir e transferir volumes muito
pequeno, inferiores a 1 ml, de forma precisa e reprodutível. As micropipetas são
instrumentos volumétricos concebidos para a medição e transferência de líquidos de
um modo preciso e seguro. Consoante o modelo, as micropipetas possibilitam a
medição e transferência de volumes desde 1 µl até 10 ml (Tabela 1). O volume
máximo (µl) para cada micropipeta encontra-se indicado no topo do êmbolo (A).
A

B
Fig. 1– Micropipetas “PIPTMAN P”. A- êmbolo; B- Regulador de Volume: C – Mostrador de
volumes.

Tabela 3: Gamas de volumes recomendadas para cada modelo de micropipeta

“pipetman P”*
Modelo Gama de volume (µl)
P2 0,1 - 2
P10 0,5 - 10
P20 2 - 20
P100 20 - 100
P200 50 - 200
P1000 200 - 1000
P5000 1000 - 5000
P10ml 1000 - 10000
* o volume mínimo recomendado pode variar entre marcas.

As micropipetas possuem um regulador de volume (B) que possibilita o seu

ajuste de uma forma contínua, dentro da gama de volume permitida.

Para que os trabalhos possam decorrer com a máxima segurança e sem

grandes riscos de contaminação cruzada entre amostras, cada micropipeta utiliza
pontas descartáveis de polipropileno.

MEDIÇÃO DE VOLUMES
O mostrador (C) contém três dígitos e a sua leitura efetua-se de cima para
baixo. Os três dígitos indicam o volume selecionado (µl) e podem ser pretos (inteiro)
ou vermelhos (decimais).

6
 rated is set using the vol- 1 0 1
eter. The dials are colored 2 7 2
5 5 5
OLUME
BIOQUÍMICA TÉCNICAS BASE EM BIOQUÍMICA

er black or red to indicate

1.25 µL 7.5 µL 12.5 µL
position ofExemplos:
the decimal
to be
nt, depending P2 on P10the P20 P100 P200 P1000
e vol-
del (see examples).
1 0 1 0 1 0
lored 2 7 2 7 2 7
5 5 5 5 5 5
dicate
volume is1.25 setµLby7.5turn- µL 12.5 µL 75 µL 125 µL 0.75 mL
cimal
the thumbwheel or the
nh-button.
the The
P100
MODO push-
P200 P1000
DE OPERAÇÃO P5000 P10ml
Coloque uma ponta na extremidade da micropipeta (amarelas para as P20 a
on makesP200, it 0easier 1 P1000 e 0brancas para P5000)
azuis paraand
1 0
e certifique-se que esta está bem
7 (sem entradas
segura 2 7
de ar). 2 7
cker to set5 volumes, 5 5 5 5
turn- when Encher
ecially
Nunca mergulhar
wearing
no líquido uma micropipeta sem a ponta colocada
75 µL 125 µL 0.75 mL 1.25 mL 7.5 mL
or
ves. theThe thumbwheel - Carregue no êmbolo (A) até sentir um travão.
- Segure verticalmente na micropipeta e mergulhe a ponta no líquido.
push-
be turned to slowly P5000 P10mllentamente, o êmbolo para aspirar a amostra.
- Liberte,reach
muito

r and setting.1 0 Push-button

required 2 7
mes, Esvaziar
5
- Coloque 5
a extremidade da ponta inclinadaThumbwheeel
e encostada à parede interior do
btain
aringmaximum 1.25 accuracy
recipiente.
mL 7.5
- Carregue no mL
êmbolo até sentir travar, se necessário continue a carregar no
n setting themesmo
wheel volume,
botão forçando o travão, para expelir o resto do líquido.
- Mantendo o êmbolo pressionado remova a micropipeta do recipiente.
ceed
y reach as follows:- Ejete a ponta.
Push-button
hen decreasing
RECOMENDAÇÕESthe
olume setting, slowly
Thumbwheeel
As micropipetas são equipamento sensível e dispendioso por isso tenha sempre o

ecuracy
máximo de cuidado no seu manuseamento e efetue todas as operações lentamente.
a c h t h e • rNunca e q uforce
i r eosdvolumes das micropipetas para além dos limites
lume, makingrecomendados;
etting, sure not
• A ponta da micropipeta deve ser mergulhada no líquido com a altura mínima
o overshoot thepossível mark. para garantir que o enchimento se efetue de forma constante,
ghen theincreasing
contínua e sem a entrada de bolhas de ar;
the volume
• As micropipetas devem ser setting,
manuseadas na pass
vertical; the
lowly
quired value• by
• Mude de ponta
1/3nunca
sempre
of deve
a turn
que pipetar
and
um líquido diferente;
O líquido entrar no corpo then
da pipeta!slowly
Para o evitar deve ter sempre
u i r e d to reach
ecrease the volume, making sure not
em conta os seguintes pontos:
- As operações devem ser efectuadas lentamente.
oreovershoot
not the-- Nunca
mark. vire a pipeta ao contrário.

ark. Nunca coloque a pipeta de lado quando tiver líquido na ponta.

- Use sempre filtros nas micropipetas P5000 e P10ml

he volume Model setting, pass Color of the volumeter numbers

/3 of a turn and then slowly Black Red Increment 7
BIOQUÍMICA TÉCNICAS BASE EM BIOQUÍMICA

ESPECTROFOTOMETRIA

Quando um feixe de luz é transmitido através de uma solução contendo um

composto absorvente, o feixe perde alguma intensidade devido à absorção de luz feita
pela solução. Muitos compostos biológicos absorvem seletivamente luz UV ou visível
tornando a espectrofotometria de absorção uma técnica muito útil em Bioquímica,
utilizada rotineiramente tanto em análises clínicas como em investigação. A medição
da luz absorvida com um espectrofotómetro permite a identificação ou a quantificação
de compostos específicos em solução. O espectro de absorção de um dado composto
é obtido fazendo incidir na amostra um feixe de radiação electromagnética e detetando
as bandas correspondentes aos comprimentos de onda absorvidos.

O ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO
O espectro electromagnético resultado da dispersão, por um prisma ou uma
rede de difração, de qualquer radiação composta nas suas radiações simples e inclui
todos os comprimentos de onda da radiação electromagnética que vão desde as
ondas rádio aos raios gama. A radiação com comprimentos de onda entre 200-400 nm
é referida como radiação ultra-violeta (UV) e a de 400-700 nm como radiação visível –
esta é aquela onde se encontram todas as cores visíveis ao olho humano.

A radiação electromagnética a um dado comprimento de onda tem associado

uma frequência e um valor de energia relacionados pelas equações seguintes onde c
é a velocidade da luz (3×108 m/s) e h = 6.65 × 10-34 J·s é a constante de Planck:

λ=c/ν e E=hν

ABSORÇÃO DE LUZ
As moléculas e os átomos podem existir em diversos níveis energéticos mas
posicionam-se essencialmente no estado fundamental (nível de energia mais baixa).
Podem passar os seus eletrões para um estado energético mais elevado, absorvendo
energia da radiação (espectro de absorção) e libertar energia como calor ou luz quando
esses eletrões retornam ao estado fundamental (espectro de emissão). A diferença de
energia entre os dois estados energéticos determina o comprimento de onda a que esse
composto vai absorver. A energia contida na radiação electromagnética é diretamente
proporcional à frequência dessa radiação, e por isso, a energia necessária para alterar um
estado energético de uma molécula corresponde a uma frequência (ou comprimento de
onda) específica da radiação.
A intensidade de luz absorvida por uma solução pode ser caracterizada pela
transmitância (T) em percentagem,
T= I/I0,
ou usualmente pela absorvância (A),
A=- Log T
A= Log I0/I
Onde I0 é a intensidade da luz incidente
I é a intensidade da luz transmitida

Se uma solução não contêm nenhum composto capaz de absorver a luz incidente
então a transmitância é de 100% e, se toda a luz for absorvida na solução T=0%.

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BIOQUÍMICA TÉCNICAS BASE EM BIOQUÍMICA

Para um dado composto, sujeito a radiação paralela e de comprimento de onda

e intensidade constante (fig.2), a absorção depende linearmente i) da concentração do
composto que absorve e ii) da espessura da camada absorvente (distância
atravessada pela radiação na amostra) conforme expresso na lei de lambert-Beer:

A = ε .c .b
λ

ε = absortividade molar (coeficiente de extinção molar) para o comprimento de

λ

onda da radiação incidente, em L.mol-1cm-1,

b = comprimento do percurso ótico, i.e. o comprimento da cuvete contendo a
solução, em cm,
c = concentração da espécie absorvente, em mol.L-1

Fig. 2 – Principais componentes do espectrofotómetro.

