CAPÍTULO VII

CONTROLE DE QUALIDADE NA ANÁLISE DE MINERAIS COM

ÊNFASE EM NUTRIÇÃO ANIMAL

Marcus Antonio Zanetti

Prof. Titular da FZEA-USP

RESUMO
A análise de minerais na área de nutrição animal tem como limitantes
os baixos níveis de minerais nos tecidos e as pequenas quantidades de amostra,
em virtude disso, a maior preocupação com qualidade é evitar a contaminação,
que pode ocorrer em praticamente todas as fases da análise. Uma das
dificuldades do estudo de mineral nos animais são as interações que podem
ocorrer entre eles, desde o alimento até a utilização pelos tecidos, isto faz
com que seja necessária a análise de vários elementos. Um dos pontos chaves
na qualidade é a coleta e preparo da amostra, que se não forem adequados
comprometem todo o restante do processo. A rotina de trabalho no laboratório
também é de extrema importância, há uma série de cuidados indispensáveis
para assegurar a qualidade. Atualmente há vários equipamentos e métodos
para análise de minerais, sendo que com o avanço da eletrônica e das técnicas
computacionais, o custo dos equipamentos tem diminuído sensivelmente ao
longo do tempo, facilitando sua aquisição. A escolha do método adequado é
indispensável e com tantos equipamentos e técnicas disponíveis a análise ficou
muito mais fácil e precisa. Há uma série de recomendações indispensáveis para
garantir a qualidade da análise de mineral, mas, a principal delas é a utilização
de material de referência certificado e de organismo independe.

INTRODUÇÃO
Apesar da análise de minerais não variar muito entre os diferentes
materiais, geralmente quando trabalhamos com tecido animal, há que se alguns
cuidados especiais principalmente com contaminação, sendo um fator de
complicação os baixos níveis nos tecidos e a pequena quantidade de amostras.
Na nutrição animal há um grupo de elementos considerados essenciais para
os animais e outro grupo tóxico, como podemos ver na Tab. 1. Os minerais
são ainda classificados como macro elementos (ocorrem em concentrações
superiores a 100 mg/kg) ou como micro elementos (abaixo de 100 mg/kg).

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Tab. 1 – Macro e micro elementos minerais essenciais e micros essenciais em situações especiais*

*Ewing & Charlton, 2005.

Além destes elementos, há ainda um grupo considerado tóxico,
constituído por cádmio (Cd), chumbo (Pb) e mercúrio (Hg). No grupo
“essenciais especiais”, apesar de já ter sido comprovada a sua essencialidade,
foi em quantidades tão baixas que normalmente não se suplementa. Atualmente
não é raro encontrar apenas o níquel sendo suplementado. Por outro lado, os
elementos deste grupo são mais estudados como minerais tóxicos aos animais
(F, As, V).
Apesar de as funções dos minerais nos animais serem inúmeras, elas
podem ser divididas em três funções gerais segundo Od´ell & Sunde (1997):
I) Estrutural; II) Catalítica e III) Transdução de sinais. Como estrutural, temos
principalmente o cálcio e fósforo como constituintes dos ossos e dentes e o
fósforo e o enxofre como constituintes das proteínas. A maioria dos minerais
participa dos processos catalíticos e como transdução de sinais o principal
mineral é o cálcio, mas o magnésio também participa.
O estudo dos minerais nos animais é um tanto quanto
complexo, principalmente devido às inúmeras interações que os
mesmos possuem e que podem ser sinérgicas ou antagônicas.
Na figura 1 podemos ver as principais interações propostas em 1982 por
Georgievskii. Desde aquela época até agora, o número de relações aumentou
bastante, mas a figura já dá uma boa idéia do problema que enfrentam os

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nutricionistas. Analisar apenas um elemento geralmente fornece pouca
ou nenhuma informação, uma vez que na maioria das vezes ele pode estar
relacionado negativamente ou positivamente com outro.

Figura 1: Interações sinérgicas e antagônicas entre os elementos minerais (GEORGIEVSKII, 1982).

