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Aterosclerose 231 (2013) 411e420

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Aterosclerose
página inicial da revista: www.elsevier.com/locate/atherosclerosis

Diferenças pleiotrópicas quantitativas e qualitativas entre a

terapia combinada com sinvastatina e Vytorin em indivíduos
hipercolesterolêmicos
Zohara Sternberga,*, Trevor Chichellia, Daniel Sternberga, David Hojnackia, Allison
Drakea, Canção Liub, Qiang Hub, Frederico Munschauera
aDepartamento de Neurologia, Stroke Center, Buffalo Medical Center, Buffalo, NY, EUA
bDepartamento de Bioinformática, Roswell Park Cancer Institute, Carlton Street, Buffalo, NY, EUA

informações do artigo abstrato

Historia do artigo: Mira:Este estudo transversal testou a hipótese de que o tratamento com a combinação de Ezetimiba/Sinvastatina
Recebido em 30 de abril de 2013 (Vytorin) leva a mudanças mais amplas nos níveis de expressão de genes imunomoduladores em comparação com a
Recebido de forma revisada em 28
monoterapia com Sinvastatina.
de agosto de 2013
Métodos:O módulo de expressão genética GenomeStudio da Illumina foi usado para comparar perfis genéticos de
Aceito em 27 de setembro de 2013. Disponível
Vytorin e Sinvastatina nas células mononucleares do sangue periférico de 20 indivíduos hipercolesterolêmicos.
online em 16 de outubro de 2013
Resultados:As características dos genes imunomoduladores, que foram alterados pelo Vytorin, diferiram daqueles
genes que foram alterados pela Sinvastatina. Vytorin alterou principalmente os níveis de expressão de genes
Palavras-chave:
relacionados à inflamação/estresse oxidativo; desregulamentou oNF-KappaBe regulou positivamente a expressão de
Dislipidemia
Ezetimiba citocinas anti-inflamatórias,IL-10,e enzimas antioxidantes,GPX1eSOD2,mas também regulou positivamente os níveis
Inflamação de expressão de genes envolvidos na ativação celular, adesão e cascata de coagulação, incluindoVWF, F7, PF4, PF4V1
Microarranjo SELP, ITGB3, ITGB5.
Células mononucleares A sinvastatina alterou principalmente os níveis de expressão de genes relacionados à apoptose/proliferação celular.
Adesão plaquetária Ele regulou positivamente os níveis de expressão de genes relacionados à apoptoseAPAF1, BAX, IER3,eLCR1R,e
Estatina
regulou negativamente os níveis de expressão de genes relacionados à proliferação celular, incluindoPTNeCD69. O
Trombose
tratamento com terapia combinada com Vytorin modulou o perfil lipídico e os níveis séricos da proteína C reativa de
forma mais eficaz do que o tratamento com sinvastatina em monoterapia.
Conclusão:A natureza dos efeitos pleiotrópicos pode desempenhar um papel na eficácia clínica do Vytorin e da
Sinvastatina.
Publicado pela Elsevier Ireland Ltd.

1. Introdução Além disso, a administração de Vytorin (Vyt) (10 mg Zetiaº20 mg de Sim)

Tanto hiperlipidemia/hipercolesterolemia[1]e inflamação/estresse
oxidativo[2,3]contribuem para a aterosclerose e para eventos
cerebrovasculares. Semelhante à sinvastatina (Sim), a ezetimiba (Zetia)
é um agente hipolipidêmico/hipocolesterolêmico eficaz[4].
Abreviações:ECA, enzima conversora de angiotensina; SCA, síndrome coronariana
aguda; ALT, alanina aminotransferase; AST, aspartato aminotransferase; BRA,
bloqueadores dos receptores da angiotensina; PA, pressão arterial; DCC, doença
coronariana; EMIC, espessura médio-intimal da carótida; PCR, proteína C reativa; HDL,
colesterol de lipoproteína de alta densidade; IL, interleucina; LDL, colesterol de
lipoproteína de baixa densidade; NFk-B,fator nuclear kappaB; PBMCs, células
mononucleares do sangue periférico; ROS, espécies reativas de oxigênio;VWF,fator de
von Willebrand; CT, colesterol total;TNF, fator de necrose tumoral; TRG, triglicerídeo.
* Autor correspondente. Centro de AVC, Buffalo Medical Center, Buffalo, NY 14203,
EUA. Tel.:º1 716 859 4235; fax:º1 716 859 2430/7573.
Endereço de email:zs2@buffalo.edu (Z. Sternberg).
em pacientes hipercolesterolêmicos leva a um efeito aditivo na redução
do LDL-C (55%) em comparação com a monoterapia com Zetia (20%) ou
Sim (38%)[5].
Semelhante às estatinas[6], Zetia possui efeitos pleiotrópicos além de
seus efeitos hipolipemiantes, incluindo efeitos antiinflamatórios e
antioxidantes[7e10]. O tratamento diário de pacientes hipercolesterolêmicos
com 40 mg de Sim em monoterapia ou em combinação com 10 mg de Zetia,
por até 90 dias, mostrou redução na liberação de monócitos de citocinas
inflamatórias e quimiocinas e níveis séricos reduzidos de proteína C reativa
(PCR) em comparação ao placebo. A terapia combinada reduziu ainda mais a
liberação de citocinas dos monócitos e os níveis séricos de PCR para níveis
observados em controles saudáveis[11]. Resultados semelhantes foram
observados após um tratamento diário de 12 semanas de pacientes
hipercolesterolêmicos com 10 mg de Zetia/10eTerapia combinada de 80 mg
de Sim, mostrando redução adicional nos níveis séricos de PCR em cada
dose individual de Sim[12].

0021-9150/$econsulte o assunto publicado pela Elsevier Ireland Ltd.