A equação de Lambert-Beer permite relacionar a absorvância de uma solução

com a concentração do soluto nessa solução, sabendo o percurso ótico e a
absortividade molar. Esta é específica e constante para a absorção do soluto em
condições determinadas (T, pH, força iónica…).
O procedimento habitual para aplicação da lei de Lambert-Beer é a utilização
de uma curva de calibração A=f(c), a partir da qual, por interpolação, na região linear,
é determinada a concentração da amostra. Este procedimento é importante pois a lei
de Lambert-Beer tem limitações e em muitos casos a linearidade não se mantém para
soluções concentradas. De facto, se houver alteração nas condições que façam variar
o valor da absortividade molar, como a interação entre as partículas em solução
concentradas ou compostos envolvidos em reações de equilíbrio, podem surgir
desvios positivos ou negativos à lei, conforme está ilustrado na Fig. 3. Para estes
desvios também pode contribuir o facto de que radiação incidente não contem um só
comprimento de onda (como assume a lei de Lambert-Beer) por limitação dos
equipamentos. Para limitar o efeito destas interferências assim como para aumentar a
sensibilidade da análise, a absorvância é normalmente medida no topo do pico de
absorção.

Fig. 3 – Curvas de calibração mostrando possíveis desvios à curva de calibração ideal.

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BIOQUÍMICA TÉCNICAS BASE EM BIOQUÍMICA

O ESPECTROFOTÓMETRO
O espectrofotómetro é um fotómetro – aparelho que mede a intensidade da luz
– que pode medir a intensidade da luz em função do comprimento de onda. Este
aparelho é constituído por (Fig. 2): Uma lâmpada como fonte de radiação, um
monocromador (selecionador de comprimentos de onda), um suporte para a cuvete
com a amostra, um detetor de radiação e um sistema de leitura.

ANÁLISE QUANTITATIVA DE PROTEÍNAS POR ESPECTROFOTOMETRIA

As proteínas tem determinadas propriedades físico-químicas que são usadas
frequentemente para a sua quantificação. O espectro de absorção de luz ultravioleta
da maior parte das proteínas é semelhante ao da fig. 4A. Os aminoácidos aromáticos
Fen, Tir, Trp são os que contribuem para a absorção ao comprimento de onda 280 nm
(Fid.4B). Os grupos prostéticos em proteínas conjugadas absorvem em comprimentos
de onda característicos, como o hemo na hemoglobina que absorve a 415 nm,
tornando-a uma proteína corada.

B
A Ligações)pep+dicas)

Aminoácidos)aromá4cos)

Fig. 4- Espectros de absorção de luz UV de A) Albumina de soro de bovino e B) aminoácidos

aromáticos.

Para além destas propriedades inerentes podem também ser adicionados às proteínas
compostos que reagem seletivamente formando complexos que absorvem luz em
comprimentos de onda característicos: i) péptidos com mais de duas ligações
peptídicas, reagem com o sulfato de cobre (II) em meio alcalino formando um
complexo de cor azul violeta (teste do biureto), ii) os grupos fenol da Tir e índole do
Trp, reagem com agentes oxidantes do reagente de Folin-Ciocalteau produzindo cor
azul, iii) os resíduos básicos e as regiões hidrofóbicas ligam o corante azul brilhante de
Coomassie (teste de Bradford), iv) os grupos amina primários dos resíduos Lis e Arg,
assim como o do N-terminal, reagem com a fluorescamina formando um produto
fluorescente. Cada um destes testes tem vantagens e desvantagens e deve ser
escolhido em função das proteínas a quantificar, da quantidade presente e dos
contaminantes (tampões, ácidos nucleicos, açúcares...).

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BIOQUÍMICA TÉCNICAS BASE EM BIOQUÍMICA

PROCESSOS DE SEPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS

As proteínas presentes nos seres vivos necessitam de ser separadas dos restante
componentes biológicos e purificadas para serem estudada ou utilizadas. O material
de partida pode ser um tecido fresco ou um sedimento de células ou microrganismos.
Os tecidos são normalmente homogeneizados mecanicamente e posteriormente
sujeitos a uma centrifugação de forma remover os fragmentos celulares e outras
impurezas seguindo-se diversas ultracentrifugações conforme a fração celular
pretendida até obtermos o material de partida para a separação (ex. enzima, proteína).
Este processo designa-se de fraccionamento celular.
A separação de uma proteína de outras proteínas ou moléculas é normalmente
realizada pela aplicação de uma combinação de métodos que se baseiam em
propriedades, da proteína em causa, como sejam a solubilidade, a dimensão
molecular, a carga molecular e a ligação específica da proteína a uma
determinada substância (ligando).

Finalidades práticas: Os laboratórios clínicos utilizam a separação de proteínas dos

fluídos biológicos no seu dia-a-dia de forma a identificarem alterações que servirão
para apoio ao diagnóstico. Assim as proteínas do plasma sanguíneo são analisadas
rotineiramente por electroforese em acetato celulose. Técnicas similares são utilizadas
para purificarem proteínas com fins terapêuticos.

PROCESSOS DE SEPARAÇÃO
Métodos baseados na solubilidade das proteínas
A solubilidade das proteínas é influenciada pela concentração salina da solução.

a. Salting Out. A adição de uma determinada concentração de sais bivalentes (ex.

sulfato de amónio) a uma solução de proteínas induz a precipitação de algumas
ficando em solução apenas aquelas que são solúveis para a concentração de sal
adicionado. Desta forma, a fração de proteínas que precipitam entre duas
concentrações de sal diferentes pode ser utilizadas para posteriores purificações. Este
tipo de separação é normalmente o primeiro passo no processo de purificação de uma
proteína, pois pode ser realizado em grande escala (ex. homogeneizado de um tecido
ou uma amostra de plasma sanguíneo).

b. Salting in. Algumas proteínas requerem iões inorgânicos para serem solúveis em
água. Uma diálise extensiva contra uma solução com baixa concentração salina pode
induzir a precipitação de determinadas proteínas existentes na mistura original.

Separação com base na dimensão molecular

a. Diálise. A diálise é uma técnica clássica para separar macromoléculas de outros
componentes de baixo peso molecular presentes numa solução. É usada uma
membrana semipermeável, na qual as pequenas moléculas passam enquanto as
grandes (ex. proteínas) ficam retidas. A membrana de diálise consiste numa matriz de
fibras de celulose com ligações cruzadas entre si e cujos poros resultam de pequenas
brechas algo irregulares entre fibras. A separação é causada pela diferença entre as
massas moleculares das moléculas a separar e a dimensão média dos poros da

11
BIOQUÍMICA TÉCNICAS BASE EM BIOQUÍMICA

membrana. A permeabilidade depende também de outros fatores como: a forma das

moléculas, o gradiente de difusão, a densidade de carga... Quanto maior a diferença
entre a massa molecular das moléculas a separar mais eficiente é o processo de
diálise. Existem membranas com diferentes limites de permeabilidade que é definido
pelo molecular weight cut-off . De um modo geral, a taxa de diálise é maior em água
destilada, no entanto muitas vezes é necessária uma solução aquosa com pH e força
iónica definida para estabilizar as moléculas em estudo. A diálise é utilizada para
muitas aplicações como por exemplo: dessalinização de soluções de proteína antes de
uma eletroforese ou cromatografia, concentração do plasma ou soro, concentração de
anticorpos ou remoção de contaminantes. Na prática, a mistura de moléculas de
diferentes massas moleculares é colocada num tubo de diálise que é posteriormente
imerso num grande volume de um solvente aquoso (pelo menos 100 x o volume da
amostra). A difusão das pequenas moléculas irá ocorrer para o exterior, devido à
diferença de concentrações, até que o equilíbrio de concentração seja atingido.

b. Ultracentrifugação. A centrifugação a grandes velocidades pode separar uma

solução de proteínas em múltiplos componentes. A velocidade a que uma proteína
sedimenta numa ultracentrifuga depende do seu tamanho e da sua forma. Para
proteínas com uma forma semelhante, quanto maior o peso molecular mais rápida a
sedimentação.

c. Cromatografia de exclusão molecular. A cromatografia é um método muito

utilizado para purificar moléculas biológicas como proteínas para usos em medicina,
bioquímica, entre outros. Esta técnica utiliza uma fase móvel – inclui o solvente e as
moléculas a separar- e uma fase estacionária em papel (cromatografia de papel) ou
em resinas (cromatografia de coluna) que a fase móvel percorre. As moléculas
percorrem a fase estacionária a diferentes velocidades que dependem da suas
propriedades químicas o que permite a separação de componentes individuais a partir
de misturas mais ou menos complexas. As resinas utilizadas como fase estacionária
podem ter diferentes características originando diferentes tipos de cromatografia:
filtração em gel (ou exclusão molecular), afinidade, troca iónica... (ver adiante).
A cromatografia de exclusão molecular, também designada como filtração em gel
ou cromatografia de peneira molecular, utiliza resinas inertes de geometria invariável a
mudanças de pH e força iónica. Estas resinas são compostas por polímeros de
hidratos de carbono insolúveis, mas extremamente hidratados, na forma de esferas
com tamanho e porosidade uniforme. Este tipo de cromatografia separa moléculas
solubilizadas pelo seu tamanho, ou peso molecular. A resina atua como uma peneira
onde as moléculas mais pequenas ficam temporariamente retidas dentro dos poros,
retardando a sua velocidade. As moléculas maiores, superiores ao tamanho das
partículas porosas do gel (limite de exclusão), não penetram no interior e são
excluídas da coluna (Fig 5). É uma técnica muito utilizada em processos de purificação
de moléculas biológicas (tais como a purificação de proteínas com fins terapêuticos),
na determinação do número de componentes de uma mistura (critério de pureza), bem
como na determinação do peso molecular de uma proteína após devida calibração da
coluna com pesos moleculares conhecidos.

