Histórico da Biologia Molecular

Prof. Dr. Nicolau Brito da Cunha

Brasília
2014
Biologia molecular

A Biologia Molecular é o campo da biologia que estuda a

composição, a estrutura e a interação de moléculas celulares, como
ácidos nucleicos e proteínas, que realizam os processos biológicos
essenciais para as funções e manutenção da célula.
 O Dogma Central da Biologia molecular

Francis Crick, 1967

Mecanismos Básicos em Biologia Molecular
 Genética (1865) Genética Moderna (1900)

Ervilha (Pisum sativum).

vc

Gregor Johan Mendel (1822 – 1884).

"Ensaios com plantas híbridas“

(1865).
• Características Analisadas – traços ou
carcteres
– Linhagem pura
– Fenótipo
• Cruzamentos
 Cruzamentos monoíbridos entre plantas de aspectos (fenótipos)
diferentes.

Pai Mãe

Pais
(F0)

Alto Baixa
(AA) (aa)

Primeira geração (F1)

Todas altas (Aa)

 Cruzamento de monoíbridos.

Pai alto (Aa) Mãe alta (Aa)

Primeira geração (F1)

Segunda geração (F2)

(AA) (Aa) (Aa) (aa)

Progênie alta Progênie baixa
3:1
Características dominantes e recessivas.

(YY) (yy)
Cor das
sementes
(Yy)

3:1 (YY) (yy)

(Yy)
(Yy) Cor das flores
Cor das vagens
Rugosidade

3:1 3:1 3:1

 Cruzamentos monoíbridos: envolvem a observação
e o estudo de um único traço.

Fatores particulados: genes (Wilhelm Johannsen -1909)

• Fator latente: recessivo

• Fator expresso integralmente
(funcional): dominante

As formas dominante e recessiva de

um gene são denominadas alelos
(do grego: “de uma outra...).

•Alelos são formas alternativas de

um gene.

Wilhelm Johannsen
(1857 – 1927)
• Base molecular da genética
mendeliana
– Alelos diferentes
– Alelo 1 (A) –
ATGTTTCGTCATGGTCCAAGG
– Alelo 2 (a) -
ATGTTTCGTCATGGACCAAGG

– Produzidos por mutações no DNA

• Base molecular da genética
mendeliana
 Representação alélica por símbolos
A constituição alélica de
cada linhagem é
chamada de genótipo.

O aspecto, a aparência
física de cada linhagem é
denominada fenótipo.

A primeira geração filial

é chamada F1. A
segunda, F2.

Os alelos do zigoto se
separam, ou segregam
durante a formação dos
gametas.

E se autofecundássemos
as plantas F2 para
produzirmos a F3?
Os dois primeiros princípios de Mendel.
Cruzamentos diíbridos: envolvem plantas que se diferem
por duas características simultaneamente.
O terceiro princípio de Mendel.
As a result of his observations, Mendel proposed
three “laws” of inheritance:

1. The law of segregation: alternative trait “factors”

that came together in the offspring separate again
when the offspring produce gametes.

2. The law of dominance: hybrids between two

alternative forms of a trait resemble one of the
parental types.

3. The law of independent assortment: differences

for one trait are inherited independently of
differences for another trait.
Descoberta da nucleína (1869)
Johann Friedrich Miescher

Glóbulos brancos contidos no

pus  apresentam um
composto de natureza ácida,
rico em fósforo e nitrogênio,
desprovido de enxofre e
resistente à ação da pepsina
 nucleína
 Descoberta da nucleína (Cont.)

1880 → Albrecht Kossel - demonstrou que a nucleína

continha bases nitrogenadas em sua estrutura.

1889 → Richard Altmann - obteve nucleína com alto

grau de pureza, comprovando sua natureza ácida e
dando-lhe o nome de ácido nucléico.
Thomas Hunt Morgan
(1910)
 Teoria cromossômica da herança.
Os genes estão localizados nos cromossomos.

Em uma célula, cromossomos homólogos pareiam durante a

meiose.

Cromossomos homólogos apresentam os mesmos genes nos

mesmos loci, mas possivelmente diferentes alelos. Por exemplo,
dois cromossomos homólogos podem ter genes que codificam a
cor dos olhos, mas um pode codificar para os olhos castanhos,
o outro para o azul.

