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FISIOLOGIA DO PARASITISMO
FITOPATÓGENOS: ARSENAL ENZIMÁTICO

INTRODUÇÃO

Fitopatógenos geralmente necessitam de seus respectivos hospedeiros para ter a

sobrevivência garantida. Nesse sentido, a maioria dos patógenos retira seus nutrientes do
hospedeiro e utilizam estes no seu próprio metabolismo, para desempenhar atividades
vegetativas e reprodutivas. Entretanto, muitos destes nutrientes encontram-se no interior do
protoplasma das células vegetais e, para ter acesso aos mesmos, os patógenos devem vencer as
barreiras externas, formadas pela cutícula e/ou parede celular, bem como promover a
colonização interna dos tecidos (Figuras 1 e 2). Os, patógenos ganham acesso ao interior dos
hospedeiros através de penetração direta, aberturas naturais ou ferimentos. As bactérias, por
exemplo, embora podendo deslocar-se em direção ao hospedeiro, conseguem penetrar nas
plantas e multiplicar-se no espaço intercelular, ou excepcionalmente no xilema, somente
através de ferimentos ou aberturas naturais (estômatos, hidatódios, etc.) e nunca diretamente
pela cutícula íntegra. No caso dos fungos, a penetração pode ocorrer diretamente através da
superfície intacta da planta, de aberturas naturais e/ou de ferimentos. A penetração direta pode
ocorrer exclusivamente através de força mecânica aplicada por estruturas específicas de alguns
poucos fungos sobre o hospedeiro. Quase na sua totalidade, porém, este processo é
acompanhado por secreções enzimáticas.
Depois da penetração, os patógenos podem se espalhar a partir do sítio de infecção e
colonizar o tecido do hospedeiro. Este processo, normalmente, caracteriza-se pela
desagregação celular e pela utilização de nutrientes, o que resulta em alterações na morfologia
e no metabolismo do hospedeiro, levando ao aparecimento dos sintomas. Simultaneamente à
penetração e colonização dos tecidos, os hospedeiros podem reagir à presença dos patógenos
em potencial através da formação de barreiras físicas e produção de substâncias químicas. Essa
batalha entre patógeno e hospedeiro a nível fisiológico e bioquímico constitui-se no objetivo
de estudo da fisiologia do parasitismo. Dessa maneira, para um patógeno infectar uma planta,
é necessário que o mesmo consiga penetrar e colonizar os tecidos do hospedeiro, retirar os
nutrientes necessários para sua sobrevivência, bem como neutralizar as reações de defesa da
planta. Para isso, utiliza-se de substancias tais como enzimas, toxinas e hormônios. A
importância dessas substâncias varia grandemente nas interações hospedeiro-patógeno. Nas
podridões moles, as exoenzimas são aparentemente as substâncias mais importantes; já no caso
da mancha ocular, causada por Helminthosporium sacchari em cana-de-açúcar, a doença
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resulta principalmente da toxina secretada pelo fungo; finalmente, nas galhas da coroa,
causadas em vários hospedeiros por Agrobacterium tumefaciens, os hormônios desempenham
papel relevante.
Dentre os fitopatógenos conhecidos, com exceção dos vírus e viróides,
aparentemente todos produzem enzimas, hormônios e, possivelmente, toxinas.
No caso dos vírus e viróides, esses agentes podem induzir as células do hospedeiro a
produzir diferentes substâncias, dentre as quais as enzimas utilizadas na replicação desses
organismos. A presença dessas substâncias químicas, mesmo que em quantidade elevada nem
sempre, no entanto, reflete a capacidade do patógeno em causar doença.
De uma maneira geral, as enzimas produzidas por fitopatógenos promovem a
desintegração dos componentes estruturais das células do hospedeiro, degradam
substâncias presentes nas células ou afetam diretamente o protoplasto.

Figura l - Representação esquemática da estrutura da cutícula em tecido foliar.

