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M.Sc. PROJETO E DISSERTAÇÃO

SOBRE

EXTRAÇÃO DE PEPTÍDEOS BIOATIVOS DA SEMENTE DE ABÓBORA E SUAS

APLICATIVO

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

ESCOLA DE AGRICULTURA

ADORÁVEL UNIVERSIDADE PROFISSIONAL

ÍNDIA

ENVIADO POR: -

Harjeet Kaur

Número de registro: -11705950

Número do rolo: -RH1730A06

SUPERVISOR: -

É. Poorva Sharma

Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos

escola de agricultura

Adorável Universidade Profissional

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Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos

escola de agricultura

Adorável Universidade Profissional

PROPOSTA DE PROJETO E PLANO DE DISSERTAÇÃO

Da proposta de Projeto de Pesquisa para o grau de

MESTRADO DE CIÊNCIAS

EM

Ciência e Tecnologia de Alimentos

Nome do Bolsista de Pesquisa: Harjeet Kaur

Número de registro: 11705950

Número do rolo: RH1730A06

Nome do Supervisor: Er. Poorva Sharma

Título da Pesquisa: Extração de Peptídeos Bioativos da Semente de Abóbora e seus

Aplicativo

Assinatura do Pesquisador Acadêmico:

Aprovado pelo Coordenador

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CERTIFICADO

Isto é para certificar que Harjeet Kaur (Registro NO. 11705950) concluiu pessoalmente o M.Sc.
Pré-dissertação intitulada 'EXTRAÇÃO DE PEPTÍDEOS BIOATIVOS DE ABÓBORA

SEED E SUAS APLICAÇÕES' sob minha orientação e supervisão. Tanto quanto é do meu conhecimento,
o presente trabalho é o resultado de uma investigação e estudo originais ocultos. Nenhuma parte da
dissertação-1 foi submetida para qualquer outro propósito na universidade.

O relatório de projeto é adequado à submissão e cumprimento parcial das condições de avaliação

conducente à atribuição do grau de Mestre em Ciência e Tecnologia Alimentar.

Data: maio de 2018 Assinatura do Supervisor

Er: Poorva Sharma

Professor assistente

escola de agricultura

Adorável Universidade Profissional

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Phagwara, Punjab, Índia

DECLARAÇÃO

Declaro que o trabalho apresentado no relatório pré-dissertação intitulado 'EXTRAÇÃO DE PEPTÍDEOS

BIOATIVOS DA SEMENTE DE ABÓBORA E SUAS APLICAÇÕES' é de minha autoria e original. O trabalho
foi realizado por mim na escola de Agricultura, Lovely Professional University, Phagwara, Punjab, Índia; sob
a orientação da Sra. Poorva Sharma, Professora Assistente (Ciência e Tecnologia de Alimentos) na escola
de Agricultura, Lovely Professional University, Phagwara, Punjab, Índia, para a concessão do grau de Mestre
em Ciência e Tecnologia de Alimentos.

Data: maio de 2018 Harjreet Kaur (11705950)

Eu certifico que a declaração acima feita pelo aluno está correta com o melhor de meu conhecimento e
crença.

Data: maio de 2018, Er. Poorva Sharma

Professor assistente

escola de agricultura

Adorável Universidade Profissional

Phagwara, Punjab, Índia

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Índice

Contente Páginas

Introdução 6

Literatura de revisão 7 - 21

declaração do problema 22

Objetivos de pesquisa 23

Metodologia de Pesquisa 24 - 31

Resultado esperado 32

Referências 33 - 34
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Introdução CAPÍTULO 1

peptídeo bioativo

Peptídeos bioativos são as partículas de proteína que apresentam atividade biológica e fornecem

efeito sobre a função do corpo acaba afetando a saúde (Kitts & Weiler, 2003). É formado por amino

ácidos ao se unir com a ajuda de ligação peptídica. Peptídeos bioativos são derivados de vários

fontes alimentares para seus benefícios e essas fontes incluem amendoim, semente de abóbora, semente de gergelim,

leite e fontes marinhas. Os efeitos benéficos desejáveis dos peptídeos bioativos são atribuídos a

diferentes propriedades encontradas em peptídeos como antimicrobianos (Reddy et al., 2004; Rajanbabu e

Chen 2011), antioxidante (Sarmadi e Ismail, 2010), antitrombótico (Wang e Ng, 1999), anti

hipertenso (Erdmann et al., 2008), atividades imunomoduladoras (Georgiev, 1990; Gauthier et al.,

al., 2006), e potenciais probióticos, entre outros. O consumo de alimentos industrializados com

conservantes químicos levou ao aumento da preocupação do consumidor e à demanda por produtos mais naturais

e alimentos minimamente processados. Como resultado, os pesquisadores têm mostrado um crescente interesse em

agentes antimicrobianos, como certos peptídeos. O crescente interesse pela BP tem motivado a

comunidade científica e a indústria de alimentos para pesquisar e explorar o desenvolvimento de novos

aditivos alimentares e produtos funcionais à base desses peptídeos. Peptídeos bioativos extraídos de

a semente de abóbora em comparação com a abóbora inteira é mais benéfica devido a mais proteína

contente. Embora alguns PB existam gratuitamente como fonte natural, a maioria dos BP conhecidos são

criptografados na estrutura das proteínas-mãe e são liberados principalmente por reações enzimáticas.