12
BIOQUÍMICA TÉCNICAS BASE EM BIOQUÍMICA

Fig. 5- Cromatografia de exclusão molecular.

Para se obter bons resultados de separação neste tipo de cromatografia, é de

fundamental importância a seleção do limite de exclusão da resina. Estão disponíveis
esferas em uma ampla variedade de tamanho de poro, ideais para o isolamento e
purificação de moléculas com um intervalo particular de peso molecular.

Na prática, a amostra é colocada no topo da matriz e as moléculas entram,

percorrem toda a fase estacionária e, por fim, saem por uma abertura no final da
coluna. Para que este processo aconteça deve ser adicionado eluente (fase líquida)
continuamente por cima da amostra após a sua entrada na matriz. O eluente é
recolhido, em pequenas frações, em tubos de ensaio ordenados sequencialmente. A
fase líquida é normalmente uma solução tampão cuja composição é adequada a
manter ativas as moléculas que se pretendem separar.

Métodos de separação com base na carga molecular

a. Cromatografia de troca iónica. O método é semelhante ao exposto no ponto
anterior (c. Cromatografia de exclusão molecular) mas a resina utilizada como fase
estacionária tem diferentes características. Utiliza-se um material de troca iónica
insolúvel contendo grupos polianiónicos ou policatiónicos que a um valor de pH
apropriado ligarão grupos com carga oposta das proteínas por interações iónicas. A
força de ligação da proteína à resina depende da quantidade de cargas da proteína
para interatuarem com a resina de troca iónica. A eluição das proteínas da resina é
geralmente realizada por lavagem com soluções salinas que quebram as interações
electrostáticas das proteínas com a resina de troca iónica ou alterando o pH da
solução que altera a carga da proteína.

O HPLC (high-performance liquid chromatography) difere das cromatografias

convencionais pelo facto de ser realizada a pressões muito elevadas. Este tipo de
cromatografia a alta pressão é um processo de separação de proteínas mais rápido e
com melhor resolução que as cromatografias a baixas pressões.

b. Electroforese. A electroforese é uma técnica de separação de misturas de

moléculas biológicas muito poderosa, baseada no facto de que moléculas com carga,
em solução aquosa, migram diferencialmente sob ação de um campo eléctrico. Há
vários procedimentos eletroforéticos mas os mais comuns, e atualmente muito
utilizados em bioquímica para separação de proteínas e ácidos nucleicos, são os em
suporte de acetato de celulose, de gel de agarose e gel de poliacrilamida. A matriz em
gel cria um suporte para a migração que impede que as moléculas se misturem de

13
BIOQUÍMICA TÉCNICAS BASE EM BIOQUÍMICA

BIOQUÍMICA FISIOLÓGICA I
novo após terminar a processo, e principalmente, 2016/2017 cria um crivo molecular que contribui

para a separação. A eletroforeseTRABALHO em gelDE deLABORATÓRIO

poliacrilamida
- P3 (PAGE) é o procedimento
mais sofisticado que permite a resolução de proteínas individuais, mesmo que sejam
P3- Proteoma do soro por electroforese 1D (SDS-PAGE)
estruturalmente semelhantes. O movimento das proteínas na matriz depende da
intensidade do campo eléctrico, da carga total da proteína e do coeficiente de fricção
OBJETIVO

que, por sua vez, depende

Familiarização da forma
com técnicas e tamanho
vulgarmente da em
usadas molécula. Assim,
bioquímica para a
o mobilidade
estudo de de
proteínas.
duas proteínas no mesmo campo eléctrico será proporcional à diferença entre as
densidadesApósdeesta
carga
aula o(ou razão
aluno de vercarga/massa).
ser capaz de: Esta propriedade varia com o valor do
pH pois este faz os
-Explicar variar a ionização
princípios em que sedos grupos
baseia presentes na molécula e
a electroforese.
-Relacionar propriedades das proteínas com a separação electroforética.
consequentemente a carga total da proteína. Para cada proteína, existe um valor de
-Dizer qual a diferença entre PAGE e SDS-PAGE e qual o papel do SDS e do gel de
pH, chamado o pontono
poliacrilamida isoelétrico, no qual as proteínas não têm carga líquida pelo que
processo electroforético.
-Interpretar dados obtidos por SDS-PAGE.
não se movem no campo eléctrico. Para valores de pH abaixo do ponto isoelétrico, a
proteína adquire
INTRODUÇÃO carga positiva movendo-se para o polo negativo (cátodo). Para
valores de pH acima do ponto isoelétrico o comportamento das proteínas é o oposto.
A electroforese é uma técnica de separação de misturas de moléculas biológicas
muito poderosa, baseada no facto de que moléculas com carga, em solução aquosa,
O migram
SDS (sulfato dodecil
diferencialmente sobdeação
sódio)
de umé campo
um detergente
eléctrico. Há aniónico muitas vezes
vários procedimentos
electroforéticos mas os mais comuns, e atualmente muito utilizados em bioquímica para
associadoseparação
a este processo (SDS-PAGE) pois liga-se fortemente
de proteínas e ácidos nucleicos, são os em suporte de acetato de às proteínas (aprox. 1
celulose, de
SDS por cada 2 resíduos
gel de agarose aminoácidos),
e gel de poliacrilamida. Arompendo
matriz em gelas ligações
cria um suportenão
paracovalentes
a migração que
que impede que as moléculas se misturem de novo após terminar a processo, e
estabilizam a estruturacrianativa
principalmente, e conferindo-lhes
um crivo molecular que contribui carga
paratotal negativa.
a separação. Na presença
A eletroforese em de
SDS, as proteínas ficam desnaturadas
gel de poliacrilamida e a suamais
(PAGE) é o procedimento carga total éque
sofisticado principalmente devida ao
permite a resolução
de proteínas individuais, mesmo que sejam estruturalmente semelhantes.
SDS e não aosOgrupos ionizáveis da própria proteína, ou seja, ficam todas com a
movimento das proteínas na matriz depende da intensidade do campo eléctrico,
mesma densidade
da carga totaldedacarga
proteínaeecom enrolamentos
do coeficiente de fricçãoaleatórios
que, por sua(Fig.6). Por vezes
vez, depende da formaas
e tamanho da molécula. Assim, a mobilidade de duas proteínas no mesmo campo
amostraseléctrico
são também tratadas com ditiotreitol (DTT) que reduz as ligações
será proporcional à diferença entre as densidades de carga (ou razão
dissulfureto (S-S) queEsta
carga/massa). estabilizam
propriedade a estrutura
varia com o valor terciaria e quaternária,
do pH pois este faz variar libertando
a ionização as
dos grupos presentes na molécula e consequentemente a carga total da proteína.
subunidades das proteínas multiméricas. Nestas condições, a mobilidade
O SDS (sulfato dodecil de sódio) é um detergente aniónico muitas vezes associado a
no campo
eléctrico faz-se exclusivamente
este processo (SDS-PAGE) poisemliga-se
função da massa
fortemente molecular.
às proteínas (aprox.Devido
1 SDS porà capacidade
cada
2 resíduos aminoácidos), rompendo as ligações não covalentes
de crivagem do gel de poliacrilamida as proteínas mais pequenas migrarão mais que estabilizam a
estrutura nativa e conferindo-lhes carga total negativa. Na presença de SDS, as proteínas
depressaficam
do que as maiores
desnaturadas o que
e a sua cargasignifica que a técnica
total é principalmente devidadeao SDS-PAGE
SDS e não aos nãogrupossó
ionizáveis da própria proteína, ou seja, ficam todas
permite separar proteínas mas também determinar a sua massa molecular.com a mesma densidade de carga e
com enrolamentos aleatórios

Proteína sem Proteína com

SDS cadeias laterais SDS
carregadas

regiões hidrofóbicas

1/5
Fig. 6- Efeito do SDS na conformação de proteínas.

