ISSN 1980-3540

05.02, 07-13 (2010) www.sbg.org.br

EXAMES DE PATERNIDADE PELO DNA: UMA METODOLOGIA PARA ENSINO DA GENTICA MOLECULAR
Autores: Cristian Kely Pereira Campos1, Mariana Natalice de Siqueira1, Joo Paulo Borges1, Layana Araujo Rodrigues1, Jader Soares de Oliveira2, Marcelo de Alcntara Rosa2, Adriana Freitas Neves1
1. Universidade Federal de Gois, Departamento de Cincias Biolgicas. 2. Ncleo Educativo, Colgio Nacional Autora correspondente: Profa. Dra. Adriana Freitas Neves; Av. Dr. Lamartine Pinto de Avelar, 1120 Setor Universitrio CEP: 75704-020, Catalo Gois, email: neves.af@gmail.com

Palavras-chave: eletroforese, exames de DNA, gentica molecular 1. Introduo No genoma humano existem determinadas regies polimrficas que so utilizadas nos exames de paternidade e outros vnculos genticos. Estas regies podem constituir repeties consecutivas de nmero varivel ou minissatlites (VNTR, do ingls, Variable Number of Tandem Repeats) ou repeties consecutivas curtas ou microssatlites (STR, do ingls, Short Tandem Repeats). As regies VNTRs, altamente polimrficas, podem gerar ndices de paternidade elevados a partir da anlise de um DNA ntegro e em grandes quantidades. A princpio, a anlise de polimorfismos VNTRs pelo uso de enzimas de restrio seguida da tcnica de Southern Blot foi por muitos anos a metodologia padro para estudos de vnculo gentico. Atualmente, as investigaes genticas nas populaes pelos perfis de locos STRs tm sido amplamente empregadas, as quais permitem o uso de amostras contendo pequenas quantidades de DNA e/ou degradadas; contudo, quando analisados individualmente no apresentam um poder de discriminao comparvel aos VNTRs e, por isso, preciso uma anlise em conjunto de vrios locos STRs para garantir resultados satisfatrios (GES, 2005). Nos testes de paternidade por STRs, a informao gentica obtida pelo resultado proveniente de quinze locos, podendo ser realizada pelo uso de kits comerciais disponveis; esse nmero pode ser aumentado para se alcanar maior confiabilidade nos resultados e as anlises so feitas a partir das frequncias allicas encontradas para a populao estudada (FIGUEIREDO et al., 2004; DOLINSKY; PEREIRA, 2007). Os polimorfismos STRs so amplificados pela tcnica Reao em Cadeia da Polimerase (PCR). Essa

tcnica consiste num processo de replicao, in vitro, de uma sequncia de nucleotdeos especfica e presente no DNA genmico extrado da amostra coletada, como sangue, fio de cabelo com bulbo, swab bucal, dentre outros. A partir do uso de um par de primers (oligonucleotdeos) que delimita a regio alvo a se amplificar, a enzima DNA Polimerase na presena de MgCl2 adicionar nucleotdeos (chamados de dNTPs), e assim como no processo in vivo, sero formadas novas molculas de DNA. Esse mtodo permite que apenas uma poro especfica do DNA genmico seja replicado vrias vezes e, no caso das anlises por STRs, os locos a serem amplificados contm os polimorfismos altamente variveis entre os indivduos de uma populao. As vrias pores dos STRs sero delimitadas pelos pares de primers, que definiro os tamanhos dos DNAs alvos a serem amplificados numa reao chamada de PCR Multiplex, ou seja, mais de um par de primer ser adicionado na reao para anlise simultnea dos quinze locos. A base da PCR consiste em variaes de temperaturas e tempos previamente determinados para que a amplificao ocorra. Numa temperatura de cerca de 95C e alguns segundos o DNA desnaturado; seguindo pela reduo da temperatura para cerca de 55-60C ocorrer o anelamento ou ligao dos primers por complementaridade de base sua sequncia especfica no DNA e por fim, subindo-se a temperatura para aproximadamente 72C, ocorrer a extenso de nucleotdeos pela Taq DNA Polimerase. Esse processo repetido ciclicamente por vrias vezes (por exemplo, 35 ciclos) at a obteno de uma quantidade suficiente de amostra que permita a anlise do resultado. O perfil de amplificao de cada indivduo gerado pela PCR obtido pela separao dos fragmentos por tamanho a partir de uma eletroforese em sistemas de gis cujo princpio se baseia na mobilidade das molculas