Alguns BP 11/05/2018 foram sintetizados quimicamente.

Extrair peptídeos bioativos de alimentos com microrganismos probioativos ajuda a aumentar

os componentes benéficos que influem na saúde. Cepas probioativas como Lactobacillus

helveticus, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus

acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus brevis utilizados no estudo para extração de

componentes bioativos. Nosso principal objetivo é a extração de peptídeos bioativos e a verificação de sua

formulários.
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Literatura de revisão CAPÍTULO 2

Peptídeos bioativos são partículas de proteínas combinadas na célula na evolução de imensos

prepropeptides, que são novamente divididos e alterados para dar resultados ativos. Como moléculas sinalizadoras,

os peptídeos bioativos desempenham papéis importantes em funções fisiológicas e patogênese (INT.J

BIOAUTOMAÇÃO, 2011). Peptídeos bioativos são biomoléculas onipresentes amplamente abundantes

e facilmente obtido a partir de proteínas alimentares. Existem tantos peptídeos bioativos obtidos de

proteína alimentar única. O papel das substâncias ativas derivadas de proteínas na dieta é aumentado. Em

No ano passado, descobriu-se que as proteínas dietéticas fornecem uma rica fonte de peptídeos biologicamente ativos.

Os peptídeos têm sido estudados por mais de 100 anos. Em 1902 uma substância secretada pelo intestino

estimulou o pâncreas a secretar enzimas digestivas. Essa substância recebeu o nome de secretina e o

classe de moléculas sinalizadoras transportadas pela corrente sanguínea foi chamada de hormônios. uma vez secretina

foi purificado e considerado um peptídeo, sua sequência de aminoácidos foi determinada. Muitos outros

hormônios peptídicos foram descobertos usando uma abordagem semelhante em que uma substância bioativa foi

purificados à homogeneidade e sequenciados e várias dessas descobertas resultaram em Prêmios Nobel

para os novos insights científicos inovadores sobre como o corpo se comunica internamente localmente

entre células e especialmente através da corrente sanguínea entre células distantes e sistemas de órgãos inteiros.

Atualmente, mais de 1.500 PA diferentes foram relatados em um banco de dados chamado 'Biopep' (Singh

e outros, 2014).

Peptídeos bioativos feitos de cadeia longa de aminoácidos. Existem 20 aminoácidos estão lá.

Quando os peptídeos se unem, formam a cadeia e ajudam a curar a doença. O

a composição e sequência de aminoácidos determina a atividade dos peptídeos uma vez que eles são

liberados da proteína precursora onde são criptografados. Existem vários tipos de

peptídeos bioativos que são antimicrobianos, antitrombóticos, anti-hipertensivos, opioides, imunes

modulador, aglutinante de minerais e antioxidante. Peptídeo bioativo derivado por enzima

hidrólise e processo químico. Peptídeos bioativos possuem inúmeras propriedades antimicrobianas,

antioxidante, anticâncer, anti-hipertensivo, ligação mineral e imunomodulador.

Existem várias fontes alimentares de onde extraímos peptídeos bioativos como leite, amendoim,

abóbora, ervilha, soja, feijão germinado, gérmen de trigo, queijo, goiaba, iogurte, cacau em pó, aveia,

milho, quinoa, edamama, whey protein. Semente de frutas e sementes de vegetais contém grande quantidade de
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peptídeo bioativo em comparação com o produto inteiro. A semente de abóbora contém 30,2 g em comparação

abóbora inteira.

Peptídeo bioativo da semente de abóbora

As sementes da abóbora são às vezes chamadas de pepitas, palavra espanhola para "pequena semente de

abóbora." As sementes de abóbora (Cucurbita sp.) são geralmente consideradas agroindustriais

resíduos e descartados. Em algumas partes do mundo, as sementes são consumidas cruas, torradas ou

cozido, mas apenas em escala doméstica. Com a descoberta da sua riqueza em proteínas, fibras,

minerais, ácidos graxos poliinsaturados e fitoesteróis, eles estão sendo considerados valiosos para

a indústria alimentícia. As sementes de abóbora contêm quantidade excessiva de proteínas, ácidos graxos e significativa

número de micronutrientes como P, K, Mg, Mn e Ca (Sohini Roy e Santa Datta, 2016).

