Biologia Marinha aula prática Nº 5, 30.03.

2006 2005/2006

Determinação de clorofila a: método espectrofotométrico

(tricromático)
Introdução
O método mais utilizado para a determinação indirecta da quantidade de fitoplâncton
em água do mar é a medição da concentração da clorofila a. Este parámetro pode
ser relacionado com a biomassa total da materia vegetal na água.

Material e Método
Um determinado volume de água do mar é filtrado através de um filtro de fibra de
vidro (Whatman GF/F; poros de 0.7 µm; diâm. 25 mm). Os pigmentos serão
extraidos com acetona de 90 % e a concentração da clorofila a será determinada
com a ajuda de um espectrofótometro.
Procedimento:
• Do recipiente (que contem a amostra de água do mar recolhida p.ex. com uma
garrafa de Niskin a uma determinada profundidade) tira-se, depois de ter agitado
(evita a sedimentação das celulas), uma subamostra (0.5 l) para uma garrafa de
polietileno
• Essa garrafa é invertida para o suporte da filtração, que já contem o filtro, e a
água é filtrada com uma sucção fraca, que não deve ultrapassar 0.2 até 0.5 bar;
este processo é repetido tantas vezes até que o filtro contenha no final o
conteudo de 1 a 2 l de água do mar (o volume a filtrar depende da concentração
esperada e da quantidade de partículas em suspensão que determina o tempo
da filtração); o filtro é sugado seco, lavado com água destilada, dobrado e posto
num copo de homogenização ou, em caso de análise posterior, guardado num
tubo de polipropileno (PP) com tampa no congelador (até ao máximo até 6
meses)
• logo depois da filtração (ou ao filtro congelado) junta-se 10 ml de acetona 90 %; o
filtro é homogenizado durante 30 - 60 segundos; o homogenizado é transferido
para um tubo de centrifugação, o copo de homogenização é lavado com 2 ml de
acetona 90 %, que depois também serão transferidos para o tubo de
centrifugação
• os tubos são centrifugados durante 60 min com a velocidade máxima; a
centrífuga é refrigerada a 0° C
• o sobrenadante (cuidado para não levantar o sedimento) é transferido para
uma cuvete de vidro de quartzo (de percurso óptico de 5 cm) e a absorvância
determinada para os seguintes comprimentos de onda no espectrofotómetro:
λ1=750 nm, λ2=664 nm, λ3=647 nm, λ4=630 nm. Antes de cada medição de cada
comprimento o espectrofotómetro é calibrado (tecla “Autozero”) com acetona
90%
• faz-se uma correcção das absorvâncias, subtraindo o valor da absorvância
λ1=750 nm (correcção para considerar qualquer material particulado ainda em
suspensão) dos outros valores obtendo assim E664, E647 e E630.

Dr. rer. nat. Manfred Kaufmann 1/2

Biologia Marinha aula prática Nº 5, 30.03.2006 2005/2006

• calcula-se a concentração da clorofila a em µg clorofila a / l:

(11.85 * E 664 −750 − 1.54 * E 647 −750 − 0.08 * E 630 −750 ) * VA

V *d

onde vA é o volume da acetona em ml; V é o volume da água filtrada em l; d é a

largura ou percurso óptico da cuvette em cm.
Resultados
Os resultados serão apresentados em forma tabelar e comparados com valores
obtidos da literatura (p.ex. Caldeira et al., 2002).

Bibliografia
CALDEIRA, R. M. A., GROOM, S., MILLER, P., PILGRIM, D. & NEZLIN, N. P.
(2002) Sea-surface signatures of the island mass effect phenomena
around Madeira Island, Northeast Atlantic. Remote Sensing of
Environment, 80: 336-360.
JEFFREY, S. W., MANTOURA, R. F. C. & WRIGHT, S. W. (1997)
Phytoplankton pigments in oceanography: guidelines to modern methods.
UNESCO Publishing, Paris.
PARSONS, T.R.; MAITA, Y.; LALLI, C.M. (1984) A manual of chemical and
biological methods for seawater analysis. Pergamon Press, Oxford.

Dr. rer. nat. Manfred Kaufmann 2/2