em um campo eltrico. Durante a eletroforese, a amostra aplicada em pocinhos de um gel de corrida (os mais comumente utilizados so feitos com agarose ou poliacrilamida, imerso em uma soluo tampo) em cuba de eletroforese e submetido a uma corrente eltrica. Como o DNA carregado negativamente, aps um tempo de corrida, ocorre migrao das molculas amplificadas e de tamanhos diferentes para o plo positivo. Ao final da eletroforese, o gel retirado da cuba e corado com intercalantes de bases ao DNA, permitindo assim a sua visualizao sob a forma de bandas (PEREZ-SWEENEY

et al. 2003). No caso dos locos STRs, na PCR so utilizados conjuntos de primers marcados com diferentes fluorescncias, o que permite dinamizao do processo de anlise, em que os fragmentos com diferentes fluorescncias podem ser visualizados a partir de eletroferogramas gerados por eletroforese em sequenciador automatizado (PEREZ-SWEENEY et al. 2003) (Figura 1). Os tamanhos dos fragmentos obtidos so comparados a padres de pesos moleculares dados em pares de bases (pb).

Figura 1. Representao esquemtica da anlise de polimorfismos STRs. (a) Esquema de PCR-STR para amplificao de um loco presente em cromossomos homlogos de um indivduo heterozigoto. O produto amplificado do cromossomo que contm oito blocos de repeties (superior) maior (linha preta na eletroforese) do que o que contm quatro blocos de repeties (inferior), utilizando o mesmo par de primers. (b) Eleferograma gerado aps PCR-STR demonstrando trs perfis heterozigotos e um homozigoto para indivduos de uma populao. Eletroferograma: cortesia Laboratrio BioGenetics Tecnologia Molecular Ltda (Uberlndia/MG). Os exames de paternidade pelo uso do DNA, ou Exames de Vnculo Gentico, tornaram-se rotina nos laboratrios devido certeza dada pelo resultado final nos casos em que o exame exclui a suposta paternidade e resultado acima de 99,999%, nos casos de incluso de paternidade. A Gentica uma rea da Biologia que vem sofrendo transformaes tecnolgicas e conceituais e os assuntos relacionados Gentica Molecular esto cada vez mais presentes na vida das pessoas. Na sociedade moderna, os exames de paternidade so amplamente divulgados pela mdia; mas por outro lado, embora presente no cotidiano das pessoas, o processo de ensino da Gentica esbarra em alguns entraves, como a falta de material didtico adequado, a falta de atualizao docente para o ensino e com a necessidade de criao de cursos de aperfeioamento profissional. Dessa forma, de fundamental importncia a elaborao e divulgao de materiais didticos que utilizem recursos variados, como o fazer ldico, tanto para o ensino mdio como superior, para facilitarem o acesso ao conhecimento. Este artigo objetiva a proposio de um esquema didtico dinmico que poder auxiliar na apreenso e fixao de conceitos clssicos e atuais da Gentica Molecular no ensino da Biologia, por meio da visualizao simblica de material Gentico, dos polimorfismos de DNA, e simulao de um processo de eletroforese.
8

2. Preparao do material didtico e estratgia de ensino 2.1 Trabalhando as sequncias de cidos nuclicos, os locos e os polimorfismos de DNA A proposta de elaborao didtica e simulao do exame de paternidade pelo DNA voltada para alunos do 3 ano do ensino mdio. Contudo, a proposta se estende utilizao no ensino de Gentica para a graduao. A construo de um cromossomo, seus locos contendo as variantes de DNA ser realizada utilizando-se barbante

e miangas grandes e coloridas (Figura 2). Observa-se nesta figura a elaborao simblica dos cromossomos de nmero 1 materno e paterno (supostos pais 1 e 2), contendo seriadamente variantes polimrficas de DNA, mostrando homozigose para todos os locos e os cromossomos do filho, mostrando os locos em heterozigose. Para a construo do cromossomo, visualizao dos locos e de suas variantes sugere-se a utilizao de miangas vermelhas, verdes, amarelas e azuis.