Figura 2. Representação esquemática da estrutura e composição das paredes de células

vegetais.
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As toxinas, por sua vez, agem diretamente no protoplasto e interferem com a

permeabilidade das membranas.
Os hormônios, basicamente, alteram a divisão e crescimento celular.

1. ENZIMAS
Enzimas são proteínas de alto peso molecular, constituídas de longas cadeias de
aminoácidos, responsáveis pela catálise das reações metabólicas. Existe uma enzima específica
catalisando cada substrato envolvido. Normalmente, as enzimas são denominadas em
função do substrato ou reação que catalisam, através da adição do sufixo -ase. Por
exemplo, cutinases são enzimas que promovem a degradação da cutina e pectinases são
enzimas que degradam as substâncias pécticas. A ligação da enzima (E) ao seu substrato (S)
resulta na formação de um complexo enzima-substrato (ES). Em função dessa ligação, o
substrato é ativado e a reação química pode ocorrer; levando à formação do complexo enzima-
produto (EP), com a conseqüente liberação do produto (P) e a restauração da enzima ao seu
estado original. Reações químicas conduzidas a 25°C e catalisadas por enzimas podem ocorrer
l05-106 vezes mais rapidamente do que as mesmas reações não calisadas. Dependendo da
enzima, o número de moléculas de substrato catalisadas por uma única molécula da enzima por
segundo ("turnover") pode variar de 100 a mais de três milhões.

1.2. Degradação da cutícula

Para entender como um patógeno penetra na superfície intacta do hospedeiro, a natureza

da cutícula necessita ser conhecida. As paredes das células epidermicas dos vegetais, em
contato com o meio exterior, mostram-se recobertas por uma camada lipídica contínua,
comumente conhecida como cutícula (Figura1) (Küller, 1991), a qual fica aderida à parede
celular através de uma camada intermediária rica em substâncias péticas. A cutícula recobre
folhas, frutos e talos jovens, tendo como funções básicas evitar a difusão de água e
nutrientes para o meio externo, bem como proteger a planta contra os efeitos adversos do
meio ambiente. A espessura e a morfologia da cutícula variam dependendo da espécie vegetal,
do órgão envolvido, do estádio de desenvolvimento do tecido e das condições do ambiente.
A cutícula pode ser separada da parede celular por meio de tratamento químico ou
enzimático, produzindo dois componentes lipídicos principais: as ceras, e a cutina.
As ceras são constituídas, principalmente, de hidrocarbonetos, álcoois primários, ácidos
graxos e ésteres, enquanto que a cutina mostra ser um poliéster, cuja despolimerização origina,
principalmente, monômeros de ácidos graxos (ácidos cutínicos).
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A cutícula, que consiste basicamente de cutina impregnada com cera e

frequentemente recoberta por placas cerosas, alem das funções acima mencionadas,
também serve como barreira protetora contra microrganismos. Dentre os fitopatógenos
em potencial, os fungos que penetram através da superfície intacta da planta mostram-se aptos
para degradar enzimaticamente essa barreira através da produção de cutinases, o que se
constitui, para alguns, em fator chave na patogenicidade. Além dessa função, aparentemente
as cutinases também podem estar envolvidas na determinação da especificidade de
fungos fitopatogênicos para com os tecidos do hospedeiro (isto quer dizer que alguns
fungos só colonizam determinados tecidos específicos como, por exemplo, só colonizam
vasos condutores, ou órgãos florais). No tocante às placas cerosas, nenhum fungo se mostra
capaz de degradá-las, aparentemente ocorrendo à penetração das mesmas através de força
mecânica.