http://dx.doi.org/10.1016/j.atherosclerosis.2013.09.031
412 Z.Sternberg et al. / Aterosclerose 231 (2013) 411e420
Além disso, um estudo cruzado em pacientes hipercolesterolêmicos
mostra a eficácia da terapia combinada Zetia/Sim (10 mg/10 mg) e da
monoterapia Sim (80 mg) na redução da disfunção endotelial, dos
níveis séricos de PCR e dos níveis plasmáticos de LDL-C.[13].
No entanto, uma terapia combinada de Zetia/Sim (10 mg/20 mg) de seis
semanas ou monoterapia com Sim (80 mg) de pacientes com doença arterial
coronariana (DAC) que estavam inicialmente em regime crônico de 20 mg de
Sim não mostrou efeitos incrementais no endotélio circulante. células
progenitoras, um marcador substituto da função endotelial, apesar da
redução adicional no CT[14].
Este estudo cruzado comparou as alterações nos perfis de
expressão gênica (com ênfase nas alterações nos genes
imunomoduladores) nas células mononucleares do sangue periférico
(PBMCs) de indivíduos hipercolesterolêmicos, após terapia combinada
com Vyt ou monoterapia com Sim. Além disso, foram examinadas as
relações entre os níveis séricos de PCR, os níveis de expressão gênica e
os perfis lipídicos.
2. Materiais e métodos
2.1. População
Vinte (20) indivíduos hipercolesterolêmicos (11 homens), saudáveis, sem
histórico de DAC, com idade média de 46,4 a 8,5 anos, inclusive, que tinham
colesterol total >200 mg/dL e/ou LDL-C >130 mg/dL foram recrutado na
Atenção Primária, Kaleida Health Medical Center, Buffalo, NY. Os critérios de
exclusão dos pacientes foram os seguintes: pacientes tratados com
estatinas, Zetia ou Vyt menos de seis meses antes da coleta de sangue,
pacientes com reação alérgica ou qualquer outra contra-indicação ao Zetia/
Sim, pacientes com doença hepática ativa indicada pela pré-triagem de
níveis elevados de enzimas hepáticas, aspartato transaminase (AST) ou
alanina transaminase (ALT) > 45 UI/L, pacientes em uso de medicamentos
imunossupressores, pacientes diabéticos, pacientes em uso de
medicamentos que inibem o CYP3A4 ou pacientes em uso de bloqueadores
dos canais de cálcio e pacientes com doença renal crônica com filtração
glomerular taxa (TFG) < 35 mL/min.
2.2. Projeto
Neste estudo cruzado randomizado de 18 semanas, todos os 20 pacientes
foram tratados com uma combinação de 40 mg de Sim e 10 mg de Zetia (Vyt) ou
40 mg de Sim único por seis semanas. Após o tratamento inicial de seis semanas
com o primeiro medicamento, os pacientes foram submetidos a um período de
eliminação de seis semanas e, posteriormente, foram tratados com o segundo
medicamento. A ordem de administração dos medicamentos foi randomizada e
baseada em números pares e ímpares. O período de eliminação foi projetado para
eliminar os efeitos do tratamento e retornar os pacientes aos níveis basais de
expressão gênica. Amostras de sangue foram obtidas nas duas linhas de base e
após cada tratamento medicamentoso para análise de expressão gênica,
determinação de perfis lipídicos e para medições de níveis séricos de PCR e
aminotransferases hepáticas.
2.3. Lógica por trás da seleção de células mononucleares
A expressão gênica foi estudada nas PBMCs, uma vez que essas células se
assemelham aos hepatócitos no que diz respeito à expressão de genes envolvidos
no metabolismo do colesterol[15]. Além disso, o envolvimento das PBMCs em
processos relacionados com o sistema imunitário e na génese da aterosclerose,
torna estas células especialmente apropriadas para os estudos dos efeitos
imunomoduladores de Sim e Vyt.
2.4. Amostra de RNA
A amostra de sangue de cada paciente foi coletada por punção venosa em cada uma
das duas linhas de base e após cada uma das duas terapias medicamentosas.
As PBMCs foram separadas em Ficoll Hypaque (Sigma). O RNA foi
extraído das células utilizando o kit QIAGEN RNEasy, seguindo as
instruções do fabricante. A qualidade e a quantidade do RNA foram
avaliadas usando o kit RNA 6000 Nano LabChip com o Agilent 2100
Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Amostras com
resultados de RNA e/ou hibridização de baixa qualidade foram
removidas. Esses critérios foram definidos pela proporção de 260/280 e
pelos genes detectáveis inferiores a 35%.
2.5. Análise de microarranjos
Os arquivos de dados BeadChip foram analisados com o módulo de
expressão genética GenomeStudio da Illumina e o pacote Bioconductor
baseado em R para determinar os níveis de sinal de expressão gênica[16].
Resumidamente, a intensidade bruta do conjunto de expressão genética
Illumina Human foi digitalizada e extraída usando BeadScan, com os dados
corrigidos por subtração de fundo no módulo GenomeStudio. Oluzmódulo
no RbasedBiocondutorO pacote foi usado para transformar a intensidade da
expressão em escala log 2[17]. Os dados de intensidade transformados em
log 2 foram normalizados usando a função de normalização Quantil. A
análise da via do mapa foi conduzida para os genes imunomoduladores,
importando as listas de entidades dos transcritos para cada tratamento
medicamentoso comP-valores <0,05 em Genespring. As listas foram
comparadas com os caminhos no formato BioPax 2 de uma variedade de
caminhos e proteínas on-line.ebancos de dados de interação de proteínas
(PPI). Além disso, Agilent Genespring (Agilent.com) foi usado como fonte de
ferramentas online para análise de cluster.
2.6. Validação RT-PCR
Foram selecionados iniciadores específicos comercialmente disponíveis
para os genes representativos. RT-PCR foi utilizado para validar os níveis de
expressão de genes que apresentaram alterações de -1,3 vezes na análise
de microarray.
Para efeitos de RT-PCR, o ARN foi convertido em ADNc através do kit
de síntese de cDNA First Strand (SABiosciencse C-08). Resumidamente,
240 ng de RNA total foram tratados com GE (Genomic DNA Elimination
Buffer) e foram então transcritos reversamente usando transcriptase
reversa MMLV. A Transcrição Reversa foi realizada em um ABI
GeneAmp PCR System 2700. A Eliminação Genômica ocorreu a 37°C por
5 min. Depois de colocar as amostras em gelo durante 1 min, a mistura
RT foi adicionada e as amostras foram incubadas a 42 15 min. C para
Finalmente a reação foi interrompida por aquecimento a 95ºC durante
C para
5 min. A PCR em tempo real foi realizada em um termociclador ABI
7900HT.
As condições de ciclagem foram as seguintes: 95°C por 10 min (para a
DNA polimerase HotStart), seguido por 40 ciclos de 95°C por 15 s, 60°C por 1
min. Ao final de cada corrida de PCR, também foi realizada análise da curva
de fusão para verificar a integridade e homogeneidade dos produtos de
PCR. As reações foram monitoradas utilizando SYBR green e os resultados
foram analisados utilizando o software ABI 7900HT SDS versão 2.4. Os
valores foram normalizados em relação ao ACTBH.
2.7. Outras medidas
Os perfis lipídicos foram medidos no plasma usando um aparelho
Cholestech LDX (Cholestech Corporation, Hayward, CA) padronizado
contra o ensaio de laboratório[18]. Os níveis séricos de PCR foram
medidos por um kit ELISA (R&D Systems, Cat # DCRP00), de acordo com
as instruções do fabricante.
2.8. Análise estatística
Realizamos duas comparações separadas. Primeiro analisamos a expressão do
