Manual de Operação da Usina MOU

FOLHA DE CONTROLE DE REVISÕES

VOLUME: XVII SIGLA: PR-Q 29 CLASSE: NA

Procedimento: DETERMINAÇÃO DA PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE COLIFORMES

TOTAIS E ESCHERICHIA COLI EM AMOSTRAS DE ÁGUA PELO MÉTODO
DO SUBSTRATO CROMOGÊNICO DEFINIDO

Número de Páginas: 01 a 06 P.A.: 007.2019 CÓPIA CONTROLADA N.°:

Anexo(s) – Página(s): 07 a 08 U.O.: DARA.T

Páginas
Rev. Ata Data Autor Revisor Responsável Aprovado
revisadas
Janine de M.
Valdeci Ribeiro Carlos Elysio Jorge Luiz lima
00 002.12 25.01.2012 Todas Mariano
de Almeida Alhanati de Rezende
Chiappetta

Janine de M.
Valdeci Ribeiro Aderval Ferrari Marcos Melo de
01 029.15 07.10.2015 Todas Mariano
de Almeida Vaz de Almeida Souza
Chiappetta

Janine de M.
Valdeci Ribeiro Aderval Ferrari Abelardo da Cruz
02 NA 29.02.2016 Todas Mariano
de Almeida Vaz de Almeida Vieira
Chiappetta

Janine de M. M. Valdeci Ribeiro Aderval Ferrari Abelardo da Cruz

03 NA 14.12.2018 Todas
Chiappetta de Almeida Vaz de Almeida Vieira

Janine de M. Valdeci Ribeiro Aderval Ferrari Abelardo da Cruz

04 NA 11.03.2019 02
Mariano de Almeida Vaz de Almeida Vieira

* Conforme PA-GE 01 Rev.67, ATA nº 027.2016, de 01.09.2016, a partir desta data, os procedimentos revisados receberão o número da última revisão em
vigor, em todas as suas folhas.

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PROCEDIMENTOS DE MONITORAÇÃO AMBIENTAL

VOLUME: XVII SIGLA: PR-Q 29 CLASSE: NA REVISÃO: 04 FOLHA: 1

ÍNDICE
PÁGINA

1. OBJETIVO 2

2. APLICABILIDADE 2

3. REFERÊNCIAS 2

4. RESPONSABILIDADES 2

5. DEFINIÇÕES 3

6. PRÍNCIPIO DO MÉTODO 3

7. MATERIAIS 4

8. PROCEDIMENTO 4

9. CONTROLE DE QUALIDADE 6

ANEXO I 7

ANEXO II 8

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1. OBJETIVO

Estabelecer metodologia para a determinação da presença ou ausência de Coliformes Totais

e Escherichia coli em amostras de água.

2. APLICABILIDADE

Este procedimento é aplicável à determinação qualitativa de Coliformes Totais e Escherichia

coli em amostras de água pelo Laboratório de Monitoração Ambiental.

3. REFERÊNCIAS

3.1. “23th Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater”. – American
Publication of Health Association – 2017 (ref. item 3.1 - Seção 9223).

3.2. Handbook of water analysis, 1th edition, 2000.

3.3. Ministério da Saúde - “Qualidade da Água para Consumo Humano” - Portaria 518, de
25 de março de 2004.

3.4. PR-Q 07 - Procedimento de Higienização, preparo e esterilização de materiais

para uso em ensaios bacteriológicos.

3.5. PR-Q 08 - Procedimento de Coleta de amostras de água para análises

bacteriológicas.

3.6. PR-Q 30 - Procedimento de Manutenção e reativação de microrganismos de

referência.

3.7. PR-Q 31 - Procedimento de Controle Interno de Qualidade do Laboratório de

Bacteriologia.

3.8. PR-Q 36 - Procedimento de Operação, manutenção e limpeza da cabine de fluxo

laminar do laboratório de bacteriologia.

4. RESPONSABILIDADES

4.1. O Chefe da Divisão de Análise Radiológica e Ambiental é responsável, gerencialmente

pela aplicação deste procedimento.