1.2.1 Papel das cutinases na patogenicidade

A produção de cutinases por microrganismos cultivados in vitro, tendo cutina como fonte
de carbono, não se constitui em prova da importância dessa enzima na infecção das plantas.
Dessa maneira, o papel da cutinase como fator na patogenicidade tem sido avaliado
principalmente através de estudos imunocitológicos e de transformação genética, bem como
através do uso de mutantes deficientes para cutinase e inibidores dessa esterase. Esses estudos
têm sido conduzidos, basicamente, em três interações hospedeiro-patógeno: Fusarium solani-
ervilha, Colletotrichum gloeosporioides-mamão e Alternaria alternata-pêra. No caso de F.
solani, por exemplo, estudos estruturais com hastes de ervilha, conduzidos com o auxílio da
microscopia eletrônica de varredura, mostraram que o fungo excretava, quando em contato
com o hospedeiro, o mesmo tipo de enzima identificada a partir de culturas mantidas in vitro.
Mutantes de C. gloeosporioides deficientes em cutinase mostraram-se altamente
patogênicos sobre a superfície injuriada de frutos de mamão. A doença, porém, não ocorre
quando os isolados são inoculados sobre a superfície intacta do fruto. A patogenicidade dos
mutantes no entanto, podia ser restaurada através do fornecimento de cutinase exógena.
Na natureza, C. gloeosporioides penetra a cutícula de frutos imaturos de mamão e
permanece subcuticularmente em estado latente no tecido, até após a maturação dos frutos.
Entretanto, em alguns casos, como na interação pepino-Colletotrichum lagenarium, as
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cutinases aparentam ser menos importantes do que a força mecânica para a penetração nos
hospedeiros.
No tocante aos estudos envolvendo a transformação genética de fungos, a transferência
do gene da cutinase de F. solani para Mycosphaerella sp., um patógeno que necessita de
ferimentos para penetrar no hospedeiro, produziu transformantes capazes de excretar a mesma
cutinase produzida por F. solani e infectar frutos de mamão intactos.
Através do emprego de técnicas de biologia molecular, foi possível verificar que esporos
fúngicos em fase inicial de germinação, quando na superfície do hospedeiro, excretam uma
pequena quantidade de cutinase pré-formada. Essa cutinase teria como função a liberação de
monômeros, a partir da cutícula da planta, os quais ativariam a transcrição do gene da cutinase,
com a conseqüente produção massal da enzima requerida para a penetração da cutícula. Após a
penetração, a quantidade de monômeros diminuiria levando, consequentemente, à paralisação
da transcrição gênica.
Finalmente, em função de sua importância para certos patógenos na penetração do
hospedeiro, a cutinase constitui-se em alvo potencial para o controle de doenças vegetais.
A desativação da enzima (inibição de sua ação e/ou síntese-excreção), em nível de
superfície do hospedeiro, evitaria a penetração e, consequentemente, protegeria as
plantas contra algumas doenças fúngicas. Essas idéias são suportadas pelos trabalhos
conduzidos com inibidores da cutinase (anticorpos e/ou organofosforados), principalmente nas
interações ervilha-F solani e mamão-C. gloeosporioides, onde a infecção foi evitada e as
plantas protegidas contra os respectivos patógenos. Em vista do exposto, um novo caminho
se abre para o controle de doenças fúngicas através do possível uso de compostos atuando
como antipenetrantes, os atuais fungicidas Organofosforados.

1.3 Degradação da Suberina

Enquanto a cutícula recobre a parte aérea das plantas, a superfície dos órgãos
subterrâneos é, geralmente, recoberta por uma camada protetora, que tem a suberina, um
polímero insolúvel associado com ceras solúveis, como componente principal. Essa camada
também se forma nos tecidos em resposta à injúria mecânica ou quando os mesmos ficam
expostos devidos, por exemplo, à abscisão de folhas e frutos. A suberização dos tecidos evita
a difusão de água e nutrientes e, provavelmente, evita a penetração de patógenos em
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tubérculos e raízes. As camadas de suberina ocorrem principalmente entre a parede celular e a

membrana plasmática e mostram uma estrutura lamelar (Figura 3).
Estudos ultraestruturais demonstraram a capacidade de alguns fungos penetrarem as
paredes celulares suberizadas, porem muito vagarosamente. No caso de bactérias, existem
indicações de que Pseudomonas solanacearum pode degradar a suberina presente no sistema
radicular das plantas.

