UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

CAMPUS MACAÉ
CURSO DE FARMÁCIA

IDENTIFICAÇÃO DOS PROVÁVEIS METABÓLITOS DA

CHALCONA LC 05 POR CG-EM APÓS BIOTRANSFORMAÇÃO
POR MICROSSOMAS HEPÁTICOS DE RATOS

Aluna: Gabriela Medina Gomes de Castro

Orientador: Prof. Dr. Thiago Barth
Coorientador: Marcos Vinicius Toledo e Silva

Macaé, 27 de Junho de 2019

 INTRODUÇÃO
 Tuberculose: um problema de saúde pública mundial
 Transmissão

Arte: Shutterclack
• Agente etiológico: Mycobacterium tuberculosis

Bacilo aeróbico, álcool- ácido

resistente, crescimento lento e
virulência variável

Figura.Transmissão da Tuberculose.
• Infecção: tosse, fala ou espirro do doente

Eliminação pela defesa imune;

• Bacilos inalados e fagocitados Forma de infecção latente;

Infecção disseminada (imunocomprometidos).

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 INTRODUÇÃO
 Tuberculose: um problema de saúde pública mundial

• Sudeste Asiático, Pacífico Ocidental e região africana;

• Brasil: TB multiressistentes ou pacientes soropositivos

Figura. Incidência estimada de tuberculose por 100.000 habitantes no ano de 2017

Legenda (%)

Brasil:
44,0
Fonte: https://www.who.int/gho/tb/epidemic/cases_deaths/en/
Rio de Janeiro: 63,5/100 mil habitantes 3
 INTRODUÇÃO
 Quimioterapia da tuberculose
Quadro. Medicamentos de primeira e segunda linha empregados no tratamento da tuberculose
(ARBEX et al., 2010a; ARBEX et al., 2010b; BRASIL, 2019 ).

Estrutura química Efeitos adversos

Medicamentos de primeira linha

Hepatotoxicidade, Exantema,
Rifampicina nefrite intersticial, irritação
gástrica

Hepatotoxicidade, psicose,
Isoniazida
neurite periférica, artrite

Hepatotoxicidade, irritação
Pirazinamida
gástrica, artralgia

Etambutol Neurite óptica e exantema

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 INTRODUÇÃO
 Quimioterapia da tuberculose
Quadro. Medicamentos de primeira e segunda linha empregados no tratamento da tuberculose
(ARBEX et al., 2010a; ARBEX et al., 2010b; BRASIL, 2019 ).

Estrutura química Efeitos adversos

Medicamentos de segunda linha

Ototoxicidade, neurotoxicidade,
Estreptomicina
nefrotoxicidade

Ototoxicidade, neurotoxicidade,
Amicacina
nefrotoxicidade

Capreomicina Nefrotoxicidade e ototoxicidade

Hepatotoxicidade,
Etionamida neurotoxicidade, irritação
gástrica.
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 INTRODUÇÃO
 Importância das chalconas como agentes antimicobacterianos
 Chalconas
 Precursoras de flavonoides e isoflavonoides,
com ampla distribuição em frutas e vegetais
(SAHU et al., 2012);

 Reações de condensação de Claisen-Schmidt

(MELLADO et al., 2018);

 Apresentam diversas atividades biológicas:

Antifúngica, antimalárica, antibacteriana,

Introdução de diferentes
antileshmanial, antinociceptiva, anti-
grupos substituintes em seus
inflamatória, antitumoral, antioxidante, anéis aromáticos (A e B)

antimicobacteriana, entre outras.

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 INTRODUÇÃO
 Importância das chalconas como agentes antimicobacterianos
Quadro - Derivados de chalconas como potenciais agentes antimicobacterianos.

Código Estrutura química CIM50 (µM) Referências

LC 04 19,7 VENTURA et al., 2015

LC 05 12,7 VENTURA et al., 2015

LC 08 10,5 VENTURA et al., 2015

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 INTRODUÇÃO
 Importância das chalconas como agentes antimicobacterianos

Anti-inflamatória

Farmacocinética e
Antimicobacteriana
hepatotoxicidade

Chalcona LC 05

• É necessário que sejam avaliadas as propriedades farmacocinéticas (metabolismo in vitro)

VENTURA et al., 2015 8

 JUSTIFICATIVA
 Atualmente, todos os medicamentos empregados para o tratamento básico da
tuberculose apresentam efeitos adversos graves e precisam de um longo período
de uso, o que acaba restringindo a adesão dos pacientes.

 Devido a isso, fica evidente a necessidade da busca por fármacos que apresentem
reduzidos ou nenhum efeito colateral e que tenham um período mais curto de
tratamento.