ANÁLISES DE MINERAIS EM NUTRIÇÃO ANIMAL

COLETA E PREPARO DE AMOSTRA

Como as amostras de tecidos animais geralmente possuem baixos
níveis de minerais (com exceção dos dentes e ossos), deve haver uma
preocupação muito grande com possíveis fontes de contaminação durante a
amostragem, preparação, armazenamento, manuseio no laboratório e durante a
análise propriamente dita.
A primeira preocupação para realizar uma análise confiável é a coleta
do material, é importante ressaltar que por mais perfeito que seja o método
de análise ele não conseguirá corrigir um erro de amostragem. Em primeiro
lugar, a amostra deve ser representativa, isto normalmente é um problema
em amostras de alimentos, principalmente em se tratando de alimentos
grosseiros (fenos, capins, silagens etc.) e que geralmente estão distribuídos em
áreas extensas. Mesmo em se tratando de alimentos concentrados em grande
quantidade, a amostragem é difícil. Em todos estes casos se faz necessária a
redução das amostras e este processo é um dos que mais contribuem para a
introdução de erros nas análises (SILVA E QUEIROZ, 2005).

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 Outra preocupação não menos importante na amostragem é o tipo
de material que será utilizado na coleta, deve ser dada preferência a material
de aço inoxidável. O uso de aço não oxidável , a exposição ao ar e o uso
de recipientes contaminados (cuidado com a reutilização de embalagens!)
são as principais fontes de contaminação de tecidos animais, enquanto que
para amostras de forragem, as principais fontes de contaminação são o solo,
poeira atmosférica e os procedimentos de coleta e de moagem. Segundo
McDowell (1992), mesmo utilizando moinhos com lâminas de aço inoxidável
há possibilidade de contaminação principalmente com Cr, mas ainda pode
haver contaminação por Ni, Co, Mn e Fe. Amostras de sangue podem ser
contaminadas com o anticoagulante utilizado, ou mesmo com a agulha de
coleta, o ideal é utilizar agulha de aço inoxidável. As tampas de borracha
utilizadas em tubos tipo “vacutainer” para sangue já foram importantes fontes
de contaminação de zinco. O uso de luvas plásticas para lidar com amostras
de tecidos é indispensável. Mesmo para amostras de alimentos pode haver
contaminação quando não se usa luva de borracha ( infelizmente o talco usado
em algumas luvas pode ser uma grande fonte de contaminação!). Para coletar
as amostras, é importante utilizar material de polietileno (sacos e frascos).
Sacos de panos e de papel podem conter nas cinzas até 2000 mg/kg de Cr,
Cu, Mn, Ni, Pb, Zn e até 100 mg/kg de Ag, Be, Co, Ga, Mo, Sn, Sr, V, Y e
Zr. Armazenagem de líquidos em vidros pode causar perda de Mn, Mo, Ni,
Ti e V. Armazenamento de material em vidro de boro silicato de sódio pode
contaminar as amostras com Na e B (MILES et al., 2001).
Na maioria das vezes a preocupação é apenas com a contaminação
da amostra, o que leva a valores superiores ao esperado, mas pode haver o
inverso, ou seja, o recipiente adsorver o elemento mineral, fazendo com que o
resultado seja inferior ao esperado, isto também é chamado de contaminação
negativa (MERTZ, 1986). Vários trabalhos já demonstraram que determinados
plásticos podem adsorver o selênio.
Atualmente é comum a utilização de geladeiras e freezers “frost-
free” para conservar amostras, neste caso há desidratação e a consequente
concentração da amostra, aumentando os níveis dos minerais.
Além de todos os cuidados acima descritos para com as amostras,
tem um ponto que geralmente não merece atenção e que tem causado grandes
perdas em resultados: a identificação inadequada das amostras. Não só
erros básicos como identificação do grupo e não das amostras individuais,
numeração repetida ou até mesmo ausente, mas também identificação com
marcadores não resistentes à água, umidade, congelamento etc. Também não é
raro a amostra estar devidamente identificada com códigos que se perdem após
a obtenção dos resultados.