gene Vyt versus sua linha de base, e a expressão do gene Sim versus
 Z.Sternberg et al. / Aterosclerose 231 (2013) 411e420
sua linha de base, respectivamente. Em segundo lugar, comparamos diretamente
os perfis de expressão dos genes Vyt e Sim. Utilizamos o programa Limma para
análise de expressão diferencial, na versão baseada em RBiocondutorpacote para
calcular as diferenças no nível de expressão gênica para cada comparação[19].
Limma demonstrou ser mais adequado para amostras pequenas[20].
Especificamente, para cada comparação, um modelo linear foi ajustado aos dados,
com médias de células correspondentes às diferentes condições e um efeito
aleatório para array. Para cada amostra, foram calculadas alterações na expressão
dos genes e suas variantes para cada amostra e cada tratamento medicamentoso
em relação às suas respectivas linhas de base. As alterações nos níveis de
expressão gênica foram calculadas em média para todos os indivíduos, para cada
regime de tratamento medicamentoso.
A plataforma Illumina continha um total de 47 mil sondas direcionadas a
20.818 genes. Nossa análise foi no nível do gene, onde múltiplas sondas
pertencentes ao mesmo gene foram agregadas usando o genomastudio.
Um total de 4.836 genes indetectáveis foram filtrados antes da análise
estatística. Os restantes 15.982 genes detectáveis foram utilizados no teste
de expressão diferencial. Portanto, a lista de genes significativos não
continha genes indetectáveis. As alterações de dobra foram calculadas a
partir da intensidade normalizada e média de todas as expressões genéticas
no microarranjo para os grupos de tratamento Vyt e Sim.
A significância das alterações pós-tratamento nos níveis de expressão
gênica, nos perfis lipídicos e nos níveis séricos de PCR foi medida por análise
repetida de variância. Regressões lineares múltiplas examinaram a
correlação entre níveis de expressão gênica, perfis lipídicos e níveis séricos
de PCR.
A investigação está em conformidade com os princípios definidos na
Declaração de Helsínquia. O estudo foi aprovado pelo IRB da Universidade
de Buffalo e o consentimento foi obtido de cada paciente antes do início de
cada tratamento medicamentoso.
3. Resultados
Não houve relatos de efeitos adversos durante as seis semanas de
tratamento com Vyt ou Sim. O tratamento com Vyt e Sim não afetou
negativamente os níveis séricos de ALT e AST.
3.1. Mudanças nos níveis de expressão gênica pós-terapia com Vytorin
ou pós-sinvastatina
Inicialmente, analisamos mudanças nos níveis de expressão gênica em
PBMCs, levando em consideração os respectivos níveis basais de expressão
gênica.
3.2. Perfis globais de expressão gênica
As alterações na expressão genética foram analisadas de várias maneiras: Os
dados foram primeiro filtrados em busca de genes que foram significativamente
alterados (P-valores <0,05) por Vyt ou Sim.Tabela Suplementar 1apresenta a lista
de genes que estavam entre as boas sondas.
O tratamento com Vyt de seis semanas levou a mudanças significativas (P-
valores <0,05) em 1.837 transcrições em relação à linha de base. Entre essas
transcrições, 780 foram reguladas positivamente e 1.057 foram reguladas
negativamente. Os indivíduos tratados com Sim tiveram 1.156 transcrições que
foram significativamente alteradas em relação ao valor basal. Entre estes, 612
transcrições foram reguladas positivamente e 544 transcrições foram reguladas
negativamente (Tabela Suplementar 1).
Diagrama de Venn (Figura 1) apresenta o número de genes alterados pelo
tratamento com Vyt ou Sim. As áreas de sobreposição no diagrama apresentam as
transcrições que foram alteradas tanto por Vyt quanto por Sim (um total de 203
transcrições, 56 reguladas positivamente e 147 reguladas negativamente).
Posteriormente, os dados foram filtrados com base nas alterações de dobramento.
No geral, muito poucas transcrições em qualquer grupo de tratamento tiveram
alterações superiores a 1,5 vezes. Indivíduos tratados com Vyt tiveram 22 transcrições
413
Figura 1.Diagrama de Venn de genes alterados pós-tratamento com Vytorin ou pós-sinvastatina.
O diagrama representa os genes alterados pós-tratamento com Vytorin ou pós-sinvastatina (P
0,05). As áreas de sobreposição representam genes que foram alterados tanto pelo Vytorin quanto pela
Sinvastatina.
(22 para cima, 0 para baixo), Sim tinha 4 (3 regulados positivamente e 1 regulado
negativamente). Uma transcrição foi comumente regulada positivamente por Vyt e Sim.
Como relativamente poucas transcrições foram detectadas como alteradas por
1,5 vezes, decidimos ampliar nossos critérios de pesquisa examinando todas as
transcrições que mostraram alterações de 1,3 vezes em relação à linha de base. Com
base nesta análise (Tabela Suplementar 2), Vyt teve 61 transcrições (59 reguladas
positivamente e 2 reguladas negativamente) e Sim teve 22 (16 reguladas positivamente e
6 reguladas negativamente) que mostraram uma alteração superior a 1,3 vezes em
relação à linha de base. Entre estes, três foram comumente expressos por Vyt e Sim (2
regulados positivamente e 1 regulado negativamente).
Os processos biológicos afetados por Vyt foram os seguintes em
ordem percentual (deve-se observar que esta classificação não é rígida,
pois muitos genes podem ter mais de uma função): transdução de sinal
(12 genes, 19,6%), adesão celular/ migração (10 genes, 16,4%),
proteínas nucleares (7 genes, 11,4%), atividades biológicas
desconhecidas (7 genes, 11,4%), ligação ao DNA (5 genes, 8,2%),
metabolismo/transporte (4 genes, 6,5%) , proliferação/diferenciação/
apoptose (3 genes, 5%), regulação transcricional (2 genes, 3%),
organização do citoesqueleto (2 genes, 3%), ciclo celular (2 genes, 3%).
Os principais processos biológicos afetados por Sim foram os seguintes:
proteínas nucleares (5 genes, 22,7%), proliferação/apoptose (3 genes,
13,6%), metabolismo/transporte (3 genes, 13,6%), atividades biológicas
desconhecidas (2 genes, 9 %), proteólise (2 genes, 9%), sinalização celular (2
genes, 9%), adesão/migração celular (2 genes, 9%), ligação ao DNA (1 gene,
4,5%), regulação transcricional (1 gene, 4,5%), desenvolvimento (1 gene,
4,5%).
3.3. Perfis de expressão gênica imunomoduladora
Posteriormente, analisamos alterações induzidas por Vyt e Sim em
genes que estavam associados a funções imunomoduladoras. Esses
genes incluíam aqueles com papel na inflamação/estresse oxidativo,
quimiocinas, genes de ativação/adesão/migração/coagulação celular e
genes envolvidos na proliferação/apoptose celular.
tabela 1apresenta a lista de genes que foram afetados pelo tratamento
com Vyt e Sim (tabela 1A) e sua estratificação dependendo da função (tabela
1B). Entre 789 alvos imunomoduladores (490 genes e suas variantes) que
estavam presentes no chip, foram observadas alterações significativas em
44 genes (29 regulados positivamente, 15 regulados negativamente) após a
administração de Vyt (P <0,05).
Vyt alterou principalmente os níveis de expressão de genes relacionados
à inflamação/estresse oxidativo; desregulamentou oNF-KappaB e regulou
positivamente a expressão da citocina antiinflamatória, IL-10, e das enzimas
antioxidantes,GPX1eSOD2.Além disso,
414 Z.Sternberg et al. / Aterosclerose 231 (2013) 411e420