Figura 2. Modelo cromossmico utilizando barbante e miangas grandes e coloridas para a representao de seus locos contendo os polimorfismos de DNA.
9

Previamente construo dos cromossomos, oito conceitos fundamentais e vrias definies de termos especficos da Gentica encontrados nos livros de ensino mdio e/ou superior como ALBERTS e cols (2004); AMABIS & MARTHO (1994); GRIFFITHS e cols (2006); SNUSTAD & SIMMONS (2008); NUSSBAUM e cols (2008), trabalhos, KASHYAP e cols (2004); PARADELA & FIGUEIREDO (2006); devero ser explicados e/ou relembrados, tais como: 1. Composio do DNA: o cido desoxirribonuclico (DNA) composto pelo acar desoxiribose, grupo fosfato e pelas bases nitrogenadas adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T), que formam os nucleotdeos. As sequncias de nucleotdeos so ligadas entre si formando uma cadeia simples. Contudo o DNA formado pela ligao de duas cadeias antiparalelas de nucleotdeos dispostas em forma helicoidal ligadas pelas bases nitrogenadas, onde adenina se pareia com timina, e citosina, com guanina. 2. Localizao do DNA: est presente em todas as clulas nucleadas dos eucariotos e tambm no interior das mitocndrias. No ncleo, apresenta-se arranjado na forma de cromossomos. 3. Cromossomos: Contm as informaes genticas do indivduo. Cada cromossomo consiste de uma nica e enorme molcula de DNA compactada, com exceo a poucos tipos celulares muito especializados que no podem replicar ou no possuem DNA (por exemplo, hemcias). Cada clula somtica humana apresenta com 23 pares de cromossomos, sendo duas cpias de cada tipo de cromossomo, uma herdada da me e a outra do pai. Nas clulas somticas, 22 pares so chamados autossomos e um par consiste de cromossomos chamados sexuais, por atuarem na determinao do sexo. Os autossomos materno e paterno de um par so chamados cromossomos homlogos. Na mulher, o par sexual formado por dois cromossomos X e, no homem, esse par constitudo por um cromossomo X e outro Y. Um cromossomo pode conter vrios genes diferentes assim como possuir segmentos que no so genes. 4. Meiose: Corresponde ao processo de diviso celular envolvendo o pareamento e separao de cromossomos homlogos (meiose I) e de cromtides irms (meiose II) que ocorre nas clulas germinativas. Em humanos e outros animais, a meiose acontece nas gnadas e seus produtos so os ovcitos e espermatozides. Assim, o gameta masculino e feminino haplides, originado das clulas diplides, possui cada um 23 cromossomos. Na fertilizao, ocorre a unio das clulas germinativas restabelecendo o conjunto diplide de cromossomos. Assim, as caractersticas genticas de um indivduo so provenientes do DNA materno e paterno.

