Universidade Federal de Sergipe Centro de Cincias Biolgicas e da Sade Departamento de Morfologia Curso de Farmcia

Tcnicas Histolgicas

Trabalho apresentado disciplina de Histologia, curso de Farmcia, 2009/1, na Universidade Federal de Sergipe, UFS.

Por: Antonio Marques Filho

So Cristvo

2009
SUMRIO

INTRODUO..............................................................................................................02 MICROSCOPIA.............................................................................................................03 Microscopia ptica.........................................................................................03 Microscopia Eltrica.......................................................................................05 TCNICAS HISTOLGICAS.......................................................................................08 Confeco de lminas histolgicas.................................................................08 Coleta do material...........................................................................................08 Fixao...........................................................................................................08 Incluso..........................................................................................................09 Microtomia....................................................................................................09 Montagem das lminas histolgicas..............................................................10 Tcnica de Criomicrotomia (= microtomia por congelamento).....................................10 Tcnicas de Colorao de Cortes Histolgicos..............................................................10 Tcnicas Utilizadas para Confeco de Lminas sseas...............................................13 Tcnicas histoqumicas...................................................................................................14 Tcnica da contrastao (microscopia eletrnica)..........................................................14 Tcnica de imuno-histoqumica......................................................................................15 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS...........................................................................16

INTRODUO

A Histologia o estudo da estrutura do material biolgico e das maneiras como os seus componentes se inter-relacionam, tanto estrutural quanto funcionalmente. O estudo da histologia se iniciou com o desenvolvimento de microscpios simples e de tcnicas para preparo de material biolgico, tornando-o adequado para exame. Os primeiros histologistas descobriram muito sobre a estrutura do material biolgico, estabelecendo a teoria celular da estrutura dos organismos vivos, onde a clula a unidade bsica da arquitetura da maioria dos materiais biolgicos. A histologia nasceu com os primeiros estudiosos que se utilizaram do microscpio: Robert. Hook, Malpighi, Graw, Ham, Fontana e outros, muito antes que Meyer (1819) desse esse nome cincia que descreve os tecidos animais e vegetais. A noo de "tecido" foi, contudo, introduzida por Xavier Bichat sem que este anatomista se tivesse utilizado do microscpio. A anatomia estuda os tecidos, isto , as agregaes de clulas que tm a mesma forma e a mesma funo. Uma particular especializao da histologia a citologia, considerada a cincia das clulas. Estuda ela a clula em si, a qual constitui, em definitivo, a base das cincias biolgicas, porque a clula o elemento fundamental de todos os seres vivos. Citologia e histologia no estudam somente a estrutura da clula e dos tecidos, mas tambm as relaes entre a estrutura e a funo, e, portanto, se integram com a fisiologia, com a fsica e com a qumica.

MICROSCOPIA
As tcnicas e os mtodos empregues no estudo da clula tm evoludo e diversificado desde a inveno do microscpio, no sc. XVII, por Antoine Leeuwenhoek e Robert Hook, antes mesmo, alis, de ter sido estabelecido o conceito de clula. Foi, com efeito, atravs da explorao das potencialidades deste recm inventado aparelho ptico que diversos naturalistas convergiram para a concepo de que todos os seres vivos, plantas e animais, so constitudos por unidades morfolgicas e funcionais, que designaram por clulas. O estudo de preparaes citolgicas ou histolgicas exige sistemas de observao adequados, que permitem observar as estruturas. Para essa finalidade o aparelho mais comumente usado o microscpio ptico que utiliza a luz transmitida. J o microscpio eletrnico, que utiliza eltrons ao invs de feixes luminosos, o aparelho mais para estudos de ultra-estrutura. Os mtodos de ensino em Biologia Celular e dos Tecidos baseiam-se principalmente no estudo das estruturas e processos celulares sob as microscopias de luz (ML) e eletrnica (ME), permitindo o reconhecimento da clula como um componente dinmico e participante do metabolismo corporal. Basicamente, estes estudos utilizam como ferramentas, lminas com coloraes histolgicas e histoqumicas, para o estudo microscopia de luz e telas de cobre contrastadas por metais pesados, para o estudo microscopia eltrica (de transmisso, de varredura, etc.). Para se usar o microscpio com eficincia preciso que ele seja manipulado de modo a reder o mximo de sua capacidade resolutiva, isto que produza a imagem mais ntida possvel. Microscopia ptica