Tabela 1A
Alterações no perfil genético imunomodulador devido ao tratamento com Vytorin ou Sinvastatina. Quatro genes (CD69, MYC, VENDA, ITGA4)foram alterados tanto pelo Vytorin quanto pela Sinvastatina.P valores<0,05
indicam significância estatística. Sinais de adição (º)indicar regulação positiva do gene; sinais de menos ( ) indicam regulação negativa do gene.

Símbolo Definição Funções associadas à aterosclerose registro FC (2) PValores

Vitorin
CCL5 Quimiocina (CeMotivo C) ligante 5 Quimioatraente de monócitos 0,251 0,016
CXCL5 Quimiocina (CeXeMotivo C) ligante 5 Ativação de neutrófilos Adesão- 0,507 0,002
F7 Fator de coagulação VII coagulação 0,06 0,03
IL10 Interleucina 10 Anti-inflamatório 0,262 0,048
IL6R Receptor de interleucina 6 Pró-inflamatório 0,092 0,041
ITGA2 Integrina, alfa 2 Adesão de plaquetas 0,079 0,04
ITGA2B Integrina, alfa 2b Adesão/ativação de plaquetas 0,466 0,002
ITGB3 Integrina, beta 3 Adesão/ativação de plaquetas 0,371 0,005
LTB4R Receptor de leucotrieno B4 Pró-inflamatório 0,18 0,002
MTHFR Metilenotetrahidrofolato redutase Receptor Anti-inflamatório 0,121 0,007
NGFRAP1 do fator de crescimento nervoso Pró-inflamatório 0,268 0,003
PDGFA Polipeptídeo alfa do fator de crescimento derivado de Ativação de plaquetas 0,268 0,003
PTGS1 plaquetas Prostaglandina-endoperóxido sintase 1 Pró-inflamatório 0,588 0,002
SELP Seleção P Adesão de plaquetas/leucócitos 0,184 0,017
SLC6A4 Família de transportadores de Pró-inflamatória 0,122 0,002
SOD2 soluto 6 Superóxido dismutase 2 Antioxidante 0,194 0,011
SSTR2 Inibidor da metalopeptidase TIMP do Anti-inflamatório 0,312 0,026
TIMP1 receptor 2 da somatostatina fator de Adesão/coagulação 0,405 0,008
VWF von Willebrand proliferativa/antiapoptótica 0,389 0,004
ITGA5 Integrina, alfa 5 Adesão/coagulação 0,096 0,046
ITGB5 Integrina, beta 5 Adesão/trombose 0,508 0,004
PF4 Fator plaquetário 4 Coagulação 0,23 0,003
PPBP Proteína básica pró-plaquetária Ativação plaquetária 0,858 0,006
CA2 Anidrase carbônica Pró-inflamatório 0,602 0,007
MPL Oncogene do vírus da leucemia mieloproliferativa Pró-proliferativo 0,462 0,003
PF4V1 Fator plaquetário 4 variante 1 coagulação 0,452 0,004
TAGLN2 Transgelina 2 Diferenciação celular 0,41 0,002
BMP6 Proteína morfogenética óssea 6 Pró-inflamatório 0,385 0,006
GPX1 Molécula de glutationa Antioxidante 0,513 0,001
CD44 peroxidase 1 CD44 Ativação, recirculação e direcionamento de 0,16 0,001
ETS1 v-ets eritroblastose vírus E26 oncogene homólogo 1 linfócitos Fator de transcrição pró-inflamatório 0,22 0,007
FAS superfamília de receptores de TNF, membro 6) Pró-inflamatório 0,14 0,003
IL18R1 Receptor 1 de interleucina 18 Pró-inflamatório 0,19 0,003
NFKB1 Fator nuclear do intensificador do gene do polipeptídeo leve kappa em células B Fator de transcrição pró-inflamatório 0,19 0,002
NÃO NÃO 1 Domínio não POU contendo ligação ao octâmero Fator de transcrição pró-inflamatório 0,06 0,043
PTGER2 Receptor 2 de prostaglandina E Pró-inflamatório 0,38 0,001
STAT4 Transdutor de sinal e ativador da transcrição 4 Fator de transcrição pró-inflamatório 0,22 0,006
IL7R Receptor de interleucina 7 Pró-inflamatório 0,23 0,03
ITGA4 Integrina, alfa 4 Coagulação 0,2 0,048
ITGB1BP1 Integrina beta 1, proteína de ligação 1 Adesão 0,1 0,032
ITGB7 Integrina, beta 7 Migração de linfócitos e homing Fator 0,12 0,021
MEU C homólogo do oncogene viral da mielocitomatose v-myc de transcrição de proliferação Pró- 0,29 1E 04
PTGER2 Receptor 2 da prostaglandina E inflamatório 0,38 0,001
VENDER Selecionando L Adesão de linfócitos/células endoteliais 0,21 0,018

Sinvastatina
APAF1 Proteína X associada ao fator 1 de ativação da Apoptótico 0,182 0,006
BAX peptidase apoptótica BCL2 Apoptose 0,074 0,039
CFLAR Regulador de apoptose semelhante a CASP8 e FADD, Anti-apoptótico 0,237 0,001
IL10RB receptor de interleucina 10, beta Anti-inflamatório 0,151 0,026
RAXR Receptor retinóide X, ligante Pró-inflamatório 0,508 0,013
SELPLG alfa selectina P Pró-inflamatório 0,12 0,037
TNFRSF1A Superfamília de receptores do fator de necrose tumoral, membro 1A Apoptose/Apoptose Pró- 0,261 0,031
TNFRSF1B Superfamília de receptores do fator de necrose tumoral, membro 1B inflamatória 0,444 0,004
CCL20 Quimiocina (CeMotivo C) ligante 20 Resposta precoce imediata 3 Quimiotaxia de Linfócitos 0,165 0,02
IER3 Receptor do fator 1 estimulador de colônias Quimiocina (CeMotivo C) Antiapoptótico 0,631 0,017
LCR1R proteína de interação Toll semelhante ao ligante 4 Antiapoptótico 0,617 0,01
CCL4L1 Pró-inflamatório 0,546 0,001
TOLLIP Pró-inflamatório 0,083 0,048
KLF2 Fator 2 semelhante a Kruppel Regula o tráfego e a adesão de células T. 0,313 0,004
ITGA5 Integrina do Homo sapiens, alfa 5 (receptor de Adesão/coagulação 0,21 0,009
fibronectina, polipeptídeo alfa) (ITGA5), mRNA.
EDN2 Endotelina 2 Ativação plaquetária 0,11 0,004
IL8RB Receptor 2 de quimiocina (motivo CXC) Fator quimiotático de neutrófilos 0,08 0,032
PTN Pleiotrofina Proliferação de células endoteliais 0,21 0,004
RPS6KA6 Proteína ribossômica S6 quinase, 90 kDa, gene fundido com Pró-inflamatório 0,12 0,02
TFG polipeptídeo 6 TRK Pró-inflamatório 0,08 0,024
CD69 Molécula CD69 Proliferação de linfócitos T 0,7 0,018
MEU C homólogo do oncogene viral da mielocitomatose v-myc Proliferação celular 0,33 0,014
VENDER Selectina L Adesão de linfócitos/células endoteliais 0,27 0,022
ITGA4 Integrina do Homo sapiens, alfa 4 (antígeno CD49D, Adesão-trombose 0,2 0,048
subunidade alfa 4 do receptor VLA-4) (ITGA4), mRNA.
 Z.Sternberg et al. / Aterosclerose 231 (2013) 411e420 415

Tabela 1B genes que mostraram alterações> 1,3 vezes pós-Vyt (mesa 2A) ou pós-Sim (
A tabela apresenta o número de genes que foram alterados pós-tratamento com Vytorin
mesa 2B) tratamento. Com base nesses critérios, 14 genes foram
ou pós-sinvastatina, estratificados por sua função.
examinados após o tratamento com Vyt (GPX1, PPBP, CXCL5, ITGA2B, PTGS1,
Regulado positivamente Regulamentado negativamente TIMP1, VWF, ITGB5, CA2, MPL, PF4V1 TAGLN2,eBMP6foram regulamentados
Vitorin ePTGER2foi regulado negativamente), e 6 genes foram examinados após o
Número total de genes Estresse 44 (100%) 29 15 tratamento com Sim (RXRA, TNFRSF1, IER3, CSF1R, CCL4L1 foram
inflamatório/oxidativo Ativação/ 22 (50%) 13 9 regulamentados eCD69foi regulamentado negativamente).mesa 2apresenta
adesão celular/ 19 (43,1%) 14 5
os níveis médios de expressão genética SEM para cada um dos dois regimes
coagulação
Proliferação/apoptose 3 (6,8%) 3 0 de tratamento. Os resultados são normalizados em relação aACTBH.
Consistente com o microarranjo, os resultados de RT-PCR mostram uma
Sinvastatina
regulação positiva significativa (em relação à linha de base) nos níveis de
Número total de genes 24 (100%) 14 8
Proliferação/apoptose 10 (41,6%) 7 3 expressão de GPX1, PPBP, CXCL5, ITGA2B, PTGS1, TIMP1, VWF, ITGB5, CA2,
Inflamação 7 (29,2%) 5 2 MPL, PF4V1 TAGLN2,eBMP6 (P-os valores variam de 0,04 a 0,001). O PTGER2
Ativação/adesão celular/ 7 (29,2%) 4 3 os níveis de expressão foram regulados negativamente em relação à linha
coagulação
de base, mas as diferenças não alcançaram significância estatística (P¼0,06)
(mesa 2A).
regulou positivamente os níveis de expressão de genes envolvidos na Os resultados do RT-PCR para Sim (mesa 2B) foram consistentes com os
ativação celular, incluindo ativação e adesão plaquetária, e genes do microarray, mostrando uma regulação positiva significativa no
envolvidos na ativação da cascata de coagulação, comoVWF, F7, PF4,
PF4V1 SELP, ITGB3, ITGB5.
Sim significativamente (P <0,05) afetou 24 genes (14 regulados positivamente, 8
regulados negativamente), influenciando principalmente os níveis de expressão de genes
de apoptose/proliferação celular. Ele regulou positivamente os níveis de expressão dos
genes relacionados à apoptose, comoAPAF1, BAX, IER3, CSF1R,e regulou negativamente
os níveis de expressão de genes relacionados à proliferação celular, comoPTNeCD69.
Além disso, 4 genes (1 regulado positivamente, 3 regulados negativamente) foram
alterados tanto por Vyt quanto por Sim.

