Revisão P1 FT721

“
Engenharia de Bioprocesso tem como papel transformar os conhecimentos obtidos por microbiologistas
e bioquímicos em processos industriais, com objetivo de aperfeiçoá-los, assim como aumentar
produtividade e rendimento”.
Processos que usam m.o na produção de produtos: fermentação (bebidas, pão, vinagre, queijo), antibióticos
(penicilina, insulina)
- A diferença entre o etanol e o antibiótico é o valor agregado, sendo esse o que dita a prioridade do
processo.
- Bioprocessos podem ser produzidos por m.o ou enzimas.
- Aplicados na indústria farmacêutica (antibióticos, vacinas), indústria químicas (acetona), meio
ambiente (monitoramento de poluentes com biosensores e tratamento de resíduos)
Bactérias: antibióticos e vitaminas
Leveduras: etanol e bebidas
Bolores: queijo, penicilina, ácido cítrico.

Caracterização do Bioprocesso:
- Quanto maior o valor agregado, menor o volume de produção
- Se o [P] tem maior valor agregado que o [S], o relevante é a produtividade (para a indústria é menos
custoso se sobrar [S]), nesses casos tenho alta conversão em baixo tempo. Ex: ácido láctico, etanol.
- Se o [P] tem baixo valor agregado, o relevante é a conversão. Nesses casos, o que interessa não é a
rapidez do processo mas a transformação em produto. A perda de [S] é mais custosa. Ex: antibióticos.

Xilitol
Produto proveniente do resíduo da cana: bagaço
- Bagaço  celulose (sólida) + xilose
Xilose (fermentação)  xilitol
Celulose (sólida) (hidrólise enzimática) glicose(fermentação)  etanol 2ªG
Poder adoçante, pode ser utilizado por diabéticos (baixas taxas glicêmicas)
Balas, gomas de mascar, bebidas tônicas, gelatinas, medicamentos de prevenção de infecção de ouvido,
vitaminas.

Aspectos de um bioprocesso
Upstream: preparação da matéria prima e dos aparelhos
Downstream: etapas de purificação. Ex: destilados
As mutações induzidas são ocasionadas por estresse
Técnica do DNA Recombinante: transferência de genes
Necessidades Nutricionais dos MO:
- H2O; Carbono; Nitrogênio (Razão C/N); Fósforo; Enxofre; Oxigênio atmosférico (aeróbios ou
facultativos); Elementos Minerais (Na, K, Ca, Mg, Fe, Cl, Cu, Zn, Co e Mn); Fatores de crescimento (AA ou
vitaminas)
Os processos biotecnológicos dependem da escolha do m.o, da definição do meio de cultivo, da
condução do bioprocesso e da purificação do produto.
Crescimento microbiano
A quantificação da biomassa (enzima ou m.o) é feita por contagem direta de células (microscópio,
plaqueamento ou filtração à vácuo) ou contagem indireta (turbidez/densidade óptica)
-  Biomassa  turbidez  densidade óptica  absorbância  massa celular.
A fermentação do m.o pode ser:
- submersa = nutriente dissolvido em meio líquido
- semi-sólida = inoculação no meio
- Em escala industrial, a esterilização pode ser feito com o meio de cultivo junto ou separado (esterilizo
o fermentador primeiro e passo o meio de cultura por um trocador de calor)
Para o m.o entrar no fermentador ele precisa estar na FASE EXPONENCIAL, por isso ele é inoculado nessa
fase. Vemos a fase por absorbância.
- Ao sair do esterilizador há um rompimento total ou parcial da célula e ocorre o downstream

Fase lag Fase exponencial

Adaptação e desenvolvimento de rotas metabólicas Onde preparamos o inóculo, ou seja, há
Não tem reprodução: o número de células é constante crescimento, e a velocidade específica é máxima
𝛍 = 𝛍𝐦á𝐱
Fase estacionária Fase morte (ou declínio)
Início da exaustão de nutrientes Redução do número de células
Produz crescimento e morte na mesma concentração Fim da concentração de substrato [S] g/L
Produção de metabólitos secundários

A fase lag pode ser reduzida usando uma cultura ativa, fazer inóculos sucessíveis até atingir o volume, ou então
com modificação de nutriente, meio, quant. de sais
O aumento de CO2 é indicativo que o m.o está crescendo

Diauxia
A diauxia acontece com 2 substratos, o m.o tem preferência por um e
quando esse acaba ele passa a consumir outro, entrando numa nova fase
lag. Só quando os dois substratos acabam que ele passa a entrar na fase
morte.
- As duas fases lag são mínimas possíveis.

