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Fotaleza - 2009
REGRAS DE SEGURANÇA DE LABORATÓRIO
Torna-se imprescindível que durante os trabalhos realizados em laboratório se
observe uma série de normas de segurança:
• Siga as instruções específicas dos professores e monitores;
• Evite conversar sobre assuntos não relacionados a aula;
• Use um jaleco apropriado;
• Não fume no laboratório;
• Nunca deixe frascos contendo solventes inflamáveis próximos ao calor;
• Evite contato de qualquer substância com a pele. Seja particularmente cauteloso ao
manusear reagentes corrosivos como ácidos e bases concentrados;
• Dedique especial atenção a qualquer operação que necessite aquecimento prolongado;
• Todos os procedimentos que envolvam a liberação de gases e/ou vapores tóxicos devem
ser realizados na capela;
• Ver as condições laboratoriais necessárias para a execução das análises;
• Relacionar e colocar todo o material necessário ao desenvolvimento da análise à
disposição no balcão, antes de iniciar o trabalho;
• Verificar a voltagem dos aparelhos antes de ligar na tomada. Desligá-los após o uso.
• Vidrarias após o uso devem ser recolhidas, descartando-se o material usado. Lavar com
água, detergente e enxaguar com água destilada. Secar adequadamente (estufa ou natural);
• Não jogue nenhum material sólido dentro da pia ou ralos;
• Bancadas e equipamentos devem ser limpas após o uso;
• Ao sair do laboratório verifique se não há torneiras (água ou gás) abertas;
Ocorrendo qualquer acidente, comunique imediatamente ao professor ou responsável, para
adoção das medidas cabíveis.
INTRODUÇÃO À BROMATOLOGIA
As análises de alimentos tiveram seu início no século XVIII em Paris – França no seio
das farmácias comerciais. Havendo na época muita fraude em alimentos, um farmacêutico
francês observou que através da determinação do princípio da densidade, poderia constatar
um tipo de adulteração do leite (adição de água).
Além do leite, outros produtos como óleos, vinhos, vinagre, farinhas, etc., passaram a ser
analisados, mas havia a falta de profissionais preparados para tal.
Por possuírem um currículo com uma boa carga horária de química, e pela necessidade de
um profissional que atuasse na área de análise de alimentos, as Faculdades de Pharmácia
foram as primeiras a criar uma disciplina específica sobre análise de alimentos que
inicialmente denominou-se de Química de Alimentos sendo esta a precursora da Química
Bromatológica e posteriormente da Bromatologia.
ANÁLISE DE ALIMENTOS
A fração umidade, cinzas e fibra não apresentam valor calórico. Glicídios e proteínas
fornecem aproximadamente 4,0 kcal/g, enquanto lipídios fornecem aproximadamente 9,0
kcal/g. Assim, conhecendo-se o teor percentual das frações que fornecem calorias podemos
estabelecer o valor calórico multiplicando-se por 4 as percentagens de glicídios e proteínas, e
por 9 o percentual de lipídeos, e em seguida somando-se os resultados. Este é o chamado
método indireto.
O valor energético também pode ser determinado pelo método direto através de uma
bomba calorimétrica. Em uma câmara de combustão, isolada do meio ambiente geralmente
pela água, queima-se determinada quantidade de amostra. Essa combustão provocará a
elevação da temperatura da água circulante, cujo volume é conhecido. Sabendo-se que 1 kCal
é a quantidade de calor capaz de elevar 1ºC o volume de um litro de água destilada, pode-se
correlacionar o aumento da temperatura com o peso da substância. O método direto pode
levar a um erro de determinação para mais, pois também são queimadas substâncias que não
são degradadas pelo organismo.
Conhecer as frações componentes de um alimento dá uma idéia do valor calórico e
nutritivo, entretanto ensaios de digestibilidade dão uma idéia mais aproximada.
A primeira etapa do trabalho é representada pelo preparo adequado da amostra que vai
ser analisada. A amostra tem valor quando representa globalmente o produto, por exemplo um
pão (casca e miolo), uma fruta, (casca, polpa e semente), a menos que haja interesse apenas
pela parte comestível deve ser feita a eliminação das partes não comestíveis.
É da amostra total do produto que se retira a chamada amostra média para exame,
que compreende uma porção da amostra que represente proporcionalmente todas as partes
contidas no todo, para isto deve ser feita, como regra prática, uma homogeneização da
amostra. Esta etapa é muito importante para obtenção de resultados corretos pois erros
cometidos nesta fase não poderão ser corrigidos, por mais que as análise sejam cuidadosas.