3.4. Análise da via dos genes imunomoduladores

Para caracterizar ainda mais os perfis genéticos imunomoduladores,

pós-Vyt ou Sim, foram analisadas as vias que ligam os genes e a natureza
das interações entre eles, usando uma variedade de vias on-line e proteínas
ebancos de dados de interação de proteínas.
Figura 2apresenta a rede de mapas imunomoduladores para genes cujos
níveis de expressão foram significativamente alterados pós-Vyt (Figura 2A)
ou pós-Sim (Figura 2B) tratamento. As redes relevantes são derivadas em
parte da lista de genes apresentada emtabela 1. Cada gene apresentado por
uma forma oval com o símbolo do gene correspondente. As legendas
codificadas por cores correspondentes mostram o tipo de interação que
ocorre.
Entre os genes imunomoduladores, que foram alterados pelo
tratamento com Vyt, 29 (66%) genes foram ligados como mostrado pela
análise da via do mapa. Três genes, incluindoNFKB1, IL-10,eMEU C
constituíram centros principais ligando mais de 22 genes na rede. Sim
significativamente (P <0,05) afetou 24 genes (14 regulados positivamente e 8
regulados negativamente). Entre os genes imunomoduladores alterados
pelo Sim, 12 (50%) genes estavam ligados. Nove desses genes estavam em
um único hub envolvendoMEU C.Sete dos 9 genes ligados eram genes de
apoptose/proliferação, que incluíamAPAF1, BAX, CFLAR, IER3, CSF1R,
TNFRSF1A,eTNFRSF1B.

3.5. Análise de cluster de genes imunomoduladores

A análise hierárquica de agrupamento de genes imunomoduladores é

mostrada emFigura 3, apresentando os genes diferencialmente expressos
pós-Vyt (Figura 3A) ou pós-Sim (Figura 3B) tratamento. A cor vermelha indica
genes cujos níveis de expressão foram elevados em relação à linha de base,
e a cor verde indica genes cujos níveis de expressão foram reduzidos em
relação à linha de base.
3.6. Validação RT-PCR
O RT-PCR foi empregado como uma abordagem alternativa para validar resultados
de microarranjos e determinar os níveis de expressão de amostras selecionadas
Figura 2.Rede de genes imunomoduladores diferencialmente expressos pós-tratamento com
Vytorin (A) ou pós-Simvaststin (B). As redes relevantes são derivadas da lista de genes
apresentada emtabela 1.Figura 2A inclui 44 genes que foram alterados pelo Vytorin; Figura 2B
inclui 24 genes que foram alterados pela sinvastatina. Cada gene é apresentado por uma forma
oval com o símbolo do gene correspondente. Genes conectados por um círculo com uma linha de
cruzamento mostram uma relação negativa. Genes conectados por um círculo com duas linhas
cruzadas mostram uma relação positiva. As legendas codificadas por cores correspondentes
mostram o tipo de interação que ocorre. O nome completo de cada gene e seus níveis de
expressão podem ser encontrados emtabela 1.
416 Z.Sternberg et al. / Aterosclerose 231 (2013) 411e420

Figura 3.Análise de agrupamento de genes imunomoduladores pós-tratamento com Vytorin (A) ou pós-Simvaststin (B). Vermelho indica genes cujas expressões foram elevadas em relação à linha de
base e verde indica genes cujas expressões foram reduzidas em relação à linha de base (P 0,05).

níveis de expressão deLCR1R (P¼0,02), e uma regulação positiva quase
significativa nos níveis de expressão deTNFRSF1 (P¼0,07). No entanto,
as mudanças nos níveis de expressão deRXRA, IER3, CCL4L1,e CD69não
foram significativos (P >0,05).
3.7. Efeitos do tratamento nos perfis lipídicos
Tabela 3apresenta as alterações percentuais (calculadas a partir de suas
respectivas linhas de base) nos perfis lipídicos pós-tratamento Vyt ou pós-
Sim. O tratamento com Vyt reduziu mais significativamente o CT (40,8% vs.
27,2%, P <0,001), LDL-C (54,4% vs. 44,5%,P¼0,01) e não-HDL-C (46,8% vs.
33,9%,P¼0,01) níveis plasmáticos, do que Sim. Consequentemente, a relação
CT/HDL-C foi significativamente menor após o tratamento com Vyt do que
com o tratamento pós-Sim (3,0 - 1,0 vs. 3,9 - 2,0,P¼0,02). Além disso,
em relação aos níveis basais, foram observadas alterações significativas nos
níveis plasmáticos de TRG pós-Vyt (p <0,001), mas não pós-Sim (p¼0,9)
tratamento.
3.8. Níveis séricos de PCR após terapia medicamentosa
Em comparação com as respectivas linhas de base, ambos Vyt (linha de base:
1,569 - 0,31 ng/ml, pós-Vyt: 1,291 - 0,27 ng/ml,P¼0,005) e Sim (linha de
base: 1,646 - 0,18 ng/ml, pós-Sim: 1,385 - 0,24 ng/ml, P¼0,013) reduziu
significativamente os níveis séricos de PCR. Esta redução foi mais
significativa pós-Vyt do que o tratamento pós-Sim.
3.9. Estudos de correlação