14
BIOQUÍMICA TÉCNICAS BASE EM BIOQUÍMICA

PROBLEMAS
1. Descreva sucintamente as propriedades das proteínas que podem ser utilizadas
para a sua separação e purificação, relacionando as mesmas propriedades com os
métodos de separação apropriados: Cromatografia de fase gel, cromatografia de
troca iónica, cromatografia de afinidade, diálise e Salting out.
2. As cinco proteínas abaixo mencionadas foram separadas por electroforese de
SDS-PAGE. Por que ordem chegam à parte de baixo do gel (local oposto ao ponto
de aplicação).
Proteína Peso molecular (daltons) pI
(a) α-antitripsina 45000 5,4
(b) Citocromo C 13400 10,6
(c) Mioglobina 17000 7,0
(d) BSA 69000 4,8
(e) Transferrina 90000 5,9
3. Preencha os espaços em branco.
a) O aumento da solubilidade de uma proteína como consequência do aumento da
força iónica do meio designa-se por ___________________. Em condições de
elevada força iónica pode ocorrer precipitação de uma proteína. Diz-se que ocorreu
________________.
b) Uma proteína com uma carga global negativa irá ligar-se a uma resina de troca
aniónica. Para eluir essa proteína da coluna é necessário um tampão com um pH
_______ ou com uma força iónica _______ à do tampão inicial.

15
 BIOQUÍMICA PROBLEMAS

ch03.qxd 2/13/2003 1:35 PM Page 15

EQUILÍBRIO ÁCIDO-BASE E PROPRIEDADES IÓNICAS DOS

AMINOÁCIDOS

AMINOÁCIDOS ENCONTRADOS EM PROTEÍNAS

Table 3–1. L- α-Amino acids present in proteins.

Name Symbol Structural Formula pK1 pK2 pK3

With Aliphatic Side Chains !-COOH !-NH3+ R Group
Glycine Gly [G] H CH COO
– 2.4 9.8
+
NH3
Alanine Ala [A] – 2.4 9.9
CH3 CH COO

NH3+
H3C
–
CH CH COO
Valine Val [V] +
2.2 9.7
H3C NH3
H3C
–
CH CH2 CH COO
Leucine Leu [L] +
2.3 9.7
H3C NH3

CH3
CH2
Isoleucine Ile [I] CH CH COO
– 2.3 9.8
CH3 +
NH3

With Side Chains Containing Hydroxylic (OH) Groups

Serine Ser [S] CH2 CH COO
– 2.2 9.2 about 13
+
OH NH3
Threonine Thr [T] CH3 CH CH COO
– 2.1 9.1 about 13
+
OH NH3

Tyrosine Tyr [Y] See below.

With Side Chains Containing Sulfur Atoms

Cysteine Cys [C] CH2 CH COO
–
1.9 10.8 8.3
+
SH NH3

Methionine Met [M] CH2 CH2 CH COO

–
2.1 9.3
+
S CH3 NH3

With Side Chains Containing Acidic Groups or Their Amides

ch03.qxd Aspartic
2/13/2003
acid 1:35Asp
PM[D]Page 16 – – 2.0 9.9 3.9
OOC CH2 CH COO
+
NH3
Asparagine Asn [N] C CH2 CH COO
– 2.1 8.8
H2N
+
O NH3
– –
OOC CH2 CH2 CH COO
Glutamic acid Glu [E] 2.1 9.5 4.1
16 / CHAPTER 3 NH3
+

–
H2N C CH2 CH2 CH COO
Table 3–1.
Glutamine L-α-Amino
Gln [Q]acids present in proteins. (continued) 2.2 9.1
+
O NH3
Name Symbol Structural Formula pK1 pK2 pK3
(continued)
With Side Chains Containing Basic Groups !-COOH !-NH3+ R Group
Arginine Arg [R] 15 – 1.8 9.0 12.5
H N CH2 CH2 CH2 CH COO
+ +
C NH2 NH3

NH2
–
CH2 CH2 CH2 CH2 CH COO
Lysine Lys [K] 2.2 9.2 10.8
+ +
NH3 NH3
–
CH2 CH COO
Histidine His [H] 1.8 9.3 6.0
HN N +
NH3

Containing Aromatic Rings 16

Histidine His [H] See above.
–
Phenylalanine Phe [F] CH2 CH COO 2.2 9.2
 2 2 2

C NH2+ NH3
+

NH2
–
BIOQUÍMICA
16 / CHAPTER 3 CH2 CH2 CH2 CH2 CH COO PROBLEMAS
Lysine Lys [K] 2.2 9.2 10.8
+ +
NH3 NH3
Table 3–1. L-α-Amino acids present in proteins. (continued) –
CH2 CH COO
Histidine His [H] 1.8 9.3 6.0
HN N +
Name Symbol NH3
Structural Formula pK1 pK2 pK3
With Side Chains
Containing Containing
Aromatic Rings Basic Groups !-COOH !-NH3+ R Group
Arginine
Histidine Arg [R]
His [H] 1.8 9.0 12.5
H N CH2 See
CH2above.
–
CH2 CH COO

C NH2+ CH2 CHNH3 COO

+
–
Phenylalanine Phe [F] 2.2 9.2
NH2 NH3
+
–
Tyrosine Tyr [Y] CH2 CH2 CH2 CH2 CH COO 2.2 9.1 10.1
Lysine Lys [K] –
2.2 9.2 10.8
NHHO
+ CH2 CHNH +COO
3 3
+
NH –
CH2 3CH COO
Histidine
Tryptophan His
Trp [H]
[W] 1.8
2.4 9.3
9.4 6.0
–
HN NCH2 CHNH3+COO
+
NH3
Containing Aromatic Rings N
Histidine His [H] See above.
H
–
Phenylalanine Phe [F] CH2 CH COO 2.2 9.2
Imino Acid
Proline Pro [P] NH3
+ 2.0 10.6
+ –
N COO
Tyrosine Tyr [Y] H2 2.2 9.1 10.1
–
HO CH2 CH COO
+
adaptado de Harper’s Illustrated Biochemistry, 26th ed. NH3
Tryptophan Trp [W] –
2.4 9.4
Amino Acids May Have Positive, Negative,
CH2 CH Molecules
that contain an equal number of ioniz-
COO
PROBLEMAS
or Zero Net Charge + able groups of opposite charge and that therefore bear
NH3
N no net charge are termed zwitterions. Amino acids in
PRÉ -REQUISITOS
Charged and uncharged forms of the ionizable
H blood and most tissues thus should be represented as in
⎯COOH and ⎯NH3 weak acid groups exist in solu-
+
A, below.
H+Imino
tion
eo inAcid
protonic equilibrium: ácido, equilíbrio ácido-base, definição de pH, Cálculos de pH
comportamento
deProline Pro [P] fracas.
ácidos ou bases +
NH3+ 2.0 10.6
NH2
R — COOH = R — COO−+ H+ N COO
–

H2 O– OH
OBJETIVOS ESPECÍFICOS +
R — NH3 = R — NH2 + H+ R R
O O
• Justificar o comportamento tampão +
de soluções em termos de equilíbrio químico.
While both R⎯COOH and R⎯NH3 are weak acids, A B
• Reconhecer
R⎯COOH
Amino Acids a importância
is aMay
far stronger deR⎯NH
acid than
Have Positive, soluções
Negative, +
3 . At
tampão no domínio
Molecules biológico.
that contain an equal number of ioniz-
physiologic
or Zero Net
• Utilizar ospHconceitos
(pH 7.4), carboxyl
Charge de pH groups
e pK exist
paraalmost Structure
able
prever o B cannot
groups
estado of de exist charge
opposite in aqueous
ionização desolution
and that because
therefore
aminoácidos at
bear
entirely as R⎯COO− and amino groups predomi- anynet
no pHcharge
low enough to protonate
are termed zwitterions.the Amino
carboxylacids
group
in
ouCharged
dasassuas
nantly and cadeias,
R⎯NH uncharged
+
3 . Figure
ou
3–1 para
forms of calcular
illustrates effectparâmetros
thetheionizable
of envolvidos
the amino
blood and grouptissues
most no
wouldthusalsoequilíbrio
be protonated.
should ácido-base
Similarly,
be represented as in
⎯COOH
pH on the and ⎯NH
charged
+ weak acid groups exist in solu-
state
3 of aspartic acid. at
A, any pH
below. sufficiently high for an uncharged amino
fisiológico (respiratório
tion in protonic equilibrium: e metabólico).
NH3+ NH2
R — COOH = R — COO−+ H+
1. O que é um tampão?
+
Como funciona? Que tipo de compostos
O– atuam como
OH
R — NH3 = R — NH2 + H+ R R
tampões nas células? O O
While both R⎯COOH and R⎯NH3 are weak acids, + A B
2.R⎯COOH
No laboratório do hospital titularam-se 10 ml de uma amostra de suco gástrico,
is a far stronger acid than R⎯NH3+. At
obtido pH
physiologic algumas
(pH 7.4),horas
carboxylapós
groupsa exist
última refeição,
almost com
Structure 7,2 ml
B cannot deinNaOH
exist 0,1 M.because at
aqueous solution
entirely as R⎯COO− and amino groups predomi- any pH jálownão
enough to protonate the carboxyl group
Assumindo que o suco gástrico deste
nantly as R⎯NH3+. Figure 3–1 illustrates the effect of
paciente contém alimentos ou bebidas
the amino group would also be protonated. Similarly,
pHeonque por isso
the charged statenão há tampões
of aspartic acid. presentesatcalcule
any pH o valor do
sufficiently pHfordoansuco
high gástrico.
uncharged amino