5. Genoma: DNA do conjunto haplide de cromossomos e da mitocndria de um organismo. 6. Mutao: Correspondem a alteraes numa sequncia especfica de DNA, resultando em variantes genticas com modificaes de bases no DNA. 7. Loco: Corresponde posio que determinado segmento de DNA ocupa em um par de cromossomos homlogos. Assim, um loco ser considerado polimrfico se num conjunto de indivduos ocorrerem duas ou mais variantes em um mesmo loco. Alm disso, quando o segmento especfico de DNA no par de cromossomos homlogos no so idnticos entre si, o gentipo do indivduo denominado heterozigoto para aquele loco especfico. J a presena de segmentos de DNA idnticos nos mesmos locos, indica que o gentipo do indivduo homozigoto para aquela sequncia que est sendo analisada. 8. Polimorfismos: Referem presena de mais de um alelo de um mesmo gene ou segmento de DNA em uma populao, em que o seu alelo mais comum tem frequncia igual ou inferior a 99% (CAVALLISFORZA et al., 1994). O conjunto de variantes de DNA encontradas em um ou mais locos num indivduo constitui seu gentipo. Os polimorfismos que variam em comprimento de bases numa sequncia de DNA so chamados de STRs e de VNTRs. Os polimorfismos de STRs ou microssatlites apresentam-se com menos de seis bases repetidas sequencialmente num determinado cromossomo (ex.: repeties de trs nucleotdeos, CAGCAGCAGCAGCAG...), enquanto os VNTRs ou minissatlites apresentam repeties maiores que seis bases e de forma altamente varivel entre os indivduos. 2.2 Trabalhando Tecnologias da Gentica Molecular Com a evoluo das tecnologias, equipamentos cada vez mais sofisticados tm permitido que as metodologias da Gentica Molecular sejam aplicadas de forma a manipular genes e estudar os fenmenos genticos da transmisso hereditria em grandes detalhes. Assim, da mesma forma que o item anterior, previamente simulao da anlise de polimorfismos a partir de uma eletroforese, alguns conceitos devero ser introduzidos para se entender a anlise de paternidade pelo DNA, permitindo a compreenso do histrico de como o processo foi evoluindo at chegar ao exame proposto atualmente. Alguns desses conceitos foram apresentados e tambm podem ser encontrados em vrios trabalhos (PENA,1997; BRAGANA, 2007; KOCH; ANDRADE, 2008). Como citado anteriormente, a primeira metodologia utilizada para anlise de DNA individual em exames de paternidade conhecida como Southern Blot. Esta tc-

10

nica utiliza, alm do DNA extrado do genoma de um indivduo, enzimas que fragmentam o DNA em vrias partes e sistemas de captura (sondagem) a partir de uma sequncia de DNA previamente marcada (sonda). Este sistema de anlise feito para sondagem das regies VNTRs, por serem altamente variveis entre os indivduos, permitindo a anlise da identidade gentica de cada pessoa. Outra tcnica utilizada no exame de DNA a PCR. Est tcnica foi concebida por Kary Mullis em meados da dcada de 80 e desde ento revolucionou toda a Gentica. A PCR uma tcnica que envolve a sntese enzimtica, in vitro, de bilhes de cpias de um segmento especfico de DNA de um indivduo em particular na presena da enzima DNA polimerase. Ao contrrio do Southern Blot, nos exames de paternidade pela PCR so analisadas as regies polimrficas do tipo STRs. O material gentico torna o indivduo singular, permitindo identific-lo em meio a vrios outros, pois cada um possui seu prprio DNA. Esta anlise , via de regra, feita a partir de migrao do DNA sobre uma matriz slida, como um gel de poliacrilamida. Os marcadores de peso molecular, fornecidos comercialmente aos laboratrios, so utilizados no gel como uma escala de anlise dos tamanhos de segmentos de DNA obtidos para cada indivduo, sendo que os fragmentos maiores ficam em cima no gel enquanto os menores ficam embaixo, ou seja, migram mais rapidamente na malha da poliacrilamida. Para simulao de uma eletroforese para separao de DNAs variantes STRs amplificados por PCR seguida da anlise de paternidade, sero utilizadas uma folha de papel sulfite e uma rgua (Figura 3). Para essa anlise, no intuito de simplificar o processo, no foram consideradas as sequncias dos primers flanqueadores dos polimorfismos, assim como foi considerada uma PCR Monoplex (um par de primers utilizado para amplificao de uma sequncia alvo).