Processos fermentativos
Em geral tem presença de inibidor
Pode ter pH acompanhado (há verificação e mudança) ou pH contido (só trabalha em pH controlado)
Podem ter metabólitos 2ª
- Não está necessariamente ligado ao crescimento. Ex: antibióticos
 - Quando o [S] começa a acabar, o m.o começa a produzir antibióticos que são nocivos para outros m.o
mas não para ele, assim, não há competição de substrato
- O metabólito 2ª aumenta a medida que [S] reduz.

a. Velocidades instantâneas.
Essas equações não se
Biomassa (x): r =
usam muito, são mais para
Substrato (S): r = − explicar a velocidade

Produto: r = específica

b. Velocidades específicas
O substrato está sedo consumido porque o m.o está crescendo
Biomassa (x): μ = μ = r = ⋅
A v. específica é a v.instantânea dividida pela massa de m.o
Substrato (S): μ = ⋅ r = ⋅ −
Usada para analisar a velocidade do m.o
Produto: μ = ⋅ r = ⋅
*Em geral, para desfazer dessa derivada a gente integra

c. Rendimento
X é a massa de biomassa produzida.
YX/S: Rendimento de substrato em biomassa celular, ou seja, o quanto de biomassa é gerada Y/ =
x−x
S −S
em relação ao substrato consumido
YP/S: Rendimento de substrato em produto, ou seja, qual o rendimento do processo, quanto P−P
Y / =
de substrato é transformado. S −S

YP/X: Fator de correlação de produto por biomassa celular, ou seja, relação do produto com P−P
Y / =
a biomassa. x−x

Em processos em batelada, x ≠ 0
P também pode ser ≠ 0, porque o m.o produz um pouco de produto no inóculo.

d. Produtividade
A produtividade está relacionada com o tempo de produção
Há situações em que tf não é o tempo final de fermentação
Produtividade da biomassa:
*o enunciado pede com o tempo específico.
x −x
P =
t
Produtividade do produto:
P−P
P =
t

e. Velocidade específica máxima

Temos que: μ = ⋅ . Se aplicarmos a integral em ambos os lados chegamos μ ⋅ t = ln x − ln x

á

em:
1
μ. dt = . dx
x
μ ⋅ (t − 0) = ln x − ln x
Lembrando que na fase exponencial μ − μ á :μ á ⋅ t = ln x − ln x
Essa equação é usada para achar o tempo de fermentação, já que a fermentação acontece na fase
exponencial
Cinética de Monod
Mesmo com mais substrato, a velocidade satura e estabiliza
A 1ª fase da cinética de monot é uma reta: inclinação afinidade pelo
[S] rapidez do processo Ks
Ks é o inverso da afinidade pelo [S], ele é o ponto de S onde á

A cinética resulta na seguinte equação:

S
μ=μ á ⋅
K +S

Essa equação precisa ser linearizada na maioria das vezes para ser
resolvida.
1 1 1 K
= + ⋅ onde y é 1/u e x é 1/S
μ μ á S μ á

a. Formação de produtos

μ = α⋅μ+β

Nesse caso, β = Nesse caso Nesse caso, a

0, porque a teríamos um formação de
formação de P β inicial. No produto por
é diretamente caso de uma tempo é
relacionada reta seria constante. No
com X. No caso da linearização crescente com início em β caso de uma reta seria uma reta
seria crescente uma reta com com coef. angular = 0, apenas uma
μ = α⋅μ+β
x = P = 0. linha

μ = α⋅μ = Y / ⋅μ μ =β

Pode ser utilizada para classificar o bioprocesso também.

b. Influência da temperatura (Arrhenius)