4.2. O Supervisor da Química é responsável pelo cumprimento deste procedimento.

4.3. Os Químicos e Técnicos em Química são responsáveis pelas análises e pelos registros
resultantes dessas análises.

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5. DEFINIÇÕES

5.1. Escherichia coli (E. coli) – Bactéria encontrada em esgoto, efluentes tratados e águas
naturais e solos sujeitos à contaminação fecal recente, de humanos, animais domésticos,
selvagens e pássaros, e, sua presença requer providências imediatas. Sendo que
atualmente são disponíveis testes rápidos para sua identificação, alguns deles submetidos a
padronização internacional e aceitos para uso em rotina. E desta forma podem ser utilizados
meios quimicamente definidos, contendo substratos para detecção de uma enzima
específica a - glucuronidase.

5.2. Coliformes totais - São definidos como bacilos Gram-negativos, oxidase negativos,
capazes de crescer na presença de sais biliares ou agentes tensoativos (como o lauril sulfato
de sódio) e de fermentar a lactose a 35 - 37C, com produção de ácido, gás e aldeído, em 24
horas. A maior parte das bactérias do grupo coliforme pertencem ao gênero Escherichia,
Citrobacter, Enterobacter, e Klebsiella, entre outros. Além de serem encontradas em fezes,
elas podem ocorrer no meio ambiente, em águas com altos teores de matéria orgânica, solo
ou vegetação em decomposição. Com o desenvolvimento de testes enzimáticos para sua
detecção, essa classe de microrganismos foi ampliada, sendo considerados coliformes totais
as bactérias que possuem a enzima - galactosidase.

6. PRÍNCIPIO DO MÉTODO

O método de substrato enzimático utiliza substratos hidrolisável para a detecção simultânea

de bactérias de coliformes totais e de enzima de Escherichia coli. Quando a técnica de
enzima é usado, o grupo coliforme total é definido como todas as bactérias que possuam a
enzima β-D-galactosidase, que é cliva o substrato cromogênico, resultando na liberação do
cromogênio. E. coli são definidas como bactérias que dá uma resposta positiva para
coliformes totais e possuem a enzima β- glucuronidase, que cliva um substrato fluorogênico,
resultando na libertação de fluorogenio.

a) Bactéria coliforme total: o substrato cromogênio (orto-nitrofenil-β-D-galactopiranosídeo (ONPG) ou

vermelho de clorofenil-β-galactopiranosídeo (CPRG) ou 5-bromo-4-cloro-3-indol-β-D-
galactopiranosídeo (X-GAL)) é usado para detecção da enzima β-D-galactosidase. Esta enzima
hidrolisa o substrato e produz uma mudança na cor do meio que indica positivo para coliforme
total após 18-24h (ONPG) ou 24h (CPRG ou X-GAL);

b) E. coli: o substrato fluorogênico 4- metilumbeliferil-β-D-glucoronideo (MUG) é usado para

detecção da enzima β- glucuronidase, que hidrolisa o substrato fluorogênico e produz fluorescência
sob luz ultravioleta (365 nm).

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7. MATERIAIS

 Cápsula do substrato cromogênico definido (Ex.: Colilert, Redcult ou Colitag);

 Álcool desinfetante, conforme PR-Q 07;
 Frasco plástico estéril graduado, com capacidade de 120mL;
 Estufa incubadora calibrada a 35 + 0,5°C;
 Gabinete de observação com lâmpada UV de 365 nm e 6 W de potência;
 Comparador colorimétrico (opcional);
 Cabine de Segurança Biológica;
 Reagente Kovac’s.

8. PROCEDIMENTO

8.1. Manuseio, coleta e preparo da amostra

Realizar a coleta e o manuseio de amostra conforme o PR-Q 08.

Nota: A amostra pode ser coletada no próprio frasco que será utilizado na análise, desde
que o mesmo tenha o conservante para as amostras cloradas.

8.2. Realização do ensaio

8.2.1. Realizar o ensaio dentro da cabine de segurança biológica para isso deve-se seguir o
PR-Q 36 para operação da cabine de segurança biológica.