A quantidade de amostra a ser utilizada depende da disponibilidade e do tipo de
alimento analisado. Para determinações de rotina, os ensaios devem ser realizados em
triplicata e devem apresentar um desvio padrão aceitável.
A água está presente em todos os organismos vivos; faz parte dos alimentos de origem
vegetal e animal em quantidades variáveis. A fração umidade, sendo constituída
principalmente por água, não possui valor calórico. Proporcionalmente, quanto mais elevado
o teor de água menor a quantidade dos demais componentes.
Para alguns alimentos existem limites legais para a quantidade máxima de água
presente, como manteiga, margarina, leite em pó, queijos e outros.
A água dos alimentos pode estar em três formas: água livre, absorvida ou de estrutura
e água de hidratação ou ligada. A água livre não se encontra ligada a nenhuma estrutura
molecular dentro da célula e por isso é relativamente fácil de ser eliminada. A maior parte da
água presente nos alimentos está entre os poros do material na forma livre. A água absorvida
ou de estrutura está presente na superfície de macromoléculas como amido, pectina, celulose e
proteína; e água de hidratação está ligada quimicamente a outras substâncias do alimento, não
sendo eliminada na maioria dos métodos empregados. Tanto a água absorvida como a de
hidratação são normalmente encontradas em baixas quantidades.
Na prática, a determinação da fração umidade, é a primeira operação que se realiza,
pois algumas das outras determinações são feitas obrigatoriamente sobre o produto dessecado.
Existem vários métodos para determinação da umidade que podem ser empregados
dependendo do tipo de amostra: métodos termogravimétricos, termovolumétricos,
desidratação à temperatura ambiente, métodos químicos e instrumentais especiais. Para o
emprego de técnicas mais aprimoradas como a análise de aminoácidos e de ácidos graxos,
processos de secagem menos agressivos como a secagem a vácuo com ou sem elevação da
temperatura ou a liofilização, devem ser empregados para que a forma química dos
componentes não seja alterada.
MÉTODOS TERMOGRAVIMÉTRICOS OU INDIRETOS (DESSECAÇÃO ATÉ
PESO CONSTANTE)
105oC (4-6 h). A determinação é feita por diferença entre o peso do alimento úmido e o peso
do alimento seco. A fração umidade engloba todos os componentes voláteis a temperatura de
OUTROS MÉTODOS
Os resultados da análise de alimentos pode ser expresso para a amostra integral, para a
parte comestível da amostra ou para o produto dessecado. Todas estas formas estão corretas, o
mais importante é que haja clareza ao expressar o modo utilizado.
- DETERMINAÇÃO DE UMIDADE -
Método Termogravimétrico
OBJETIVO DA DETERMINAÇÃO
A cinza total é utilizada para verificar o valor nutricional de alguns alimentos e rações, é
um indicativo do índice de refinação de açúcares e farinhas e é utilizada também para estimar
o conteúdo de frutas em geléias e doces. A determinação dos componentes individuais das
cinzas é importante para determinar o valor nutricional, devido a essencialidade dos minerais
na dieta como também indicar a presença de alguns minerais que podem ser prejudiciais à
saúde e que estão presentes no solo, resíduos de agrotóxicos e de processos industriais.
MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO
CINZA SECA
Na determinação da cinza total podemos obter a cinza seca ou a cinza úmida. A cinza
seca é mais frequentemente utilizada por ser obtida através de uma técnica simples e útil em
análises de rotina.
A amostra é pesada em cadinhos, que podem ser de quartzo, porcelana, vycor, aço,
platina ou outro material que seja resistente a elevadas temperaturas.
A cinza seca é obtida após a destruição da matéria orgânica em temperatura de 500-
600°C, no forno mufla. Temperaturas abaixo de 500°C podem não destruir totalmente a
matéria orgânica, enquanto temperaturas maiores que 600ºC podem conduzir a perdas de
alguns dos constituintes. A perda pode ocorrer por volatilização ou interação entre os
constituintes da amostra, mesmo na faixa de temperatura indicada pela metodologia. Podemos
utilizar a incineração simples ou a incineração dupla. A incineração simples é a mais
utilizada, consiste em levar a amostra diretamente à temperatura de 550 ºC. A incineração
dupla é usada para amostras ricas em carboidratos, que formam espuma, o que poderia levar a
perdas. Neste caso a amostra sofre uma carbonização prévia, na faixa de 200 ºC para, em
seguida, ser calcinada a 550 ºC.
O tempo de incineração varia com o produto e o método. A determinação termina
quando o material se torna totalmente branco ou cinza, o que geralmente acontece após várias
horas no forno mufla.
