SENAI - Serviço Nacional de Aprendizagem Industrial

SENAI Américo Rene Gianetti

Gabriel Falletti Bittencourt

Guilherme dos Santos Peixoto de Matos
Leonardo Henrique Gonçalves Sena Ferreira
Victor Maurício Maia Couto

Relatório da prática 05 de imunologia:

Técnicas de pipetagem

Belo Horizonte - MG
01/12/2021
 Lista de abreviaturas e siglas

Sol. Solução

Qnt. Quantidade

Pur./Con. Pureza ou concentração

Fab. Fabricação

Med. máx. Medida máxima

vol. Representação da grandeza volume em texto

nº Número

V Representação da grandeza volume quanto variável

M Concentração molar

MM Massa molar

P% Percentual de pureza

mr Massa real ou ideal

µ Letra grega micro; no S.I. representa o prefixo de valor 10−6

S.I. Sistema Internacional de medidas

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

 Lista de ilustrações

Figura 1 – Exemplo de pipeta volumétrica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

Figura 2 – Exemplo de pipeta graduada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
Figura 3 – Exemplo de micropipeta. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
Figura 4 – Diferentes tipos de pipetadores. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
Figura 5 – Microtubos no suporte, visão lateral. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
Figura 6 – Microtubos no suporte, visão aérea. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
Figura 7 – Microplaca fundo chato após diluição seriada. . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
Figura 8 – Comparação entre microplacas fundo chato e em ’U’ após diluição seriada. . . . 17
Figura 9 – Micropipeta 0,5 - 10 µL. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Figura 10 – Micropipeta 10 - 100 µL. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Figura 11 – Micropipeta 500 µL. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
Figura 12 – Micropipeta multicanal 20 - 200 µL com microplaca fundo chato e banheira de
permanganato de potássio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
Figura 13 – Pipetando 50 µL de água nos poços da microplaca de fundo chato. . . . . . . . 23
 Lista de tabelas

Tabela 1 – Reagentes e soluções utilizadas no desenvolvimento. . . . . . . . . . . . . . 10

Tabela 2 – Equipamentos utilizados na prática. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
Tabela 3 – Vidrarias utilizadas no processo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
Tabela 4 – Utensílios utilizadas no processo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
Tabela 5 – Micropipetas e volumes de solução de KM nO4 transferidos descritos na subse-
ção 4.2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
 Sumário

1 Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
2 Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.1 Geral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.2 Específicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
3 Materiais utilizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
4 Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
4.1 Preparo da solução de permanganato de potássio . . . . . . . . . . . 12
4.2 Transferências de líquidos através de pipetagem . . . . . . . . . . . . 13
4.3 Diluição seriada com micropipeta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
5 Resultados e discussões . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
6 Considerações finais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

REFERÊNCIAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

APÊNDICE A – VOLUMES E MICROPIPETAS . . . . . . . . . . . . 20

APÊNDICE B – ALGUMAS DAS MICROPIPETAS UTILIZADAS . . 21

APÊNDICE C – PIPETAGEM DE ÁGUA NOS POÇOS . . . . . . . 23

1 Introdução
De acordo com o site Dicio, Dicionário Online de Português, PIPETAR se refere ao
ato de "transferir volumes com auxílio de uma pipeta". As pipetas são instrumentos
essenciais em um laboratório, onde, sem a presença desta, seria inviável os processos
analíticos, devido à grande demanda de manipulação tanto das amostras quanto dos
reagente envolvidos.
Existem variados tipos de pipetas, como as volumétricas (imagem 1), gradua-
das(imagem 2) e as micropipetas ou automáticas, como também são chamadas (ima-
gem 3).(SANCHES, 2016)

Figura 1 – Exemplo de pipeta volumétrica.

Fonte: Disponível em: <https://bit.ly/3lHOzha> Acesso em: 6 dez. 2021

Figura 2 – Exemplo de pipeta graduada.

Fonte: Disponível em: <https://bit.ly/3y3WDh7> Acesso em: 6 dez. 2021

 Figura 3 – Exemplo de micropipeta.