3. CASO CLINICO 1: Concentração de bicarbonato no sangue num caso de acidose

metabólica.
Os tampões no sangue de um adulto normal controlam o valor do pH à volta de 7,40.
Todas as condições que levam a que o pH desça para valores inferiores a 7,35 são
classificadas como acidoses. Valores de pH à volta de 7,0 podem ter consequências
sérias e eventualmente causar morte. Por esta razão é muito importante medir os
parâmetros ácido-base do sangue de doentes com acidose, particularmente se esta é
causada por variações no metabolismo. Os parâmetros de maior interesse clínico
incluem o pH, [HCO3-] e [CO2]. Estes têm valores normais de pH = 7,40, [HCO3-] =24,0
mM e [CO2].= 1,2 mM.

17
BIOQUÍMICA PROBLEMAS

No sangue de um doente com acidose metabólica foram determinados os seguintes

valores: pH = 7,03 e [CO2] = 1,10 mM. Qual é a concentração de [HCO3-] no sangue
deste doente e que quantidade da [HCO3-] normal foi utilizada para tamponizar a
acidez causada pela condição.
4. Uma prática comum nos atletas de corrida em curtas distâncias é respirar rápida e
profundamente (hiperventilação) durante 30 s imediatamente antes do início da
prova de forma a remover o CO2 dos seus pulmões. Como consequência o valor
do pH do sangue pode subir até 7,6. Explique.
5. Os resultados do laboratório mostram que o pH do sangue num doente diabético
era 7.08.
a) Como variou a concentração de protões comparando com a concentração
normal de 7.4?
b) E se o pH do sangue baixar de 7.4 para 6.4?
6. Os iões amónio dissociam-se formando amónia (a base conjugada) e protões.
a) Qual a forma predominante no sangue?
b) E na urina (pH 5.5-7)?
7. Os aminoácidos contêm grupos ionizáveis que se comportam como ácidos ou bases
fracas. Cada grupo ionizável de um aminoácido tem dois estados possíveis de
ionização: carregado ou não carregado (ex.: -COO- e -COOH).
a) Represente os estados possíveis de ionização da serina.
b) Indique qual a forma predominante para os seguintes valores de pH: 1,7 e 10 (pKa
da α-amino = 9,2 e pKa do α-carboxilo = 2,2)
c) Qual o ponto isoelétrico deste aminoácido?
8. Examine a estrutura dos aminoácidos numa tabela e indique a quais estão associadas
as seguintes propriedades:
a) cadeia lateral alifática
b) cadeia lateral básica
c) cadeia lateral capaz de formar ligações de hidrogénio
d) três grupos ionizáveis
e) carga negativa a pH 7
f) dois grupos carboxílicos
g) mais hidrofóbico dos 4

9. Um bom tampão a pH fisiológico seria uma proteína rica em qual dos aminoácidos?
Justifique
10. Recorrendo a uma tabela com as estruturas dos aminoácidos, decida qual obedece às
seguintes descrições.
a) _________________ tem uma cadeia lateral não polar e interatua com outros
resíduos aromáticos (os anéis aromáticos têm tendência a interatuar entre si).
b) _________________ é um pequeno resíduo e não contêm enxofre. Pode
formar ligações de hidrogénio internas com outros resíduos.
c) As cadeias laterais de _________________ e de ________________, em
condições fisiológicas, encontram-se na sua totalidade carregadas
positivamente, enquanto que as cadeias laterais de ___________ só o estão
parcialmente.
11. Qual a espécie iónica de glutamato predominante a pH 10 (consulte uma tabela com os
pKa)? Justifique.

18
BIOQUÍMICA PROBLEMAS

12. Determine a concentração da espécie predominante referida na questão anterior

sabendo que a concentração total de glutamato em solução é de 1M? Justifique.
13. Qual o ponto isoelétrico da leucina (consulte uma tabela com os pKa)?
14. Indique se as seguintes questões são verdadeiras ou falsas. Justifique as que
considerar falsas.
a) Só a pH muito alto ou muito baixo é que a forma não ionizada de um dado
aminoácido predomina.
b) A alanina é mais polar que a Leucina.
c) A um pH superior ao valor de pKa de um dado grupo ionizável mais de metade
desses grupos estão dissociados.

CARGA, PROPRIEDADES DAS PROTEÍNAS

PROBLEMAS

1. Desenhe um dipéptido em que o N-terminal é uma alanina e o C-terminal é uma

glicina. Diga se existe rotação livre em torno desta ligação. Porquê?
2. Considere o seguinte peptídeo: Gly-Ser-Cys-Glu-Asp-Asn-Cys-Arg
⏐ ⏐
S⎯⎯⎯⎯⎯-⎯S

o peptídeo representado é ácido, básico ou neutro? Justifique.

3. Um polipeptídeo isolado do cérebro tem a sequência:
Glu-His-Trp-Ser-Tir-Gli-Leu-Arg-Gli
a) Escreva a sequência do polipeptídeo indicando os grupos ionizáveis.
b) Calcule o ponto isoelétrico deste polipeptídeo.
4. Associe os níveis de organização das estruturas proteicas (coluna da esquerda)
com as descrições apropriadas (coluna da direita).
(a) Estrutura primária (1) Associação de subunidades proteicas
(b) Estrutura secundária (2) Agregados de hélices α e folha β
(c) Estrutura supersecundária (3) Sequência linear de aminoácidos
(d) Estrutura terciária (4) Arranjo espacial dos aminoácidos que se
encontram próximos um dos outros na sequência
linear
(e) Estrutura quaternária (5) Necessária para a atividade enzimática
5. Explique brevemente porque é que a maioria das proteínas globulares:
a) precipitam a pH baixo

b) precipitam após aquecimento

c) em alguns casos a solubilidade na água depende da concentração de sal, mas se a

concentração de sal for muito elevada, as proteínas precipitam.

6. Porque é que se alterarmos a polaridade do solvente de uma determinada

proteína, ela pode perder a sua atividade biológica?

19
BIOQUÍMICA PROBLEMAS

7. Foi admitida no hospital, uma mulher de 78 anos com uma infeção respiratória e
uma insuficiência ventricular esquerda. A doente apresentava glicosúria e foi
pedida a glucose plasmática, pois é frequente a hiperglicemia em doentes graves.
No laboratório, 1 ml da amostra de plasma desta doente foi adicionado a 1 ml de
uma solução contendo os reagentes necessários (que inclui NADP+, MgCl2, as
enzimas adequadas…). Após um dado tempo, necessário para completar a
reação, foi lida a absorvância de 0,61 (λ=340 nm). Calcule a concentração de
glucose no plasma.
(ε(NADPH)= 6,22 x 103 M-1.cm-1)

20
BIOQUÍMICA PROBLEMAS

ESTRUTURA DOS GLÚCIDOS

Os hidratos de carbono estão distribuídos de uma forma generalizada pela

natureza. No reino vegetal a glucose é sintetizada a partir de dióxido de carbono e
água pelo processo de fotossíntese, utilizando a luz solar e é armazenada sobre a
forma de amido ou convertida em celulose, um dos constituintes da parede celular. Os
animais podem sintetizar alguns hidratos de carbono a partir de lípidos e proteínas,
mas a maior parte dos hidratos de carbono animais derivam em última análise das
plantas.
Os hidratos de carbono são polihidroxialdeídos, polihidroxicetonas ou seus
derivados que possuem a fórmula geral CnH2nOm. Os monossacáridos (oses) são os
hidratos de carbono mais simples, ou seja, aqueles que não podem ser hidrolisados
em compostos mais simples. Polissacáridos (ósidos) são polímeros constituídos pela
associação de mais de oito monossacáridos.