8.2.2. Dispor sobre a bancada de trabalho os seguintes materiais, previamente limpos com
álcool desinfetante:

a) Frascos de coleta com amostras;

b) Frascos estéreis para análise, caso não seja utilizado o frasco de coleta;
c) Cápsula de substrato cromogênico;
d) Recipiente para descarte.

8.2.3. Em ambiente asséptico, adicionar o conteúdo da cápsula de substrato cromogênico

em 100mL da amostra.

8.2.4. Fechar o frasco e agitar levemente para dissolver completamente o reagente.

8.2.5. Incubar o frasco contendo a amostra e o substrato cromogênio definido por 24 horas a
35  0,5C.

8.2.6. Registrar todas as análises realizadas na folha de controle de análise (ANEXO I).

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8.3. Interpretação dos resultados

8.3.1. Após a incubação, observar visualmente os frascos e efetuar a interpretação do

resultado utilizando a tabela abaixo.

Tabela 1 – Interpretação do Resultado

Composição do Coliforme Total E. coli

Substrato Positivo Negativo Positivo Negativo
ONPG-MUG Amarelo Incolor
Vermelho ou Fluorescência Sem
CPRG-MUG Amarelo
Magenta Azul fluorescência
Levemente
X-GAL-MUG Verde azulado
amarelo

8.3.2. Se a cor não estiver uniforme em toda a amostra, misturar por inversão antes da
leitura.

Nota: Para as visualizações dos aspectos da cor pode ser utilizado, opcionalmente, o
comparador de referência fornecido comercialmente pelo fabricante com mesmo substrato
enzimático.

8.3.3. Se a resultado cromogênio for questionável incubar por mais 4h para o ONPG e 24h
para o CPRG e X-GAL. Se a cor se intensificar é positivo para coliformes totais, caso
contrário a amostra é negativa.

Nota: Os resultados obtidos após o período de incubação devem ser desconsiderados.

8.3.4. Se a fluorescência for questionável incubar por mais 4h para o ONPG e 24h para o
CPRG e X-GAL. Se a fluorescência se intensificar o resultado é positivo, caso contrário a
amostra é negativa.

8.3.5. Confirmar o positivo adicionando 2,5mL do reativo de KOVAC’s na amostra, quando

utilizar o X-GAL.

8.3.6. Os resultados de coliforme total e E. coli devem ser reportados como presença
(positivo) ou ausência (negativo) em 100mL de amostra.

8.4. Destinação da amostra após ensaio

Após a realizar o ensaio e interpretar os resultados, descontaminar o frasco contendo

amostra e reagente, segundo item 7.1 do PR-Q 07.

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9. CONTROLE DE QUALIDADE

9.1. A cada novo lote de substrato testar sua performance utilizando 3 culturas de controle:
Escherichia coli, Enterobacter aerogenes e não coliforme (Pseudomonas aeruginosa ou
Enterococos faecalius ou Staphylococus aureus). Preparar uma suspensão microbiana de
maneira a se obter uma turvação equivalente ao tubo 0,5 da escala Mac Farland. Seguir o
procedimento do item 8.2, substituindo a amostra pelas culturas controle. O ensaio deverá
apresentar resultado conforme esperado no item 8.3.1.

Nota: O preparo da suspensão microbiana deverá ser feito segundo item 7 do PR-Q 30.

9.2. Realizar um ensaio controle seguindo o procedimento do item 8.2, substituindo a

amostra pela água de diluição esterilizada, preparada conforme PR-Q 46. O ensaio controle
deverá apresentar resultado negativo para os dois ensaios.

9.3. Registrar as análises de controle de qualidade na folha de controle (ANEXO II).

Nota: Se a água de diluição apresentar fluorescência ou positivo para coliformes, descartar e

usar uma nova cápsula de substrato. Se o erro persistir desconsiderar o novo lote de
substrato.

9.4. Realizar o controle do ar da cabine de segurança conforme item 7.9.1 do PR-Q 31.

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ANEXO I

MODELO DE FORMULÁRIO - REGISTRO DE ANÁLISES - TÉCNICA P/A

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ANEXO II

MODELO DE FORMULÁRIO - REGISTRO SUBSTRATO P/A

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