Fonte: Disponível em: <https://bit.ly/3oy5vIW> Acesso em: 6 dez. 2021

Alguns dos equipamentos auxiliares para o processo de pipetagem, aqueles que

são utilizados para realizar a sução e expulsão dos líquidos, são os pipetadores elé-
tricos (elemento ’C’ da imagem 4) e os pipetadores manuais, como o elemento ’A’,
comumente denominados de peras e o elemento ’B’. (FERREIRA et al., 2001)

Figura 4 – Diferentes tipos de pipetadores.

Fonte: Disponível em: <https://bit.ly/3DDLGUU> Acesso em: 6 dez. 2021

De acordo com Moulatlet (2013), as automáticas foram inventadas em 1940 po

George Riggs, com o objetivo de serem uma alternativa às pipetas graduadas de
vidro, onde a pipetagem era realizada com a boca. O invento evitaria tal prática que
é atualmente inaceitável em um laboratório, como consta o item 32.10.14 da Norma
Regulamentadora 32 ((ANVISA, 2019)).
Dentre os fatores que determinam uma boa utilização de pipetas automáticas,
pode-se citar o uso de pipetas que possuam uma faixa de volume ideal para o vo-
lume a ser pipetado; no momento de realizar a sucção do líquido, respeitar a primeira
’resistência’ presente no botão de pipetar e, no momento de dispensar o líquido, seguir
até a segunda ’resistência’ do botão. ((MOULATLET, 2013))
2 Objetivos

2.1 Geral

Praticar e testar as técnicas de pipetagem de diferentes volumes micrométricos em

diferentes contextos.

2.2 Específicos

• Preparar 100 mL de solução de KM nO4 de concentração 0,02 M ;

• Realizar a transferência de determinados volumes e transferi-los para respecti-

vos microtubos com micropipetas ideais;

• Fazer diluição seriada de 50 µL de solução de KM nO4 em microplaca de fundo

chato com micropipeta multicanal;

• Fazer diluição seriada de 150 µL de solução de KM nO4 em microplaca de fundo

em ’U’ com micropipeta multicanal.
3 Materiais utilizados
A seguir estão listados todos os materiais utilizados na prática, organizados por
meio de tabelas que segmentam os materiais por tipo.1

Tabela 1 – Reagentes e soluções utilizadas no desenvolvimento.

Nome Pur./Con. Lote Qnt. Fabricante Validade Fab.

Permanganato 99,3% 40433 0,3328 g Dinâmica 07/2014 07/2010

de potássio
Sol. 1,0% *** 250 mL *** *** ***
hipoclorito
de sódio
Água *** *** *** *** *** ***
destilada
Sol. per- 0,02 M *** 25 mL *** *** ***
manganato
de potássio
Fonte: Os autores.

Tabela 2 – Equipamentos utilizados na prática.

Nome Marca Modelo/nº série Med.máx.

Balança analítica Marte AY220 200 g

Micropipeta BioPet *** 0,5 - 10 µL

Micropipeta Digipet *** 10 - 100 µL

Micropipeta Digipet *** 100 - 1000 µL

Micropipeta Kasvic Basic *** 20 - 200 µL

Micropipeta vol. fixo *** *** 200 µL

Micropipeta vol. fixo ICELL MOD. P-213 500 µL

Micropipeta vol. fixo ICELL MOD. P-213 1000 µL

Fonte: Os autores.

1
Nas tabelas 2 e 3 foram utilizados apenas uma unidade de cada item.
 Tabela 3 – Vidrarias utilizadas no processo.

Nome Med. máx./Tamanho Fabricante

Béquer 600 mL Uniglass

Béquer 100 mL FMG

Vidro de relógio Médio ***

Bastão de vidro *** ***

Fonte: Os autores.

Tabela 4 – Utensílios utilizadas no processo.