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CUIDADOS NO LABORATÓRIO
No laboratório é importante que a preparação da amostra seja feita em
local diferente da análise e que, principalmente a água seja além de destilada
(ou bidestilada), deionizada e armazenada com recipientes adequados
(polietileno). No destilador a água não pode entrar em contato com partes de
metal (principalmente resistência). Vidro e Pirex podem contaminar soluções
ácidas com Al, B, Ca, Fe, Pb, Li, Mg, Mn, Na, Si e Sc (Miles et al., 2001).
Uma das fontes mais comuns de contaminação no laboratório são os reagentes,
mesmo os reagentes “das melhores marcas” podem apresentar níveis elevados
de contaminantes, principalmente no caso do selênio. É importante checar os
níveis de garantia antes da utilização e sempre utilizar na análise o “branco”.
A poeira e a fumaça são fontes importantes de contaminação e podem
ser trazidas também pelo aparelho ar condicionado.
Os vapores de ácido comuns nos laboratórios podem liberar uma
série de elementos (Cd, Cu, Ni, Pb, Zn etc.) existentes nas partes de metal,
como as maçanetas das portas, canaletas, canos, cadeiras etc. É importante
manter todo ácido em capela.
A limpeza do material utilizado na análise de minerais é de grande
importância, principalmente do material que é reutilizado, como os cadinhos,
vidraria e pipetas etc., o esquema para limpeza de material proposto por Miles
et al., (2001) é o que segue:

a) Cadinhos: depois de limpos devem permanecer uma noite em

recipiente plástico contendo 50% de HCl ou 50% de HNO3 (de preferência
o mesmo ácido utilizado para solubilizar a amostra) e depois ser lavado
três vezes em água deionizada. Terminada a lavagem, colocar o cadinho em
bandeja de fibra de vidro revestida com gaze, secar em estufa e guardar em
saco plástico;

b) Vidraria e material plástico: Deixar o material por uma noite em uma

solução de detergente não fosfatado. Lavar três vezes em agua deionizada e
deixar por uma noite em recipiente de nalgene contendo solução de HNO3
10%, depois lavar novamente três vezes com água deionizada. Todo material
deve ficar submerso na solução ácida e não flutuando. Secar em estufa em
bandeja de fibra de vidro forrada com gaze e guardar em saco plástico ou
vedado com parafilme. A secagem em estufa deve ser feita a baixa temperatura
e nunca ultrapassar 90º. C para vidraria calibrada. Material contaminado
com LaCl3 ou sangue deve ser lavado em água morna antes do contato com
detergente para evitar precipitação. Não utilizar material contaminado com
produtos químicos ou sabão que secou sem antes tratar com ácido dicromato-
sulfúrico ou HNO3 quente.

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c) Pipetas: Deixar as pipetas por uma noite em um cesto dentro de
recipiente de nalgene em solução de detergente sem fosfato. Transferir o cesto
para um lavador sifonado e lavar por três vezes com água deionizada. Deixar
as pipetas por uma noite em tanque de nalgene contendo solução de HNO3
10%%, lavar três vezes em lavador sifonado com água deionizada e secar em
estufa com temperatura inferior a 90ºC.

ANÁLISES

Matéria Mineral
Não é raro encontramos em uma análise de alimentos o termo “matéria
mineral” ou “cinzas”. Nesta análise o material é queimado a temperatura
de 350 a 600º. C visando a destruição de toda a matéria orgânica (Ewling
e Charlton, 2005), que é transformada em CO2 e H2 O. Certa quantidade de
CO2 pode permanecer nas cinzas formando carbonatos com metais alcalinos,
nos produtos de origem terrestre forma-se K2CO3 e nos produtos de origem
marítima, ricos em sódio, forma-se Na2CO3 (SILVA e QUEROZ, 2005). Está
análise tem pouco significado na nutrição animal, principalmente quanto se
trata de plantas. Neste caso, a sílica geralmente está presente em grandes
quantidades. Em alguns alimentos como, por exemplo, farinha de carne
ou de peixe, a análise de matéria mineral é importante para saber se houve
adulteração das mesmas (osso em excesso). Também é importante ressaltar
que esta análise não é precisa uma vez que ocorre perda de mineral volátil
como o cloro, iodo e o selênio, além de poder possuir carbonatos como já
citado e ainda óxidos e sulfatos. Mas o principal ponto negativo é não informar
quais os minerais presentes. Em temperatura de 650º. C pode ocorrer perda de
I, K, Cu, Zn, PB e Se (MILES et al., 2001).