Com relação ao crescimento in vitro, alguns microrganismos possuem a capacidade de

utilizar paredes suberizadas como única fonte de carbono. Dentro desse contexto, pode-se
destacar Streptomyces scabies, Fusarium solani f. sp. pisi, Helminthosporium sativum,
Rhizoctonia corcorum e Phytophthora infestans.

Figura 3. Representação esquemática de paredes celulares suberizadas.

1.4. Degradação dos componentes da parede celular

Durante a penetração e colonização, fitopatógenos repetidamente encontram e

atravessam as paredes celulares dos hospedeiros (Figuras 1 e 2). A maioria dos fitopatógenos
pode produzir uma variedade de enzimas, normalmente extracelulares, que atuam na
degradação dos componentes da parede celular. Geralmente, essas enzimas mostram-se
induzíveis, estáveis e presentes em tecido hospedeiro infectado. O contato entre essas enzimas
e a parede celular pode ser visto como uma das primeiras interações moleculares entre
patógeno e hospedeiro, cujo resultado pode alterar o balanço final da interação.
As paredes celulares mostram-se como estruturas complexas e dinâmicas, circundando o
protoplasto, externamente à membrana plasmática. Podem estar envolvidas na expansão
celular, influenciando a forma da célula e, consequentemente, a morfogenese de tecidos
vegetais. De maneira geral, são divididas em três regiões estruturais: lamela média, que
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compreende a região entre as paredes de células vizinhas; parede primária, localizada entre a
membrana plasmática e a lamela média, formada, somente em células em ativo processo de
crescimento, após a divisão celular ser completada; parede secundária, localizada
internamente à parede primária, formada após o término da expansão celular.

1.4.1 Lamela média

A lamela média é constituída principalmente por substâncias pécticas, as quais são

polissacarídeos formados por longas cadeias de ácido D-galacturônico. Dependendo do grau de
metilaçao dos grupos carboxílicos dos resíduos de ácido galacturônico, esses polímeros são
conhecidos como ácido pectínico (< 75 % metilação) ou pectina (> 75 %). Os
polissacarídeos pécticos também são encontrados na parede primária (35% em
dicotiledôneas e 8-9% em monocotiledôneas), onde formam um gel amorfo, o qual
preenche os espaços entre as microfibrilas de celulose. Em função da capacidade de
formarem géis, devido às ligações entre cadeias por meio de íons cálcio, as substâncias
pécticas atuam como uma espécie de cimento intercelular, mantendo coesos os tecidos
vegetais.
Várias enzimas, conhecidas como pectinases ou enzimas pectolíticas, degradam
substâncias pécticas.

1.4.2 Paredes primária e secundária

Os polissacarídeos constituintes das paredes celulares têm sido tradicionalmente

divididos em substâncias pécticas, hemiceluloses e celulose, com base na solubilidade, e não
na composição química (Tabela 1). As hemiceluloses são encontradas na matriz das paredes
primária (em maior abundância) e secundária, sendo compostas principalmente pêlos
monossacarídeos xilose, arabinose, glicose, manose e galactose. Uma das funções biológicas
desses polímeros é a conexão das frações péctica e celulósica nas paredes. A hemicelulose
predominante nas paredes primárias de plantas dicotiledôneas é a xiloglucana, que
proporcionando às paredes primárias e secundárias imaturas flexibilidade e maior
permeabilidade. Por sua vez, xilanas, constituem-se nas principais hemiceluloses das paredes
secundárias das dicotiledôneas. No caso das plantas monocotiledôneas, as principais
hemiceluloses encontradas são as arabinoxilanas. Várias outras hemiceluloses tem sido
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caracterizadas, principalmente a partir da parede secundária de plantas lenhosas, como

mananas, glucomananas e galactoglucomananas.
A degradação das hemiceluloses em constituintes monoméricos requer a atividade de
várias enzimas, genericamente conhecidas como hemicelulases.
A celulose, um polissacarídeo de cadeias longas é formada por moléculas de glicose e
constitui-se no principal componente estrutural das paredes celulares dos vegetais (20-30% nas
paredes primárias e acima de 40% na parede secundária de plantas lenhosas) (Tabela 1).