microscopia ptica, mais propriamente designada por microscopia fotnica, seguiu-se a inveno de outras microscopias, nomeadamente da microscopia eletrnica, e de tcnicas complementares, como a Histologia, que permitiram prosseguir e aprofundar o estudo da arquitetura estrutural da clula quase at ao nvel macromolecular. O microscpio fotnico comum, tambm designado por microscpio de cmara clara, um sistema ptico capaz de fornecer, de um objeto, uma imagem ampliada, permitindo a observao de detalhes invisveis a olho nu. constitudo basicamente por dois conjuntos de lentes: o conjunto objetiva e o conjunto ocular. A objetiva d do objeto AB uma imagem real A'B', ampliada e invertida.

A ampliao da objetiva, Aob, dada pela frmula: Aob = AB/AB A ampliao uma das caractersticas pticas essenciais da objetiva. A ocular, por sua vez, fornece de AB uma imagem virtual AB muito afastada, mas que, atravs do cristalino, se projeta na retina do globo ocular. A ampliao da ocular funo da distncia focal (foc) em milmetros: Aoc = 250/foc Entre outras, destacam-se, nos microscpios, trs caractersticas principais: a ampliao, a abertura numrica e o poder de resoluo. Simultaneamente, foram surgindo outras tcnicas analticas, umas que fracionam a clula permitindo isolar por centrifugao alguns dos seus componentes; outras que descem ao nvel molecular e perscrutam a composio e o funcionamento da maquinaria qumica subjacente vida.

Microscpio fotnico e esquema ptico de formao de imagem

Microscopia Eltrica

O desenvolvimento concomitante da microscopia eletrnica e da melhoria nas tcnicas de preparao dos tecidos ampliaram consideravelmente o campo de estudo da histologia, pois o microscpio eletrnico aproximadamente 1000 vezes mais poderoso que o microscpio ptico. Existem vrios tipos de microscpios eletrnicos. Nos reteremos a descrio do microscpio eletrnico de transmisso (MET) e do microscpio eletrnico de varredura (MEV). A diferena bsica entre as duas modalidades de microscopia, consiste no fato de na primeira, a imagem ser produzida por ftons e na segunda, por eltrons. Da decorrem necessariamente, conseqncias, quer a nvel de concepo fsica dos aparelhos, quer a nvel da preparao do material, quer a nvel da natureza da imagem e ou ainda da performance da tcnica. o Microscpio Eletrnico de Transmisso (MET) O alto poder de resoluo do microscpio eletrnico de transmisso, juntamente com o grande aumento, permitem a obteno de imagens com uma grande riqueza de detalhes. As imagens no microscpio eletrnico de transmisso so formadas pela excitao de uma tela fluorescente ou um filme fotogrfico por eltrons. Esses eltrons so produzidos graas ao aquecimento de um filamento no vcuo. Essas partculas so aceleradas devido a uma diferena de potencial de 60 a 100 Kv existentes entre o ctodo e o nodo. Esse feixe defletido por lentes eletromagnticas, de maneira parecida ao que acontece com a luz no microscpio ptico. O condensador focaliza o feixe de eltrons no plano do objeto, e a objetiva forma sua imagem. Esta imagem ainda ampliada por uma ou duas lentes que a projetam numa tela fluorescente ou filme fotogrfico. A espessura dos cortes precisa estar entre 20 a 100 nm. Para isso, desenvolveram-se mtodos especiais de microtomia, que consistem em fixar os tecidos em aldedo glutrico e tetrxido de smio, desidratar e incluir em resinas duras a base de Epxi, como, por exemplo, as resinas Epon e Araldite. Os cortes so feitos em ultramicrtomos, nos quais so usados navalhas de vidro ou diamante.