Extratos e óleos de semente de abóbora foram considerados úteis no tratamento de doenças como

câncer, diabetes, obesidade, hipertensão e imunomoduladores. Extração de peptídeos bioativos

da semente apresenta bons resultados para habitar os agentes causadores da doença. então o estudo

mais se concentra nos benefícios potenciais do extrato de peptídeos bioativos da semente de abóbora.

Descrição da planta

A planta de abóbora tem folhas grandes, veios extensos com folhas enroladas e modificadas chamadas gavinhas. O

as folhas são simples, alternadas e rasas a profundamente lobadas. A raiz perto da superfície, caule seria

ser quadrado, as flores serão amarelas brilhantes e o fruto é mais fibroso e menos doce do que no inverno

abóbora. As sementes variam em tamanho com base na diversidade e tipo (Fruh Writh & Hermetter - 2007). Abóbora

semente tem uma pele defensiva real chamada casco. A abóbora é cultivada desde o

história mais antiga da humanidade (Brucher - 1989).

Taxonomia

Divisão: Spermatophyta

Sub-Divisão: Angiospermas

Aula: Dicotiledôneas

Sub-classe: Poli patela

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Series: Caliciflorae

Ordem: Passiflorales

Família: cucurbitáceas

Gênero: cucurbita

Espécies: Máximo

Abóbora é uma abóbora que pesa em média de 4 a 8 quilos com o maior da espécie

têm a capacidade de estender um peso de 34 quilos (Pumpkins, 2003). Eles variam muito em

forma, variando de oblato a oblongo. As frutas são geralmente laranja, amarelas, brancas e vermelhas ou

cinza (Pumpkin, 2003). As abóboras são monoecius com flores masculinas e femininas

peptídeo bioativo Fonte Referência

antimicrobiano peptídeo, Abóbora Ting Zhou e outros, 2007

Antitrombótico peptídeo,

Anti-hipertensivo peptídeo,

Peptídeo imunomodulador,

Mineral vinculativo e

Peptídeo antioxidante.

antimicrobiano peptídeo, Leite Korhonen e Pihlanto et

antioxidante peptídeo, al,2007

imunomodulador peptídeo,

portadores de minerais peptídeos

antioxidante peptídeo, Amendoim Dias e cols. 2015

Anticâncer peptídeo,

peptídeo imunomodulador.

antioxidante peptídeo, Soja Agyei D et al,2015

antimicrobiano peptídeo,

Anti-hipertensivo peptídeo,
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10

Anticâncer e

Peptídeo imunomodulador.

Anti-hipertensivo Peptídeos, Carne e derivados Joseph Thomas Ryan et

Antioxidante Peptídeos, al,2011
antimicrobiano e

Peptídeos antiproliferativos,

Abóbora

A abóbora é uma das culturas mais importantes da família Cucurbitaceae. Cucurbitáceas usadas como

vegetais e remédios em todo o mundo. Cucurbita maxima (C. maxima) é uma espécie extremamente

espécies diversas. Esta espécie teve origem na América do Sul, há mais de 4000 anos. Índia,

Bangladesh e Mianmar são considerados centros secundários de diversidade para Cucurbita

máximo. Outras verdades mais importantes da abóbora Cucurbita pepo e Cucurbita moschata.

Existem muitos nomes de abóbora em diferentes idiomas: Abóbora (inglês), Kumbra (bengali),

Kohlu (Gujarati), Kaddu (Hindi), Kumbala (Kannada), Paarimal (Kashmiri), Mathan ou Chakkara

kumbalanga (Malayalam), Lal bhopla, (Marathi), Kakharu (Oriya), Sitaphal (Punjabi),

Purangikkai ou Pooshanikai (Tamil), Gummadi kayi (Telugu), Dangaree (sânscrito) (Gopalan et

al., 2011).

A abóbora vem em diferentes formas, como oval, pequena, grande, esférica, obvia, longitudinalmente

ranhurado e não ranhurado (Harry S. Pairs 1988). A cor da abóbora varia de verde claro a

verde escuro. A cor das abóboras é devido aos pigmentos carotenóides, beta

criptoxantina, alfa e beta-caroteno, que é o precursor da vitamina A. É doce em teste.

Abóbora produzir em todo o mundo. A Índia é a primeira na produção de abóbora. O

palavra abóbora derivada da palavra pepon, que é grego para "grande melão". o alter francês

este nome para pompon, que depois os britânicos modificaram para pumpion e para ajustar os colonos americanos

tornou-se admitido como abóbora.

Em várias áreas do mundo, como América do Norte e Estados Unidos

Reino, abóbora tradicionalmente cita apenas algumas variedades redondas e alaranjadas de abóbora,
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11

predominantemente obtido de Cucurbita pepo, enquanto no inglês australiano, nome de abóbora como

abóbora de qualquer reflexão.