Se temos a temperatura devemos utilizar Arrhenius

Passo a passo de um exercício

Caso peça a massa total de m.o e do produto:
1. Organizar os dados, caso ele não de a conversão de substrato em produto a gente sempre considera 99%,
então S vai ser 1% de S0.
2. Encontramos pelas equações de rendimento
- O “aproveitamento de biomassa” é o YX/S
- Caso de um valor em % (p/v) isso indica g/100mL, para transformar em g/L é necessário multiplicar por
1000. Ex: 5% (p/v) = 0,05 g/mL = 50 g/L.
Caso peça o tempo de fermentação na fase exponencial:
1. Usamos a equação da velocidade específica máxima já que μ = μ á na fase exponencial.
2. A velocidade específica geralmente é descrita como “crescimento em cada hora por x g de biomassa”
Caso peçam tempo total de fermentação
1. Nesse caso precisamos considerar 4 equações:

Monot: μ = μ á ⋅ Eq. I Rendimento do substrato em biomassa:

∆
Y / = = = Eq. II
∆

Velocidade específica: μ = Eq III Rendimento do substrato em biomassa:

Y / = →x=x +Y / (S − S) Eq. IV

Unindo II em III: μ = (Y / ⋅− ). Eq V

Unindo I em V: μ á ⋅ = (Y / ⋅− ). Eq VI

Unindo IV em VI : μ á ⋅ = (Y / ⋅− ).
/ ( )

Assim nossa equação final é

−μ á K +S
⋅ dt = ⋅ dS
Y / S ⋅ [x + Y / (S − S)]

2. Para resolver essa equação precisamos integrar de cada lado e resolver as integrais por partes
−μ á K +S
⋅ dt = ⋅ dS
Y / S ⋅ [x + Y / (S − S)]

−μ á K S
⋅ dt = ⋅ dS + ⋅ dS
Y / S ⋅ [x + Y / (S − S)] S ⋅ [x + Y / (S − S)]

a. Ks é uma constante então sai da equação:

Dica:
1 1
Ks =K ⋅ =
S ⋅ (x + Y ⋅ S ) − Y ⋅ S ) S⋅a−b⋅S 1 ln X − ln(−a + bX)
= |
aX − bX a
ln S − ln(−a + bS) 1 ln S − ln(a + b ⋅ S)
K ⋅ =| =K ⋅ + 1 − ln(a − bX)
a a ln S − ln(a + b ⋅ S ) = |
a − bX b
⎡ − ln (x + Y ⋅ S + Y ⋅ S ⎤
1 ⎢ ln S ⎥
K ⋅ ⎢ + ⎥
(x + Y ⋅ S ) ⎢ln S − ln (x + Y ⋅ S ) + Y ⋅ S ⎥
⎢ ⎥
⎣ ⎦

b. Primeiro cortamos o S:
1 1 − ln(a − b ⋅ S) 1 ln (a − b ⋅ S)
⋅ dS = = | =− ⋅ =
(x + Y ⋅ S ) − Y ⋅ S a−b⋅S b b ln (a − b ⋅ S )

⎡ ln (x + Y ⋅ S −Y ⋅S ⎤
1 ⎢ ⎥
− ⋅⎢ ⎥
Y ⎢ ⎥
⎢ln (x + Y ⋅ S −Y ⋅S ⎥
⎣ ⎦

c. Resolvendo a última integral sabendo á

é uma constante.
/

−μ á −μ á −μ á
⋅ 1 ⋅ dt = ⋅ t| = ⋅t
Y / Y Y

3. Em cada etapa devemos substituir os valores para chegar em uma equação simples e igualar.
 R çõ s n im ic s
Características das enzimas
Tem alto poder específico de atuação e não são consumidas no processo
Tem especificidade pelo substrato.
- O mecanismo de ligação enzima-substrato é chave-fechadura.
O sítio ativo é um resíduo de aminoácidos
Os cofatores são compostos não proteicos que combinam com a enzima no estado inativo (apoenzima) e
cataliticamente ativos (holoenzima)

Atividade enzimática 1 U = 1 = 10

Condições de reação mais suaves (T e pH) do que reações químicas

Enzimas são biodegradáveis e atóxicas
Capacidade de regulação:
- Atividade catalítica varia em resposta à concentração de substâncias diferentes do substrato
Fatores que alteram a velocidade de reações enzimáticas:
- Concentração do substrato
- Concentração da enzima
- Presença de inibidores
- Temperatura
- pH