 Nessa circunstância, a chalcona LC 05 apresentou uma atividade dupla

(antimicobacteriana e anti-inflamatória) comprovada para TB e pode ser
considerada um possível agente para geração de novos fármacos anti-TB no futuro
(VENTURA, 2015).

 Entretanto, para que isso aconteça, uma vez comprovada a atividade biológica, é
necessário estudar os parâmetros farmacocinéticos, no qual o metabolismo está
incluído.

 Logo, o desenvolvimento de um método bioanalítico para determinação da chalcona

LC 05 em meio de incubação microssomal e a caracterização estrutural dos
possíveis metabólitos formados pode vir a contribuir com o avanço nos estudos pré-
clínicos.
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 OBJETIVO GERAL

Estudar a biotransformação in vitro da chalcona LC 05

empregando fração microssomal de fígados de ratos

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 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Desenvolver método por CLAE-DAD para determinação da chalcona

LC 05 em meio de incubação microssomal

Desenvolver procedimento de preparo de amostras para extração da

chalcona LC 05 em meio de incubação microssomal, empregando
extração líquido-líquido (ELL)

Aplicar o método desenvolvido na determinação da chalcona LC 05

em meio de incubação microssomal

Identificar e caracterizar os possíveis metabólitos formados da

chalcona LC 05 a partir da biotransformação com microssomas
hepáticos de ratos, empregando técnicas analíticas.
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 MATERIAIS E MÉTODOS
 Desenvolvimento da separação por CLAE (preparo das
amostras)

Misturas:
• ácido acético 0,1% + ACN
• ACN + H2O
Chalcona LC 05 (PM 252,26 g/mol)

100 µgmL

 Número de pratos teóricos

 Fator de assimetria

 Resolução

 Tempo de retenção

• Cromatógrafo da Shimadzu® (CLAE-DAD)

• Coluna Ascentis® C18 (100 x 4,6 mm, 2,7 µm)

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 RESULTADOS E DISCUSSÃO
 Desenvolvimento da separação por CLAE

Coluna Ascentis® C18

(100 x 4,6 mm, 2,7 µm)

Figura. Cromatograma representativo da análise de chalcona LC 05 em

Alta eficiência cromatográfica diferentes proporções da fase móvel (acetonitrila: água ultrapura), sendo
em menor tempo de análise (A) 60:40; (B) 65:35 e (C) 55:45.

• Acetonitrila: Solução de ácido acético 0,1%

H3C C N
Apenas as proporções 55:45 e 50:50
(ACN:H2O) foram avaliadas
• Acetonitrila: Água ultrapura

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 RESULTADOS E DISCUSSÃO
 Desenvolvimento da separação por CLAE
Pratos teóricos Simetria dos picos

↑ o número de pratos (N) = ↓ a

altura equivalente do prato teórico Fator de assimetria (As)
(H) = maior a eficiência

Não deve apresentar valores

2000 pratos teóricos superiores a 2

Figura. Influência do percentual de acetonitrila sobre o Figura. Influência do percentual de acetonitrila sobre o
parâmetro cromatográfico da eficiência medido em pratos parâmetro cromatográfico fator de assimetria.
teóricos. 14
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
 Desenvolvimento da separação por CLAE
Parâmetro
Resolução Condições de análise

Coluna Ascentis® C18 (100 x 4,6 mm, 2,7 µm)

A diferença das forças físicas e Fase móvel (FM) ACN:H2O (50:50, v/v)
químicas dos solutos, FM e FE é o Vazão 1 mL/min
que determina a resolução. Volume de injeção 4 µL

Temperatura de análise 35 °C
Tabela - Condições cromatográficas otimizadas.
Valores superiores a 1,5 Detecção UV 357 nm

Figura. Influência do percentual de acetonitrila sobre o Figura. Cromatograma representativo da análise da chalcona LC
parâmetro cromatográfico da resolução. 05 na condição otimizada e seu respectivo espectro de absorção
no UV com máximo de absorção em 357 nm. 15
 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Desenvolver método por CLAE-DAD para determinação da chalcona

LC 05 em meio de incubação microssomal

Desenvolver procedimento de preparo de amostras para extração da

chalcona LC 05 em meio de incubação microssomal, empregando
extração líquido-líquido (ELL)

Aplicar o método desenvolvido na determinação da chalcona LC 05

em meio de incubação microssomal

Identificar e caracterizar os possíveis metabólitos formados da

chalcona LC 05 a partir da biotransformação com microssomas
hepáticos de ratos, empregando técnicas analíticas.
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 MATERIAIS E MÉTODOS
 Otimização dos parâmetros de ELL da chalcona LC 05 (preparo
das amostras)

Meio microssomal: tampão Adição de 2 mL do Agitação (1 min) Centrifugação

TRIS + tampão fosfato + solvente extrator (5 min, 3000 rpm)
fração microssomal
(1mg/mL) + H20 +
LC 05 (500 µg/mL) Recolher 75 % do
volume do solvente
Solventes: Acetato de Etila, n-Hexano e Éter
metil terc-butílico (MTBE).
Razão de fases: 2:1 (1 mL); 3:1 (1,5 mL) e 4:1
(2 mL).
Tempo de extração: 30s; 45s; 60s.