Alguns cuidados devem ser tomados dependo do tipo de amostra analisada. Amostras
líquidas ou úmidas devem ser secas em banho-maria ou estufa; as que são ricas em material
volátil devem ser aquecidas vagarosamente para fumegar sem pegar fogo; amostras ricas em
gordura devem ser aquecidas lentamente para evitar a formação de chama; produtos
açucarados tendem a formar espuma, isto pode ser evitado usando-se vaselina ou azeite de
oliva em pequenas quantidades (estes produtos não possuem elementos minerais).
A pesagem das cinzas deve ser feita cuidadosamente por se tratar de um material muito
leve que pode ser perdido facilmente. Algumas são muito higroscópicas, portanto devem ser
pesadas rapidamente.
CINZA ÚMIDA
Alguns elementos são voláteis na temperatura utilizada para determinação da cinza seca,
como o chumbo, arsênio e mercúrio, entre outros. Na determinação da cinza úmida usamos
temperaturas mais baixas e um ou mais ácidos fortes para a completa decomposição da
matéria orgânica. A digestão pode ser feita com um único ácido (H2SO4 ou HNO3), mas às
vezes não é suficiente para completa digestão da matéria orgânica. Uma mistura
frequentemente utilizada é a de ácido sulfúrico e ácido nítrico (H2SO4-HNO3). O ácido
perclórico também pode ser utilizado misturado ao ácido nítrico. A mistura dos três ácidos
citados também pode ser utilizada, mas requer maiores cuidados como o controle exato da
temperatura.
- DETERMINAÇÃO DE CINZAS -
Cálculos:
Cinzas % = 100 x N
p
N = nº de g de cinzas
p = nº de g da amostra
ANÁLISE DE LIPÍDEOS
MÉTODO DE SOXHLET
A extração da fração lipídica pode ser feita com o solvente quente ou pelo método a
frio. O método de Soxhlet é recomendado pelo Instituo Adolfo Lutz, sendo portanto um
método oficial.
Neste método, o processo de extração é intermitente, o solvente aquecido é
volatilizado e após a condensação passa pela amostra várias vezes, a cada passagem extrai
uma parte dos lipídeos que são arrastados para o balão. A temperatura deve ser controlada,
pois a velocidade do refluxo sendo muito alta pode levar a pouca penetração do solvente na
amostra. Como a amostra não fica em contato com o solvente muito quente, as alterações são
minimizadas.
A amostra deve estar dessecada para que o solvente penetre mais eficientemente e o
solvente deve ser isento de água para que substâncias hidrossolúveis não sejam extraídas
juntamente com os lipídeos.
O aparelho de Soxhlet consiste em condensador, extrator de sifão e balão de fundo
chato sobre uma chapa aquecedora. O balão deve estar limpo e desengordurado e deve ser
pesado antes do início da extração. A amostra é pesada em um cartucho poroso ou
acondicionada em papel de filtro e colocada no extrator de sifão. O solvente é colocado sobre
a amostra em quantidade suficiente para ser sifonado. O final do processo de extração pode
ser verificado através do teste da mancha, que é feito coletando-se algumas gotas do solvente
que está sendo sifonado e observando-se a presença ou não de uma mancha de gordura.
MÉTODO DE BLIGH-DYER
Cálculos:
A degradação de lipídios pode ser ocasionada por diversos fatores como oxidação,
hidrólise, polimerização e outros. Algumas destas alterações podem modificar a qualidade
sensorial (sabor, aroma, textura e cor), o valor nutricional, como também levar à formação de
compostos tóxicos. Estas mudanças podem ocorrer durante a produção, processamento,
armazenamento ou preparo do alimento.
A caracterização de óleos e gorduras é feita através de uma série de índices que se
baseiam nas propriedades físicas, químicas e físico-químicas desses produtos. São raros os
lipídeos que possuem reação característica específica e, mesmo neste caso, a simples reação
não garante a pureza destes lipídeos. Quando tomados em conjunto, estes índices ou
constantes servem para identificação e avaliação da maioria dos óleos e gorduras.
Os métodos de cromatografia em fase gasosa são aplicados para o conhecimento da
composição dos ácidos graxos destes compostos. Existem algumas fraudes que só podem ser
detectadas por esta técnica, visto que os índices físico-químicos do produto final caem dentro
dos intervalos característicos do óleo puro, como exemplo: óleo de milho fraudado pela
adição de óleo de colza, óleo de oliva fraudado pela adição de óleo de babaçu e de soja.
Reação de Kreiss: A floroglucina reage em meio ácido com os triglicerídeos oxidados, dando
uma coloração rósea ou vermelha, cuja intensidade aumenta com a deterioração, devido,
provavelmente, à presença de aldeído malônico ou de aldeído epidrínico.
