DETERMINAO DE AMINOCIDOS ENSAIO DA NINHIDRINA

YEMM, E.W. & COCKING, E.C. (1954) Grupo 02: Girlene Santos de Souza Graciele Teodora da Costa Karine Cristina Bicalho Paula de Souza Cabral Costa

INTRODUO Mtodo Colorimtrico: reao com ninhidrina; Baseado na produo quantitativa de DYDA (diketohydrindylidenediketohydrindamina); Aminocido Ninhidrina Amnia (desaminao); Hidrindantina (reduo);

Cor Roxa atribuda ao nion de DYDA; Amnia + Hidrindantina = DYDA

INTRODUO Moore e Stein (1948) Mtodo fotomtrico; Introduo de agente redutor para prevenir a oxidao da hidrindantina Smith e Agiza (1951) Simplifica o mtodo, a produo de DYDA no foi quantitativa.

INTRODUO Troll e Cannan (1953); Amnia e ninhidrina formam DYDA na presena de agente redutor, capaz de produzir hidrindantina; A desaminao e a condensao so acopladas de algum modo

INTRODUO Troll e Cannan Adotaram uma soluo tamponada de gua e fenol (pH=5) com piridina como solvente mais eficiente; KCN pH =5 agente redutor foi timo para todos os aminocidos testados, exceto triptofano e lisina.

MATERIAIS
Tampo citrato de sdio 0,2M, pH=5,0, dissolvido em gua destilada; Ninhidrina 5% em metil Celosolve; KCN 2% em Metil Celosolve (2ml de KCN 0,01 M em 100mL de metilcelosolve); Etanol 60% (v/v); Glicina ou qualquer outro aminocido em concentrao 0,1 mol/mL

MATERIAIS Determinao do Branco Para equalizar o aparelho anulando o erro da luminescncia prpria dos reagentes.

METODOLOGIA Padro de aminocidos +

Reagentes A,B,C Tampo Citrato Ninhidrina KCN

Tubos de Ensaio Agitou-se Banho-maria 100C/15 min. Desenvolvimento de colorao

METODOLOGIA Esfriou por 5 minutos em gua corrente; Volume completado com etanol 60%; Agitou-se novamente; Resfriamento; Leitura da absorvncia em espectrofotmetro UV, no comprimento de onda de 570 nm, para prolina e hidroxiprolina usou-se 440nm;

RESULTADO E DISCUSSO Observou-se a colorao at 3 horas antes e at 1hora aps a adio do etanol;
Os aa estudados deram colorao 100% da DYDA pura, exceto tirosina e fenilalanina (89%), triptofano (83%) e lisina (108%); necessrio o aparecimento da amnia na reao para a formao da DYDA; A cistena o nico aminocido que no forma DYDA (apresenta uma colorao amarela).

Isolamento da DYDA
Mtodo de Moore e Stein 50 mg de sal sdico recristalizado pela mistura gua + propanol, os cristais so secos a vcuo por 48 horas; Moore e Stein esto de acordo com a descoberta de Troll e Cannan: O espectro de absoro do sal sdico foi idntico mistura da reao fracionada obtido de aminocidos na anlise da ninhidrina.

RESULTADOS E DISCUSSO
A ninhidrina desenvolveu a colorao da soluo, de acordo com as concentraes de aminocidos presentes em cada tubo; concentrao de aa, intensidade de cor grfico

Valores de absorvncia

Curva padro do aa
r os b A
Concentrao do aa (x)

RESULTADOS E DISCUSSO