Trajeto dos eltrons (em amarelo) no microscpio eletrnico de transmisso Ento, simplificadamente, o funcionamento do microscpio eletrnico de transmisso se baseia na propriedade que as estruturas tm de desviar ou deixar passar por si os eltrons. As estruturas que desviam os eltrons so chamadas de eltrons densas e aparecem escuras na imagem, j que os eltrons no chegam at a tela fluorescente. J as estruturas que so atravessadas pelos eltrons (eltron lcidas) aparecem claras na imagem, pois os eltrons que incidiram sobre a estrutura conseguem excitar a tela fluorescente ou o filme fotogrfico que fica abaixo do corte. o Microscpio Eletrnico de Varredura (MEV) No microscpio eletrnico de varredura a imagem formada por eltrons refletidos sobre o objeto. Entre a lente eletromagntica e o objeto, interposta uma bobina de varredura que provoca um desvio do feixe de eltrons, de tal modo que o mesmo vai incidir sobre o objeto ponto a ponto, numa seqncia determinada. O objeto no se deixa atravessar pelo feixe devido sua espessura e a uma pelcula feita por um jato de material refletor, como ouro, por exemplo. Desse modo, o feixe de eltrons que incide sobre o objeto (chamado feixe primrio) sofre reflexes originando eltrons secundrios, que so captados por detectores especiais, que geram um sinal eltrico transferido para um monitor de vdeo, formando uma imagem tridimensional da superfcie da estrutura.

Trajeto dos eltrons no microscpio eletrnico de varrimento

Microscpio eletrnico de varrimento

TCNICAS HISTOLGICAS
A correta observao do material biolgico, em microscopia ptica, implica uma srie de procedimentos tcnicos prvios, que a seguir se descrevem sumariamente. Estes procedimentos, designam-se genericamente por tcnicas histolgicas. A tcnica histolgica visa preparao dos tecidos destinados ao estudado microscopia de luz. O exame ao microscpio feito geralmente por luz transmitida, o que significa que a luz deve atravessar o objeto a ser examinado. Assim, necessria a obteno de fragmentos dos tecidos que sero coletados em lminas muito finas e transparentes. Muitas so as tcnicas utilizadas em histologia. Algumas tcnicas freqentemente so utilizadas em rotinas de laboratrios que proporcionam a visualizao das microestruturas dos tecidos. o Confeco de Lminas Histolgicas Para a anlise sob microscopia ptica necessria a confeco de lminas delgadas dos tecidos que formam os rgos. Estas lminas podem ser permanentes ou provisrias. o Coleta do Material Partes de rgos so retiradas com o auxlio de um bisturi, pina ou lmina de barbear. No indicada a extrao de pores grandes, uma vez que o objetivo final a obteno de uma camada fina que possa ser analisada em um microscpio ptico. o Fixao do material Esta etapa consiste na utilizao de procedimentos fsicos ou qumicos para imobilizar as substncias constituintes das clulas e dos tecidos, fornecendo maior resistncia para suportar as demais etapas. Alm disso, os fixadores retardam os efeitos pos-mortem do tecido, mantendo sua arquitetura normal. Os agentes fixadores mais utilizados so o formol tamponado e o lquido de Bouin. Ambos fixam as protenas evitando sua degradao. O formol, por ser mais acessvel e de uso simples, o fixador mais utilizado nas tcnicas histolgicas. Contudo, seus resultados geralmente no so satisfatrios. Por essa razo recomendada a dissoluo de formol em tampo fosfatado (Junqueira e Junqueira, 1983). O tempo de fixao depender do tamanho do fragmento do tecido, podendo variar entre 06 e 24h. recomendado que, sempre que possvel, no ultrapasse a 3 mm de espessura.

o Incluso Este procedimento consiste na impregnao do tecido com uma substncia de consistncia firme que permita, posteriormente, seccion-lo em camadas delgadas. Pelo fcil manuseio e bons resultados, a parafina a mais utilizada neste procedimento. Como ela no miscvel em gua, a primeira etapa da incluso compreende a desidratao, quando ocorre a retirada da gua dos tecidos e a sua substituio por lcool. A diafanizao a etapa seguinte, com a substituio do lcool, agora presente nos tecidos, por xilol. Finalmente, na impregnao, ltima etapa, o xilol substitudo por parafina fundida a 60 em pequenos blocos. Neste momento a catalogao do bloco importante para a posterior identificao da pea. o Microtomia Esta etapa consiste, basicamente, em utilizar um micrtomo para obter cortes sucessivos, delgados e uniformes, a partir dos blocos de parafina com as peas includas. Este aparelho formado por uma lmina (fixa ou descartvel) de ao, afiada, e um brao ao qual se prende o bloco e que se desloca verticalmente.

Micrtomo (tipo rotativo) e operao de corte

difcil obter cortes abaixo de 3 a 4 micrmetros de espessura dos materiais includos em parafina. De um modo geral, so obtidos cortes entre 5 e 7 micrmetros.

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o Montagem das lminas histolgicas As fitas obtidas a partir do micrtomo so transferidas para um banho-maria, com o auxlio de uma pina, para serem distendidas (Fig. 1 B). A gua deve estar entre 3 e 8 abaixo do ponto de fuso da parafina utilizada. Nesta etapa, so retiradas as dobras e evitadas as bolhas abaixo da fita. Aps a distenso, os cortes so separados individualmente ou em grupos, conforme a convenincia, utilizando se lminas de vidro previamente limpas com detergente, estocadas em lcool 80% e previamente secas. Antes da utilizao das lminas, necessrio revestir suas superfcies com uma fina camada de albumina para facilitar a adeso da pea. Os cortes obtidos podem ser transferidos, inicialmente, para uma estufa onde ficam alguns minutos (no mais que dez minutos) para posteriormente serem colocados em um suporte inclinado. Finalmente, os cortes devem ser depositados em uma estufa a 60 para secagem entre uma e 24 horas. Tcnica de Criomicrotomia (= Microtomia por Congelamento)

A tcnica descrita acima, sem dvida, a mais utilizada. Contudo, em alguns casos, esta tcnica contra-indicada, como, por exemplo, no estudo da distribuio dos lipdios, em tcnicas histoqumicas avanadas ou quando so necessrios cortes urgentes, como em exames patolgicos. Nestes casos, os tecidos so endurecidos atravs do congelamento. Os aparelhos utilizados para os cortes podem ser de dois tipos: micrtomos de congelamento ou criostatos (Junqueira e Junqueira, 1983). O criostato um aparelho mais aperfeioado que o anterior. Permite a obteno de cortes muito mais finos de tecidos no fixados (at dois micrmetros), facilitando a visualizao das clulas (Junqueira e Junqueira, 1983). Tcnicas de Colorao de Cortes Histolgicos

A colorao consiste numa etapa muito importante para a visualizao das estruturas do tecido. Normalmente so utilizados corantes hidrossolveis, sendo necessrio, deste modo, a remoo da parafina da pea que foi preparada nas etapas descritas anteriormente e que permanece na lmina de vidro. Existem muitos tipos de corantes, mas de um modo geral podem ser agrupados em trs classes distintas (Gartner e Hiatt, 1999): o Corantes que diferenciam os componentes cidos e bsicos das clulas; o Corantes especializados que diferenciam os componentes fibrosos da matriz extracelular; o Sais metlicos que precipitam nos tecidos. 11

Os corantes mais utilizados nos procedimentos histolgicos so a Hematoxilina e a Eosina (HE). A Hematoxilina uma base que cora, preferencialmente, componentes cidos das clulas em um tom azulado escuro. Como os componentes cidos mais abundantes so o DNA e o RNA, tanto o ncleo, quanto certas partes do citoplasma, se tornam azulados. Esses componentes so chamados de basfilos. A Eosina, ao contrrio, um cido que cora as estruturas bsicas da clula de rosa. Estas estruturas so abundantes no citoplasma e so chamadas de acidfilas (Gartner e Hiatt, 1999). Outros corantes so tambm utilizados em procedimentos de rotina em laboratrios, tais como (Gartner e Hiatt, 1999): o Tricrmico de Masson - cora o ncleo de azul escuro, o citoplasma, a queratina e o msculo de vermelho e o mucignio e o colgeno de azul claro; o Orcena - cora as fibras elsticas de marrom; o Weigert - cora as fibras elsticas de azul; o Prata - cora as fibras reticulares de preto; o Hematoxilina frrica - cora as estriaes dos msculos, os ncleos e os eritrcitos de preto; o cido peridico reativo de Schiff cora as molculas ricas em glicognio e carboidrato de magenta; o Wright e Giemsa - especializado em clulas sangneas, cora de rosa os eritrcitos e os grnulos eosinfilos, de prpura o ncleo dos leuccitos e grnulos basfilos e de azul o citoplasma dos moncitos e dos linfcitos. Para corar peas includas em parafina necessria a retirada da parafina e a hidratao da pea. Este procedimento realizado a partir de uma seqncia de banhos em xilol, lcool e gua, inversamente ao procedimento executado na etapa de incluso. Aps a hidratao, os cortes so corados de acordo com o procedimento mais apropriado para a anlise que ser realizada posteriormente. Aqui sero abordadas as etapas do mtodo da hematoxilina-eosina, por ser o mais utilizado e por ter um resultado final satisfatrio.

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o Tcnica da hematoxilina-eosina (HE) a) Material necessrio para a soluo de Hematoxilina de Harris (Junqueira e Junqueira, 1983): - Hematoxilina ______________________ 2,5g - lcool 100% _____________________ 25ml - Almen de amnio ou potssio ______ 50g - gua destilada ___________________ 500ml - xido vermelho de mercrio _______ 1,25g - cido actico _____________________ 20ml Inicialmente, a Hematoxilina deve ser dissolvida no lcool e o almen na gua destilada (previamente aquecida). Posteriormente, as duas solues devem ser misturadas e aquecidas at a fervura. O xido de mercrio adicionado soluo que deve ser resfriada, mergulhando-se o frasco em gua fria. O cido actico ento colocado na soluo fria para finalmente ser filtrada. O prazo de envelhecimento desta soluo entre dois e trs meses. A partir desta data o corante perde suas propriedades e no reage adequadamente com o tecido. b) Material necessrio para a Eosina (Junqueira e Junqueira, 1983): - Eosina solvel em gua _______________ 1g - gua destilada ___________________ 100ml c) Procedimentos para a colorao: Embora as etapas possam ser definidas, o tempo em cada fase depende da qualidade e da idade das solues dos corantes. Deste modo, poder ser observada nas etapas abaixo uma variao muito grande em relao ao tempo que pode ser ajustado durante o procedimento no laboratrio. De acordo com Junqueira e Junqueira (1983), as etapas so: 1) desparafinar e hidratar os cortes; 2) corar em hematoxilina entre 5 e 15min; 3) lavar em gua corrente por 10min; 4) corar em eosina entre 1 e 10min; 5) lavar em gua e desidratar em lcool 70% rapidamente; 6) diafanizar e montar em resina.

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d) Montagem Final da Lmina: Este processo consiste em depositar uma gota de resina lquida sobre o corte que est aderido lmina de vidro e cobri-lo com uma lamnula. Nesta etapa deve-se evitar as bolhas de ar que se formam na resina durante a colocao da lamnula. Finalmente a lmina catalogada. A resina depois de seca garantir uma lmina permanente que poder durar anos. Tcnicas Utilizadas para Confeco de Lminas sseas

Para a confeco de lminas sseas so utilizadas duas tcnicas: a primeira consiste no desgaste do osso atravs do polimento com lixa. o Confeco de lminas sseas por desgaste Inicialmente, retirado um fragmento do osso a ser analisado. Esse fragmento colado com blsamo do Canad sobre uma superfcie de madeira plana. Em um bloco de madeira colada uma lixa de granulometria grossa para o primeiro polimento. O polimento final feito com uma lixa mais fina, com movimentos firmes e no mesmo sentido, at que se tenha obtido uma camada de osso delgada. O osso retirado da madeira com xilol e aderido superfcie da lmina de vidro. Sobre ele colocada uma lamnula e fixada com resina (Amaral et al. 1994; Timm, 1996 a, b). o Confeco de lminas sseas por descalcificao A segunda tcnica implica na descalcificao do osso. Este procedimento tem por objetivo retirar o fosfato de clcio do tecido sseo para que possa ser seccionado posteriormente. A descalcificao pode ser feita atravs da imerso em cidos ou compostos quelantes. Os quelantes capturam os ons metlicos (entre os quais o clcio), removendoos dos tecidos com um mnimo de alterao. Embora de ao mais lenta, agridem menos o tecido, e so mais utilizados nos procedimentos histolgicos. Aps a fixao, o material lavado para retirar o excesso de fixador e transferido para um descalcificador. No recomendado utilizar fragmentos maiores do que 3 mm de dimetro. Devem-se usar, no mnimo, 40 vezes o volume do tecido, agitando o frasco vrias vezes ao dia e trocando o descalcificador a cada 2 ou 3 dias. Os tecidos descalcificados no devem ser transferidos diretamente ao lcool 70%, e sim, lavados em gua corrente por algumas horas. Para a confeco das lminas histolgicas de ossos descalcificados seguemse as etapas rotineiras citadas anteriormente. 14

Tcnicas Histoqumicas

A histoqumica uma tcnica histolgica que tem por objetivo a identificao da natureza qumica de constituintes celulares. Consiste na colorao especfica desses constituintes, recorrendo basicamente a substncias que, reagindo com os componentes celulares, do origem a produtos corados. Esta tcnica contrasta com a colorao histolgica comum, acima referida, na medida em que esta ltima se baseia na absoro, pelas estruturas, de substncias coradas (os corantes), enquanto que na histoqumica, as cores so propriedades de produtos que se formam in sito. Um dos exemplos clssicos o mtodo de Feulgen que se destina a identificar o DNA. O princpio da reao baseia-se no fato de que o DNA, aps hidrlise cida moderada, quando tratado pelo reagente de Schiff , dar lugar formao de um produto que se cora em vermelho arroxeado. So processos de colorao que conferem especificidade, pois expem os grupamentos e radicais qumicos que compem as estruturas, para que os mesmos sejam especificamente evidenciados pelos corantes histoqumicos. Ex: carboidratos, cidos nuclicos, aminocidos, ons, lipdeos, etc. - Localizao de cidos nuclicos: mtodo de Feulgen. - Localizao de carboidratos: tcnica do PAS (Periodic Acid-Schiff).

Tcnica da Contrastao (Microscopia Eletrnica)

A microscopia eletrnica expe estruturas que ao selecionar a passagem de eltrons pelas mesmas, tornam-se eltron-densas ou eltron-lcidas. So duas as substncias contrastantes mais usualmente aplicadas para a microscopia eletrnica: o acetato de uranila e o citrato de chumbo.

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Tcnica de Imuno-Histoqumica (IHC)

As tcnicas de imuno-histoqumica (IHQ) detectam molculas (antgenos) teciduais, sendo de grande valor nos diagnsticos antomo-patolgicos e na investigao cientfica. O mecanismo bsico o reconhecimento do antgeno por um anticorpo (Ac primrio) associado a diversos tipos de processos de visualizao. Atualmente h disponibilidade de grande nmero de anticorpos para uso em tecidos fixados em formol e includos em blocos parafina, permitindo o estudo de blocos arquivados por longos perodos. A tcnica de IHQ mais usada a indireta, associada ao complexo avidinabiotina-enzima. O complexo formado pela ligao de uma molcula de (strept) avidina com vrias de biotina associadas a uma enzima (peroxidase ou fosfatase alcalina), que tem como funo a converso de um cromgeno incolor em um produto final que pode conferir diversas cores aos antgenos teciduais marcados. As cores mais comuns so a castanha (peroxidase+ diaminobenzidina-DAB) e a vermelha (fosfatase alcalina + fast red). o Indicaes: Em diversos casos necessrio utilizar o exame imuno-histoqumico, procedimento sensvel de deteco molecular que pode auxiliar no diagnstico de doenas inflamatrias, infecciosas e neoplasias, ou ainda fornecer dados mais precisos e individualizados sobre o melhor tratamento e provvel evoluo do cncer. A imuno-histoqumica pode auxiliar em diversas situaes, tais como: - Diagnstico de tumores indiferenciados; - Diagnstico diferencial entre tumores e estados reacionais; - Diagnstico de diversas doenas infecciosas; - Determinao de fatores preditivos de neoplasias; - Determinao de fatores prognsticos de neoplasias; - Determinao / sugesto de stio primrio de adenocarcinoma; - Determinao de tipo / subtipo de linfomas e leucemias.

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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Histologia bsica. 8 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1995. JUNQUEIRA, Luis Carlos U.; JUNQUEIRA, Luiza Maria M. S. Tcnicas bsicas de citologia e histologia. So Paulo: Santos, 1983. STEVENS, Alan; LOWE, James. Histologia. So Paulo: Manole, 1995. BECAK, Willy. JORGE PAULETE. Tcnicas de citologia e histologia. Rio de Janeiro: Livros Tcnicos e Cientficos, 1976.

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