As abóboras são produzidas em todo o mundo por várias razões, desde necessidades agrícolas (como

como ração animal) a comercial. A grande fabricação internacional de abóboras como

Estados Unidos, Canadá, México, Índia e China.

As abóboras são uma cultura de clima quente que geralmente cresce antes de julho. as coisas particulares

necessário para a produção de abóboras, como temperaturas do solo de 8ÿ (3 pol) de profundidade na terra. colheita de abóbora

deteriorar devido à menor disponibilidade de água ou devido às temperaturas frias (neste caso, abaixo

18 °C ou 65 °F; geada pode ser prejudicial) e solo arenoso com menor poder de retenção de água.

As abóboras são resistentes e, mesmo que mais folhas e porções da videira sejam retiradas, a planta

pode muito frequentemente voltar a crescer em vinhas secundárias para substituir o que foi removido.

Produção de abóbora em diferentes países

País Produção em toneladas Área em ha. Rendimento, h/ha

Índia 3500000 360000 97222

China 6315000 328000 192530

EUA 864180 39500 218780

Alemanha 83100 2200 377727

Japão 237000 17000 139412

Espanha 315000 7500 420000

África do Sul 95000 12000 79166

Paquistão 255000 26000 98076

México 17000 5500 212727

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12

Colômbia 60000 3650 164384

(Anju K. Dhiman e outros, 2009)

A preservação de longo prazo de abóboras dá a decisão de que a pilha de luteína e ÿ-caroteno

com uma pequena redução na zeaxantina. Esses produtos químicos variam entre diferentes cultivares e

estações do ano: ÿ-caroteno de 175mg a 693mg/100g; luteína 20mg a 59mg/100g; e zeaxantina não

detectado a 3mg/100g. Zhang et ai. (2014) sugerem que o acúmulo pode ser devido ao “aumento

provavelmente resultou de uma biossíntese contínua com um volume de negócios possivelmente reduzido e/ou melhorado

sequestro, sugerindo uma complexa regulação do acúmulo de carotenoides durante o armazenamento dos frutos.

A abóbora aumenta a biodisponibilidade de ferro e a ação antioxidante (Dias et al. 2015). Gibson & Hotz

(2001) sugerem que um molho feito de folhas de abóbora aumentaria a biodisponibilidade de zinco e

ferro sobre um molho feito de batata-doce.

A abóbora contém vários tipos de minerais como P, Ca, Fe, Mg, Zn, Na e muitos mais. Contém

varia tipos de aminoácidos como arginina, ácido aspártico, ácido glutâmico, alanina, glicina,

Histidina, Leucina, Isoleucina e muitos mais.

O conteúdo nutricional da abóbora é bom. Em comparação com a abóbora inteira, a semente de abóbora contém

mais nutrientes que estão melhorando o sistema imunológico.

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Abóbora e semente de abóbora

(Livro de Ciência Global)

Composição química da abóbora

Variedade de Umidade carboidrato proteína lipídios fibra cinzas Referência

abóbora contente cotações

cucurbita 88,50% 77,33% - - 8,55% 7% Arun mohan et ai.

máximo

cucurbita - 66% 3% 2,3% 11,46% 16% Manudose et al.

pepo
cucurbita 79% 1,90% .97- .07- .56- .57- Chandu chopra em el.
moschata 1,41% 0,16% 1,56% 0,89%
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Composição química da semente de abóbora

Variedade de Umidade carboidrato lipídios proteicos Fibra Cinzas Referência

semente contente datas

cucurbita 4,06% 1,08% 34,56% 36,7% 2,91% 3,8% Amit et al.

máximo

semente

cucurbita 5,20 ± 25,19 ± 25,40 ± 41,5±2,7% 2,49 ± 5,34± Gohari Ardabili

semente de pepo 0,28% 3,3% 0,61% 0,11% 0,04% e outros

cucurbita 51,79 ± 140,19 ± 298,11±1 456,76±11 108,51± 53,15± Santosh et al.

moschata 6,04g/kg 7,60g/kg 4,75g/kg 0,66g/kg 8,36g/kg 0,20g/kg

semente
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Propriedades dos peptídeos bioativos

(Chibuike C.Udenigwe et.al2011)

O conteúdo de peptídeos bioativos depende da concentração de proteína presente nos alimentos

que é diferente em alimentos diferentes. Principais fontes de proteína na dieta de

países desenvolvidos e em desenvolvimento (USDA, 1993)

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fonte Desenvolvendo % Desenvolvido %

Cereais 58,8 29.1

Carne 8.6 26.4

pulsos 7.4 1.7

Leite e laticínios 5.6 16.7

Peixe, frutos do mar 4.1 7.3

Oleaginosas 3.8 1.9

Vegetais 3.5 3.5

Raízes amiláceas 3.1 3.2

Ovos 1.6 4.3

Miúdos 1.2 2.2

frutas 1,0 1.1

(J. Agric. Food Chem., Vol. 44, No. 1, 1996)

