Universidade Iguaçu - UNIG

AVALIAÇÃO DA NEOVASCULARIZAÇÃO E NEUROINFLAMAÇÃO CEREBRAL

EM RATOS ESPONTANEAMENTE HIPERTENSOS ALIMENTADOS COM DIETA
HIPERLIPIDICA TRATADOS COM SITAGLIPTINA

Nome do Professor Orientador: Aluana Santana Carlos

Nome do aluno bolsista: Lucas Silva Bastos

1
 Universidade Iguaçu - UNIG
1 Resumo

A hipertensão arterial, dislipidemia e diabetes mellitus são fatores de risco conhecidos e

sinérgicos para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares. Ambos aceleram o
desenvolvimento de complicações crônicas, macro e microvasculares do sistema nervoso central
e periférico, as quais foram pilares para o nosso estudo de novas terapias medicamentosas. Sendo
assim, o principal objetivo deste trabalho avaliar os efeitos da administração de sitagliptina sobre a
neovascularização e neuroinflamação cerebral em ratos espontaneamente hipertensos
alimentados com dieta hiperlipídica.

Palavras chave: Hipertensão arterial, Neovascularização, Neuroinflamação, Sitagliptina.

2
 Universidade Iguaçu - UNIG
2 Introdução

A obesidade tem se tornado um problema de saúde pública de repercussão global.1

Esse quadro vem se agravando devido à alimentação inadequada e ao alto grau calórico
associado à diminuição do gasto calórico, o que contribui de modo significativo para a
elevação da adiposidade e traz consigo uma série de comorbidades, dentre elas:
hipertensão arterial, dislipidemia, diabetes mellitus tipo 2 (DM2)e doença vascular
arteriosclerótica.2 A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que, atualmente no
mundo, existem aproximadamente 100 milhões de indivíduos obesos.3,4 Recentemente,
alguns estudos epidemiológicos confirmaram que existe uma interação entre obesidade,
síndrome metabólica e doença renal.5,6 Em várias populações, a elevação do índice de
massa corporal e a presença de síndrome metabólica se associam com diminuição da
função renal e o aparecimento de doença renal terminal, independentemente da
presença de hipertensão arterial e diabetes mellitus.
A Hipertensão arterial sistêmica (HAS) está associada com alterações estruturais
adversas miocárdicas, vasculares e aumento da atividade inflamatória vascular que
também podem ser marcadores de doença coronária.7 A angiotensina II (angio II) é o
mais importante peptídeo do sistema renina- angiotensina-aldosterona (SRAA) e sua
ação sobre receptores de membrana tipo 1 (AT1) implica na fisiopatologia da doença
cardiovascular por gerar vasoconstrição, trombose, produção de superóxido,
modificações na arquitetura e integridade da parede dos vasos pela modulação do
crescimento celular, síntese de componentes da matriz extracelular e estimulação de
mediadores hormonais.8A angio II promove hipertrofia de músculo liso vasculares de
cardiomiócitospela produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), através da
ativação de cascatas de sinalização, por exemplo, proteína C quinase e proteína quinase
ativada por mitógenos. As EROs têm sido também implicadas na fisiopatologia da doença
cardiovascular, como aterosclerose, hipertensão arterial e insuficiência cardíaca.9
Entre os fatores de risco para mortalidade, a HAS é responsável por 40% das
mortes por acidente vascular cerebral e 25% daquelas por doença coronariana10. A
hipertensão arterial é considerada um fator determinante de inúmeras alterações
anatômicas e funcionais expressivas no organismo humano, cursando com alterações
hemodinâmicas, metabólicas e tróficas11.
A associação entre DM2 e HAS são duas condições que podem causar efeitos
deletérios sobre o sistema cardiovascular, acelerando o processo de aterosclerose
envolvido tanto no DM2 como na hipertensão.11 Além disso, sabe-se que a neuropatia
autonômica cardíaca (NAC), que resulta de danos nas fibras autonômicas que inervam o
coração e vasos sanguíneos, é uma séria complicação da DM2 e hipertensão arterial
sistêmica (HAS).4
O tratamento do diabetes tipo 2 (DM) e da HAS compreende ações interligadas,
3
 Universidade Iguaçu - UNIG
que objetivam manter em níveis adequados a glicemia e a pressão arterial. É comum,
devido a alta incidência de DM e HAS, encontrar pacientes que façam uso de anti-
hipertensivos e medicamentos hipoglicemiantes simultaneamente.
Os antidiabéticos orais têm como o principal objetivo dos fármacos no tratamento
do DM é, inicialmente, aumentar o tempo de vida do paciente bem como aliviar os
sintomas da doença e, posteriormente, diminuir os riscos de desenvolvimento das
complicaçõe s secundárias causadas pelo DM aumentando assim, a longevidade do
paciente13 .Os inibidores DPP-4 inibem a degradação de GLP-1, reduzindo glucagon e
sangue os níveis de glicose no diabetes também podem ter efeitos antioxidantes no
coração. Por exemplo, sitagliptina reduziu a peroxidação lipídica e aumentou a defesa
antioxidante em corações de ratos T1D, e isso foi associado a uma redução nos índices
de risco cardiovascular. Vildagliptina e a sitagliptina reduziram a peroxidação lipídica, a
carbonilação de proteínas e a produção de ROS em modelos de roedores de T2D
induzido por HFD que está associado a uma melhor variabilidade de HR e despolarização
mitocondrial reduzida e inchaço. Além disso, o coração melhorias observadas em
camundongos fêmeas T2D após tratamento com inibidor de DPP-4, linagliptina, estão
igualmente associados a marcadores reduzidos de estresse oxidativo cardíaco.14-16
Os efeitos antioxidantes benéficos dos inibidores DPP-4 podem ser devidos à
melhora função mitocondrial e aumento da biogênese mitocondrial e relacionado a
autofagia melhorada. Curiosamente, estudos no rim demonstraram que o efeito
antioxidante dos inibidores DPP-4 pode ser dependente de um sistema antioxidante
intacto, embora se este seja o caso no coração diabético ainda não tenha sido confirmado.
Curiosamente, os parâmetros de estresse oxidativo reduzidos no coração diabético não
são observados com inibidores DPP-4 em todos os modelos de diabetes , sugerindo o
potencial antioxidante de A inibição de DPP-4 requer investigação de adição. Infelizmente,
embora esses dados pré-clínicos parecem promissores, nenhum dos grandes ensaios
clínicos de resultados CV recentemente publicados demonstrou qualquer benefício
cardiovascular significativo em pacientes com DM2.16-18

