Amostragem de solo e raiz para

constatação de fitonematoides
 Nematoides >>> organismos microscópicos >>> impossibilita
observação do agente causal em campo
 A maioria ocorre no solo >>> Recomendações:
- colher solo da rizosfera Atentar para: obtenção,
manuseio e transporte
- amostrar raízes novas das amostras
 Definição do universo de estudos
- Diagnose de espécies e seus níveis populacionais

 Amostragem: representar um universo maior

- Deve ser seguida de critérios estatísticos e comprovações práticas
 Importante definir:
- Grupo trófico que se quer trabalhar
- Universo que se quer alcançar
- Órgãos de plantas – amostrar:

PARA CONSTATAÇÃO DE AMOSTRAR

Aphelenchoides bessey grãos de arroz

Bursaphelenchus cocophilus caules e raízes

Ditylenchus dipsaci bulbilhos de alho, folhas, raízes...

Meloidogyne spp. raízes e solo da rizosfera

 Profundidade e modo de coleta de amostra de solo
 Modo de coletar subamostras e raízes:
- andando em zigue-zague
- procurando por ilhas sintomáticas

Coleta de amostras de solo e raízes em área

com reboleiras de plantas com sintomas; as
subamostras tiradas nos pontos com a letra A,
nos bordos das reboleiras, formarão a amostra
composta A; as subamostras tiradas nos pontos
com a letra B, de plantas aparentemente sadias,
formarão a amostra composta B.
Fonte: Embrapa Cerrados
 Amostra >>> deve representar um universo bem maior
Exemplo: Propriedade de café com 4 milhões de plantas.
Dispendioso em tempo e recursos. Como fazer?
 Produção reduzida

Perda de vigor (declínio)

REALIZAR
AMOSTRAGEM
Redução do tamanho das plantas APENAS NESTES
TALHÕES

Amarelecimento

Plantas anormais, etc.

 Tipos de amostras:

- Amostra simples: colhidas em diversos lugares >>> possibilita maior

chance de encontrar fitonematoides.

- Amostra composta: mistura das amostras simples >>> colhe-se a

amostra composta que será enviada ao laboratório para análise.
 LEMBRE-SE!
 O sucesso na identificação correta do fitonematoide presente na
sua área de cultivo dependerá:
- amostragem
- manuseio
- transporte da amostra

Não se extrai ovo de fitonematoide do solo.

Os ovos são formas de sobrevivência em
condições de campo sem hospedeiros.
 1. Época de amostragem

 CULTURA ANUAL:
Final de ciclo da planta ou quando os danos econômicos
estiverem evidentes

 CULTURA PERENE:
Qualquer época, porém, melhor no verão
 2. Local de amostragem

 Sempre coletar solo da rizosfera

 Buscar raízes finas, mas... (M. paranaensis)

 Cultura perene: coletar na projeção da copa

 3. Processo de amostragem

 CULTURA ANUAL:
- Percorrer o local de amostragem em zigue-zague.
- Colher em cada vértice uma amostra simples (ou sub-amostra): 65
cm³ de solo e 10 g de raízes finas.
- Profundidade: 15 a 20 cm (eliminar os 5 cm iniciais).
- Coletar 20 amostras simples >>> misturá-las >>> amostra composta
com 500 g de solo e 80 g de radicelas.
 3. Processo de amostragem

 CULTURA PERENE:
- Amostras simples (ou sub-amostra): colhidas na projeção da copa
nos quadrantes norte, sul, leste e oeste
- Profundidade: 25-30 cm
- Coletar 150 g de solo e 20 g de radicela por amostra simples
 3. Processo de amostragem

 CULTURA PERENE:
- Amostrar de 6 a 10 árvores

- Reunir todas as amostras simples (sub-amostras) >>>

misturá-las >>> retirar 500 g de solo e 80 g de radicelas
 3. Processo de amostragem

 AMOSTRAGEM EM VIVEIROS:
Uma amostra...
- não deve representar mais do que 50 mil plantas;
- deve conter pelo menos 30 plantas;
- as mudas devem ser lavadas cuidadosamente em água parada;
- deve conter apenas o sistema radicular.
 3. Processo de amostragem

 AMOSTRAGEM EM VIVEIROS:
- colocar as amostras levemente umidecidas em saco plástico

- informar o número de plantas, idade das mudas, lote e endereço do viveiro

 3. Processo de amostragem
 AMOSTRAGEM EM VIVEIROS:
Ao comprar mudas, devemos acreditar no laudo fornecido?
 3. Processo de amostragem

 AMOSTRAGEM EM VIVEIROS:
Ao comprar mudas, devemos acreditar no laudo fornecido?

Orientações no site do Laboratório de Nematologia da UFLA

http://www.dfp.ufla.br/index.php/pt-R/laboratorios/nematologia
 4. Número de amostras por propriedade

 Até 6 hectares: 1 amostra composta a cada 1,5 ha

 De 6 a 40 ha: 6 a 8 amostras compostas

 Mais de 40 ha: 10 amostras compostas

Priorizar os locais suspeitos!!!

 Amostrar terrenos úmidos (60% cc).

 Acondicionar as amostras em sacos plásticos amarrados para evitar

perda de umidade.

 Durante a coleta: proteger amostras dos raios solares e temperaturas

superiores a 38ºC >>> manter em local fresco.
 Estocá-la a 8-10ºC até chegar no laboratório de análise.

 Enviar a amostra imediatamente ao laboratório.

- Intervalo ideal entre amostragem e análise
no laboratório: 2 a 3 dias.

 Identificar corretamente a amostra: nome, endereço, cultura

amostrada e tamanho da propriedade.
 Não amostrar após aração e gradagem e em terrenos sem
hospedeiros por vários meses.
 Extração: é o processo de separação dos nematoides das
partículas do solo e dos tecidos da planta infectada como raízes,
folhas, bulbilhos, caules, etc. e consequente obtenção deles em
água limpa.

 O modo de parasitismo dos nematoides na planta definirá o

processo de extração mais adequado.
 Apropriado na extração de nematoides ectoparasitas e formas livres
temporárias de endoparasitas no solo
1. Colocar 100 g de solo peneirado e destorroado em um copo e
completar o volume para 600 mL com água.

2. Agitar por 20 segundos e deixar em repouso

por 60 segundos

3. Derramar o sobrenadante nas peneiras

de 40 mesh sobre a de 325 mesh
4. Na peneira superior ficarão retidos os detritos e as partículas
maiores do solo.
5. Com uma pisseta >>> borrifar água no material retido na peneira
de 325 mesh >>> coletar em copo
6. Colocar toda a suspensão em tubo de centrífuga de 50 mL >>>
calibrar >>> centrifugar: 420G por 5 minutos

7. Eliminar o líquido sobrenadante, sem perder o precipitado

8. Completar o volume dos tubos com solução de sacarose

(453g de açúcar cristal e completar o volume para 1 litro com água)
9. Centrifugar por 60 segundos a 420 G
10. Derramar cuidadosamente o sobrenadante em uma peneira de 500
mesh de 8 cm de diâmetro
11. Com uma pisseta, borrifar água nas malhas da peneira de 500 mesh
>>> recolher material em copo
12. Colocar a suspensão em caixas de contagem >>> identificar os
gêneros e espécies/ contar os espécimes em microscópio de objetiva
invertida
Flotação e Centrifugação
Método de Flotação (Jenkins,
e centrifugação (Jenkins, 1964)
1964)
 Apropriado para extração de endoparasitas migradores
1. Cortar as radicelas em pedaços de 0,5 cm de
comprimento
2. Coloca-las na superfície da tela forrada com
material poroso
3. Colocar água até completar o volume do funil
4. Repor água sempre que o seu nível estiver abaixo
da tela
5. Após 48 e 72 horas >> abrir pinça de Mohr >>
coletar 2 mL da suspensão
6. Identificação em microscópio de objetiva invertida
- Interpretação de Laudo
- Rotina de um Laboratório de Nematologia
 Processamento da
Emissão de laudo amostra
 No laudo:
- Relação de espécies de fitonematoides incidentes na amostra
- Quantidade de espécimes da cada espécie encontra >>> expresso em:
 Número de nematoides por 100 cc de solo
 Número de nematoides por grama de raiz
 Número de nematoides por 10 g de raiz (ou de outro órgão amostrado)
  Quanto a quantidade de nematoides:
Quando que o número será considerado elevado:
(segundo alguns laboratórios)

QUANTIDADE ESPÉCIE ENCONTRADA TIPO DE AMOSTRA

Mais de 300 juvenis de Meloidogyne spp Em 100 cc de solo

segundo estádio (J2)
Mais de 2000 espécimens Pratylenchus spp Em 10 g de raiz
(juvenis e adultos)
 Como o Engenheiro agrônomo deverá interpretar estes dados do
laudo emitido pelo laboratório?
- Observar se há a presença de espécies de importância econômica
para a cultura em questão.
apenas estas espécies merecerão atenção e motivarão a
recomendação de táticas de controle.
 Como o Engenheiro agrônomo deverá interpretar estes dados do
laudo emitido pelo laboratório?
Quanto ao número de nematoides de cada espécie e de importância
econômica encontrada.
(as respostas para essas duas perguntas serão dadas nas aulas teóricas)
 Durante o processamento da amostra:
- A amostra, quando chega ao laboratório, é estocada em câmara fria a
8-10ºC
- Deverá ser processada e o laudo emitido em até 3 dias
- Separa-se o solo das raízes, pois os processos de extração de
nematoides serão diferentes
- Ocorrendo galhas as fêmeas são separadas para cortes e observação
da configuração perineal
- Quando necessário, faz-se análise de fêmeas por eletroforese
 Durante o processamento da amostra:
- Extração de nematoides:
Solo ---> método de flotação e centrifugação (Jenkins, 1964)
Raízes ---> funil de Baermann
- observando-se os nematoides extraídos do solo, suspeitar-se-á da
ocorrência de J2 de Meloidogyne spp e portanto, poderá ter fêmeas nas
raízes, porém, sem evidência clara de galhas, podendo ser
escamações!
 Em resumo:
 Com fêmeas fazer corte perineal e eletroforese
 Com nematoides filiformes: montagem de lâminas semi-
permanentes
 Pelo desenho da configuração perineal e dos fenótipos em
esterase, identificar-se-ão as espécies de Meloidogyne
 Nos nematoides filiformes montados em lâminas semi-
permanentes serão observadas as estruturas morfológicas e com o
auxílio de chaves de classificação serão caracterizadas as espécies
 Meloidogyne javanica:
Arco dorsal arredondado
Sulco lateral interrompendo todas as linhas
 Meloidogyne incognita:
Arco dorsal trapeizodal
Linhas contínuas
 Meloidogyne arenaria:
Arco dorsal arrendondado
Dobras nas estrias
 Meloidogyne hapla:
Arco dorsal arrendondado e achatado com linhas finas
Dobras laterais ou prolongamentos à semelhança de asas
Pontuações visíveis próximas à parte terminal da cauda
 Meloidogyne enterolobii
(Meloidogyne mayaguensis)
 Técnica - resumo:
 Preparo de tampões (extrator, do gel separador, do gel empilhador e
do tanque)
 Preparo das soluções do gel (solução de bis-acrilamida e persulfato
de amônia a 10%)
 Montagem das placas
 Preparo dos géis (separador e concentrador)
 Técnica - resumo:
 Preparo das fêmeas e colocação no gel (retirar as fêmeas, colocar na
solução extratora e esmagar)
Obs: M. javanica, M. incognita e M. arenaria: apenas uma fêmea
M. exigua: cerca de 20 fêmeas
 Processar a amostra
 Técnica - resumo:
 Revelação do gel para esterase e obtenção das bandas
 Devido a tensão superficial que existe na
superfície da água, nesta fase, o
nematoide não fica com facilidade na
ponta do estilete, devendo-se ir tentando
até conseguir capturá-lo (D)

 Líquido de montagem: formalina 2%

(solução diluída de formaldeído)

 Anteparo entre lamínula: bastonetes

metálicos, de lã de vidro ou anel de
parafina (diferente da lâmina fúngica)
 Tipos de cutícula
 Estilete (tipo e tamanho)
 Vulva (posição dela – indicativo de 1 ou 2 ovários)
 Espículas
 Bursa
 Tipo de cauda (arredondada, pontiaguda, espinho)
 Tipo de esôfago (cilíndrico, dorilamoide, tilencoide)
 Formato do corpo e tamanho
 Bulbo médio esofageano (tamanho)
 Campo lateral e sulcos cuticulares
Xiphinema – nematoide grande
Bursaphelenchus cocophilus e B. xylophilus
Helicotylenchus dihystera
Pratylenchus coffeae
Mesocriconema (Criconemella)
Ogma