Uma célula humana contém 23 pares de cromossomos

homólogos: 22 deles são cromossomos não sexuais homólogos
(ou autossomos) e 1 par homólogo de cromossomos sexuais.
Nas fêmeas, os cromossomos sexuais homólogos são de 2 X;
Nos machos os cromossomos X e Y.
Princípio Transformante (1928)
Frederick Griffith
 Injeção

Bactérias virulentas Camundongo

vivas encapsuladas morre
Bactérias não-virulentas Camundongo
vivas não-encapsuladas sobrevive
 Calor

Bactérias
virulentas vivas
encapsuladas Bactérias virulentas
Camundongo
mortas pelo calor
sobrevive
 Bactérias virulentas mortas pelo calor

Bactérias não-
virulentas
vivas não- Mistura de bactérias
encapsuladas virulentas mortas e não- Camundongo
virulentas vivas morre
Um gene codifica uma proteína (1941).

George Beadle Edward Tatum

(1903 – 1989) (1909 – 1975)
Mutagênese em células do fungo Neurospora crassa
Princípio Transformante = DNA
(1944)

Avery, Mcleod & McCarty

 Princípio Transformante = DNA
Bactéria virulenta
Bactérias virulentas Lipídeos
mortas pelo calor Bactéria avirulenta
Carboidratos

Proteases Ribonuclease Desoxirribonuclease

Bactérias Bactérias Bactérias

avirulentas avirulentas avirulentas

Ocorre Não ocorre

transformação transformação
 Bactérias não-virulentas vivas

DNA isolado de bactérias

virulentas mortas pelo calor

Transformação

Camundongo
morre
Bactérias
não-
virulentas
vivas não- Bactérias virulentas
encapsuladas encapsuladas
 Chargaff (1949): A=T, C=G ; A+G = C + T
Razão de Chargaff: A+T/G+C Variável

Organismo Adenina Timina Guanina Citosina A+T/G+C

EcoliK12 26 23,9 24,9 25,2 1,0

Sreptococcus
29,8 31,6 20,5 18 1,59
pneumoniae

Mycobacterium
15,1 14,6 34,9 35,4 0,42
tuberculosis

Leveduras 31,3 32,9 18,7 17,1 1,79

Homo sapiens 30,3 30,3 19,5 19,9 1,53

Methanococcus
34,4 34,1 15,5 15,8 2,18
jannaschii

Archaeoglobus
25,8 25,6 24,2 24,3 1,05
fulgidus
Bacteriófagos T2, 32P e 35S (1952)
Martha Chase & Alfred Hershey
Experimento com 32P Experimento com 35S
Capa não-radioativa Capa radioativa

DNA Fago DNA não-

radioativo radioativo

Bactéria
Injeção

(a)
 Agitação
em
liquidificador

(b)
Não radioativo
Separação
Radioativo
por
centrifugação

Radioativo Não radioativo

(c)
Rosalind Franklin & Wilkins
Cristalografia (1950-1952)
Difração de Raios-X

Raios difratados

Feixe de raio-X

Molécula
cristalizada

Filme
Cristalografia
Modelo molecular da estrutura do DNA em
hélice dupla. Watson e Crick (1953)
Watson e Crick - 1993
Mecanismo enzimático de replicação do DNA
Arthur Kornberg (1958)
 Mecanismo molecular de replicação do
DNA. Meselson e Stahl (1958)

DNA extraído e
centrifugado em
gradiente de
cloreto de césio
Elucidação do código genético
 O código genético
A
T
G
Met
G
A
A Glu
G
A
T Asp
G
G Gly
T
T
C Ser
T
A Met
T
G Proteina
A Lys
A
A
DNA Met
A
T
G
 O código genético
Segunda letra do códon

Primeira letra do códon

Degeneração do código genético
AA Códons AA Códons
DNA ligase (1967)

Martin Gellert Robert Lehman Charles C. Richardson

(1929). (1924). (1924).