NOMENCLATURA
O nome do tipo de monossacárido inclui o tipo de função, um prefixo grego
indicando o número de átomos de carbono e a terminação -ose. Por exemplo
aldohexose.

ISOMERIA DOS HIDRATOS DE CARBONO

Isómeros são compostos com a mesma fórmula mas diferem na sua configuração
espacial. A presença de um carbono assimétrico (um átomo de carbono ligado a
quatro átomos diferentes) permite a formação de isómeros. Os tipos de isomeria mais
importantes encontradas, por exemplo, na glucose são as seguintes:
(a) D e L: A designação de um isómero como forma D ou pela sua imagem ao espelho
como forma L, é determinada pela relação espacial com o gliceraldeído (composto
parente de três carbonos da família dos hidratos de carbono). A orientação dos
grupos -H e -OH em torno do átomo de carbono adjacente ao terminal do átomo
de carbono com o álcool primário (ex. o átomo cinco da glucose) determina o tipo
de isómero.
(b) Estruturas cíclicas sob a forma de piranose ou furanose: Esta terminologia está
relacionada com a forma de ciclização do monossacárido.
(c) Anómeros α e β: A estrutura em anel de uma aldose resulta num hemiacetal e a de
uma cetose num hemicetal. Conforme o grupo hidroxilo fica no plano do anel ou
para cima do plano do anel temos uma forma a ou b.
(d) Epímeros: Isómeros que diferem pela configuração dos grupos hidroxilo na posição
2,3 e 4 do anel da glucose.
(e) Isomerismo ceto-aldólico: A frutose tem a mesma fórmula molecular da glucose
mas difere na fórmula estrutural pois possui um grupo cetona enquanto a glucose
possui um grupo aldeído.

PROBLEMAS
1. Que grupo químico é encontrado em todos os hidratos de carbono? Qual a
diferença entre os dois hidratos de carbono seguintes?

21
BIOQUÍMICA PROBLEMAS

2. Desenhe a estrutura da glucose sob a forma de piranose. Desenhe também:

a) a estrutura do anómero do açúcar.
b) a estrutura do enantiómero do açúcar.
c) a estrutura dum epímero do açúcar.

3. Escreva a α-D-glucopiranose. Numere os átomos de carbono.

a) Qual o carbono que não está no anel?
4. Considere o seguinte dissacárido:

CH2 OH CH2 OH
O
H H O
H
O
OH H H OH
OH
CH2 OH
H OH OH H
a) Numere os átomos de carbono de cada resíduo de monossacárido. Diga se este
dissacárido é ou não um açúcar redutor.
b) Que nome dá à ligação entre as duas unidades de açúcar? Classifique o tipo de
ligação.
5. Que moléculas se obtêm na hidrólise da sacarose? E da lactose? Porque razão a
maltose e a lactose são açúcares redutores e a sacarose não?
6. O ........................... é uma fonte de reserva das plantas. Em que grupo pode incluir
esta macromolécula? Qual o monossacárido que a compõe? Que tipo de ligação
está envolvida?
7. Qual a diferença entre amilose, amilopectina, glicogénio e celulose?

22
BIOQUÍMICA PROBLEMAS

ESTRUTURA DOS LÍPIDOS

Os lípidos são um grupo heterogéneo de compostos, de estrutura muito

diversa, que têm em comum o facto de conterem uma cadeia alifática mais ou menos
longa. Estes compostos foram assim agrupados devido às suas características de
solubilidade.

NATUREZA DOS LÍPIDOS

Devido à predominância de cadeias hidrogenocarbonadas (-CH2-CH2-CH2-) os
lípidos têm uma natureza hidrófoba, a qual explica a sua insolubilidade ou pouca
solubilidade em água e solubilidade em solventes orgânicos.

CLASSIFICAÇÃO
a) Lípidos simples (contêm apenas átomos de C, H e O) em que o álcool a que os
ácidos gordos se encontram esterificados pode ser um glicerol ou um esterol.
b) Lípidos complexos em que além dos elementos dos lípidos simples contêm também
N, P e hidratos de carbono. Estes dividem-se em:
(i) Glicerolípidos
(ii) Esfingolípidos

NATUREZA E NOMENCLATURA DOS ÁCIDOS GORDOS

Os ácidos gordos são constituídos por longas cadeias hidrogenocarbonadas,
insolúveis em água, com um grupo carboxilo no término da cadeia, a qual pode ser
saturada ou insaturada. Os ácidos gordos saturados não têm duplas ligações. O
nome sistemático revela o número de carbonos (através do prefixo grego) com o
sufixo -oico. Por exemplo, o ácido palmítico que tem 16 carbonos é denominado por
ácido hexadecanoico. Os ácidos gordos insaturados têm uma, ou mais, ligações
duplas.
O sistema mais utilizado para designar a posição das duplas ligações consiste
na numeração pelo sistema delta (Δ), que consiste em:
(a) O terminal carboxílico é designado por carbono 1 e a posição da dupla ligação é
dada pelo número de átomos de carbono a contar pelo lado do grupo carboxílico. Por
exemplo o ácido palmitoleico possui 16 carbonos e um dupla ligação entre o carbono 9
e 10, pelo que será designado por 16:1: Δ 9.
(b) O nome sistemático indica o número de átomos de carbono, o número de duplas
ligações seguido do sufixo -oico. As duplas ligações presentes em ácidos gordos
naturais ocorrem sempre numa conformação cis.
Um outro sistema utilizado para classificar ácidos gordos insaturados,
principalmente em Nutrição, é o sistema omega (ω). Este sistema divide os ácidos
gordos em classes conforme o posicionamento da última ligação dupla relativamente ao
carbono terminal da cadeia (carbono ómega).

PROBLEMAS
8. Qual o nome sistemático dos seguintes ácidos gordos ?
a) CH3-(CH2)14-COOH
b) CH3-(CH2)7-CH=CH- (CH2)7-COOH

9. Que grupos participam numa ligação éster?

23
BIOQUÍMICA PROBLEMAS

a) Faça um esboço do glicerol.

b) Forme uma ligação éster entre o glicerol e um ácido gordo. Diga que composto
obteve.
c) Forme ligações éster entre os restantes grupos hidroxilo do glicerol e as
moléculas de ácido gordo necessárias. Diga que composto obteve.
e) O que espera da solubilidade em água do lípido anterior.
f) Esperaria que o composto a que se refere a alínea c) formasse uma bicamada
lipidica?
10. Na lecitina qual o álcool funcional? Porque razão este grupo promove a
solubilidade em água? Conhece outro álcool na lecitina?
11. Quais os glicolípidos que conhece? Qual a diferença entre eles?
12. Quais as características principais dos lípidos constituintes das membranas
biológicas? Quais os tipos de lípidos membranares e como são constituídos? Que
tipo de interações são importantes na manutenção da estrutura em dupla camada?
13. Define-se temperatura de transição de fase, TM de uma membrana como sendo a
temperatura à qual esta passa de uma estrutura ordenada e rígida, para uma
estrutura consideravelmente flexível. Determinou-se em três tipos de membranas a
temperatura de transição de fase e a composição em ácidos gordos. Relacione os
resultados obtidos.
Membrana A Membrana B Membrana C
Tm (ºC) 18 25 15
Ácidos gordos (%)
16:0 24 24 24
20:0 44 50 37
18:1(9) 11 8 14
20:2(9,12) 21 18 25
14. Qual a parte da molécula do colesterol que é hidrófilo? Os esteróides são um
constituinte comum das membranas biológicas. Espera encontrá-los na camada
lipídica ou proteica? Além de ser um constituinte da membrana que outras funções
biológicas possui?

24
BIOQUÍMICA PROBLEMAS

ENZIMAS

INTRODUÇÃO
As enzimas são proteínas com a função de catalisar (aumentar a velocidade)
de reações químicas, cuja ação é conhecida há vários milénios.
Existem duas caraterísticas importantes das enzimas: (i) a enzima não se
altera no decorrer de uma reação mantendo a sua atividade e (ii) a enzima não
modifica as propriedades termodinâmicas dessa mesma reação o que significa que as
enzimas aumentam a velocidade com que uma determinada reação chega ao
equilíbrio mas não alteram a constante de equilíbrio dessa reação.
Algumas enzimas necessitam de cofatores para a sua ação. Há cofatores de
diversa natureza química, desde os metálicos aos tetrapirrólicas até às coenzimas de
natureza vitamínica.

CLASSIFICAÇÃO DAS ENZIMAS

As enzimas podem ser classificadas em 6 grandes classes conforme o tipo de reações
que catalisam (EC - Enzyme Comission):
EC1 - Oxidoredutases quando envolvidas em reações de oxidação-redução
EC2 - Transferases quando envolvidas em reações de transferência de grupos
funcionais (ex. grupos amina ou fosfato).
EC3 - Hidrolases quando envolvidas em reações clivagem de ligações por transferência
de H2O.
EC4 - Liases quando envolvidas em reações de adição ou remoção de grupos (água,
amónia ou dióxido de carbono).
EC5 - Isomerases quando catalisam alterações/rearranjos numa molécula.
EC6 - Ligases quando catalisam a ligação de duas moléculas (gasto de ATP).