Equação de Michaelis-Menten
Características que precisamos levar em consideração:
- A etapa limitante é a etapa É igual a equação de velocidade
específica da biomassa, mas para
lenta [S]
v=v á ⋅ enzimas a velocidade é v e não μ e a
- A concentração de [ES] é K + [S]
concentração de substrato para uma
imensurável
velocidade que é metade da máxima
- K3 é muito menor que K1 e K2 é Km e não mais Ks.
- Km é a constante relacionada a afinidade da enzima ao
substrato
- Km afinidade
*O desenvolvimento está no slide ou no ex. 11 da lista 1.

a. Comparando a atividade de duas enzimas

Se Km 1 < Km 2:
Ambas as enzimas têm a mesma capacidade máxima, mas Km 1 é menor
que o 2 ou seja, a enzima 1 tem mais afinidade pelo substrato e por isso sua
velocidade de reação é maior
Km2

Linearização
O objetivo da linearização é determinar os parâmetros cinéticos de vmáx e Km
Se a reação ocorre em um lugar com acúmulo de inibição, mas não é retirado do produto, a reação pode parar
Para decidir a melhor linearização utilizamos o r da calculadora, entre os métodos, o mais próximo de 1 será
aquele com melhor linearização.
Passo, a passo da linearização em calculadora
Utilizando a calculadora, os passos são:
1. Shift + Clr + 3 (all) + = (Reset All)
2. Mode + 3 (Reg) + 1 (Lin)
3. Digitar todos os valores na ordem de X para Y, ou seja, 1/S e depois 1/V, com vírgula entre eles e
apertando M+ no final, então, por exemplo, para sem inibição:
Ex: 3.03, 0.018+M++
2+,+0.014+M++....
4. Ao terminar todos os valores, apertamos Shift + Svar (é o número 2) + seta direita até aparecer A
e B. Primeiro acha A e aperta 1 e =, depois acha B e aperta 2 e =
A equação é dada por y = A + Bx e então, igualamos a cada tipo de linearização. Em geral a mais usada é a LB

igual a = + ⋅
á á

a. Linearização de Lineweaver-Burk
Nesse método temos que 1/v=y e 1/S=x. 1 Km 1 1
= ⋅ +
1. Linearizamos os dados em calculadora v v á [S] v á
e igualamos a equação.

2. Sendo assim, o coeficiente linear é equivalente a . Já o coeficiente angular é

á

, sabendo o valor da velocidade máx

á

É o método mais comum e mais usado

b. Linearização de Eadie-Hanes
Nessa equação linearizada, temos que S/v=y e S=x
[S] 1 K
1. Linearizamos os dados em calculadora e = [S] +
v v á v á
igualamos a equação.
2. Sendo assim, o coeficiente linear é

equivalente a . Já o coeficiente angular é .

á á

c. Linearização de Hofstee
Nesse método temos que v=y e v/S=x v
v = −Km ⋅ + v á
1. Linearizamos os dados em calculadora e S
igualamos a equação.
2. vmáx é o coeficiente linear e -Km o angular.

Reações com inibição

a. Inibição irreversível
Formação do complexo enzima-inibidor de maneira irreversível
[ ] [ ]
Não há acúmulo de [ES]: = 0, porém há acúmulo do processo inibidor ≠0

Não possui modelo cinético

b. Inibição reversível competitiva
Inibidor compete diretamente com o substrato pelo sítio ativo, [S] [I]
v=v á ⋅ K =K 1+
então reduzo a quantidade de enzimas trabalhando no substrato [S] + K K

ao mesmo tempo
O complexo [EI] pode se desfazer
A capacidade da enzima de converter [S] em [P] é a mesma, mas o tempo é maior
Vmáx é o mesmo do vmáx sem inibição v á =v á , ou então
muito próximos. Já K ≠K
Ki inibição
[]
Se a inibição tender a 0, o termo 1 + =0
[]
Se a inibição tender a ∞, o termo 1 + =1

c. Inibição reversível não-competitiva

Inibidor se liga a enzima em um ponto diferente do centro ativo, v
[S] á
v=v ⋅ v =
então tenho enzimas ocupadas que não trabalham. O substrato á [S] + K
á [I]
1+
K
continua sendo usado em enzimas ligadas a inibição, por isso há
 formação de produto e  capacidade máxima.
 [S] e  formação do complexo [ES]
A afinidade é a mesma então K = K , porém a v á ≠v á .