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Propriedades medicinais da semente de abóbora

Atividade anti-câncer: O câncer é uma doença causada pela divisão descontrolada de células anormais em um

parte do corpo. Hoje o câncer é a razão mais predominante para a morte da pessoa em todo o

o mundo. . As células cancerígenas se espalham em qualquer parte do corpo e de uma célula no final torna-se

trilhões de células, então chamamos isso de metástase, meio incontrolável que se espalha pelo sangue e

através do linfonodo. É uma das doenças crônicas mais perigosas que cresce rapidamente.

Tradicionalmente, para prevenir doenças crônicas, uma pessoa recorre a tratamentos caros como

quimioterapia e radiações que levam a efeitos colaterais, mas agora várias alternativas são encontradas

fora. Pesquisadores descobriram o consumo de alimentos ricos em extrato de componentes bioativos

da capacidade de elevação da semente de abóbora para lutar contra a célula cancerígena, como gástrica, mama, pulmão

e câncer colorretal.

Atividade antidiabética: Diabetes é um tipo de doença em que uma pessoa que sofre de alta

nível de glicose no sangue por causa do poder do corpo prejudicado para produzir ou responder ao

hormônio insulina que é produzido pelo pâncreas, ajuda a usar a glicose dos alimentos para entrar nas células de

o corpo para produzir energia. Existem dois tipos de diabetes. O diabetes tipo 1 ocorreu

de acordo com o estudo em 5% da população em que há crianças, adolescentes. neste tipo

corpo produz pouca ou nenhuma insulina. Portanto, nesta condição, as crianças vão para o tratamento diário

para sua sobrevivência. No caso do diabetes tipo 2, uma pessoa é capaz de produzir insulina, mas não o faz.

seu trabalho corretamente. Ocorre em 95% das pessoas com idade superior a 40 anos. Pode ser curado por

medicamentos e por precauções.

Atividade anti-hipertensiva: A hipertensão é basicamente uma condição na qual a taxa de fluxo sanguíneo

contra as paredes das artérias é muito alto. Outro nome da hipertensão é chamado de hipertensão arterial

pressão. Aumenta o risco de doenças cardíacas, derrame. É aumentada pelo excesso de sal, peso corporal,

fumo, álcool. Consumo de nutracêuticos e alimentos funcionais elevando a capacidade de habitar

esse tipo de doença crônica. Estes alimentos contêm alguns componentes ativos que são responsáveis

para a cura desta doença. Extração de componentes bioativos de proteínas derivadas

de várias fontes vegetais e animais com poder de prevenir a hipertensão.

Atividade antimicrobiana: Refere-se ao processo de matar ou habitar a doença causadora

micróbios. Peptídeos antimicrobianos agrupados de acordo com os microrganismos que atuam principalmente

contra como antibacteriano. É uma proteína de baixo peso molecular com amplo espectro
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18

atividade antimicrobiana contra bactérias, fungos, vírus. Eles geralmente estão presentes entre 12-50

aminoácidos (Brij Pal Singh).

Sementes de abóbora para depressão: A Organização Mundial da Saúde (OMS) define a depressão como uma

transtorno mental comum que se apresenta com humor deprimido, perda de interesse ou prazer, sentimentos

de culpa ou baixa auto-estima, sono ou apetite perturbado, baixa energia e falta de concentração

(OMS, 2006). Em alguns relatórios, os aminoácidos triptofano, fenilalanina tirosina e

metionina são frequentemente úteis no tratamento de inúmeras infecções de humor, incluindo depressão

(McLean, 2004). Eagles (1990) e Axford et al. (1991) escreveu sobre os benefícios para a saúde mental da

semente de abóbora; Kim e outros. (2016) escreveu sobre as vantagens do ÿ-caroteno em Sweetme sweet Pumpkin

(Cucurbita moschata assada), que é usada para lidar com pacientes com depressão na Coréia.
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Probiótico

É uma substância que ajuda a estimular o progresso de microorganismos, principalmente aqueles que

tendo efeitos úteis sobre a flora intestinal. Em outro termo podemos dizer que é um alimento para probióticos.

Termo probiótico descoberto por Lilly e Stillwell. em 1965 Probióticos significa “deixar os micróbios bons

trabalham para você em diferentes campos recebem seus benefícios e descansam”. Ele ajuda a manter o

pH do sistema digestivo.

Características do probiótico eficaz

- Capaz de sobreviver à travessia pelo sistema digestivo.

- Capaz de se acoplar ao epitélio intestinal e colônias.

- Capaz de equilibrar a boa viabilidade.

- Capaz de utilizar os nutrientes e componentes da alimentação normal.