mesa 2 Posteriormente, examinamos a relação entre os níveis séricos de PCR, os

Validação por PCR dos níveis de expressão de 14 genes pós-tratamento com Vytorin (A) e 6 genes níveis de expressão gênica e os perfis lipídicos, tanto no início quanto após o
pós-sinvastatina (B) e suas respectivas linhas de base. Os genes selecionados apresentaram
tratamento com cada um dos dois medicamentos.
alterações >1,3 vezes após o tratamento medicamentoso. Os valores são normalizados em
0,05 indica significância estatística.
relação aACTBH. Pvalores
3.9.1. Estudos de correlação Vytorin
Símbolo genético Linha de base Pós-Vytorin P-valores
Os níveis de expressão de 14 genes foram validados por RT-PCR.
Média - SE Média - SE Estudos de correlação para esses genes mostraram uma relação
A inversa entre os níveis plasmáticos de TRG basais (antes do tratamento
GPX1 0,52 - 0,09 2,14 - 0,39 0,02 com Vyt) e os níveis basaisCA2níveis de expressão (R¼0,801,P¼0,030), e
PPBP 0,20 - 0,07 6,87 - 2,1 0,04 entre os níveis plasmáticos basais de não HDL-C e os níveis basais
CXCL5 4,899 - 0,32 6,58 - 0,69 0,016
PF4V1 níveis de expressão (R¼0,801,P¼0,030).
ITGA2B 4,26 - 0,63 6,071 - 0,49 0,002
PTGS1 4,399 - 0,39 5,775 - 0,35 0,007
Além disso, os níveis séricos basais de PCR correlacionaram-se com
TIMP1 3,858 - 0,18 4,247 - 0,19 0,034 o CT basal (R¼0,617,P¼0,008), LDL-C (R¼0,526,P¼0,036) e não-HDL-C (R
VWF 8,567 - 0,45 10,121 - 0,34 0,004 ¼0,703,P¼0,001) níveis plasmáticos. Não observamos associação entre
ITGB5 5,951 - 0,43 7,58 - 0,41 0,001 os níveis séricos basais de PCR e os níveis de expressão dos 14 genes
CA2 4,101 - 0,50 5,7 - 0,48 0,006
basais.
MPL 6,938 - 0,54 8,51 - 0,53 0,002
PF4V1 4,116 - 0,56 5,679 - 0,64 0,006 Uma análise semelhante dos dados pós-tratamento com Vyt
TAGLN2 1,648 - 0,30 2,293 - 0,13 0,019 demonstrou uma relação inversa entre os níveis plasmáticos de TRG e
BMP6 6,265 - 0,55 7,965 - 0,49 0,001 os níveis de expressão deITGA2B (r¼ 0,81,P¼0,026),PTGS1
PTGER2 5,305 - 0,28 5,176 - 0,53 0,061
(r¼ 0,774,p¼0,041) eVWF (r¼ 0,810,p¼0,027). Em
Símbolo genético Linha de base Pós-sinvastatina P-valores Além disso, os níveis plasmáticos de não HDL-C correlacionaram-se
Média - SE Média - SE inversamente com os níveis de expressão dePF4V1 (r¼0,784,P¼0,0371). No
entanto, após o tratamento com Vyt, não houve associação significativa
B
RAXR 6,319 - 0,22 6,66 - 0,48 0h30 entre os níveis séricos de PCR e os níveis de expressão dos 14 genes, e entre
TNFRSF1 5,23 - 0,14 5,90 - 0,30 0,07 os níveis séricos de PCR e os perfis lipídicos.
IER3 8,57 - 0,52 9,47 - 0,54 0,13
LCR1R 5,83 - 0,27 6,74 - 0,31 0,02 3.9.2. Estudos de correlação de sinvastatina
CCL4L1 5,45 - 0,47 6,17 - 0,93 0,52
Observamos uma relação significativa entre a relação CT/HDL eIER3
CD69 6,28 - 0,68 5,89 - 0,89 0,55
níveis de expressão na linha de base (R¼0,75,P¼0,05).
 Z.Sternberg et al. / Aterosclerose 231 (2013) 411e420
Tabela 3
Efeitos de Vytorin ou Sinvastatina nos perfis lipídicos. OPos valores correspondem às diferenças (subtraídas de suas respectivas linhas de base) nos perfis lipídicos entre as duas modalidades de
tratamento. Abreviaturas: HDL: lipoproteína de alta densidade, LDL: lipoproteína de baixa densidade, TC: colesterol total, TRG: triglicerídeos.
Perfis lipídicos 1ª Linha de Base Vitorin
CT (mg/dL) 248,4 - 40,5 147,2 - 18,9
HDL-C (mg/dL) 52,9 - 15,7 55,0 - 17,7
TRG (mg/dL) 169,0 - 108,4 111,7 - 48,2
LDL-C (mg/dL) 165,2 - 32,2 73,0 - 24,0
Não-HDL-C (mg/dL) 196,1 - 47 99,0 - 24,5
TC/HDL-C 5,1 - 1,7 3,0 - 1,0
Além disso, uma relação inversa entre os níveis séricos basais de PCR e
os níveis basaisTNFRSF1níveis de expressão foram observados (r¼
0,782,P¼0,03).
3.10. Comparação da expressão gênica entre Vytorin e Sinvastatina
Além disso, comparamos diretamente as diferenças nos perfis de
expressão gênica de Vyt e Sim, sem considerar os níveis basais de expressão
gênica. Esta análise mostrou diferenças significativas (P<0,05) em 391 genes
globais (199 regulados positivamente por Vyt em relação a Sim, e 192
regulados negativamente por Vyt em relação a Sim) (Tabela de Suplementos
3). No entanto, as diferenças nos níveis de expressão genética foram
inferiores a 1,3 vezes. Além disso, quatro genes relacionados à
imunomodulação foram incluídos entre os 391 genes. Esses genes incluíram
MTHFR, que foi regulamentado positivamente, eITGA8, C3,eCCL1,que foram
regulamentados negativamente pela Vyt em relação ao Sim.
4. Discussão
Nossos resultados mostram que a terapia combinada Zetia/Sim, bem
como a monoterapia com Sim, alteram os níveis de expressão de genes
globais e imunomoduladores e reduzem os níveis de PCR e lipídios
aterogênicos, com alterações mais amplas e redução mais eficaz pela
terapia combinada Zetia/Sim em comparação com Sim. monoterapia.
Nossos resultados concordam com os de um estudo anterior mostrando
efeitos anti-inflamatórios mais eficazes da terapia combinada Zetia 10 mg/
Sim40 mg em comparação com 40 mg Sim em monoterapia[11]. Embora as
alterações observadas nos níveis de expressão genética tenham sido
relativamente pequenas em magnitude, elas têm o potencial de sinergizar,
produzindo efeitos biológicos importantes[21].
A monoterapia com Sim levou a alterações em um número relativamente
grande de genes globais, mas muitos desses genes não foram influenciados
pela terapia pós-Vyt. Este fenômeno foi aparente tanto para os genes
globais quanto para os imunomoduladores. Estas observações sugerem
interações entre Zetia e Sim, apontando para a possibilidade de que a
terapia combinada com Vyt possa suprimir alterações na expressão de
genes que de outra forma seriam influenciadas pela monoterapia com Sim.
Acredita-se que os efeitos pleiotrópicos do Sim resultem em parte de
uma diminuição na disponibilidade de vários componentes intermediários
biologicamente ativos na via do mevalonato, devido ao bloqueio da
isoprenilação[22]. Embora o(s) mecanismo(s) subjacente(s) aos efeitos
pleiotrópicos de Zetia permaneçam em grande parte desconhecidos, um
tratamento diário de quatro semanas de pacientes com insuficiência
cardíaca com 10 mg de Sim ou 10 mg de Zetia influenciou diferentemente o
mevalonato, o produto da HMG-CoA-redutase: Sim reduziu mevalonato
sérico, enquanto Zetia o aumentou; no entanto, os dois regimes mostraram
reduções semelhantes no LDL-C[23]. Estes resultados sugerem que a adição
de Zetia ao Sim pode diminuir os efeitos pleiotrópicos do Sim. Estudos
futuros devem examinar as possíveis interações entre os efeitos
pleiotrópicos de Sim e Zetia em uma coorte maior.
Observamos diferenças na natureza dos genes imunomoduladores
que foram alterados pelo Vyt e aqueles que foram alterados após a
terapia Sim. O tratamento com Vyt levou a um aumento significativo
417
% Mudanças 2ª linha de base Sinvastatina % Mudanças P-valores
40,8 235,5 - 26,3 175,6 - 31,7 27.2 <0,001
6.1 50,1 - 15,4 52,3 - 19,1 2.9 0,4
19.6 137,5 - 57,8 139,5 - 87,1 4.9 0,1
54,4 160,6 - 29,1 95,5 - 41,2 44,5 0,01
46,8 185,4 - 32,8 123,3 - 38 33,9 0,001
37.1 5,1 - 1,6 3,9 - 2,0 23,9 0,02
regulação negativa de uma série de fatores de transcrição pró-inflamatórios,
incluindo um dosNF-KBsubunidades,NF-KB1.A análise do caminho do mapa
mostra queNF-KB1O gene é o principal centro de uma rede que liga muitos
genes imunomoduladores.NF-KBregula positivamente a expressão de genes