Tabela 3 - As seis classes de enzimas e exemplos de subclasses.

Classificação Caraterísticas
Oxidoredutases
Oxidases - utilizam o O2 como aceitador de eletrões sem o incorporar no substrato
Desidrogenases - utilizam outro tipo de aceitadores de eletrões (por ex: NAD+)
Oxigenases - incorporam O2 no substrato
Peroxidases - utilizam o H2O2 como aceitador de eletrões
Transferases
Metiltransferases - transferem unidades de 1 carbono entre substratos
Aminotransferases - transferem NH2 entre aminoácidos e cetoácidos
Cinases - transferem fosfato do ATP para um substrato
Fosforilases - transferem fosfato do fosfato inorgânico (Pi) para um substrato
Hidrolases
Fosfatases - removem fosfato do substrato
Fosfodiesterases - clivam ligações fosfodiésteres
Peptidases - clivam ligações amidas

25
BIOQUÍMICA PROBLEMAS

Liases
Descarboxilases - produz CO2 por reações de eliminação
Aldolases - produz aldeídos por reações de eliminação
Sintases - liga duas moléculas sem utilizar ATP
Isomerases
Racemases - interconverte estereoisómeros L e D
Mutases - transfere grupos entre átomos de uma mesma molécula
Ligases
Carboxilases - utiliza CO2 como substrato
Sintetases - liga duas moléculas através de uma reação dependente de ATP

COMO ATUAM AS ENZIMAS

Uma reação química ocorre quando existe uma certa proporção de moléculas de
reagente que se encontram suficientemente energizadas para alcançar o estado de
transição, no qual aumenta a probabilidade de uma ligação química se formar ou quebrar
para formar o produto. O efeito dos catalisadores, portanto das enzimas, é o de diminuir a
energia de ativação. As enzimas são específicas relativamente às substâncias com que
reagem, por outras palavras, ligam-se e reagem exclusivamente com uma molécula em
particular, ou quanto muito, com uma classe de moléculas que são o substrato das suas
reações. Esta especificidade da enzima é determinada por pelos grupos funcionais do substrato,
pelos grupos funcionais da enzima e dos seus cofactores e pela proximidade física dos vários
grupos funcionais.

CINÉTICA ENZIMÁTICA
A atividade enzimática é geralmente expressa em unidade de atividade
enzimática (U), que representa a quantidade de enzima que catalisa a transformação
de 1 mmol de substrato por minuto em condições ótimas de medida; A atividade
específica é o número de unidades de enzima ativa por quantidade (mg) de proteína
total; O turnover de uma enzima é o número de moléculas de substrato processadas
por cada molécula de enzima por unidade de tempo.
Quando a velocidade de uma reação enzimática depende unicamente da
concentração de substrato, diz-se que a reação obedece a uma cinética de Michaelis-
Menten. A velocidade inicial de uma reação deste tipo está relacionada com a
concentração de substrato da forma representada na Fig.7, onde v representa a
velocidade inicial da reação, Vmax representa a velocidade máxima da reação e KM é a
constante de Michaelis:

Fig. 7 - Hipérbole obtida pela representação da velocidade inicial da reação em função da

concentração de substrato para uma reação catalisada por uma enzima.

26
BIOQUÍMICA PROBLEMAS

Para concentrações baixas, a reação é de primeira ordem mas com o aumento

do substrato para concentrações muito elevadas a reação é de ordem zero, isto é, a
velocidade é independente da concentração de substrato. Os investigadores Michaelis
e Menten sugeriram que uma reação catalisada por uma enzima envolve a formação
reversível de um complexo enzima substrato, o qual ao quebrar forma enzima livre e
um ou mais produtos. Este postulado pode ser descrito da seguinte forma:

onde E é a enzima livre, S é o substrato, ES o complexo enzima substrato, P o

produto, k1 a constante de velocidade de formação do complexo ES, k-1 a constante de
velocidade de dissociação do complexo ES a E + S e k2 a constante de velocidade de
formação e dissociação do produto (ES a E + P).
A equação de Michaelis-Menten baseia-se no pressuposto de que o complexo ES está
em estado estacionário ou seja a sua concentração praticamente não muda. Este
pressuposto é válido para parte inicial uma reação enzimática típica.
O valor de KM é a concentração de substrato para o qual a velocidade da
reação é metade da velocidade máxima. Reflete, por isso, a afinidade da enzima pelo
seu substrato. O KM é único para cada par enzima-substrato.
A constante de catálise ou turnover de uma enzima é:
Kcat = vmax/[E]
onde [E] é a concentração total de enzima. É uma medida direta da produção catalítica
de produto nas condições ótimas. As unidades de kcat são s–1. O inverso de kcat
representa o tempo necessário para uma molécula de enzima processar uma molécula
de substrato.
Devido à dificuldade de calcular o valor de Vmax num gráfico hiperbólico, podem
ser utilizadas transformações lineares da equação de Michaelis-Menten para realizar
os cálculos referidos como é o caso da equação de Lineweaver-Burk:
1/v=1/Vmax + KM/Vmax ⋅ 1/[S]

Esta equação é representada por uma reta (y=b + mx), na qual KM/Vmax (m) é o declive
e 1/Vmax (b) a interceção da reta no eixo dos yy’. Na Fig. 8 podemos ver uma
representação desta reta.

Fig. 8 - Reta obtida pela representação de Lineweaver-Burk

27
BIOQUÍMICA PROBLEMAS

PROBLEMAS
1. Classifique as seguintes afirmações com verdadeiro ou falso. Justifique sempre as
falsas.
a) A velocidade máxima, Vmax, está relacionada com o número máximo de
moléculas de substrato que podem ser processadas por unidade de tempo e
por molécula de enzima.
b) O KM é expresso em unidades de velocidade (ex: mol/s).
c) O KM é a concentração de substrato necessária para converter metade das
enzimas no complexo enzima substrato.
d) A velocidade inicial de uma reação catalisada enzimaticamente é independente
da concentração de substrato.
e) A concentrações saturantes de substrato, a velocidade da reação é
proporcional à concentração de enzima.
f) A constante de Michaelis, Km é igual à concentração de substrato quando v=
½ Vmax.
g) As enzimas são catalisadores orgânicos, de natureza proteica, sensíveis às
variações de temperatura.
h) As enzimas são substâncias químicas, de natureza lipídica, que são
consumidas durante o processo químico.
i) As enzimas apresentam uma região designada de centro ativo, à qual se liga a
molécula de substrato.

2. A maioria das proteínas globulares sofre desnaturação com perda de atividade

biológica quando aquecidas a 65ºC. No entanto, algumas proteínas que contêm
muitos resíduos de cisteína (que contém enxofre), precisam de ser aquecidas por
tempos mais longos e temperaturas mais elevadas para serem desnaturadas. Uma
dessas proteínas é a ribonuclease, que tem 124 resíduos de aminoácidos e quatro
ligações dissulfureto. Dê uma justificação molecular para esta propriedade.

3. A aldolase do músculo esquelético que catalisa a quebra de D-frutose 1,6-difosfato

em dihidroxiacetona fosfato e D-gliceraldeído 3-fosfato e vice versa, tem uma
massa molecular de aproximadamente 160 kDa e contem 4 subunidades iguais. A
acidificação leva a que as subunidades se dissociem e fiquem inativas. Após
neutralização, as subunidades reassociam-se rápida- e espontaneamente
formando de novo a enzima ativa.
Questões:
a) Enzimas com múltiplas subunidades são_____________
b) Nesta enzima, uma estrutura ________intacta é necessária para a atividade.
c) O ensaio de atividade para esta enzima usa a enzima triose fosfato isomerase
e a gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase que catalisam respectivamente as
reações:
1- dihidroxiacetona fosfato ó gliceraldeido-3-fosfato

2- gliceraldeído 3-fosfato + NAD+ ó 3-fosfoglicerato + H+ + NADH

Estas duas enzimas são usadas porque o aparecimento de NADH pode ser
medido por espectrofotometria. Que quantidade de cada enzima deve ser
usado?