- Não patogênico e não toxigênico

- Capaz de causar um bom impacto no host.

- Estabilidade das características exigidas ao longo do processamento, armazenamento e transporte.

- Anti-inflamatório, antimutagênico, imunoestimulante.

cepas probióticas

espécies de lactobacilos

- L. acidophilus

- L. plantarum

- L. casei subespécie rhamnosus

- L. brevis See More

- L. delbreuckii subespécie bulgaricus

Espécies de Bifidobacterium
- B. bífido

- B. longum

- B. infantis

- B. breve
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- B. adolescente

Outros
- Streptococcus salivarius ssp. Thermophilus

- Lactococcus lactis ssp. Lactis

- Lactococcus lactis s ssp. Cremoris

- Enterococcus faecium

- Leuconostoc mesenteroides ssp.Dextranicum

- Propionibacterium freudenreichii

- Pediococcus acidilactici

- Saccharomyces boulardii
Alimentos probióticos

Iogurte- usamos cultura Streptococcus thermophilus e Lactobacillus acidophilus ou

Lactobacillus bulgaricus.

Barras de chocolate e granola - usamos a cultura Lactobacillus acidophilus.

Yakult Dairy Drink-Lactobacillus Casei shirota.

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Benefícios para a saúde dos probióticos

Eles são capazes de competir com os micróbios ruins e colonizar nosso sistema digestivo.

Eles são capazes de fermentar nossos alimentos em subprodutos mais simples e podem promover nossa saúde por muitos

diferentes mecanismos.

Os probióticos promovem a saúde removendo micróbios tóxicos, fornecem os micróbios úteis, reduzem a

trabalho do nosso sistema digestivo e a quantidade de alimentos necessários para o nosso corpo devido ao correto

digestão e metabolismo de qualquer quantidade de alimento. (Salminen et ai,1998)

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22

problemas de instrução CAPÍTULO 3

Os probióticos são bons para o sistema digestivo, sistema imunológico, trato gastrointestinal e previnem

as várias doenças como câncer de cólon. Por outro lado, os peptídeos bioativos da semente de abóbora

reduzir a obesidade, colesterol, infecção e atua como um antioxidante.

Para combinar as propriedades desses dois componentes, microrganismos probióticos seletivos

serão inoculados para extrair os peptídeos bioativos para melhorar o estado nutricional do
indivíduos.
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23

Objetivo CAPÍTULO 4

1. Para otimizar a extração do leite das sementes de abóbora.

2. Determinar a atividade proteolítica de cepas probioativas.

3. Analisar as propriedades físico-químicas do leite extraído da semente de abóbora.

4. Determinar as aplicações de peptídeos bioativos extraídos.

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24

Metodologia de Pesquisa CAPÍTULO 5

Preparação do leite de semente de abóbora:

Pegue 10g de semente de abóbora e misture com 50ml de água destilada.

Coloque a amostra no moedor e moa a amostra até que todas as sementes não se misturem com a água.

Armazene o leite em refrigerador.

Análise nutricional do leite de semente de abóbora:

Estimativa de gordura: A gordura do leite de semente de abóbora será estimada pelo método de Gerber.

Reagente necessário: Ácido Sulfúrico Con

: Álcool iso-amílico

: semente de abóbora

Procedimento: mistura de extrato de leite de semente de abóbora com ácido sulfúrico e álcool isoamílico em um

Tubo Gerber especial. O tubo é centrifugado e a gordura sobe para o local calibrado do

tubo que medirá como porcentagem da quantidade de gordura da amostra de proteína do leite.

Umidade:

O teor de umidade foi determinado pelo procedimento AOAC, (2000). Amostras de 5g de leite pesadas com precisão foram

retiradas em placa de Petri e aquecidas a 110±2 0C por 4 h em estufa de ar quente. as placas eram

removido, resfriado à temperatura ambiente sobre sílica gel em dessecador e pesado. As placas foram aquecidas novamente a

110 ± 20C , resfriadas e pesadas. O processo de aquecimento, resfriamento e

a pesagem continuou até que a diferença em 2 leituras sucessivas fosse inferior a 1 mg. o teor de umidade foi calculado a partir

da perda de peso da amostra no aquecimento a 110 0C como

indicado abaixo.

Teor de umidade %= W2-W1/W×100

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25

Onde W1 e W2=pesos das placas de petri junto com a amostra antes e depois

secagem respectivamente e W=peso da amostra.

Cinzas totais:

As cinzas totais foram determinadas pela AOAC, (2000).