Digestão da amostra:
Há vários métodos de digestão de amostra, sendo os principais os
abaixo relacionados:

1) Digestão seca: Neste método a mostra é queimada a 600º. C da

mesma maneira descrita acima para a “Matéria Mineral”. Uma das vantagens
deste método é não necessitar de supervisão constante, mas tem como principal
desvantagem a perda de alguns elementos, como o iodo e o selênio; o tempo
necessário e o número pequeno de amostras trabalhadas, já que geralmente as
muflas possuem pouco espaço. Para amostras de tecido animal há a necessidade
de realizar uma pré-digestão ácida e nunca levar o material direto para a mufla,
sob pena de perder grandes quantidades de amostras;

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2) Digestão úmida: A digestão úmida tem como principal vantagem
não haver perdas por volatilização, podendo ainda ser realizada em pouco
tempo, em compensação possui várias desvantagens: uso de ácidos fortes que
necessitam de cuidados especiais, risco de explosão no caso do uso de ácido
perclórico, os ácidos se constituem em fonte de contaminação ao ambiente,
possibilidade de contaminar o ambiente, custo elevado. É indicada para
amostras de tecidos animais.

3) Micro-ondas: Há vários tipos de digestão com micro-ondas, o mais

utilizado atualmente é uma digestão ácida (variável) em uma capsula fechada,
com alta pressão. Há a necessidade de um bom controle para evitar risco de
explosão. Pode ser feita em pouco tempo e um dos inconvenientes é a pequena
quantidade de amostra a ser digerida. Há outro método com micro-ondas, onde
ocorre a combustão da amostra, este procedimento tem a grande vantagem de
poder utilizar quantidades maiores de amostra (BARIN et al., 2012).

Preparo da solução mineral:

Caso tenha sido feita a digestão seca, há a necessidade de solubilização
dos minerais presentes nas cinzas, o que é feito normalmente com a adição
de ácido clorídrico e com aquecimento, neste processo deve-se tomar
cuidado com o ácido utilizado, que pode ser fonte de contaminação, sendo
imprescindível a utilização de um “branco”. Pode haver contaminação em
um primeiro momento quando do aquecimento, que se for muito intenso pode
fazer com que a amostra de um cadinho contamine o cadinho vizinho. Caso
haja necessidade de interromper o processo antes da filtragem e transferência
para o balão, deve-se esperar esfriar e cobrir os cadinhos com um plástico,
deixando sempre na capela e nunca no laboratório.

Principais métodos de análises

Atualmente há vários métodos confiáveis para realizar a análise
de minerais, a escolha depende de vários fatores, segundo Mertz (1986), os
principais são: 1) Se a análise será de apenas um elemento ou de vários; 2)
Tipo de matriz da amostra biológica e o potencial de interferência; 3) Número
de amostra e o tempo requerido por amostra (automatizada ou manual e
equipamento); 4) Tamanho da amostra; 5) Disponibilidade, tamanho, custo,
facilidade de operação e assistência técnica do equipamento; 6) Habilidade,
treinamento e experiência do pessoal disponível e 7) Se a instrumentação será
dividida com outros laboratórios ou usada por diferentes pessoas.
Os principais métodos de analises de minerais utilizados são:
espectrofotometria de absorção atômica (AAS), ativação por nêutrons
(NAA), próton induzido por emissão de raios-X (PIXE), diluição isotópica

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por espectrometria de massa (IDMS), fluorescência por raios-X (XRF),
espectroscopia de emissão ótica por plasma induzido (ICP-OES), espectroscopia
de massa por plasma induzido (ICP-MS e ICP-TOFMS), espectroscopia por
refletância infravermelha (NIRS), cromatografia gasosa com espectrometria de
massa, fluorimetria, fotometria de chama, eletrodo de íon seletivo etc. (Ewing
& Charlton, 2005).
Abaixo são apresentados os princípios dos métodos mais utilizados
atualmente.

1) Espectrofotometria de absorção atômica: Esta é a técnica que foi

mais utilizada para determinar minerais nos últimos tempos, possui poucos
interferentes, tem boa sensibilidade e precisão e baixo custo uma vez que
nos últimos anos o preço diminuiu muito. Um inconveniente é que tem que
trabalhar na faixa linear de calibração, mas o principal inconveniente é que
analisa apenas um elemento por vez. Esta limitação esta fazendo com que
esta técnica seja substituída por outras, principalmente por ICP. O elemento
a ser analisado na absorção atômica sob ação da chama é dissociado em
átomos em situação de repouso. Nesta forma, o elemento absorve radiação de
comprimento de onda específico, emitida por uma lâmpada do elemento em
análise, sendo que a quantidade de luz absorvida quando passa pela chama é
proporcional à quantidade do elemento a ser analisado. Além da chama, pode
também ser usado para a atomização o forno de grafite (GF-AAS). O forno
de grafite aumenta em muito a sensibilidade da absorção atômica, podendo
detectar concentração até 1000 vezes menor, e outra grande vantagem é
utilizar amostras muito pequenas (McDowell, 1992).