Nome Qnt. Med. máx./Tamanho

Pipeta Pasteur 1 3 mL

Microtubo 20 2 mL

Suporte para microtubo 1 32 espaços

Marcador permanente 1 ***

Ponteira pipeta 0,5 - 10 µL 3 ***

Ponteira pipeta 10-100 e 200 5 ***

µL
Ponteira pipeta 500, 1000 e 3 ***
100-1000 µL
Microplaca fundo 1 96 poços
chato/Marca: Costar
Microplaca fundo em ’U’ 1 96 poços

Banheira 2 60 mL

Espátula metálica 1 Grande

Rolha para balão 100 mL 1 ***

Pisseta com água destilada 1 500 mL

Fonte: Os autores.
4 Procedimento

4.1 Preparo da solução de permanganato de potássio

1. Foram selecionados um vidro relógio médio, bastão de vidro, béquer 100 mL,
espátula metálica grande e o reagente permanganato de potássio;

2. Os materiais como a espátula, béquer, bastão de vidro e vidro de relógio foram

identificados com marcador permanente;

3. A balança analítica foi acionada e sua calibração e limpeza foi realizada com o
peso padrão de 200 g;

4. Logo após, e com auxílio da espátula, o permanganato de potássio foi transferido

para o vidro de relógio que já se encontrava dentro da balança analítica, na
intensão de se aferir 0,3183 g de permanganato para se preparar 100 mL de
solução a 0,02 M ; 2

5. Após aferida, a massa de permanganato de potássio foi transferida, com auxílio

da mesma espátula utilizada anteriormente, para o béquer de 100 mL, onde foi
acrescido cerca de 75 mL de água destilada através da pisseta juntamente com
o composto;

6. A homogenização foi inicialmente realizada por meio de movimentos circulares

com posterior agitação com bastão de vidro;

7. A pré-solução foi transferida para o balão de 100 mL, tendo sido o béquer sujeito
a três lavagens consecutivas com água destilada através de pisseta e o resultado
da lavagem, transferido para o balão;

8. Foi acrescido ao balão água destilada com a pisseta até que se chegasse pró-
ximo do menisco, que foi alcançado fazendo-se uso de uma pipeta Pasteur com
água destilada, armazenada em um no mesmo béquer utilizado para lavagem;

9. O balão foi selado com a rolha apropriada e posteriormente agitado;

2
O valor da massa verdadeiramente aferida pode ser encontrada na tabela 1.
4.2 Transferências de líquidos através de pipetagem

10. Anteriormente ao início do processo de pipetagem, foi preparado uma béquer de

600 mL com ≈250 mL de solução de hipoclorito de sódio 1% para o descarte
de ponteiras;

11. 18 microtubos de 2 mL foram identificados com os volumes que lhes seriam

adicionados por meio de marcador permanente e foram posicionados no suporte
para microtubos;

12. Um pouco do volume da solução de permanganato de potássio, anteriormente

preparada, foi transferida para uma banheira de 60 mL para que, dali, fossem
pegos os volumes necessários para serem transferidos para os microtubos;3

13. A micropipeta de 0,5 - 10 µL foi selecionada, acoplada a sua ponteira ideal e

utilizada para transferir 4 vezes os volumes de 2,5 , 5 e 10 µL da solução de
permanganato de potássio, para os microtubos levando a ponteira até o fundo
do microtubo, onde a solução é depositada; 4

14. O mesmo processo se repetiu para todos os outros 15 microtubos restantes, com
a diferença de que para os volumes de 50 e 100 µL foi-se utilizada a pipeta de
de 10 - 100 µL, enquanto para o volume de 200 µL foi utilizada micropipeta de
volume fixo de 200 µL, o volume de 500 µL, a micropipeta de volume fixo de
500 µL, para o volume de 1000 µL, a micropipeta volume fixo de 1000 µL e os
volumes 150, 250, 300, 350, 400, 450, 600, 700, 800 e 900 µL, a micropipeta de
100 - 1000 µL;

4.3 Diluição seriada com micropipeta

15. Uma nova banheira de 60 mL foi selecionada e preenchida com água destilada
e a banheira de 60 mL já utilizada anteriormente foi preenchida com mais certa
3
Inicialmente a solução se encontrava em um béquer de 100 mL (não listado nos materiais). A
alteração se fez necessária em vista de que um béquer não se tratava do recipiente ideal para se
realizar tal processo, como na pipetagem com uma micropipeta multicanal.