Procedimento:

A cinza seca foi realizada por incineração de amostras de alimentos a uma temperatura muito alta (550 0C) em um

forno mufla. A cinza é equivalente ao conteúdo mineral da amostra de alimento. com precisão

amostras pesadas 3g foram retiradas em um prato de sílica alcatroada e queimadas em fogo baixo para carbonizar

matéria orgânica. Após a carbonização completa, os pratos foram colocados em uma mufla e aquecidos a 550 0C por

3-4 h, até a obtenção de cinzas de cor acinzentada a esbranquiçada. O prato de sílica contendo cinzas

foi resfriado em dessecador e pesado. Porcentagem do total de cinzas calculada da seguinte forma:-

Cinza % = peso de cinzas/peso de amostra × 100

Acidez titulável:

A acidez titulável será estimada pela titulação de um volume conhecido da amostra contra o padrão

Solução de NaOH 0,1N usando fenolftaleína como indicador até o ponto final (cor rosa).

% Acidez Láctica = ml de .1NaOH usado × .009 × 100 ÿWt. de amostra

pH:

O pH será medido com a ajuda do medidor de pH ELTOP-3030. Antes da medição do pH, o

instrumento será padronizado com as soluções tampão de pH 4, 7 e 9. O pH das amostras

seria estimado diretamente.

Extração de peptídeos bioativos usando microrganismos probióticos seletivos:

Microrganismos probióticos seletivos, como Lactobacillus helveticus, Lactococcus lactis,

Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus

bulgaricus, Lactobacillus brevis utilizado no estudo para extração de componentes bioativos será
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ser adquirido da Microbial Type Culture Collection (MTCC), Chandigarh, Índia. Todos adquiridos

as cepas serão mantidas congeladas em caldo MRS ágar com glicerol (15%).

O potencial proteolítico das cepas LAB acima mencionadas será examinado pelos métodos

aplicado por Beganovic et al., 2013 usando ágar de leite desnatado para o ensaio. O poço do leite desnatado

ágar será inoculado com uma cultura viável de cepas probióticas e incubado a uma temperatura de

37°C por um período de 4h. A presença ou ausência de uma zona clara ao redor do poço de ágar inoculado

após o período de incubação serão verificados e registrados.

O método de ensaio de placas duplas conforme descrito por Pescuma et al., (2010) será utilizado para verificar a

compatibilidade das cepas bacterianas com a atividade proteolítica. As cepas LAB com o

atividades proteolíticas mais altas que são usadas para a extração de peptídeos bioativos.

Fermentação do leite de semente de abóbora:

Mistura de cultura LAB com igual volume de leite de semente de abóbora e incubada a 37ÿC por

fermentação ocorra.. durante a fermentação, a cada intervalo de 2h, o pH, proteolítico

atividade, acidez titulável e sólidos solúveis totais serão verificados.

Purificação

Após a fermentação, a solução será centrifugada a 10.000 rpm por 10 minutos e o sobrenadante

passado por um filtro de seringa para purificação.

A extração de peptídeos bioativos será feita de acordo com o método fornecido por Singh et al., 2015.

extração de leite Pasturização Centrifugação

Verificação da atividade
fracionamento de
Filtração por filtro de microbiana de acordo com
peptídeos por tubos
seringa o peso molecular de
Vivaspin
peptídeos bioativos
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Método para a determinação de diferentes atividades potenciais do extrato

peptídeos bioativos:

Método para a detecção de atividade antimicrobiana: Atividade antimicrobiana do peptídeo extraído

será verificado usando o método de difusão em poço de ágar (Singh et al., 2015)

Coloque o agar nutritivo 15-20ml na placa de Petri e deixe solidificar sob fluxo de ar laminar.

Ágar nutriente sobreposto com 7ml de ágar mole inoculado com 100ul de cultura ativa noturna de

cepas indicadoras (Patógenos).

O ágar-ágar macio permite solidificar. Vários poços foram perfurados na placa de ágar com estéril

broca. Em seguida, placa refrigerada a 4ÿC por 1 hora. Poços preenchidos com extrato de peptídeo bioativo

amostra na concentração de 100ul.

A placa precisa ser novamente refrigerada a 4ÿC por 3-4 horas e depois incubada a 37ÿC por 24-48

horas.

O diâmetro ao redor dos poços medidos e a zona clara de 1mm ou mais foi considerado

inibição positiva.

Atividade antioxidante:

Pegue 5g de amostra e extraia com 50ml de metanol 80% por refluxo a 50-60ÿC por 2 horas

e filtre o extrato.

O resíduo foi reextraído com 50ml adicionais de metanol 80% por 1 hora.

Filtre o extrato. Recolher o filtrado e completar o volume de 100ml com 70% de metanol.
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1ml de extrato metanólico + 2ml de DPPH 1mM recém-preparado.

Adicione 1ml de tampão tris e misture bem.

Medido a 517 nm após 30 minutos e metanol usado como branco

Atividade de eliminação do radical DPPH (%) = (A0 - As)/A0 × 100

A0 - Absorvância de controle em 517nm

As - Absorvância da amostra a 517nm

Atividade anti-hipertensiva: A atividade inibitória da ECA será verificada por espectrofotometria (228

nm) método descrito por El-Fattah et al., 2016.

