Análise Genômica

Parte I
Método de Sanger e NGS
Definição - Análise genômica
Pontos Principais:
Sequenciamento de DNA é o processo de determinação da sequência de
nucleotídeos (As, Ts, Cs, e Gs) em um pedaço de DNA.

No método Sanger de sequenciamento, o DNA alvo é copiado muitas vezes,

produzindo fragmentos de comprimentos diferentes. Nucleotídeos
“terminadores de cadeia” fluorescentes marcam os finais dos fragmentos e
permitem que a sequência seja determinada.

As técnicas de Sequenciamento de Última Geração (NGS) são novas

abordagens feitas em grande escala que aumentam a velocidade e diminuem os
custos do sequenciamento.
O que é sequenciamento?
“genomas estão sendo sequenciados”.
Por exemplo, o genoma humano foi concluído em 2003, depois de
vários anos de esforços internacionais. Mas o que significa sequenciar
um genoma ou mesmo pequenos fragmentos de DNA?

Sequenciamento de DNA é o processo de determinação da sequência

de bases nucleotídicas (As, Ts, Cs, e Gs) em um pedaço de DNA.

Atualmente, com os materiais e equipamentos corretos, sequenciar um

pequeno fragmento de DNA é relativamente simples.
O que é sequenciamento?
Sequenciar um genoma inteiro (todo o DNA de um organismo) é uma tarefa uma
tarefa complexa. Isso requer quebrar o DNA do genoma em pequenos
fragmentos, sequenciar esses pedaços e montar as sequências em uma única e
longa sequência "consenso".
Entretanto, graças a novos métodos que têm sido desenvolvidos nas duas
últimas décadas, o sequenciamento genômico é agora muito mais rápido e mais
barato do que era durante o Projeto Genoma Humano
Sequenciamento de
Sanger: o método de
terminação da cadeia
Sanger

O método Sanger foi desenvolvido pelo

bioquímico britânico Fred Sanger e
seus colaboradores, em 1977.
Regiões de DNA com até 900 pares de
base de comprimento são
rotineiramente sequenciados pelo
chamado método Sanger de
sequenciamento ou método de
terminação da cadeia.
Sanger

No Projeto Genoma Humano, o método Sanger foi usado para determinar

as sequências de muitos fragmentos relativamente pequenos de DNA
humano. (Esses fragmentos não tinham necessariamente 900900900 pb
ou menos, mas os pesquisadores conseguiam "caminhar" ao longo de
cada fragmento usando diversas rodadas de sequenciamento por Sanger.)
Os fragmentos foram alinhados com base nas porções de sobreposição
compondo sequências de regiões mais longas de DNA e, eventualmente,
os cromossomos inteiros.
Década de 70
Década de 70
Década de 70
Aprimoramento do Método de Sanger - anos 90
Década de 90
Década de 90
NGS
Sequenciamento de
Nova/Última Geração
 NGS

O princípio desta tecnologia foi proposto por Hyman em 1988 (1988), mas
somente em 2005 tivemos o primeiro sequenciador de segunda geração
disponibilizado no mercado pela empresa Roche (sequenciador 454 GS20).
NGS
NGS
Pode sequenciar direto?

Tamanho do Fragmento (impossível sequenciar TUDO de uma vez)

Sensibilidade de detecção = Sinal Alto = Várias cópias do gene alvo

Biblioteca
Biblioteca
Biblioteca
Verde e Vermelho: Marcadores conhecidos (gene ou região alvo) - Kit comercial pronto
Azul: DNA
Marcadores de amostra: cada amostra
(paciente) um marcador foi adicionado ao
DNA separadamente, depois juntar tudo
em um tubo e sequenciar junto.

Pode rodar de 2 até 384 amostras juntas.

Amplificação
Amplificação Illumina
Sequenciamento
Sequenciamento

Floríferos
Sequenciamento
Sequenciamento
Sequenciamento
Sequenciamento
Sequenciador
https://www.youtube.com/watch?v=
Uma54mKcR40

https://www.youtube.com/watch?v=
0ZVdROXCsi0