• Amostras: n=5

• Padrão: chalcona + FM= 100% recup.(n=3) Redissolver em 500µL de Evaporação completa

FM e analisar em CLAE- do solvente em fluxo
• Controle: s/ adição da chalcona (n=3). DAD de ar comprimido
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 RESULTADOS E DISCUSSÃO
 Otimização dos parâmetros de ELL da chalcona LC 05

Figura. (A) Cromatograma representativo da análise da chalcona LC 05 na concentração de 500

µg/mL extraída com n-Hexano. Amostra branco, não fortificada com a chalcona LC 05, extraída
com n-Hexano (B); Acetato de etila (C); MTBE (D).

18
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
 Otimização dos parâmetros de ELL da chalcona LC 05

Recuperação da
chalcona LC 05 na
Log P
condição ótima
3,69

SciFinder®
87%

Figuras - Otimização dos parâmetros de extração líquido-líquido da chalcona LC 05 a partir do meio

de incubação microssomal. (A) Seleção do solvente extrator; (B) Razão volumétrica entre a fase
aquosa e orgânica; (C) Tempo de agitação em vortex. A barra denota o erro das réplicas (n = 5).
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 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Desenvolver método por CLAE-DAD para determinação da chalcona

LC 05 em meio de incubação microssomal

Desenvolver procedimento de preparo de amostras para extração da

chalcona LC 05 em meio de incubação microssomal, empregando
extração líquido-líquido (ELL)

Aplicar o método desenvolvido na determinação da chalcona LC 05

em meio de incubação microssomal

Identificar e caracterizar os possíveis metabólitos formados da

chalcona LC 05 a partir da biotransformação com microssomas
hepáticos de ratos, empregando técnicas analíticas.
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 MATERIAIS E MÉTODOS
 Procedimento geral de incubação para o estudo de
biotransformação in vitro

Meio de incubação microssomal: Incubação das amostras (37ºC; ELL

LC 05 (500 µg/mL) + tampão 60 min; sob agitação) (n-Hexano; 2:1; 60s)
fosfato de potássio 0,5M +
mistura de cofatores + H2O +
fração microssomal (1mg/mL)

• Amostras: c/ fração microssomal (n=10).

• Controle: s/ fração microssomal (n=3).

Redissolver em 500µL Redissolver em 500µL

de FM e analisar em de FM e analisar em
CG-EM CLAE-DAD 21
 MATERIAIS E MÉTODOS
 Identificação estrutural da chalcona LC 05 e seus metabólitos
 Análise por CLAE-DAD e CG-EM

CLAE-DAD CG-EM

Condições cromatográficas: Espectrômetro de massas: Cromatógrafo Gasoso:

• Coluna: Ascentis® C18 (100 x 4,6 mm;
2,7 μm)
• Fase móvel: ACN:H2O (50:50 v/v)
• Vazão: 1 mL/min
• Temperatura: 35°C
• Volume de injeção: 4 μL
• Detecção no UV: 254 e 358 nm
• Intervalo de massas: m/z 100-1000
• Energia de ionização: 70 eV
• Análises: modo Full Scan
• Temperatura interface: 280 °C
• Temperatura da fonte de íons: 250°C
• Coluna capilar: DB –5M (30 m x 0,25
mm; 0,25μm)
• Gás de arraste: He (vazão de 10
mL/min)
• Temperatura do injetor: 250°C
• Modo de injeção: Splitless (1μL)
• Temperatura inicial de análise: 120°C
(4 min)
• Temperatura final de análise: 300°C
(12 min)
• Rampa de aquecimento: 8°C/min-1 22
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
 Identificação estrutural da chalcona LC 05 e seus metabólitos
 Análise por CLAE-DAD

- Pico 1: impureza de síntese

da chalcona LC 05

- Pico 2: Chalcona LC 05

- Picos 3 a 7: Prováveis
metabólitos da chalcona LC 05

Formação total de
metabólitos: 13%

- Nenhum pico diferente aos

do controle foi observado

Figura. (A) Cromatograma representativo do metabolismo da chalcona LC 05

em microssomas hepáticos de ratos. (B) Controle do metabolismo (ausência
de microssomas). Detecção UV em 254 nm (acima) e 358 nm (abaixo). 23
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
 Identificação estrutural da chalcona LC 05 e seus metabólitos
 Análise por CLAE-DAD
Banda II Banda I
O
(240-280 nm) (300-380 nm)

A B

Porção benzoil Porção cinamoil

Figura. Estrutura básica de chalconas e

suas porções que geram as bandas de
absorção características no UV.

