OBJETIVO: Proceder a contagem de fungos e bactrias totais em amostras de alimentos (observar e diferenciar as caractersticas das colnias).

INTRODUO: A presena de micro-organismos em alimentos pode ser considerada prejudicial, no caso de contaminaes, e ou benficas quando micro-organismo utilizado no processo de preparao do alimento. Assim, a presena de alguns grupos de micro-organismos, tais como fungos e algumas bactrias podem causar a sua deteriorao e, em algumas situaes, provocar graves intoxicaes. O mtodo empregado, com maior frequncia, para contagem de microorganismos em amostras de alimentos a contagem em placas (mtodo direto). Nesse mtodo, uma amostra do alimento deve ser pesada e aps proceder-se a uma srie de diluies do mesmo em soluo diluente adequada. A diluio pode ser feita de vrias maneiras, sendo que as mais utilizadas so: 25 g de amostra para 225 mL de gua peptonada. 10 g da amostra para 90 mL de gua peptonada ou 1 g de amostra para 9 mL de gua peptonada. 10 - retirada 0,1 (plaqueamento em superfcie) ou 1 mL (plaqueamento de profundidade) da amostra que colocada diretamente na placa. 10- - retirado 1 mL da amostra e colocado em um tubo contendo 9 mL de gua peptonada. Correspondente a 0,01 de amostra inoculada. 10- - retirada 1 mL do tubo contendo a diluio 10- e colocado em outro tubo de ensaio contendo tambm 9 mL de gua peptonada. Corresponde a 0,001 de amostra inoculada.

10- - retirado 1 mL da diluio 10- e colocado em outro tubo contendo 9 mL de gua peptonada. Corresponde a 0,0001 de amostra inoculada. O nmero de diluies requeridas dependera do nvel de contaminao esperado, de forma a resultar em placas com 30 a 300 colnias. Para realizar a contagem em placas deve-se realizar primeiramente o plaqueamento das diluies, o qual pode ser realizado atravs de dois mtodos: . Plaqueamento de profundidade ou pour plate: Permite a inoculao de at 2,0 mL da amostra ou suas diluies, indicado para a anlise de amostras com contagens acima de 10/mL, porque a inoculao de diluies permite abranger uma faixa ampla de variao. Limite de deteco = 1UFC/mL. Selecionar trs diluies adequadas de amostra e inocular 1,0 mL de cada diluio em placas de petri separadas, vazias e estreis, abrindo as placas apenas o suficiente para inserir a pipeta, prximo ao Bico de Bunsen. Depositar o inculo fora do centro da placa, pois isto facilitara a posterior mistura com o meio de cultura. Para aumentar a preciso das contagens recomenda-se inocular duas ou mais placas por diluio (duplicata ou triplicata) e no utilizar pipetas com capacidade maior do que 2,0. Colocar nas placas inoculadas, 15 mL a 20 mL de meio de cultura, de acordo com o micro-organismo a ser analisado. Misturar o inculo com o meio de cultura movimentando suavemente as placas, numa superfcie plana, em movimentos na forma de oito, de 8 a 10 vezes, sempre mantendo o mesmo movimento para todas as placas. . Plaqueamento em superfcie ou spread plate:

Este plaqueamento limita o volume inoculado a 0,1 mL de amostra ou suas diluies, mas permite uma melhor visualizao das caractersticas das colnias na superfcie, alm de facilitar sua transferncia para outros meios de cultura. Limite de deteco = 10UFC/mL. Para as diluies, proceder da mesma de preparo para o plaqueamento de profundidade. Para plaqueamento em superfcie, as placas devem ser previamente preparadas, com 15 ml a 20 mL do meio de cultura especifico para o determinado microrganismo. Antes da utilizao, a superfcie do meio deve ser seca, o que pode ser feito em estufa (50 C/2hrs ou de um dia para o outro) ou em cmara de fluxo laminar (0,5 a 1 hora, com as tampas parcialmente abertas). Selecionar trs diluies adequadas da amostra, seguindo as mesmas recomendaes de plaqueamento de profundidade. Inocular 0,1 mL de cada diluio na superfcie das placas previamente preparadas, e usando uma ala de Drigalski, espalhar o inoculo pela superfcie do meio, at que todo o excesso do liquido seja absorvido. A contagem em placas mede o nmero de micro-organismos viveis, mas h necessidade de incubar as placas por 24/48H para que ocorra o aparecimento das colnias. Considera tambm que cada clula bacteriana cresce e se divide para produzir uma nica colnia, embora isso nem sempre represente a realidade porque as bactrias podem crescer em agregados (mais de uma clula) e a partir desse surgir uma colnia. Assim, visando corrigir essa possvel distoro as contagens das colnias em placas so denominadas unidades formadoras de colnias (UFC).

MATERIAIS E METODOLOGIA:

Primeiramente fora da capela pesou-se 10 gramas do alimento slido e colou em 90 ml de soluo salina (0,85%), preparou as diluies seriadas em soluo salina estril, lembrando que a primeira diluio (10g do alimento em 90 mL de soluo salina) considerada como 10-. A partir desta realizou as demais diluies (1 mL da suspenso microbiana em 9 mL de soluo salina), depois de realizar a agitao transferiu para o meio de cultura (Saboraud) 0,1 mL da suspenso microbiana das diluies (10-, 10-, 10- 3 10-4) e espalhou cuidadosamente com a ala de Drigaslki utilizando trs repeties para cada diluio. Posteriormente repetiu-se o procedimento transferindo para o meio de cultura (PCA) 0,1 mL da suspenso microbiana das demais diluies. Depois de identificar as placas incubou as mesmas com o meio Saboraud a 28C por uma semana e as placas com o meio PCA a 35C por 48/72 h.

RESULTADOS: Procedeu a contagem das colnias e expressou o nmero de fungos e bactrias em UFC/g na seguinte maneira: 98 ________0,1 mL x _________1mL x = 98 x 10 = 980 UFC/mL 980 x 100 = 98000 UFC/10g

98000 _________ 10g x ___________ 1g x = 98000/10 x = 9800 UFC/g

As diluies da amostra so feitas para viabilizar a contagem de microorganismos posteriormente. Quando no se tem noo do numero de unidades formadoras de colnia em determinada amostra, fazem-se vrias diluies, porm quando j se tem noo, faz-se inoculao em faixas de diluio determinadas.

CONCLUSO: Durante as aulas prticas, pode-se observar que o mtodo de diluio inevitvel em anlises microbiolgicas, pois assim podemos determinar as unidades formadoras de colnias obtendo informaes sobre a qualidade do alimento e determinar as condies de comercializao, verificando se o produto atende ou no as legislaes e normativas vigentes.

REFERNCIAS: Disponvel em: [http://www2.ufersa.edu.br/portal/view/uploads/setores/126/Mic robiologia%20Geral/petrifilm.pdf] Acesso em: 23 de janeiro de 2013 as 19h:34min

Disponvel

em:

[http://www.ebah.com.br/content/ABAAAA2WIAI/contagem-

microorganismos-atraves-das-tecnicas-spread-plate-pour-plate] Acesso em: 23 de janeiro de 2013 as 20h:18min

PESQUISA: 1) Quais so as vantagens de se utilizarem os mtodos de plaqueamento em superfcie e o de profundidade? 2) Quais so as demais formas utilizadas na medida do crescimento de microorganismos?

3) Quais so os fatores que afetam o crescimento de micro-organismos em alimentos? 4) Faa um esquema de diluio e plaqueamento para a contagem de microorganismos numa amostra de alimento que contenha 1000000 de clula/mL? 5) Descreva o procedimento para coleta de amostras de alimento para anlise microbiolgica.