2) Ativação por Nêutrons: Apesar de ser uma técnica que analisa multi-
elemetos, é cara e geralmente utilizada principalmente em centros de pesquisa,
por trabalhar com técnica de radio química. Nela, a amostra é bombardeada
com nêutrons e os elementos emitem radiação específica que é medida, por
isso, é bastante sensível (GILL et al., 2004).

3) Espectrometria de Emissão Atômica (ICP-AES ou ICP-OES –

Atomic Emission ou Optical Emission): Esta técnica utiliza o plasma induzido
de argônio para atomizar a amostra para ser analisada por espectroscopia de
emissão. Inicialmente a amostra na forma de aerossol é vaporizada, dissociada
e ionizada, com emissão de luz, sendo que cada região do espectro é associada
a uma transição eletrônica e as intensidades luminosas são proporcionais
à concentração do elemento. O grande diferencial do plasma são as altas
temperaturas, podendo chegar a 7000 K, que ionizam a amostras com grande
eficiência. Uma grande vantagem deste método é a possibilidade de analisar

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um grande número de elementos ao mesmo tempo (KARACAN & ÇAGRAN
2009).

4) Espectrometria de massa (ICP-MS ou ICP-TOFMS (time of fligth):

Além de determinar a concentração do mineral, pode fornecer informação
isotópica (McDOWELL, 1992). Os íons produzidos atravessam um campo
magnético que altera as trajetórias dependendo da massa de cada elemento.
Tanto a massa quanto a carga é medida, identificando deste modo tanto os
elementos quanto os isótopos. A sensibilidade deste método é muito alta,
geralmente de PPT (parte por trilhão), apesar de esta ser uma grande vantagem,
neste nível de detecção, qualquer contaminação, por menor que seja já interfere
(recipientes, reagentes etc.). Este método consegue detectar quantidades
menores que o ICP-OES (HANÉ et al., 2011; PHAN-THIEN et al., 2012)

5) Forno de grafite: Utilizado para aumentar a sensibilidade de alguns

equipamentos (AAS e ICP). No forno de grafite, ao invés da chama, a energia
para atomização é fornecida por uma corrente elétrica elevada que passa através
de um tubo de grafite contendo a amostra. O tubo “fecha o circuito elétrico”
propiciando alta temperatura (até 3000ºC.). A luz do aparelho passa no centro
do tubo. Esta técnica tem como vantagem poder analisar elementos em níveis
até 1000 vezes mais baixos que na absorção atômica e outra grande vantagem
é a utilização de apenas alguns microlitros de amostra. Como desvantagem, é
um método lento, mais caro e pode sofrer mais interferência e contaminação.

6) Gerador de hidretos: Utiliza a propriedade que alguns elementos

(dos grupos IV, V e VI da tabela periódica), principalmente selênio e mercúrio,
têm de formar hidretos covalentes e voláteis com o hidrogênio. Como fonte de
hidrogênio geralmente é utilizado o borohidreto de sódio. Com esta técnica, o
elemento é separado e concentrado, facilitando a detecção e aumentando em
muito o poder de detecção.

IMPORTÂNCIA DO CONTROLE DE QUALIDADE NA ANÁLISE DE

MINERAIS
Como verificamos até aqui, há uma série de fatores que podem
influenciar na qualidade dos resultados das análises de minerais, desde a
amostragem, passando pelo preparo da amostra, indo até o método de análise.
Infelizmente, somente estes cuidados não bastam para assegurar resultados
confiáveis, é importante haver uma preocupação constante com a qualidade e
seu controle.
O controle de qualidade deve envolver: a) recepção das amostras,
b) análises, c) revisão dos resultados e d) haver evidências escritas dos itens