4
O fato do processo ter se repetido por 4 vezes esta justificado na seção 5. Isto se repete para todas
as outras transferências de volumes desta subseção.
 quantidade de solução de permanganato de potássio para ser utilizada nova-
mente;

16. Uma micropipeta multicanal foi selecionada juntamente com suas ponteiras e
uma microplaca de fundo chato de 96 poços, onde estes foram preenchidos
com 50 µL da água destilada proveniente da banheira, através da micropipeta
multicanal;

17. Com todos os poços preenchidos, foi realizada a pipetagem de 50 µL da solução

de permanganato de potássio contido na banheira e estes foram transferidos
para a primeira fileira de 8 poços, onde se deu início ao processo de diluição
seriada até a fileira 12 da microplaca; 5

18. O mesmo processo foi realizado para uma microplaca de funfo em ’U’, mas, desta
vez, os poços foram preenchidos com 50 µL de água destilada e, posteriormente,
a diluição seriada foi feita com 150 µL de KM nO4 havendo homogenização a
cada série de diluição, realizando a sucção e expulsão do líquido; 6

5
Uma imagem do resultado deste processo pode ser conferida pela imagem 7 e uma imagem do
processo de transferência de água destilada para os poços pode ser visualizada no apêndice C!

6
Uma imagem do resultado do processo, juntamente com o processo anterior, permitindo uma dife-
renciação, pode ser conferida na imagem 8!
5 Resultados e discussões
A massa aferida de KM nO4 , como é possível se conferir na tabela 1, teve uma dife-
rença ligeiramente grande em relação ao valor necessário para se obter uma solução
o mais próximo possível do valor de concentração esperado (0,02 M ).
A massa necessária para se obter uma solução de 100 mL com tal concentração
é dada pela equação,

V(Sol.) · M M(KM nO4 ) · M(Con. desejada) · 100%

mr = (1)
P%

onde M M(KM nO4 ) = 158,034 g · mol−1 e os valores das outras variáveis podem ser
encontrados anteriormente citados e na tabela 1. Tal equação resulta em uma massa
ideal de 0,3183 g de M M(KM nO4 ) .
Entretanto, tal ocorrido não se mostrou tão danoso ao processo, tendo em vista
que este era puramente qualitativo.
De acordo com o descrito no processo 13 da seção 4, os volumes especificados
na tabela 5 disponível no apêndice A se deve pelo motivo de que cada integrante da
equipe (os autores do presente relatório) pudessem ter a experiência de realizar a
transferência destes mais variados volumes de líquidos, aperfeiçoando suas técnicas
de pipetagem.
Na imagem 5, a solução de permanganato de sódio transferida para os microtubos
pode ser visualizada lateralmente através de um espaço presente no suporte para
microtubos.

Figura 5 – Microtubos no suporte, visão lateral.

Fonte: Os autores.
 É possível notar na imagem 6 que há a presença de mais microtubos do que os
especificados durante a descrição do procedimento de transferência (4.2). Isso se
deve ao fato de que, como eram quatro medidas do mesmo volume, a capacidade do
microtubo era excedida e se fazia necessário a utilização de mais um microtubo para
comportar o volume demandado.

Figura 6 – Microtubos no suporte, visão aérea.

Fonte: Os autores.

No que diz respeito às diluições seriadas realizadas no processo descrito na sub-

seção 4.3, a primeira diluição (na microplaca de fundo chato) resultou, como pode ser
visualizado na imagem 7, em uma clara diminuição da intensidade da coloração dos
poços que apresentaram um fator de diluição maior o que acaba por confirmar que tal
diluição de fato ocorreu.

Figura 7 – Microplaca fundo chato após diluição seriada.

Fonte: Os autores.

