- As amostras foram coletadas na bacia hidrográfica

de Quilcay na Cordilheira Branca nos Andes

peruanos, sendo quatro lugares amostrados no
período de janeiro e fevereiro no ano de 2012

- Houve amostragem em dois pontos de duas

altitudes diferentes (3.000 e 4.000 metros),
contendo sempre respectivamente um ponto limpo
de metais pesados e um rico

- Foi medido em cada local a temperatura (°C), pH,

condutividade e oxigenação

- A irradiação solar foi medida a cada dois dia

durante o período da amostragem, as medições
tinham início as 10h00 e fim às 14h00. Foi
calculado os valores máximos em cada mês

- As análises químicas continham Alumínio (Al),

Arsênio (As), Cálcio (Ca), Cobalto (Co), Cobre (Cu),
Ferro (Fe), Manganês (Mn), Níquel (Ni), Estrôncio
(Sr) e Zinco (Zn)

- Houve tripla coleta em cada local de amostragem,

cada amostra foi mantida em garrafas de
polipropileno de 1L, preservadas com 10 N HNO3
(Ácido Nítrico) e analisadas por indução
espectroscopia de emissão de plasma acoplado. O
controle de qualidade foi realizado por meio de
 análises estabelecidas pela USEPA (Agência de
Proteção Ambiental dos Estados Unidos) e material
de referência para amostras de água.

- A coleta das larvas de Chironomidae foi feita nós

sedimentos de cascalho/seixos e pedras ao longo
das margens, usando um conjunto de peneiras e
bandejas de plástico. Os animais foram
transportados em potes plásticos até o laboratório,
separados individualmente em tubos de 1,5 mL
com tampa de rosca contendo 100 mL do reagente
TRIzol (isola DNA, RNA, tecidos, células e
proteínas), homogeneizados com pilão plástico e
armazenados a 80 °C até o envio para o
Universidade de Amsterdã (Holanda).

- Para extrações de DNA, 20 L de clorofórmio foram

adicionados ao homogeneizado. As amostras foram
então incubadas à temperatura ambiente por 5 min
e centrifugadas a 12.000 g por 15 min a 4 °C. A
fase aquosa contendo RNA foi removida e
guardada a -80°C para análise posterior. 30 lL de
tampão TNES-6U foi então adicionado à fase de
fenol-clorofórmio e incubado à temperatura
ambiente por 10 min. Posteriormente, as amostras
foram centrifugadas a 18.000 g por 15 minutos a 4
°C, e a fase aquosa superior foi transferida para um
tubo limpo. Um volume igual de isopropanol 100%
foi adicionado e as amostras foram incubadas a 80
 °C durante a noite, após o que foram centrifugadas
a 18.000 g por 30 minutos a 4 °C. O DNA foi então
eluído em 20 L de tampão T10E1 e armazenado a
20 °C.

- Os produtos de PCR foram colocados em um gel

de agarose a 1% para determinar sua qualidade e
tamanho. Uma mistura de 1 L de produto de PCR e
1 L de primer direto ou reverso com 7 L de H2O foi
então enviada para a MacroGen Europe (Amsterdã,
Holanda) para sequenciamento. As sequências
retornadas foram cortadas no mesmo comprimento
com base nas pontuações de qualidade. As
sequências foram então traduzidas usando a tabela
de códons de mtDNA de invertebrados para
determinar que não continham códons de parada, o
que é uma evidência de que são sequências
genuínas de mtDNA

- As posições de códon incluídas foram

1ª+2ª+3ª+não codificantes. Todas as posições
contendo lacunas e dados ausentes foram
eliminadas. Havia um total de 531 posições no
conjunto de dados final.