que codificam citocinas pró-inflamatórias, moléculas de adesão e genes
relacionados à apoptose e está envolvido na patologia da aterosclerose[24].
Portanto,NF-KB1a regulação negativa pode estar entre as principais vias de
sinalização que contribuem para os efeitos pleiotrópicos de Vyt. O
tratamento Sim não alterou significativamente Níveis de expressão de NF-
kB1,mas desregulamentouRPS6KA6eTFG, dois genes que medeiamNF-kB
ativação[25,26].
Além disso, o tratamento com Vyt regulou positivamente as enzimas
superóxido dismutase-2 (SOD2)e glutationa peroxidase-1 (GPX1), ambos
com atividades antioxidantes[27].SOD2demonstrou inibir a atividade
mediada por ROS mitocondriaisNFK-Bativação, um processo que está
envolvido na calcificação vascular[28]. Além disso, um aumentoGPX1os
níveis de expressão estão entre os mecanismos adaptativos que reduzem a
expressão gênica pró-aterosclerótica induzida por estiramento em células
endoteliais humanas[29]. A regulação positiva desses genes pode contribuir
para a capacidade do Vyt de suprimir o estresse oxidativo de forma mais
eficaz do que o Sim em pacientes após eventos coronarianos agudos
[30]. Além disso, Vyt regulou positivamenteIL-10,que é outro centro
principal que liga muitos genes, enquanto Sim regulou positivamente o
receptor de IL-10. IL-10é uma citocina antiinflamatória, que limita a
inflamação na transcrição e tem potencial para exercer efeitos
antiaterogênicos[31,32].
EnquantoMEU Capresenta um dos três hubs na rede Vyt de genes
alterados, é o único hub na rede Sim.MEU Cé um fator transcricional
que regula a proliferação, diferenciação e apoptose celular e pode
contribuir para a promoção da aterosclerose[33].MEU Ca regulação
negativa por Sim poderia modular beneficamente os processos
patológicos da aterosclerose.
Como uma das estatinas mais lipofílicas, o Sim tem o potencial de induzir
respostas pró-inflamatórias transitórias tantoem vitroe na Vivo[34]. Um estudo de
microarranjos mostra a regulação positiva de um número relativamente grande
de genes pró-inflamatórios em PBMCs de indivíduos hiperlipidêmicos 12e36 horas
após tratamento com 20 mg de atorvastatina lipofílica. No entanto, os genes
envolvidos na apoptose foram inibidos principalmente após 1e4 semanas de
tratamento com atorvastatina[21]. Estes resultados são consistentes com os
nossos dados que mostram a regulação de genes apoptóticos por Sim, enquanto
os efeitos pró-inflamatórios de Sim podem ter ocorrido mais cedo e, portanto,
foram menos aparentes seis semanas após o tratamento com Sim.
Observamos baixa correlação entre os níveis de expressão gênica e os
perfis lipídicos pós-terapia combinada com Vyt, bem como monoterapia pós-
Sim, sugerindo que os efeitos pleiotrópicos de Vyt e Sim podem ser
independentes de seus efeitos nos perfis lipídicos. Esta conclusão é apoiada
por um estudo que mostra que um tratamento de quatro semanas de
pacientes dislipidêmicos com atorvastatina leva a alterações na expressão
gênica em PBMCs precedendo alterações detectáveis no perfil lipídico
sérico[21]. Além disso, os efeitos cardioprotetores das estatinas também
foram demonstrados em pacientes com lipídios plasmáticos normais.
[35]. No entanto, não se pode excluir a possibilidade de que o observado
418 Z.Sternberg et al. / Aterosclerose 231 (2013) 411e420
os efeitos pleiotrópicos são secundários à inibição da HMG CoA
redutase, conhecida por estar presente em PBMCs[21].
A comparação direta entre Vyt e Sim também indicou a
superioridade do primeiro em modular a expressão de genes
relacionados aos processos de aterosclerose, comoMTHFR, ITGA8, C3, e
CCL1. MTHFRé o gene que codifica a metilenotetrahidrofolato redutase,
a enzima limitante da taxa no metabolismo da homocisteína. Foi
demonstrado que a homocisteína interfere nas propriedades
antiaterogênicas e antiinflamatórias do Sim[36]e induzir disfunção
endotelial, promovendo inflamação e estresse oxidativo[37]. Portanto,
a maior expressão desta enzima induzida por Vyt tem o potencial de
modular beneficamente os fatores envolvidos na aterosclerose.
Além disso,C3,o gene que codifica o terceiro componente do
complemento é um marcador de inflamação crónica com um papel na
patologia da aterosclerose. Os níveis séricos de C3 estão elevados em
pacientes com DAC e os níveis predizem eventos cardiovasculares maiores
[38]. De forma similar,CCL1codifica uma quimiocina inflamatória, cujo nível
de expressão é regulado tanto pelo fator de necrose tumoral (TNF)-a
e lipoproteína (a)[39]. A redução observadaCCL1os níveis de expressão
gênica têm o potencial de contribuir para a redução induzida por Zetia
e Sim na lipoproteína (a)[40,41]. Portanto, a regulação negativa de
ITGA8, C3,eCCL1e a regulação positiva deMTHFR apoiam os efeitos
antiinflamatórios e antiaterogênicos de Zetia, favorecendo a terapia
combinada.
No entanto, apesar dos efeitos anti-inflamatórios superiores, Vyt também
regulou positivamente os níveis de expressão de um grande número de genes
conhecidos por estarem envolvidos, direta ou indiretamente, na ativação celular,
adesão/migração e na cascata de coagulação.
O tratamento com Vyt levou a alterações na expressão de 19 desses
genes (14 foram regulados positivamente e cinco foram regulados
negativamente), enquanto Sim alterou a expressão de 7 desses genes (3
foram regulados positivamente e 4 foram regulados negativamente).VWFfoi
um dos muitos genes regulados positivamente por Vyt. A regulação positiva
deVWFem pacientes com doença arterial coronariana foi considerada a
razão da falta de eficácia do Zetia, em comparação às estatinas, na melhoria
da função vasodilatadora endotelial[42]. Portanto, apesar de um potencial
relativamente alto para exercer efeitos antiinflamatórios e hipolipemiantes,
a ativação induzida por Vyt de genes relacionados à ativação/adesão/
migração celular e à ativação da cascata de coagulação pode afetar
adversamente a eficácia terapêutica do medicamento. No entanto, foi
demonstrado que a terapia combinada com Zetia10 mg/Sim 20 mg reduz de
forma mais eficaz a agregação plaquetária em pacientes com DAC estável
em comparação com a monoterapia com 80 mg Sim.[43], sugerindo que
fatores complexos têm potencial para influenciar a eficácia clínica do Vyt.
Nossos resultados mostram que tanto a terapia combinada com Vyt quanto a
monoterapia com Sim reduzem os níveis séricos de PCR. No entanto, foi
demonstrado que estatinas como Sim reduzem os níveis de PCR devido à sua
capacidade de induzir óxido nítrico, e não devido aos seus efeitos anti-
inflamatórios diretos nas células produtoras de PCR.[44]. Estes resultados
sugerem que a redução nos níveis séricos de PCR pode não refletir
necessariamente os efeitos antiinflamatórios do Sim. O(s) mecanismo(s) pelo qual
o tratamento combinado com Simand Zetia leva a uma redução adicional nos
níveis séricos de PCR é desconhecido e deve ser explorado em estudos futuros.
A eficácia clínica da terapia combinada Zetia/Sim em relação à
monoterapia com Sim foi estudada em vários grandes ensaios clínicos
randomizados. No estudo ENHANCE (Ezetimibe and Sinvastatin in
Hypercholesterolemia Enhances Atherosclerosis Regression), envolvendo
720 pacientes com hipercolesterolemia familiar heterozigótica, uma terapia
combinada de dois anos com 10 mg de Zetia / 80 mg de Sim teve efeitos
semelhantes na espessura da íntima-média da carótida (cIMT) ( um