A celulose mostra-se como uma substância cristalina e insolúvel em sua forma nativa. A
degradação desse polímero, com a produção final do monossacarídeo glicose, resulta da ação
de diferentes celulases.
Derivados do ácido cinâmico são constituintes comuns das paredes celulares, sendo que
o mais comum é a lignina, principalmente em plantas lenhosas.
A deposição de lignina ocorre após a maturação da parede celular, em substituição às
moléculas de água, podendo ligar-se covalentemente aos outros constituintes poliméricos,
dando rigidez à parede. A degradação enzimática da lignina, embora não completamente
esclarecida, e catalisada por ligninases.
As paredes celulares podem também apresentar proteínas, cujo conteúdo (em geral <10%)
varia com o tipo de célula e condições ambientais. Dentre as proteínas encontradas nas
paredes, têm-se as glicoproteínas ricas em hidroxiprolina (GRHP), também denominadas
extensinas. Essas proteínas têm uma aparente função estrutural. A degradação enzimática
dessas extensinas por proteases, no entanto, parece pouco viável devido ao baixo número de
ligações suscetível à ação enzimática da protease.

Tabela 1 Principais polímeros das paredes celulares de plantas dicotiledôneas.

Polímeros Peso em relação à parede celular (%)

Celulose 35
Hemicelulose
 Xiliglucana 19
 Glucouronoarabinoxilana 5
Polissacarídeos pécticos
 Homogalactoronana 6
 Ramnogalacturonana I 7
 Ramnogalacturonana II 3
 Arabanas, galactanas e 18
arabinogalactanas
Glicoproteína rica em hidroxilprolina 19
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1.4.2.1 Papel das enzimas degradadoras da parede (EDP) na patogenicidade