4
 Universidade Iguaçu - UNIG
3 Hipóteses

Estudos clínicos e experimentais sugerem que a disfunção microvascular e redução

da perfusão tecidual cerebral decorrente em DM2 e HAS avaliados de forma isolada.
Estratégias farmacológicas já foram sugeridas para o tratamento do DM2, no entanto,
nenhum medicamento demonstrou promover a normalização dos níveis glicêmicos
associada à proteção efetiva da rede microvascular cerebral. O DDP4 (Sitagliptina,
incretinomimético) vêm sendo considerados promissores na melhora nos desfechos
cardiovasculares pacientes com DM2. Portanto, a nossa hipótese e o quadro estudo da
associação de comorbidaddes para verificar o efeito da Sitagliptina sobre a
neovascularização e neuroinflamação cerebral em ratos espontaneamente hipertensos
alimentados uma dieta rica em lipídeos.

5
 Universidade Iguaçu - UNIG

4 Objetivos

Avaliar se um inibidor de DDP-4, a sitagliptina pode ser benéfico na neovascularização e

neuroinflamação cerebral em ratos espontaneamente hipertensos alimentados com dieta
hiperlipídica tratados com sitagliptina. Para tal, são estabelecidos os seguintes objetivos
específicos:

- Investigar a expressão de IB-4 e VGFA nas células endoteliais cerebrais para avaliação de

neovascularização;

- Estudar o perfil lipídico e insulina sérica para avaliação parâmetros metabólicos;

- Verificar a inflamação hipotalâmica através da expressão IBA-1, GFAP cerebrais;

- Avaliação quantitativa dos marcadores IB-4 , VGFA, IBA-1, GFAP.

6
 Universidade Iguaçu - UNIG

5 Justificativas

No entanto, apesar dos importantes e crescentes avanços no diagnóstico e tratamento da

doença hipertensiva, assim como na prevenção de lesões de órgão salvo (acidente vascular
cerebral, doença cardíaca e renal), a hipertensão arterial continua sendo uma das principais
causas de morbi-mortalidade mundial. Desta forma, esperamos trazer a luz o conhecimento sobre
a utilização de Sitagliptina podem trazer benefícios na prevenção de acidente vascular cerebral
em ratos espontaneamente hipertensos alimentados com dieta hiperlipídica.

7
 Universidade Iguaçu - UNIG

6 Metas

Metas Data
1- Avaliar parâmetros biométricos Fevereiro 2024
2- Avaliação perfil lipídico Março 2024
3- Avaliação insulina sérica Abril 2024
4- Investigar a expressão de IB-4 e VGFA nas células Junho a Agosto 2024
endoteliais cerebrais
5- Investigar inflamação hipotalâmica através da Abril a Junho 2024
expressão IBA-1, GFAP cerebrais
6- Análise quantitativa por morfometria Setembro 2024
7- Análise de dados estatísticos Outubro 2024
8- Produção do artigo científico Novembro a Dezembro 2024

8
 Universidade Iguaçu - UNIG

7 Material e métodos

Esse estudo está de acordo com os Princípios Éticos na Experimentação Animal

adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), está aprovado à
Comissão de Ética (CEUA) no uso de animais da Universidade Iguaçu (PEBIO/UNIG No
014/2020).
A realização da etapa experimental já foi realizada no Laboratório de Experimentação
Animal sendo finalizada em maio/23.

Delineamento experimental

Para a realização deste trabalho foram utilizados ratos Rattus norvegicus albinus da
linhagem Wistar-SHR (Spontaneously Hypertensive Rats), proveniente da colônia de criação
do biotério, mantidos em gaiolas medindo 34 x 41cm, em número máximo de 4 animais por
gaiolas, em sala com temperatura controlada a 25 ± 2 ºC com temperatura, umidade constante
e ciclo claro/escuro de 12 horas (6:00 às 18:00).
A partir de 21 até dias de idades (desmame) os animais foram transferidos para o
Laboratório de experimentação animal (LEA/UNIG campus 1). Incialmente os animais foram
distruídos aleatóriamente em três gupos experimentais: O grupo controle SHR receberam a
ração padrão comercial (Nuvilab); grupo SHR receberá ração manipulada hiperlipídica até final
do período experimental aos 180 dias de vida. Os animias foram anestesiado e eutanaziados
aos 180 dias de vida com coleta de cérebros e sangue para posteriores análises.

Delineamento temporal

9
 Universidade Iguaçu - UNIG

Tabela 1- Distribuição dos animais, de acordo com o tratamento realizado

Dieta N°de animais

Grupos Tratamento

SHR Nuvilab 8 Solução salina 0,9% (veículo)

SHR HF Hiperlipídica 8 Solução salina 0,9% (veículo)

SHR HF-Sita Hiperlipídica 8 Sitagliptina (1 mg/kg)

Ração manipulada
A ração hiperlipídica foi fabricada de acordo com o American Institute of Nutrition,
apropriada para estudos com nutrição experimental. As rações foram produzidas no laboratório
de tecnologia de alimentos da UNIG/ Campus 1. Os ingredientes da ração forão pesados em
balança de precisão (MF-Filizola) e colocados na batedeira industrial no ciclo leve por 10
minutos. Após esse processo, a massa foi transformada em pellets para secagem em estufa a
56°C por 18 horas. Após a produção, as rações foram embaladas e armazenadas em sacos
plásticos na temperatura de 5°C.

A B C

D E

Figura 1 – Produção da ração hiperlipídica. A) Liquidificador industrial; B) Fogão; C) Diluição da

banha com leite condensado; D) Produção dos pellets; E) Embalagem dos pellets.

10
 Universidade Iguaçu - UNIG

Figura 2 – Ficha técnica da dieta hiperlipídica.

11
 Universidade Iguaçu - UNIG
Administração da Sitagliptina
O tratamento foi realizado aos 150 dais de vida. Para a administração dos
medicamentos foi utilizada técnica alternativa à tradicional gavagem. Dose utilizada por cada
droga: Sitagliptina (1mg/kg). A realização desta etapa foi realizada no LEA/UNIG campus 1.

Medidas Hemodinâmicas
A realização da aferição foi realizada aos 70 e 170 dias de vida. As medidas da pressão
arterial sistólica aos e diastólica em animais conscientes, através de um sistema
computadorizado de pletismografia caudal (BP-2000, Visitech blood pressure analysis system,
USA), um método não invasivo de medida da PA. A partir destas medidas este sistema calcula
a pressão arterial média destes animais. Assim, pelo menos uma semana antes da medida da
PA, os ratos eram adaptados por 3 dias consecutivos neste aparelho de pressão caudal pré-
quecido para a aclimatação ao procedimento experimental. A realização desta etapa foi
realizada no LEA/UNIG campus 1.

Análise dos parâmetros bioquímicos

Os níveis séricos de glicose, aspartato aminotransferase, alanina aminotransferase,
gama glutamil transferase, lactato desidrogenase, triglicérides, colesterol total, HDL-colesterol
(cHDL) e LDL-colesterol (cLDL) com kits (Bioclin, Minas Gerais, Brasil). A dosagem de insulina
será realizada através do Kit Abcam (ab273188), o mesmo ja está disponível para utilização no
LPPC. A realização desta etapa no LPPC/UNIG campus 1.

Microtomia com criostato

Os encéfalos (cérebros) após a coleta permaneceram por 24h em tampão sacarose a
30% crescido da referida solução fixadora e água destilada. Posteriormente, se deu a pós-
fixação em solução sacarose a 30% e paraformaldeído a 4%, onde os cérebros permaneceram
refrigerados até o momento. A realização desta etapa foi LEA/UNIG campus 1.
A técnica de microtomia a frio será realizada em parceria com o laboratório de
Imunofarmacologia/FIOCRUZ através de micrótomo de criostato (Leica), os cérebros serão
cortados em secções coronais com espessura de 50 μm distribuídos sequencialmente em quatro
compartimentos individuais contendo solução anticongelante à base de etileno-glicol e tampão
fosfato, a fim de garantir a crioproteção das secções a uma temperatura de -20ºC

Imunofluorescência
Os cortes serão lavados com PBS e incubados com NGS a 10% diluído em PBS com
Triton X-100 a 0,3% por 90 min. Em seguida, serão incubados Anticorpos (Listagem) (IB4;
1:100; Vector Laboratories) durante a noite a 4°C, lavado com PBS e incubado com
streptavidina-Cy3 (1:400) por 2 h. Os cortes capturados por microscopia de fluorescência nas
objetivas de 10x. . A realização desta etapa no LPPC/UNIG campus 1.
12
 Universidade Iguaçu - UNIG

Anticorpo Diluição Laboratorio

IB-4 1:1000 Vector
VGFA 1:1000 ABCAM
IBA-1 1:1000 Santa Cruz
GFAP 1:1000 Santa Cruz

Morfometria
A quantificação das imagens fluorescentes de seções cerebrais marcadas com IB4 e
VGFA serão analisadas usando o software AngioTool (https://ccrod.cancer.gov/confluence/
display/ROB2/Downloads) que permite calculo do comprimento dos capilares no córtex cerebral
da vasculatura.
A contagem de neurônios totais será realizada forma manual mediante amostragem por
conglomerados, na qual foram selecionadas aleatoriamente quatro subpopulações neuronais de
cada uma das sub-regiões do hipocampo através da seleção nativa do ImageJ nas dimensões
de 165 x 165 μm.
A expressão de GFAP e IBA-1 será avaliada através do programa Image J para
realização cálculo semiquantitativo. . A realização desta etapa no LPPC/UNIG campus 1.

Análise estatística
Os resultados serão analisados através do método de análise de variância ANOVA univariada,
seguida do pós-teste de comparação múltipla Newman Keuls. Todos os resultados serão
expressos como média±erro padrão da média (EPM), considerando o nível de significância de
p<0.05. O software utilizado foi o Prism (GraphPad Prism version 9.00).

✓ Riscos: Nenhum, modelo é de ordem experimental.

✓ Benefícios: O projeto fornecerá dados que irão contribuir para evolução científica no
tratamento da hipertensão arterial e, possibilitando a nível translacional a metodologia
empregada.

13
 Universidade Iguaçu - UNIG

8 Cronograma de execução

Atividade/Mês 1º 2º 3º 4º 5º 6º 7º 8º 9º 10º 11º 12º

Avaliar parâmetros X
biométrico
Avaliação perfil lipídico x
Avaliação insulina sérica x

Imunohistoquimica x x x x x x x
Morfometria x x
Análise de dados x x x x x
estatísticos
Produção do artigo x x x
científico

14
 Universidade Iguaçu - UNIG
9 Resultados preliminares

Medidas hemodinâmicas

As avaliaçoes hemodinâmicas evidenciaram aumento de todos os parâmetros

analisados, mostrando confirmam que os aniamais SHR apresentam aumento da pressão aterial
sistólica, diastólica e pressão arterial média. Em contrapartida, o tratamento com sitagliptina
apresentou diminuição significativa nos parâmetros PAS e PAD.

Gráfico 1: Avaliação hemodinamica aos 170 dias de vida em ratos controle

espontâneamente hipertensos (SHR–controle, n=8), ratos controle espontâneamente
hipertensos alimentados com dieta hiperlipídica (SHR+HF; n=8), ratos controle
espontâneamente hipertensos alimentados com dieta hiperlipídica tratados com
Sitagliptina (SHR+HF+Sita; n=8) . Valores representados em média±erro padrão da
média

15
 Universidade Iguaçu - UNIG

16
 Universidade Iguaçu - UNIG

8 Viabilidade e Potencial de Publicações

Congresso Brasileiro de Endocrinologia e Metabologia (CBEM) 2024.

Hormone Metabolic Research ( Qualis A2)

17
 Universidade Iguaçu - UNIG

9 Referências

1. Abel ED, Litwin SE, Sweeney G (2008) Cardiac remodeling in obesity. Physiol Rev 88: 389-
419.

2. Kenchaiah S, Evans JC, Levy D, Wilson PW, Benjamin EJ, et al. (2002) Obesity

and the risk of heart failure. N Engl J Med 347: 305-313.

3. Thomsen M, Nordestgaard BG (2014) Myocardial infarction and ischemic heart disease in

overweight and obesity with and without metabolic syndrome. JAMA Intern Med 174: 15-22.

4. Holloway GP, Snook LA, Harris RJ, Glatz JF, Luiken JJ, et al. (2011) In obese Zucker rats,
lipids accumulate in the heart despite normal mitochondrial content, morphology and long-
chain fatty acid oxidation. J Physiol 589: 169-180.

5. Supakul L, Pintana H, Apaijai N, Chattipakorn S, Shinlapawittayatorn K, et al. (2013)

Protective effects of garlic extract on cardiac function, heart rate variability, and cardiac
mitochondria in obese insulin-resistant rats. Eur J Nutr.

6. Rosca MG, Tandler B, Hoppel CL (2013) Mitochondria in cardiac hypertrophy and heart
failure. J Mol Cell Cardiol 55: 31-41.

7. Schumacker PT (2013) Nitric oxide quenches the fire in heart mitochondria. Nat Med 19: 666-
667.

8. Marín-García J, Akhmedov AT, Moe GW (2013) Mitochondria in heart failure: the emerging
role of mitochondrial dynamics. Heart Fail Rev 18: 439-456.

9. Bayeva M, Gheorghiade M, Ardehali H (2013) Mitochondria as a therapeutic target in heart

failure. J Am Coll Cardiol 61: 599-610.

10. Bouitbir J, Charles AL, Echaniz-Laguna A, Kindo M, Daussin F, et al. (2012) Opposite effects
of statins on mitochondria of cardiac and skeletal muscles: a ‘mitohormesis’ mechanism
involving reactive oxygen species and PGC-1. Eur Heart J 33: 1397-1407.

18