Enzymatic joining of DNA strands, II. An enzyme-adenylate intermediate in the dpn-dependent DNA ligase
reaction. J W Little, S B Zimmerman, C K Oshinsky, and M Gellert 1967 Nov;58(5):2004-11. Proc Natl Acad Sci U S
A. 1967 November; 58(5): 2004–2011.
Endonucleases de restrição (1968)

Proc Natl Acad Sci U S A.

Tipo I, II e IIII.

Werner Arber (1929) Stuart Linn

Endonuclease R = HindII
 Manipulação de DNA

Enzimas de
restrição
DNA ligase
 DNA híbrido

DNA humano DNA de barata

AATCG,,,,
TTAGCTTAA + AATTCCGTTTA
,,,, GGGAAAT
AATCGAATTCCGTTTA
TTAGCTTAAGGGAAAT

ATP
AMP +
PPi
 Clonagem

Fragmento de DNA
a ser clonado
DNA vetor

Ligação catalisada
pela DNA ligase

DNA recombinante
Transformação

DNA recombinante
Cromossomo
bacteriano
Clonagem de genes

Animais

Plantas

Bactérias Leveduras
 Engenharia genética
(1972 - 1973)

Paul Berg
(1926 )

Stanley Cohen Herbert Boyer

(1935) (1936 )
Plasmídeos

a) b)
Cassete de expressão
Hind III Eco RI Nco I Hind III

Transcrição

promotor
pep. seqüência terminador
sinal codante
start stop
codon codon

Eco RI Nco I

Hind III Hind III

Plasmídeo
 Humulin ™ Genentech Labs.

Protropin ™ Genentech Labs.

The molecular basis of eukaryotic transcription
Roger Kornberg (1970)
Reação em cadeia da DNA Polimerase (PCR – 1986)

Kary Mullis (1944)

 (1984 - 1987)
Transferência de genes

Luis Herrera- Patricia Zambryski

Estrella (1956 - )
Agrobacterium tumefaciens
 (1987-1989)
Biobalística

John Sanford Elíbio Rech

(1950 - )
 (1960s)
Cultura de Tecidos

Toshio Murashige Folke Skoog

(1908 - 2001)
 (1994)

O tomate “longa vida” (Flavr Savr®)

 (1995)

Laurate long chain rapeseed

The Plant Cell, Vol. 10, 613–621, April 1998
 (1999)

O projeto “Golden Rice”.

a) b)

b)
 (1995)

O Algodão Bt

Proteína cry1Aa
 (1996)

Soja Monsanto Roundup Ready®

 Glifosato® Triptofano
Fenilalanina
Tirosina

EPSPS
 Plataformas para a biossíntese de proteínas recombinantes.

Ma, J.K.C. et al. The production of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Nature Review Genetics 4, 794-805. (2003).

v
 6000

1300

90
70

Daniell et al.,
Sequenciamento de DNA

(1977) Allan Maxam, Walter Gilbert e

Frederick Sanger
Sequenciamento automático de DNA
Projeto Genoma Humano
- 1º cromossomo (1999)
-”rascunho” (2000)

3 100 000 000 nt

Dolly (1997) - 1ª clonagem de um mamífero
 Green Fluorescent Protein (GFP)

Aequorea victoria
Silenciamento gênico por RNAi
RNAi pathway
Células tronco
 Kit de diagnóstico baseado no DNA
• Por $79, o DNA é testado para
saber como o organismo do
cliente responde a 10
substâncias (cafeína, estatinas
(colesterol), warfarin (raleia o
sangue) tamoxifen (câncer de
mama).
• Por $179, futuros pais podem
ser testados para 23 potenciais
Pathway Genomics
condições genéticas.
Corporation,
San Diego, CA, EUA • Por $179, o cliente pode ter o
seu DNA testado para essas 23
Valor do kit US$ 20-30 kit.
condições.
• Por $249 o cliente pode ter
todos esses testes.
Silenciamento de um cromossomo
21 in vitro

Cromossomo 21

Paciente
com
Síndrome
de Down
Célula pluripotente Gene Xist Corpúsculo
derivada do fibroblasto
Fibroblasto de Barr

Jung Jiang et al. (2013). Nature.

Translating dosage compensation to trisomy 21
Edição de genoma
 Martin Evans
1925 1937 1941
Edição de genoma: TALEN
 Edição de genoma: CRISPRs
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats