ISSN 1980-3540

05.02, 07-13 (2010)

www.sbg.org.br

EXAMES DE PATERNIDADE PELO DNA: UMA METODOLOGIA PARA

ENSINO DA GENTICA MOLECULAR
Autores: Cristian Kely Pereira Campos1, Mariana Natalice de Siqueira1, Joo Paulo Borges1, Layana
Araujo Rodrigues1, Jader Soares de Oliveira2, Marcelo de Alcntara Rosa2, Adriana Freitas Neves1
1. Universidade Federal de Gois, Departamento de Cincias Biolgicas. 2. Ncleo Educativo, Colgio Nacional
Autora correspondente: Profa. Dra. Adriana Freitas Neves; Av. Dr. Lamartine Pinto de Avelar, 1120 Setor Universitrio CEP: 75704-020, Catalo Gois, email: neves.af@gmail.com

Palavras-chave: eletroforese, exames de DNA,

gentica molecular
1. Introduo
No genoma humano existem determinadas
regies polimrficas que so utilizadas nos exames de
paternidade e outros vnculos genticos. Estas regies
podem constituir repeties consecutivas de nmero
varivel ou minissatlites (VNTR, do ingls, Variable
Number of Tandem Repeats) ou repeties consecutivas
curtas ou microssatlites (STR, do ingls, Short Tandem
Repeats).
As regies VNTRs, altamente polimrficas,
podem gerar ndices de paternidade elevados a partir da
anlise de um DNA ntegro e em grandes quantidades.
A princpio, a anlise de polimorfismos VNTRs pelo
uso de enzimas de restrio seguida da tcnica de
Southern Blot foi por muitos anos a metodologia
padro para estudos de vnculo gentico. Atualmente,
as investigaes genticas nas populaes pelos perfis
de locos STRs tm sido amplamente empregadas, as
quais permitem o uso de amostras contendo pequenas
quantidades de DNA e/ou degradadas; contudo, quando
analisados individualmente no apresentam um poder
de discriminao comparvel aos VNTRs e, por isso,
preciso uma anlise em conjunto de vrios locos STRs
para garantir resultados satisfatrios (GES, 2005).
Nos testes de paternidade por STRs, a informao
gentica obtida pelo resultado proveniente de quinze
locos, podendo ser realizada pelo uso de kits comerciais
disponveis; esse nmero pode ser aumentado para se
alcanar maior confiabilidade nos resultados e as anlises
so feitas a partir das frequncias allicas encontradas
para a populao estudada (FIGUEIREDO et al., 2004;
DOLINSKY; PEREIRA, 2007).
Os polimorfismos STRs so amplificados pela
tcnica Reao em Cadeia da Polimerase (PCR). Essa

tcnica consiste num processo de replicao, in vitro,

de uma sequncia de nucleotdeos especfica e presente
no DNA genmico extrado da amostra coletada,
como sangue, fio de cabelo com bulbo, swab bucal,
dentre outros. A partir do uso de um par de primers
(oligonucleotdeos) que delimita a regio alvo a se
amplificar, a enzima DNA Polimerase na presena de
MgCl2 adicionar nucleotdeos (chamados de dNTPs), e
assim como no processo in vivo, sero formadas novas
molculas de DNA. Esse mtodo permite que apenas
uma poro especfica do DNA genmico seja replicado
vrias vezes e, no caso das anlises por STRs, os locos a
serem amplificados contm os polimorfismos altamente
variveis entre os indivduos de uma populao. As
vrias pores dos STRs sero delimitadas pelos pares
de primers, que definiro os tamanhos dos DNAs alvos
a serem amplificados numa reao chamada de PCR
Multiplex, ou seja, mais de um par de primer ser
adicionado na reao para anlise simultnea dos quinze
locos.
A base da PCR consiste em variaes de
temperaturas e tempos previamente determinados para
que a amplificao ocorra. Numa temperatura de cerca
de 95C e alguns segundos o DNA desnaturado;
seguindo pela reduo da temperatura para cerca de
55-60C ocorrer o anelamento ou ligao dos primers
por complementaridade de base sua sequncia
especfica no DNA e por fim, subindo-se a temperatura
para aproximadamente 72C, ocorrer a extenso de
nucleotdeos pela Taq DNA Polimerase. Esse processo
repetido ciclicamente por vrias vezes (por exemplo, 35
ciclos) at a obteno de uma quantidade suficiente de
amostra que permita a anlise do resultado.
O perfil de amplificao de cada indivduo gerado
pela PCR obtido pela separao dos fragmentos por
tamanho a partir de uma eletroforese em sistemas de gis
cujo princpio se baseia na mobilidade das molculas

em um campo eltrico. Durante a eletroforese, a

amostra aplicada em pocinhos de um gel de corrida
(os mais comumente utilizados so feitos com agarose
ou poliacrilamida, imerso em uma soluo tampo) em
cuba de eletroforese e submetido a uma corrente eltrica.
Como o DNA carregado negativamente, aps um tempo
de corrida, ocorre migrao das molculas amplificadas
e de tamanhos diferentes para o plo positivo. Ao final
da eletroforese, o gel retirado da cuba e corado com
intercalantes de bases ao DNA, permitindo assim a sua
visualizao sob a forma de bandas (PEREZ-SWEENEY

et al. 2003).
No caso dos locos STRs, na PCR so utilizados
conjuntos de primers marcados com diferentes
fluorescncias, o que permite dinamizao do
processo de anlise, em que os fragmentos com
diferentes fluorescncias podem ser visualizados a
partir de eletroferogramas gerados por eletroforese em
sequenciador automatizado (PEREZ-SWEENEY et al.
2003) (Figura 1). Os tamanhos dos fragmentos obtidos
so comparados a padres de pesos moleculares dados
em pares de bases (pb).

Figura 1. Representao esquemtica da anlise de polimorfismos STRs. (a) Esquema de PCR-STR para
amplificao de um loco presente em cromossomos homlogos de um indivduo heterozigoto. O produto amplificado
do cromossomo que contm oito blocos de repeties (superior) maior (linha preta na eletroforese) do que o que
contm quatro blocos de repeties (inferior), utilizando o mesmo par de primers. (b) Eleferograma gerado aps
PCR-STR demonstrando trs perfis heterozigotos e um homozigoto para indivduos de uma populao. Eletroferograma: cortesia Laboratrio BioGenetics Tecnologia Molecular Ltda (Uberlndia/MG).
Os exames de paternidade pelo uso do DNA, ou
Exames de Vnculo Gentico, tornaram-se rotina nos
laboratrios devido certeza dada pelo resultado final
nos casos em que o exame exclui a suposta paternidade
e resultado acima de 99,999%, nos casos de incluso de
paternidade. A Gentica uma rea da Biologia que vem
sofrendo transformaes tecnolgicas e conceituais e os
assuntos relacionados Gentica Molecular esto cada
vez mais presentes na vida das pessoas. Na sociedade
moderna, os exames de paternidade so amplamente
divulgados pela mdia; mas por outro lado, embora
presente no cotidiano das pessoas, o processo de ensino
da Gentica esbarra em alguns entraves, como a falta

de material didtico adequado, a falta de atualizao

docente para o ensino e com a necessidade de criao de
cursos de aperfeioamento profissional.
Dessa forma, de fundamental importncia a
elaborao e divulgao de materiais didticos que
utilizem recursos variados, como o fazer ldico, tanto
para o ensino mdio como superior, para facilitarem
o acesso ao conhecimento. Este artigo objetiva a
proposio de um esquema didtico dinmico que poder
auxiliar na apreenso e fixao de conceitos clssicos e
atuais da Gentica Molecular no ensino da Biologia, por
meio da visualizao simblica de material Gentico,
dos polimorfismos de DNA, e simulao de um processo
de eletroforese.
8

2. Preparao do material didtico e estratgia

de ensino
2.1 Trabalhando as sequncias de cidos
nuclicos, os locos e os polimorfismos de DNA
A proposta de elaborao didtica e simulao do
exame de paternidade pelo DNA voltada para alunos do
3 ano do ensino mdio. Contudo, a proposta se estende
utilizao no ensino de Gentica para a graduao. A
construo de um cromossomo, seus locos contendo as
variantes de DNA ser realizada utilizando-se barbante

e miangas grandes e coloridas (Figura 2). Observa-se

nesta figura a elaborao simblica dos cromossomos de
nmero 1 materno e paterno (supostos pais 1 e 2), contendo
seriadamente variantes polimrficas de DNA, mostrando
homozigose para todos os locos e os cromossomos
do filho, mostrando os locos em heterozigose. Para a
construo do cromossomo, visualizao dos locos e
de suas variantes sugere-se a utilizao de miangas
vermelhas, verdes, amarelas e azuis.

Figura 2. Modelo cromossmico utilizando barbante e miangas grandes e coloridas para a representao de
seus locos contendo os polimorfismos de DNA.
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Previamente construo dos cromossomos, oito

conceitos fundamentais e vrias definies de termos
especficos da Gentica encontrados nos livros de ensino
mdio e/ou superior como ALBERTS e cols (2004);
AMABIS & MARTHO (1994); GRIFFITHS e cols
(2006); SNUSTAD & SIMMONS (2008); NUSSBAUM
e cols (2008), trabalhos, KASHYAP e cols (2004);
PARADELA & FIGUEIREDO (2006); devero ser
explicados e/ou relembrados, tais como:
1. Composio do DNA: o cido desoxirribonuclico (DNA) composto pelo acar desoxiribose,
grupo fosfato e pelas bases nitrogenadas adenina (A),
guanina (G), citosina (C) e timina (T), que formam os
nucleotdeos. As sequncias de nucleotdeos so ligadas
entre si formando uma cadeia simples. Contudo o DNA
formado pela ligao de duas cadeias antiparalelas de
nucleotdeos dispostas em forma helicoidal ligadas pelas
bases nitrogenadas, onde adenina se pareia com timina, e
citosina, com guanina.
2. Localizao do DNA: est presente em todas
as clulas nucleadas dos eucariotos e tambm no interior
das mitocndrias. No ncleo, apresenta-se arranjado na
forma de cromossomos.
3. Cromossomos: Contm as informaes
genticas do indivduo. Cada cromossomo consiste de
uma nica e enorme molcula de DNA compactada, com
exceo a poucos tipos celulares muito especializados
que no podem replicar ou no possuem DNA (por
exemplo, hemcias). Cada clula somtica humana
apresenta com 23 pares de cromossomos, sendo duas
cpias de cada tipo de cromossomo, uma herdada da
me e a outra do pai. Nas clulas somticas, 22 pares so
chamados autossomos e um par consiste de cromossomos
chamados sexuais, por atuarem na determinao do
sexo. Os autossomos materno e paterno de um par so
chamados cromossomos homlogos. Na mulher, o par
sexual formado por dois cromossomos X e, no homem,
esse par constitudo por um cromossomo X e outro Y.
Um cromossomo pode conter vrios genes diferentes
assim como possuir segmentos que no so genes.
4. Meiose: Corresponde ao processo de diviso
celular envolvendo o pareamento e separao de
cromossomos homlogos (meiose I) e de cromtides
irms (meiose II) que ocorre nas clulas germinativas. Em
humanos e outros animais, a meiose acontece nas gnadas
e seus produtos so os ovcitos e espermatozides. Assim,
o gameta masculino e feminino haplides, originado
das clulas diplides, possui cada um 23 cromossomos.
Na fertilizao, ocorre a unio das clulas germinativas
restabelecendo o conjunto diplide de cromossomos.
Assim, as caractersticas genticas de um indivduo so
provenientes do DNA materno e paterno.

5. Genoma: DNA do conjunto haplide de

cromossomos e da mitocndria de um organismo.
6. Mutao: Correspondem a alteraes numa
sequncia especfica de DNA, resultando em variantes
genticas com modificaes de bases no DNA.
7. Loco: Corresponde posio que determinado
segmento de DNA ocupa em um par de cromossomos
homlogos. Assim, um loco ser considerado polimrfico
se num conjunto de indivduos ocorrerem duas ou mais
variantes em um mesmo loco. Alm disso, quando o
segmento especfico de DNA no par de cromossomos
homlogos no so idnticos entre si, o gentipo do
indivduo denominado heterozigoto para aquele loco
especfico. J a presena de segmentos de DNA idnticos
nos mesmos locos, indica que o gentipo do indivduo
homozigoto para aquela sequncia que est sendo
analisada.
8. Polimorfismos: Referem presena de mais
de um alelo de um mesmo gene ou segmento de DNA
em uma populao, em que o seu alelo mais comum
tem frequncia igual ou inferior a 99% (CAVALLISFORZA et al., 1994). O conjunto de variantes de
DNA encontradas em um ou mais locos num indivduo
constitui seu gentipo. Os polimorfismos que variam
em comprimento de bases numa sequncia de DNA so
chamados de STRs e de VNTRs. Os polimorfismos de
STRs ou microssatlites apresentam-se com menos de
seis bases repetidas sequencialmente num determinado
cromossomo (ex.: repeties de trs nucleotdeos,
CAGCAGCAGCAGCAG...), enquanto os VNTRs ou
minissatlites apresentam repeties maiores que seis
bases e de forma altamente varivel entre os indivduos.
2.2 Trabalhando Tecnologias da Gentica
Molecular
Com a evoluo das tecnologias, equipamentos
cada vez mais sofisticados tm permitido que as
metodologias da Gentica Molecular sejam aplicadas
de forma a manipular genes e estudar os fenmenos
genticos da transmisso hereditria em grandes detalhes.
Assim, da mesma forma que o item anterior, previamente
simulao da anlise de polimorfismos a partir de uma
eletroforese, alguns conceitos devero ser introduzidos
para se entender a anlise de paternidade pelo DNA,
permitindo a compreenso do histrico de como o processo
foi evoluindo at chegar ao exame proposto atualmente.
Alguns desses conceitos foram apresentados e tambm
podem ser encontrados em vrios trabalhos (PENA,1997;
BRAGANA, 2007; KOCH; ANDRADE, 2008).
Como citado anteriormente, a primeira metodologia utilizada para anlise de DNA individual em exames
de paternidade conhecida como Southern Blot. Esta tc-

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nica utiliza, alm do DNA extrado do genoma de um indivduo, enzimas que fragmentam o DNA em vrias partes e
sistemas de captura (sondagem) a partir de uma sequncia
de DNA previamente marcada (sonda). Este sistema de
anlise feito para sondagem das regies VNTRs, por serem altamente variveis entre os indivduos, permitindo a
anlise da identidade gentica de cada pessoa.
Outra tcnica utilizada no exame de DNA a PCR.
Est tcnica foi concebida por Kary Mullis em meados da
dcada de 80 e desde ento revolucionou toda a Gentica.
A PCR uma tcnica que envolve a sntese enzimtica,
in vitro, de bilhes de cpias de um segmento especfico
de DNA de um indivduo em particular na presena da
enzima DNA polimerase.
Ao contrrio do Southern Blot, nos exames de paternidade pela PCR so analisadas as regies polimrficas do tipo STRs. O material gentico torna o indivduo
singular, permitindo identific-lo em meio a vrios outros, pois cada um possui seu prprio DNA. Esta anlise
, via de regra, feita a partir de migrao do DNA sobre
uma matriz slida, como um gel de poliacrilamida. Os
marcadores de peso molecular, fornecidos comercialmente aos laboratrios, so utilizados no gel como uma
escala de anlise dos tamanhos de segmentos de DNA
obtidos para cada indivduo, sendo que os fragmentos
maiores ficam em cima no gel enquanto os menores ficam embaixo, ou seja, migram mais rapidamente na malha da poliacrilamida.
Para simulao de uma eletroforese para separao
de DNAs variantes STRs amplificados por PCR seguida
da anlise de paternidade, sero utilizadas uma folha
de papel sulfite e uma rgua (Figura 3). Para essa
anlise, no intuito de simplificar o processo, no foram
consideradas as sequncias dos primers flanqueadores
dos polimorfismos, assim como foi considerada uma
PCR Monoplex (um par de primers utilizado para
amplificao de uma sequncia alvo).

Na folha de papel sulfite sero marcadas as bandas

geradas a partir das amplificaes dos locos polimrficos
presentes nos cromossomos construdos na Figura 2.
importante salientar que essa anlise apenas ilustrativa do
processo geral de eletroforese, e que, previamente a essa
tcnica, para anlise dos polimorfismos de STRs, o DNA
genmico amplificado por PCR Multiplex utilizando
pares de primers fluorescentes especficos para cada
segmento. Outro ponto importante a ser enfatizado que
os STRs de cada indivduo so atualmente visualizados
num sistema fechado de eletroforese capilar a partir de
produtos gerados contendo diferentes fluorescncias e o
resultado final dado pela anlise dos eletroferogramas
proveniente do produto amplificado esperado para cada
loco (Figura 1).
Para os quatro locos esquematizados na Figura 2,
cada mianga representar um bloco de repetio polimrfico de acordo com a Tabela 1. Supondo que o DNA
de cada um dos indivduos, aps ter sido extrado da clula, foi replicado in vitro, utilizando a PCR, o resultado da
eletroforese ser de acordo com a simulao proposta na
Figura 3. Nessa simulao de eletroforese, os quatro locos
em questo sero analisados separadamente e uma rgua
de 20 cm ser utilizada como escala de anlise das bandas,
colocada ao lado esquerdo de uma folha de papel sulfite.
A anlise dever comear de baixo para cima
e uma linha que representar as bandas de um gel de
poliacrilamida, ser marcada na posio esperada do
DNA amplificado de cada indivduo, tendo como base
seu gentipo e a migrao por eletroforese em gel
(Figura 3). A anlise realizada loco por loco e para
cada indivduo. Por exemplo, para o loco 1, a me, o
SP1, o SP2 e o filho apresentam os seguintes padres
de bandas, respectivamente: 6 (6X1) e 6 (6X1); 6 (6X1)
e 6 (6X1); 18 (6X3) e 18 (6X3); 6 (6X1) e 6 (6X1) cm.
Dessa forma, a anlise feita na folha pela marcao de
bandas (traos horizontais) loco por loco (Figura 3).

Tabela 1: Dados para simulao de uma eletroforese de locos polimrficos de DNA.

11

Tendo como base somente a anlise da eletroforese

organizada na Figura 3, analise qual o provvel pai
biolgico do filho (F), lembrando que: i) este herdar
um cromossomo 1 paterno e outro materno; ii)
diferente de seus genitores ser heterozigoto; iii) na
eletroforese apresentar um perfil de bandas esperado
de ambos os genitores. A anlise desta Figura sugere
ser o suposto pai 1, o provvel pai biolgico do filho
em questo. Alm de perguntas como a anteriormente
formulada, possvel discutir o motivo de a anlise
ter sido realizada de baixo para cima (fragmentos

menores migram mais rapidamente pelo gel) e, com

base na quantidade de repeties, possvel discutir
que o provvel tipo de repetio analisada a de STRs.
Ainda, questionrios podero ser elaborados abordando
os conceitos anteriormente descritos e aplicados antes e
aps a realizao dessa simulao a fim de se verificar
a compreenso e apreenso de conhecimentos pelos
alunos. Para complementar a aula, a simulao poder
ser realizada pedindo-se para que os alunos representem
o resultado da eletroforese do filho, caso o suposto pai
2 seja o seu pai biolgico.

Figura 3. Representao de uma eletroforese para anlise de polimorfismos de DNA e simulao de um exame
de paternidade.
Consideraes Finais
A montagem dos cromossomos e a simulao
do resultado da eletroforese apresentados nas Figuras
2 e 3, respectivamente, de acordo com o tempo de aula
disponvel, podero ser trabalhadas utilizando ambos os
pais heterozigotos. O mesmo tambm poder ser feito
para a representao de mais locos ou utilizando-se
somente a anlise de um gel. A partir dessa abordagem
da gentica molecular, conceitos de citogentica
podero ser trabalhados, tais como nmero e tamanho
de cromossomos para as construes de caritipo,
assim como a variao em termos de quantidade de
cromossomos nas diferentes espcies.
Bibliografia Recomendada
AMABIS, J. M.; MARTHO, G. R. Biologia das clulas. So Paulo:
Moderna, 1994.

BRAGANA, W. O. A freqncia de regies de minissatlites em

uma populao brasileira e sua utilidade para a identificao
humana. 2007. Tese (Doutorado) faculdade de Cincias Mdicas.
Universidade Estadual de Campinas. Campinas, 2007.
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GES, A. C. S. Anlise de regies polimrficas do DNA com o objetivo

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de estabelecer vnculos genticos, identificar restos mortais ou

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realizar percias criminais. Revista do Biomdico. n. 65, p. 22-23,

2006. Disponvel em: <http://www.dnaforense.com.br> Acesso em:

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