Figuras. Espectro de absorção no ultravioleta da chalcona LC

05 (A), da sua impureza de síntese (B) e de seus prováveis
metabólitos (C, D, E, F e G).
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 RESULTADOS E DISCUSSÃO
 Identificação estrutural da chalcona LC 05 e seus metabólitos
 Análise por CG-EM

Figura. (A) Cromatograma representativo do metabolismo da chalcona LC 05 em microssomas

hepáticos de ratos. (B) Controle do metabolismo (ausência de microssomas). Em destaque picos
relativos aos prováveis metabólitos.
 
25
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
 Identificação estrutural da chalcona LC 05 e seus metabólitos
 Análise por CG-EM (Chalcona LC 05)

A B

LC 05

Figura. Espectro de massas da chalcona LC 05 obtido a partir da fonte de ionização por elétrons. 26
 Resultados
RESULTADOS E DISCUSSÃO
 Identificação estrutural da chalcona LC 05 e seus metabólitos
 Análise por CG-EM (Chalcona LC 05)
(RAZA et al., 2016)

α
m
ge
li va
C

Figura. Proposta de fragmentação de alguns íons da chalcona LC 05 empregando a

ionização por elétrons.

• clivagem α → acílio
• Isomerização → rearranjo de McLafferty 27
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
 Identificação estrutural da chalcona LC 05 e seus metabólitos
O
 Análise por CG-EM (Isômero da chalcona LC 05)
O
O
B
A

Isômero LC 05 (cis)

Figura. Espectro de massas do isômero da chalcona LC 05 obtido a partir da fonte de ionização por
elétrons. 28
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
 Identificação estrutural da chalcona LC 05 e seus metabólitos
O
 Análise por CG-EM (Metabólito M1)
O

A B
O

Di-hidrochalcona

Figura. Espectro de massas do metabólito M1 obtido a partir da fonte de ionização por elétrons.
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 RESULTADOS E DISCUSSÃO
 Identificação estrutural da chalcona LC 05 e seus metabólitos
 Análise por CG-EM (Metabólito M1)
(HEDIN e PHILLIPS, 1992)

Figura. Proposta de fragmentação de alguns íons do metabólito M1 empregando a

ionização por elétrons.

Atividades: antituberculose, antioxidante, antileishmanial e antimicrobiana.

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 RESULTADOS E DISCUSSÃO
 Identificação estrutural da chalcona LC 05 e seus metabólitos
 Análise por CG-EM (Metabólito M2) O O

O
OH

A B ou A B
OH
O
LC 05
Di-hidrochalcona

Figura. Espectro de massas do metabólito M2 obtido a partir da fonte de ionização por elétrons.
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 CONCLUSÃO
 O método cromatográfico empregando uma coluna analítica empacotada com partículas superficialmente porosas
forneceu adequados parâmetros de eficiência cromatográfica (> 2000 pratos teóricos, < 2 fator de assimetria e >
1,5 resolução) e tempo de análise (7 min).

 A extração líquido-líquido apresentou uma maior recuperação da chalcona LC 05 utilizando como solvente extrator
o n-hexano, a razão de fases 2:1 e o tempo de agitação de 60 segundos.

 As condições de incubação empregadas no estudo de metabolismo in vitro com microssomas hepáticos de ratos da
chalcona LC 05 possibilitaram a formação de 5 metabólitos em análises por CLAE-DAD, dos quais 2 deles foram
possivelmente identificados através de análises por CG-EM. O primeiro metabólito (M1) sugere-se resultar de uma
redução do alceno da chalcona LC 05, enquanto que o segundo (M2), sugere-se resultar de uma redução do
alceno e de uma hidrólise no metilenodioxi da chalcona LC 05.

 No entanto, ainda é necessário utilização de outras técnicas analíticas a fim de complementar a elucidação
dos outros três metabólitos. Devido a isso, as amostras já foram submetidas em CLAE-EM-EM e os fragmentos
estão em estudo de fragmentação.

 O próximo passo é buscar formas alternativas para obter uma maior quantidade de massa desses
metabólitos a fim de realizar testes de toxidez e/ou atividade biológica e realizar também estudos com
microssomas humanos com intuito de tentar correlacionar os metabólitos encontrados em microssomas de ratos.
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OBRIGADA!!!