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anteriores. Estes princípios são contemplados pelas Boas Práticas. Para que o
controle de qualidade seja efetivo, há a necessidade do engajamento de todos os
envolvidos, a começar pela direção do laboratório, até o responsável pela limpeza.
O propósito do programa é monitorar o processo analítico e não o pessoal.
Além de constituir em uma ferramenta educacional, deve ser estabelecido
processo de validação. Os principais objetivos do controle de qualidade é
reduzir os erros analíticos a níveis aceitáveis, reduzir o trabalho para obter
dados confiáveis e prover uma base de dados para comparação de resultados.
O controle de qualidade é necessário para satisfazer o desejo do analista para
um trabalho de qualidade, para agir com responsabilidade com relação aos
descartes de resíduos e para gerar relatórios e documentação para uso imediato
e futuro, no interesse de todos. A motivação para que o controle de qualidade
seja eficiente é fundamental, ela é uma ferramenta de marketing muito forte,
além da qualidade dos resultados, as pessoas envolvidas tem sua reputação
melhorada, além do que os laboratórios sem CQ não sobreviverão!
Para implantação de um sistema de qualidade é imprescindível
conhecer a natureza dos erros, o sistema de medida e o que fazer para
minimizar os erros. No caso dos minerais, os principais pontos que influenciam
negativamente nos resultados já foram listados anteriormente, o conhecimento
de cada um deles é imprescindível.

DETERMINAÇÃO DO DESEMPENHO ANALÍTICO

Precisão x acurácia: Precisão é o grau de reprodutibilidade de um
procedimento analítico no tempo, para ser calculada devem ser eliminados os
fatores externos que possam influir nos resultados, deve ser utilizado material
de referência para fazer a checagem e inclusive eliminar os efeitos da matriz.
A amostra deve ser analisa pelo menos sete vezes em dias diferentes e
calculados a média e o desvio padrão para cada dia. Pode ocorrer variação
nos resultados de um mesmo dia ou variação de dia para dia. As principais
falhas na precisão são: falta de homogeneidade, calibração de equipamento,
contaminação e erro do analista.
Acurácia é a concordância do valor encontrado com um valor
conhecido e verdadeiro para o que está sendo analisado. Os principais fatores
que limitam a acurácia são: contaminação da amostra, padrão errado, falha do
instrumento, falha no uso dos dados da curva de calibração, não linearidade
na curva de calibração e problema entre o padrão e a matriz da amostra.
Nas figuras 2 a 5 são apresentadas as diferentes combinações de acurácia e de
precisão.

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Fig. 2 - Pobre acurácia e pobre precisão

Figura. 3 – Boa acurácia pobre precisão

Figura 4- Pobre acurácia boa precisão

Figura 5 – Boa acurácia boa precisão

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 Uma maneira prática para checar a precisão é analisar duplicada de
5% das amostras e para acurácia analisar 5% das amostras com fortificação
ou taxa de recuperação. É desnecessário ressaltar a importância do uso de
material de referência para as checagens. Para minerais é bastante utilizado
o material de referência (SRM-Standard Reference Materials) do NIST
(National Institute of Standards and Technology) do governo americano
(http://ts.nist.gov/srm). As amostras certificadas possuem erro desprezível e alta
precisão, uma vez que geralmente utilizam espectroscopia de massa ou ativação
por nêutrons e ainda geralmente são determinadas por no mínimo dois métodos
de análises aceitos, podendo ainda ter sido analisada por mais de um laboratório.
Segundo Miles (comunicação pessoal, 19971) para assegurar
qualidade na análise de minerais é importante observar os seguintes pontos:

1) Realizar analise em duplicatas;

2) Periodicamente analisar amostras fortificadas;
3) Ressubmeter amostras às cegas;
4) Realizar comparações entre laboratórios;
5) Utilizar amostras de referência interna (do próprio laboratório);
6) Utilizar material certificado (NIST);
7) Manter registros:

a) o que foi feito;

b) quem fez;
c) quando;
d) qual o instrumento utilizado;
e) qual foi o padrão utilizado e quais os reagentes utilizados;
f) o que deu errado.

Finalizando, os pontos chaves no controle de qualidade de minerais
é a utilização de métodos aprovados de análise, instrumentação analítica
adequada ao método; calibração periódica dos equipamentos e utilização de
material de referência certificado e de instituição independente.

MILES, P.H., Curso de análise de minerais, FZEA-USP, 1999.

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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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