Pegue 50 ul de extrato e misture com igual volume de solução de ACE.

As misturas foram pré-incubadas a 37 C por 10 min em um bloco de aquecimento.

Um 150ul de substrato 4,15 mM (ou seja, hippuril-histidil-leucina em tampão borato contendo 0,3 M

NaCl, pH 8,3) foi então adicionado à amostra e incubado a 37ÿC por 30 min. A reação

foi subsequentemente interrompido pela adição de 500 ul de HCl 1 M.

Adicionou-se então acetato de etilo (1,5 ml) para extrair o ácido hipúrico. A mistura resultante foi
vortex por 1 min e permaneceu por 5 min.

Uma camada de 800ul de acetato de etila foi então transferida para um tubo de microcentrífuga de 2 ml e vácuo

seco em concentrador a vácuo a 45ÿC por 30 min. Após a secagem, 1 ml de destilado desionizado

água foi adicionada e vórtex até que o resíduo estivesse totalmente dissolvido.
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A concentração de ácido hipúrico foi determinada usando espectrofotômetro a 228 nm.

Inibição (%) = (AControl - Uma amostra)/AControl × 100

A amostra de controle foi preparada substituindo a amostra de teste por água destilada.

Atividade antidiabética: A atividade antidiabética será verificada de acordo com o método descrito por

Eckert et al., 2015.

A amostra de teste (25 ul) foi misturada com um volume igual do substrato Gly-Pro–p-nitroanilina

(1,6 mM) a 37ÿC por 10 min.

ÿ

50uL misture a amostra com tampão Tris-HCln 0,1 M, pH 8,0 e incubada a 37ÿC por 60 min.
ÿ

A reação foi interrompida pela adição de 100 mL de tampão de acetato de sódio 1 M, pH 4,0. O

p-nitroanilina liberada como um produto de hidrólise foi medida a 405 nm.

= % de inibição de ÿ-glucosidase e Dipeptidil-peptidase-ÿV (DPP- ÿV) será verificada.

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Resultados

Teor de gordura: teor de gordura estimado pelo método Gerber e o resultado esperado é =
5,5%

Acidez titulável:

A acidez titulável seria expressa como porcentagem de ácido málico/cítrico (AOAC,

2004).

% Acidez Láctica = ml de .1NaOH usado × .009 × 100 ÿ Peso. de amostra

= 1,9 × 0,009 × 100/10

= 0,171%

Conteúdo de umidade :

O teor de umidade foi determinado pelo procedimento AOAC, (2000).

Teor de umidade %= W2-W1/W×100

Onde W1 e W2=pesos das placas de petri junto com a amostra antes e depois da
secagem respectivamente e W=peso da amostra.

S.No. Inicial Depois Depois Depois Final Peso de %

Peso 1 hora peso Umidade
30 minutos. 30
amostra contente
min.

1. 41,37g 37,24g 37,22g 37,22g 4,15g 4,7g 88,29

2. 38,80g 34,40g 34,37g 34,36g 4,44g 5,03g 88,27

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Teor de Cinzas: As cinzas totais foram determinadas pela AOAC,

Cinza % = peso de cinzas/peso de amostra × 100

S. No. Peso inicial de Peso de Peso final de Perda em % Cinzas

Cadinho (g) Amostra Cadinho com Peso

cinzas (gm)

1. 22.57 5 22.73 .16 3.2

2. 21.34 5 21.51 .17 3.4

Teor de Proteína: teor de proteína determinado pelo método Kjeldahl.

Volume usado para a titulação do branco = 1,3ml

Volume usado para a titulação da amostra = 4,4 ml

Volume do título da amostra = 4,4 - 1,3 = 3,1 ml

Volume tomado para digestão = 0,5ml

Volume total feito para a digestão da amostra = 50ml

Teor de nitrogênio presente em 50ml de amostra digerida = 3,1 × 0,00014 × 50 / 0,5

% de teor de nitrogênio = 3,1 × 0,00014 × 50 × 100 / 0,5 = 4,34%

% Teor de proteína na amostra = 6,25 × 3,1 × 0,00014 × 50 × 100 / 0,5 = 27,125%

pH: O pH será medido com a ajuda do medidor de pH ELTOP-3030. Antes da medição do pH, o

instrumento será padronizado com as soluções tampão de pH 4, 7 e 9. O pH das amostras

seria estimado diretamente.

ph: 5,01
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Resultado esperado CAPÍTULO 6

Extração de peptídeos bioativos por microrganismos probióticos da semente de abóbora e verificação de sua

aplicações para aumentar seu valor nutricional.

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33

Referência CAPÍTULO 7

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