Com exceção dos vírus e viróides, fitopatógenos podem produzir um grande número de
enzimas (pectinases, celulases, hemicelulases, ele.) capazes de degradar os polímeros
estruturais das paredes celulares. Embora ainda não tenham sido demonstradas para qualquer
combinação hospedeiro-patógeno, as EDP estão provavelmente envolvidas na maioria das
doenças de plantas. A contribuição dessas enzimas na patogenese pode envolver a
extensiva destruição dos tecidos vegetais por patógenos necrotróficos (por exemplo,
enzimas pectolíticas), bem como alterações específicas localizadas nas paredes celulares por
patógenos biotróficos (por exemplo, glicanases e glicosidases). Essas enzimas (EDP) têm sido
estudadas em Botrytis fabae, Colletotrichum lindemuthianum, Erwinia carotovora, E.
chrysanthemi, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, Pseudononas solanacearum, Puccinia
graminis f. sp. tritici, Rhizoctonia solani e Verticillium albo-atrum. Embora estejam ligadas à
degradação dos componentes da parede, a comprovação do envolvimento das EDP na
patogênese deve preencher alguns critérios, como: capacidade do patógeno em produzir as
EDP in vitro; detecção das EDP em tecido infectado; correlação da produção das EDP com
patogenicidade; alterações nas paredes de tecidos infectados observáveis com o uso de técnicas
de microscopia; reprodução das alterações na parede ou sintomas da doença com o uso de EDP
purificadas.
Dentre as EDP as enzimas pectolíticas são as mais estudadas no tocante ao papel na
patogênese. Uma das razões para esse interesse deve-se ao tratamento de tecidos vegetais
com pectinases purificadas, o que ocasiona a separação das células e morte das mesmas.
Esse processo ocorre durante o desenvolvimento de muitas doenças, principalmente nas
podridões moles onde os tecidos perdem a rigidez. A separação das células, chamada
maceração, é devida à destruição da integridade estrutural da lamela média,
principalmente por pectinases (endopoligalacturonases e endopectatoliases). A morte celular
ocorre, aparentemente, devido ao enfraquecimento da parede celular primária, em virtude do
rompimento das ligações entre os resíduos de ácido galacturônico, o que ocasiona o
rompimento ou alteração da permeabilidade seletiva da membrana plasmática sob condições
de estresse osmótico. As pectinases podem também ser mais prejudiciais às células do que
o enfraquecimento das paredes celulares.
Estudos sobre o papel das celulases e hemicelulases bacterianas e fúngicas na
patogênese são escassos e não mostram um claro relacionamento entre degradação dos
polímeros celulose/hemicelulose e patogênese, como no caso da degradação dos polímeros
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pécticos. As evidências sugerem que a degradação da parede celular, pelo menos nos
estágios iniciais, envolve a degradação da pectina e hemiceluloses, com a conseqüente
exposição das microfibrilas de celulose à ação das celulases. A importância da degradação
das hemiceluloses na patogênese, porém, permanece obscura.
A degradação enzimática da lignina é característica de fungos saprófitas, na maior
parte basidiomicetos, envolvidos na decomposição de madeira. Embora vários
fitopatógenos, principalmente ascomicetos/deuteromicetos e algumas bactérias, produzam
pequenas quantidades de ligninases, a habilidade desses microrganismos em degradar a lignina
tem sido pouco investigada.

1.5. Degradação de componentes da membrana plasmática

A membrana plasmática (plasmalema) (Figuras 1 e 2) separa o interior da célula do

ambiente externo, enquanto as membranas de organelas delimitam compartimentos no interior
celular. Extensões da membrana plasmática (plasmodesmata) atravessam a parede celular e
promovem conexões com as células vizinhas. As membranas vegetais contêm proteínas (40-
50%) e lipídios (40%), sendo que a maioria pode também conter carboidratos (0-10%) na
forma de glicolipídios e glicoproteínas.
Em função da composição, as membranas podem sofrer ação destrutiva de enzimas como
fosfolipases (liberam ácidos graxos a partir de moléculas de fosfolipídios) e proteases
(liberam peptídeos e aminoácidos a partir da ruptura das ligações peptídicas em moléculas de
proteínas).
A maioria dos fitopatógenos obtém os nutrientes necessários para o crescimento e a
reprodução a partir de protoplastos dos hospedeiros. Alguns dos nutrientes, como açúcares
(monossacarídeos) e aminoácidos, podem ser utilizados diretamente pelas bactérias e fungos.
Outros constituintes das células vegetais, porém, como amido, proteínas e lipídios,
necessitam ser degradados por enzimas secretadas por esses microrganismos. Todos os
fitopatógenos podem degradar através da ação de enzimas proteolíticas, diferentes tipos de
proteínas, o que resulta em profundas alterações na organização e função celulares no
hospedeiro. O amido, um polímero de glicose, constitui-se no principal polissacarídeos de
reserva nas células vegetais. A maioria dos patógenos produz amilases, as quais degradam
esse polímero em moléculas de glicose diretamente utilizáveis nas atividades metabólicas
desses microrganismos.
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Diferentes tipos de lipídios (compostos formados por ácidos graxos) são encontrados nas
células vegetais: óleos e gorduras, principalmente nas sementes, ceras, na cutícula,
fosfolipídios e glicolipídios, nas membranas. Várias bactérias e fungos podem degradar esses
compostos através da ação de enzimas lipolíticas (lipases , fosfolipases , etc.), liberando
ácidos graxos que podem ser utilizados diretamente por esses fitopatógenos.