28
 H C OH H C OH

BIOQUÍMICA CH2OPO3 2- CH2OPO3 2- PROBLEMAS

glucose-6-phosphate → fructose-6-phosphate
4. A enzima enolase que catalisa a desidratação do 2-fosfoglicerato para o converter
em fosfoenolpiruvato,
which is tem by
catalyzed uma exigência absoluta
phosphoglucose por iões divalentes (Mg2+ ou
isomerase.
Mn2+), que complexam com a enzima antes do substrato se ligar. A enzima é
a. What is its stoichiometry? answer
fortemente inibida por iões fluoreto.
b. What poderáis the simplest representation of this reaction in terms
M e dQue
S I U S c h o o l o f a) i c i n etipo de inibidor
B I O C H E M I Sser
TRYo fluoreto? Enzymes/Membrane Transport
b) A enolase catalisa of S,E,uma
and reação
P? answercritica na produção de energia e o fluoreto é
essencial em pequenas
c. What quantidades
are S,E, para
and P in this os ossos
reaction? e dentes mas tem sido
answer
usado como veneno para ratos. Explique a razão desta utilização.
c) O que6. A inferir
pode more do general
papelform of an
dos iões equationnesta
divalentes for anreação?
enzyme catalyzed
reaction is:
5. Um esquema mais geral de uma reação catalisada enzimaticamente é
k1 k2 k3
E+S ES EP E+P
U School of Medicine B I O C H E M I SkT R Y k-2 Enzymes/Membrane
k-3 Transport
-1
Considere para uma reação irreversível, o seguinte diagrama de energia e identifique
qual a constante de velocidade
Consider que limita
the essentially a velocidade
irreversible da represented
reaction reação? by the free-
a. Using below.
energy diagram the letters indicated in the diagram, relate each of the
rate constants in the Equation above to the energy-level dif-
ference that determines it. answer
b. Which rate constant limits the rate of formation of product?
answer
c. Does Km approximately equal Ks for this enzyme? answer

7.
To study the dependence of the rate of an enzyme-catalyzed reac-
tion on the substrate concentration, a constant amount of
enzyme is added to a series of reaction mixtures containing dif-
ferent concentrations of substrate (usually expressed in mol/L).
aculty: P.M.D. Hardwicke The initial reaction rates are determined byProblem
measuring the2num-
Unit - Page 43
6. Para estudar a ber
a. Using the letters indicated in the diagram, relatecatalisada
forma
of como
moles (or a velocidade
µmoles) of deconsumed
substrate uma reação
(or product pro-of thepor uma
each
enzima varia com rate a
duced) concentração
per minute.
constants de substrato,
Consider
in the such above
Equation adiciona-se
an experiment
to in whichuma
the energy-level quantidade
the dif-
initial
constante de enzima rates
a thatin Table
misturas 2 were
de reaçãoobtained at the indicated substrate
contendo diferentes concentrações de
ference
concentrations. determines it. answer
substrato. A velocidade inicial da reação é determinada quantificando o número de
b. Which rate constant limits the rate of formation of product?
moles de produtoTable
formado (ou
2: Initial deat substrato
rates consumido)
various substrate por minuto.
concentrations for a Imagine que
answer hypothetical enzyme-catalyzed reaction
obtém os seguintes dados:
c. Does Km approximately equal Ks for this enzyme? answer
[S] (mol/L) v (µmol/min)
7. To study the dependence of the rate of
2.0 X 10-1 60 an enzyme-catalyzed reac-
tion on the substrate concentration, a constant amount of
enzyme is added to 2.0aXseries 60 mixtures containing dif-
10-2 of reaction
ferent concentrations of substrate (usually
2.0 X 10-3 60 expressed in mol/L).
The initial reaction rates are determined by measuring the num-
ber of moles (or µmoles) -4
2.0 X 10of substrate48
consumed (or product pro-
duced) per minute. Consider such an
45 experiment in which the
1.5 X 10-4
initial rates in Table 2 were obtained at the indicated substrate
concentrations. 1.3 X 10-5 12

a) Qual é a Table
Vmaxa.da reação?
2:What
Initial rates
is V at various substrate concentrations for a
max for this reaction? answer
b) Por que é que v é hypothetical
constante para concentraçõesreaction
enzyme-catalyzed de substrato acima de 2.0 x
-3
10
Faculty: P.M.D. Hardwicke M? Problem Unit 2 - Page 44
[S] (mol/L) v (µmol/min)

2.0 X 10-1 60

2.0 X 10-2 60 29

2.0 X 10-3 60
BIOQUÍMICA PROBLEMAS

c) Qual é a concentração de enzima livre quando a concentração de substrato é

de 2.0 x 10-2 M?
d) Calcule o valor do Km?

7. Complete a seguinte tabela sabendo que o Km da enzima, que obedece à cinética

de MM, é igual a 1mmol/L.
[S] (mmol/L) Vi (µmol/L/min)
0,5 50
1,0
3,0
10,0

8. Sabendo que a ureia (H2N-CO-NH2) pode ser decomposta em CO2 e NH3, um

estudante interessado em obter NH3 rapidamente a partir de ureia, preparou uma
série de tubos e incubou-os a 30ºC por 10 minutos. Após este tempo, doseou a
amónia nos tubos. A composição dos tubos (com volume de 1 ml) e os resultados
das dosagens foram:

a) Porque é que não houve formação de NH3 no tubo 9?

b) Qual a velocidade da reação (em µmol/min) nos tubos 5 e 8?
c) De que depende a velocidade de reação nesta experiência?
d) Faça o gráfico de V0 versus [S] e determine a constante de Michaelis-Menten
(Km).

9. Imagine que pretende caracterizar uma nova enzima X e após medir a velocidade
de reação com diferentes concentrações de substrato obtém os seguintes dados:
[SUBSTRATO] (mM) VELOCIDADE INICIAL (mmol/min)
3,0 10,5
5,0 14,5
10 22,5
30 33,8
90 40,5
a) Esta reação segue a cinética simples de Michaelis menten?
b) Faça um gráfico com os dados da tabela e determine KM e vmax. Apresente
todos os cálculos que efetuar.
c) Imagine que decidia repetir esta experiência mas desta vez apenas com um
terço da concentração de enzima utilizado na primeira experiência. Qual o valor
de Km e Vmax ?

30
BIOQUÍMICA PROBLEMAS

10. A acetazolamida é usada como diurético para aumentar a produção de urina. A

atividade deste fármaco depende da sua capacidade de inibir a enzima anidrase
carbónica. O gráfico representa o efeito da droga na atividade da enzima.

d) Que tipo de inibidor é a acetazolamida? Justifique.

e) Porque razão este tipo de inibição é mais adequada para esta aplicação (pense
no efeito do substrato)?

11. Existem três tipos de metodologias utilizadas para a determinação das atividades
enzimáticas. Uma delas analisa o consumo de substrato durante a reação
enzimática, outra o produto formado durante a reação enzimática e ainda outra
pode analisar a variação da alteração de uma coenzima que participa na reação
enzimática acoplada. Analise as metodologias empregadas nos itens apresentados
a seguir e escreva qual a metodologia que foi empregada em cada um deles
justificando as suas respostas.
a) Determinação da atividade da amilase – técnica I
Princípio: A amostra é incubada com um substrato de amido e a diminuição da cor
azul, após a adição de iodo, é comparada com um controle sendo proporcional à
atividade da amilase na amostra. (o amido reage com o iodo originando um composto
de cor azul).
b) Determinação da atividade da amilase – técnica II
Princípio: A α-amilase hidrolisa o substrato α-(2-cloro-4-nitrofenil)-β-1,4-
galactopiranosilmaltoside (Gal-G2-α-CNP), libertando 2-cloro-4-nitrofenol (CNP) e 1,4
galactopiranosilmaltoside (Gal-G2). A velocidade de formação de CNP pode ser medida
espetrofotometricamente e proporciona uma medida direta da atividade da α-amilase
na amostra.
Gal-G2-α-CNP + H2O Gal-G2 + CNP

c) Determinação da atividade da AST:

Princípio: A transaminase do Aspartato (AST) catalisa especificamente a
transferência do grupo amina do aspartato para o alfa-cetoglutarato com formação de
glutamato e oxaloacetato. O oxaloacetato é reduzido a malato por ação da malato
desidrogenase (MDH, em excesso), enquanto que a coenzima NADH é oxidada a
NAD+.
AST
Aspartato + alfa-Cetoglutarato Oxaloacetato + Glutamato
MDH
Oxaloacetato + NADH Malato + NAD+

d) Determinação da atividade da fosfatase alcalina:

31
BIOQUÍMICA PROBLEMAS

Princípio: A fosfatase alcalina (FALC) do soro, em pH alcalino, hidrolisa o p-

nitrofenilfosfato libertando o p-nitrofenol e fosfato inorgânico, segundo a seguinte
reação:
p-Nitrofenilfosfato + H2O p-Nitrofenol + fosfato

A quantidade produzida de p-nitrofenol, que absorve luz a 450 nm, é diretamente

proporcional à atividade enzimática da fosfatase alcalina na amostra.

32