marcador substituto de aterosclerose precoce) como 80 mg de Sim em
monoterapia, apesar da redução adicional de LDL-C, TRG e PCR no primeiro
em comparação com o último[45].
No estudo SANDS (Stop Atherosclerosis in Native Diabetics Study),
499 pacientes diabéticos foram randomizados para um tratamento de
três anos com terapia combinada Zetia 10 mg/Sim 80 mg ou 80 mg Sim
em monoterapia. Ambas as modalidades de tratamento melhoraram a
EIMC em comparação com o placebo[46], sugerindo que Zetia e Sim
podem exercer efeitos pleiotrópicos através de diferentes mecanismos.
Nosso estudo genômico mostra consistentemente diferenças nos perfis
de expressão gênica imunomoduladora de Vyt e Sim. Além disso, a
ausência de diferenças significativas na EIMC entre a terapia
combinada Zetia/Sim e a monoterapia Sim pode resultar em parte das
influências opostas de Sim e Zetia na via do mevalonato[23].
Os fatores que influenciam a eficácia da terapia complementar com
Zetia incluem a patologia clínica associada à população em tratamento
[47], gênero[48]e níveis basais de LDL-C[49]. No entanto, é possível que
o limiar para redução da EIMc nestes dois ensaios clínicos já tenha sido
alcançado com 80 mg de Sim e que a adição de 10 mg de Zetia não
conferisse benefícios adicionais.
Esta suposição é apoiada pelos resultados do estudo VYCTOR (Vytorin on
Carotid Intima-Media Thickness and Global Arterial Rigidity), mostrando que
uma dose mais baixa de Sim incluída na terapia combinada Zetia/Sim (10
mg/40 mg) é tão eficaz quanto a monoterapia com alta dose de Sim (80 mg)
na redução de EIMc, PCR e LDL em pacientes que sofrem de DAC[50]. Além
disso, um estudo retrospectivo demonstrou que pacientes com síndrome
coronariana aguda (SCA) que receberam 10 mg de Zetia/10eA terapia
combinada de 20 mg de Sim teve uma taxa significativamente menor de
reinternação em comparação com 10e 20 mg de Sim em monoterapia[51].
A terapia combinada com uma dose mais baixa de Sim também
demonstrou exercer eficácia clínica em comparação ao placebo no
estudo SEAS (Simvastatina e Ezetimiba na Estenose Aórtica).[52]e o
ensaio SHARP (Estudo de Proteção Cardíaca e Renal)[53]. Mais estudos
são necessários para comparar a eficácia da dose baixa vs. alta de Sim
na terapia combinada nos resultados clínicos dos pacientes.
As estatinas diferem umas das outras na sua potência para exercer
efeitos pleiotrópicos e hipolipidêmicos, tanto em monoterapia quanto em
terapia combinada com Zetia. Por exemplo, ao contrário da redução da EIMC
observada pela monoterapia com Sim no estudo SANDS[46], um tratamento
de doze meses de 398 mulheres hiperlipidêmicas na pós-menopausa com 80
mg de atorvastatina no estudo CASHMERE (Carotid Atorvastatin Study in
Hyperlipidemic postMenopausal Women: A Randomized Evaluation) não foi
mais eficaz que o placebo em retardar a progressão da EIMc, apesar da
redução nos níveis de LDL-C[54].
Estudos comparando a eficácia clínica de Sim e de atorvastatina relatam
que um tratamento diário de seis meses de pacientes com DAC com 20 mg
de Sim foi tão eficaz quanto 80 mg de atorvastatina na redução dos níveis de
expressão de mRNA de marcadores pró-inflamatórios em PBMCs[55]. Da
mesma forma, um tratamento de dois anos de pacientes
hipercolesterolêmicos familiares heterozigotos com 40 mg de Sim foi tão
eficaz quanto 80 mg de atorvastatina na redução dos níveis plasmáticos de
lipoproteína (a).[41]. No entanto, no ensaio ASAP (Efeito da redução lipídica
agressiva versus convencional na progressão da aterosclerose na
hipercolesterolemia familiar), 80 mg de atorvastatina reduziram a EIMC de
forma mais eficaz do que 40 mg de Sim.[56].
Além disso, no estudo EASEGO, a duplicação da dose de Sim de 20 para
40 mg foi mais eficaz na obtenção de níveis plasmáticos de LDL-C <2,5
mmol/L em pacientes que sofrem de doença coronariana ou diabetes
mellitus do que a duplicação da atorvastatina de 10 para 20 mg.[57]. Além
disso, uma percentagem mais elevada destes doentes (73%) atingiu níveis
plasmáticos de LDL-C <2,5 mmol/L com a terapêutica combinada de Zetia 10
mg/Sim 40 mg do que com a terapêutica combinada de Zetia 10 mg/
Atorvastatina 20 mg (57%)[57].
Da mesma forma, no estudo VYMET, um tratamento de seis semanas
com Zetia10 mg/Sim20eA terapia combinada de 40 mg levou a maiores
porcentagens de pacientes com doença vascular aterosclerótica que
atingiram LDL-C < 70 mg/dL, não-HDL-C < 100 mg/dL e Apo
 Z.Sternberg et al. / Aterosclerose 231 (2013) 411e420
B < 80 mg/dL que tratamento com atorvastatina 10e40mg[58]. Esses
estudos sugerem efeitos hipolipidêmicos e pleiotrópicos complexos das
estatinas, tanto em monoterapia quanto em combinação com Zetia.
Um resumo desses ensaios clínicos, seus objetivos, o desenho e a
população envolvida são apresentados emTabela Suplementar 4.
O estudo IMPROVE-IT é um ensaio clínico adicional com resultados
esperados em 2013[59]. Este estudo tem como objetivo determinar se a
terapia combinada com Vyt melhora os resultados cardiovasculares em
pacientes após SCA em comparação com a monoterapia com Sim. Os
resultados do IMPROVE-IT ajudarão a definir a relação entre os resultados
da expressão genética observada e os resultados clínicos dos pacientes.
Concluímos que as diferenças na natureza dos efeitos pleiotrópicos
podem ter um impacto significativo na eficácia clínica de Vyt e Sim na
prevenção e redução de doenças vasculares, e que o equilíbrio entre
vários genes relacionados com pleiotrópicos pode desempenhar um
papel crítico no início e progressão de processos aterogênicos.
5. Limitações do estudo
Nosso desenho de estudo transversal tem o potencial de corrigir
parcialmente a grande variabilidade interindividual. No entanto, nosso
estudo de pequeno porte é de natureza exploratória e não fornece análise
de poder adequada para mudanças nos níveis de expressão gênica e para
múltiplas correções de testes. Além disso, nosso estudo fornece perfis de
expressão gênica para terapia combinada de Simmonoterapia e Vyt, mas
não para monoterapia com Zetia.
Este estudo mediu os efeitos pleiotrópicos da terapia combinada
com Vyt e da monoterapia com Sim no nível da expressão gênica. No
entanto, estudos futuros devem examinar se as alterações observadas
nos níveis de expressão genética se traduzem em alterações nos níveis
das proteínas relacionadas.
Além disso, utilizamos PBMCs para conduzir este estudo, uma
fração que contém uma população celular heterogênea. Não se sabe
qual subpopulação de PBMCs (células T, monócitos ou células B) foi a
principal fonte para as alterações observadas nos níveis de expressão
gênica.
Além disso, o alvo de ação do Sim e do Zetia são os hepatócitos e os
enterócitos, respectivamente. Portanto, é provável que nosso estudo
do perfil de expressão gênica em PBMC produza resultados diferentes
daqueles em hepatócitos e enterócitos[60].
Fontes de financiamento
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Merck.
Divulgações
Nenhum declarado.
Reconhecimento
Os autores agradecem ao Dr. Jasen Wise pela ajuda na análise dos dados
do microarranjo e ao Dr. Murali Ramanathan pela contribuição intelectual.
Apêndice A. Material suplementar
Material complementar relacionado a este artigo pode ser encontrado
em http://dx.doi.org/10.1016/j.atherosclerosis.2013.09.031.
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