Material: Pipeta de 5 ml, proveta de 10 ml e proveta de 50 ml com rolha
esmerilhada.
Reagentes: Ácido clorídrico, solução de floroglucina a 0,1% em éter.
Procedimento: Transfira, com o auxílio de uma pipeta, 5 ml da substância fundida para uma
proveta de 50 ml, com rolha esmerilhada. Adicione 5 ml de ácido clorídrico e agite por 30
segundos. Adicione 5 ml de uma solução de floroglucina a 0,1% em éter. Agite novamente
por 30 segundos e deixe em repouso per 10 minutos. Na presença de substâncias rançosas, a
camada inferior apresentará uma coloração rósea ou vermelha.
Nota: Se a intensidade da coloração for fraca, compare a camada inferior com
uma quantidade análoga de solução de permanganato de potássio a 0,0012% (3,8 ml de uma
solução 0,01N elevada a 100 ml ). Se a intensidade for a mesma, ou inferior, o resultado pode
deixar de ser levado em consideração, se os caracteres organolépticos do produto forem
satisfatórios.
Cálculos:
Acidez em ml sol. N% = V x f x 10
P
Índice de Refração
Transferir o resíduo para o mesmo béquer, desta vez com o auxílio de 200ml de
solução 1,25% de hidróxido de sódio, igualmente aquecido. Novamente adaptar ao béquer o
refrigerador de refluxo e aquecer até a ebulição que deverá ser mantida por 30 minutos.
Findo esse tempo, filtrar sobre papel de filtro de cinza conhecida e previamente
tarado (estufa a 105°C, esfriar em dessecador e pesar). Lavar com água destilada quente,
retirando todo o material existente no frasco. Continuar lavando até que o filtrado não mais
apresente alcalinidade (verificar com papel indicador).
Lavar em seguida, o resíduo contido no papel filtro, duas vezes com álcool e duas
vezes com éter. Após evaporação total do éter levar à estufa a 105°C, até peso constante. Tem-
se assim a fibra total.
MÉTODO DE KJELDAHL
Este método foi proposto por Kjeldahl na Dinamarca em 1883 e tem passado por
várias modificações e desde então até hoje, é o mais amplamente adotado e o mais indicado
para amostras de origem biológica. Na determinação da fração protéica pelo método de
Kjeldahl, obtém-se o nitrogênio total da amostra, que é transformado em nitrogênio protéico
através de cálculos, considerando-se que cada 100g de proteína contém em média 16g de
nitrogênio. Desta forma, o fator 6,25 multiplicado pelo percentual de nitrogênio total da
amostra, corresponderá ao percentual de proteína da mesma.
100g de proteína -----16g N
X -----1g N ; X = 6,25 (fator que converte nitrogênio em proteína)
3a) titulação:
Determinação quantitativa do amônio contido na solução receptora
NH4H2BO3 + HCl NH4 Cl + H3BO3
Pesar (o peso não deve ser superior a 0,1g) a amostra seca (para evitar a formação de
espuma durante a digestão), utilizando papel manteiga. Transferir a amostra enrolada no papel
para um tubo de micro-Kjeldahl (tubo Tecnal). Adicionar ao tubo 600mg de K2SO4 (aumenta
o ponto de ebulição do H2SO4 de 180o para 400o C, tornando a digestão mais rápida), 300mg
de CuSO4 (catalisador que promove a ativação do oxigênio tornando-o com maior poder de
oxidação) e 20 ml de H2SO4. Proceder a digestão no bloco digestor, em capela, até que a
amostra se torne incolor. A temperatura da digestão deve ficar entre 370°C e 410°C.
Após a digestão adaptar o tubo ao aparelho de micro-Kjeldahl (destilador), colocar um
erlenmeyer contendo 10ml de solução de ácido bórico e indicadores (vermelho de metila e
verde de bromocresol) na sua posição para receber o destilado, tomando-se o cuidado de
mergulhar a ponta do destilador na solução. Adicionar, lentamente, 15ml da solução de NaOH
a 50%. Receber o destilado no erlenmeyer, coletando aproximadamente 50 ml do destilado.
Titular o destilado com a solução de HCl 0,02N até o aparecimento de coloração violeta ou
rosa.
CÁLCULOS
Transformar a quantidade de nitrogênio total em proteína utilizando as seguintes
fórmulas:
Nitrogênio (g) = N HCl x V x 14
1000
P = peso da amostra
V = volume da solução gasto na titulação.
Determinação de Sacarose em Açúcar Comercial