d. Inibição reversível incompetitiva

Inibidor combina-se com o complexo ES formando ESI
[S] v = á
K =
inativo v=v á ⋅ á [ ] [ ]
[S] + K
Nesse caso tanto vmáx quanto Km são distintos, pois tanto
a capacidade de produção quanto a afinidade são menores

e. Inibição pelo substrato

O substrato é inibidor
[S] dV
A derivada da função de MM é 0 = 0 → S∗ = K ⋅K
v=v á ⋅ dS
[S]
S* é o ponto onde COMEÇA a [S] + K +
K
inibição

Passo a passo de um exercício

Em geral, serão fornecidos dados de S e V, ou em gráfico ou em tabela, esses dados precisam ser linearizados
Se pedir vmáx e Km: No caso de tabelas
1. Lembrar de alterar as unidades mM em M (multiplicas por 10-3), umol em mol (multiplicar por 10-6)
2. Fazer os equivalentes a y e x (ou seja 1/S e 1/v)

3. Linearizar e igualar y = A + Bx a = + ⋅
á á

Se pedir vmáx e Km: No caso de gráficos

1. Observamos o gráfico até o início da inibição, os dados linearizados serão de o começo até o ponto do
substrato estagnar.
2. Fazer os equivalentes a y e x (ou seja 1/S e 1/v)
 3. Linearizar e igualar y = A + Bx a = + ⋅
á á

Se pedir qual o tipo de inibição

1. Repetir o processo para os dados com a velocidade máxima com inibição. Com os resultados, vamos
comparar vmáx e Km para descobrir o tipo de inibição
*em geral, inibição por substrato vai ser por gráfico porque é muito característico.
Se pedir Ki
1. Depende do tipo de inibição
Competitiva Não competitiva Incompetitiva Por substrato
[I] v á
v á = v = á
K = S∗ = K ⋅K
K =K 1+ [I] á [ ] [ ]
K 1+
K

Influência da temperatura
A velocidade da reação é dada por v = k[E]
Em baixas temperaturas
Ea é a energia de ativação Ea
ln K = ln K −
RT

Em altas temperaturas ou zona de desnaturação

Kd* é a constante de desnaturação E
ln K = ln K ∗ −
RT
Ed é a energia de ativação de desnaturação
A enzima tem um Kd a determinada temperatura, ou seja, para K = K∗ ⋅ e

encontrar Kd utilizamos a temperatura constante.

Tempo de meia vida

E=E ⋅e ⋅

ln 0,5
t =
K

Estabilidade térmica

 T  Kd estabilidade Se eu preciso fornecer uma energia maior para a enzima se degradar

 T t1/2  estabilidade ela é mais resistente e, portanto, mais estável
 T  Ed  estabilidade A imobilização da enzima também aumenta o tempo de meia vida e,
portanto, a estabilidade.

Passo a passo de um exercício

Se pede a energia de ativação/desnaturação

1. O primeiro passo é transformar os dados, sabendo que ln K = ln K − , assim, precisamos transformar

Kd em ln Kd e T(ºC) em 1/T, sabendo que a temperatura precisa estar em Kelvin (+273,15).

2. Tendo em vista os dados e a linearização em calculadora, temos um A e B, sabendo que y = A + BX e

ln K = ln K ∗ − ⋅ . Estipulamos uma constante dos gases de 8,31 J/mol.K e igualando − a B.

Se pede a constante de desnaturação para cada temperatura

1. Caso já tenho Kd*, -Ed, é só substituir cada temperatura e achar cada Kd
 2. Caso tenha apenas Ed ou uma tabela com Kd e T, temos que repetir os passos anteriores, linearizando

todos os dados e sabendo que y = A + BX e ln K = ln K ∗ − ⋅ . Vamos encontrar Kd* igualando Ln Kd* a

A, e depois elevando Euler a esse número

3. Com isso, vamos encontrar uma equação do tipo
K = K∗ ⋅ e
E então aplicamos cada temperatura para achar Kd
Caso peça constante de desnaturação usando uma temperatura de referência
1. Nesse caso, vamos ter duas equações

K = K∗ ⋅ e e K (T ) = K ∗ ⋅ e
∗
⋅
Logo, dividimos uma pela outra: =
( ) ∗
⋅

K = K (T ) ⋅ K ∗ ⋅ e( + )

2. E então aplicamos cada temperatura para achar Kd