O mesmo pode ser visto na imagem 8 comparativa da microplaca fundo chato à

esquerda e da microplaca fundo ’U’ à direita, mas com uma mudança menos percep-
tível ao longo das fileiras de poços da placa. Isso se deve, como descrito no item 18,
ao acréscimo de uma volume maior da solução de permanganato de potássio, o que
resultou em fatores de diluição maiores para que o fenômeno ocorresse.

Figura 8 – Comparação entre microplacas fundo chato e em ’U’ após diluição seriada.

Fonte: Os autores.
6 Considerações finais
Como muito bem explicado na seção 5, a massa real aferida na balança analítica
se diferiu da masa real teórica necessário para se produzir uma solução 100 mL de
KM nO4 à 0,02 M , devido ao fato de op processo ser qualitativo, não necessitando de
aferições tão precisas, poupando tempo.
A transferência dos volumes listados na tabela do apêndice A se deu po completo
e sem mais dificuldades, como proposto no roteiro de prática. Havendo apenas al-
guns infortúnios, como algumas micropipetas falhando, mas nada que não pôde ser
rapidamente resolvido.
Quanto às diluições seriadas, apenas na segunda diluição, a que ocorreu na micro-
placa de fundo em ’U’, é que houve homogenização a cada fileira de diluição, ficando
a noção de que, em um processo de diluição seriada aplicada a uma situação real, tal
falta de homogenização poderia ser essencial para o experimento em curso.
Ademais, o processo de diluição se sucedeu muito bem e a diferença de contraste
entre as cores dos poços mais diluídos para os menos diluídos, como era esperada,
foi observada.
 Referências

AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Segurança e Saúde

no Trabalho em Serviços de Saúde. NR 32, 2019. 37 p. Disponível em:
<https://pncq.org.br/wp-content/uploads/2020/05/NR-32-2019.pdf>. Acesso em: 6
dez. 2021.

FERREIRA, C. et al. Equipamentos - Utilização e monitoramento em unidades

hemoterápicas e laboratórios de saúde pública. [S.l.], 2001. Disponível em:
<https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22113/mod_resource/content/1/
manualEquipamentos.pdf>. Acesso em: 6 dez. 2021.

MOULATLET, A. C. Pipeta automática. 2013. Disponível em: <http://labiq.iq.usp.br/

paginas_view.php?idPagina=13&idTopico=65#.Ya5P8rDMK00>. Acesso em: 6 dez.
2021.

PIPETAR. In: Dicio, Dicionário Online de Português. Porto: 7Graus, 2021: [s.n.].
Disponível em: <https://www.dicio.com.br/pipetar/>. Acesso em: 6 dez. 2021.

SANCHES, C. A importância da pipetagem nos processos analíti-

cos. 2016. Disponível em: <https://www.labnetwork.com.br/especiais/
a-importancia-da-pipetagem-nos-processos-analiticos/>. Acesso em: 6 dez.
2021.
 APÊNDICE A – VOLUMES E MICROPIPETAS

Tabela 5 – Micropipetas e volumes de solução de KM nO4 transferidos descritos na subseção 4.2.

Micropipeta Volumes transferidos (µL)

Micropipeta 0,5 - 10 µL 2,5, 5 e 10

Micropipeta 10 - 100 µL 50 e 100

Micropipeta 100 - 1000 µL 150, 250, 300, 350, 400, 450, 600,
700, 800 e 900
Micropipeta 200 µL 200

Micropipeta 500 µL 500

Micropipeta 1000 µL 1000

Fonte: Os autores.
APÊNDICE B – ALGUMAS DAS MICROPIPETAS
UTILIZADAS

Figura 9 – Micropipeta 0,5 - 10 µL.

Fonte: Os autores.

Figura 10 – Micropipeta 10 - 100 µL.

Fonte: Os autores.
 Figura 11 – Micropipeta 500 µL.

Fonte: Os autores.

Figura 12 – Micropipeta multicanal 20 - 200 µL com microplaca fundo chato e banheira de perman-
ganato de potássio.

Fonte: Os autores.
APÊNDICE C – PIPETAGEM DE ÁGUA NOS POÇOS