Na folha de papel sulfite sero marcadas as bandas geradas a partir das amplificaes dos locos polimrficos presentes nos cromossomos construdos na Figura 2. importante salientar que essa anlise apenas ilustrativa do processo geral de eletroforese, e que, previamente a essa tcnica, para anlise dos polimorfismos de STRs, o DNA genmico amplificado por PCR Multiplex utilizando pares de primers fluorescentes especficos para cada segmento. Outro ponto importante a ser enfatizado que os STRs de cada indivduo so atualmente visualizados num sistema fechado de eletroforese capilar a partir de produtos gerados contendo diferentes fluorescncias e o resultado final dado pela anlise dos eletroferogramas proveniente do produto amplificado esperado para cada loco (Figura 1). Para os quatro locos esquematizados na Figura 2, cada mianga representar um bloco de repetio polimrfico de acordo com a Tabela 1. Supondo que o DNA de cada um dos indivduos, aps ter sido extrado da clula, foi replicado in vitro, utilizando a PCR, o resultado da eletroforese ser de acordo com a simulao proposta na Figura 3. Nessa simulao de eletroforese, os quatro locos em questo sero analisados separadamente e uma rgua de 20 cm ser utilizada como escala de anlise das bandas, colocada ao lado esquerdo de uma folha de papel sulfite. A anlise dever comear de baixo para cima e uma linha que representar as bandas de um gel de poliacrilamida, ser marcada na posio esperada do DNA amplificado de cada indivduo, tendo como base seu gentipo e a migrao por eletroforese em gel (Figura 3). A anlise realizada loco por loco e para cada indivduo. Por exemplo, para o loco 1, a me, o SP1, o SP2 e o filho apresentam os seguintes padres de bandas, respectivamente: 6 (6X1) e 6 (6X1); 6 (6X1) e 6 (6X1); 18 (6X3) e 18 (6X3); 6 (6X1) e 6 (6X1) cm. Dessa forma, a anlise feita na folha pela marcao de bandas (traos horizontais) loco por loco (Figura 3).

Tabela 1: Dados para simulao de uma eletroforese de locos polimrficos de DNA.

11

Tendo como base somente a anlise da eletroforese organizada na Figura 3, analise qual o provvel pai biolgico do filho (F), lembrando que: i) este herdar um cromossomo 1 paterno e outro materno; ii) diferente de seus genitores ser heterozigoto; iii) na eletroforese apresentar um perfil de bandas esperado de ambos os genitores. A anlise desta Figura sugere ser o suposto pai 1, o provvel pai biolgico do filho em questo. Alm de perguntas como a anteriormente formulada, possvel discutir o motivo de a anlise ter sido realizada de baixo para cima (fragmentos

menores migram mais rapidamente pelo gel) e, com base na quantidade de repeties, possvel discutir que o provvel tipo de repetio analisada a de STRs. Ainda, questionrios podero ser elaborados abordando os conceitos anteriormente descritos e aplicados antes e aps a realizao dessa simulao a fim de se verificar a compreenso e apreenso de conhecimentos pelos alunos. Para complementar a aula, a simulao poder ser realizada pedindo-se para que os alunos representem o resultado da eletroforese do filho, caso o suposto pai 2 seja o seu pai biolgico.

Figura 3. Representao de uma eletroforese para anlise de polimorfismos de DNA e simulao de um exame de paternidade. Consideraes Finais A montagem dos cromossomos e a simulao do resultado da eletroforese apresentados nas Figuras 2 e 3, respectivamente, de acordo com o tempo de aula disponvel, podero ser trabalhadas utilizando ambos os pais heterozigotos. O mesmo tambm poder ser feito para a representao de mais locos ou utilizando-se somente a anlise de um gel. A partir dessa abordagem da gentica molecular, conceitos de citogentica podero ser trabalhados, tais como nmero e tamanho de cromossomos para as construes de caritipo, assim como a variao em termos de quantidade de cromossomos nas diferentes espcies. Bibliografia Recomendada
AMABIS, J. M.; MARTHO, G. R. Biologia das clulas. So Paulo: Moderna, 1994.

BRAGANA, W. O. A freqncia de regies de minissatlites em uma populao brasileira e sua utilidade para a identificao humana. 2007. Tese (Doutorado) faculdade de Cincias Mdicas. Universidade Estadual de Campinas. Campinas, 2007. CAVALLI-SFORZA L.L., MENOZZI P., PIAZZA A. The history and geography of human genes, Princeton University Press, Princeton, USA, 1994. DOLINSKY, L. C.; PEREIRA, L. M. C. V. DNA forense. Sade e Ambiente em revista, v.2, n.2, p. 11-22, 2007. FIGUEIREDO, M. S.; FERNANDEZ-ROSADO, F.; KUNII, I.; PACHECO A. C.; LORENTE,J. A.; BUDOWLE, B. Brasilian Caucasian Population Data for 15 STR Loci (PowerPlex 16TM Kit). J Forensic Sci, v. 49. n. 1, paper ID JFS2003274491, available online at: www.astm.org, 2004.

12

GES, A. C. S. Anlise de regies polimrficas do DNA com o objetivo de estabelecer vnculos genticos, identificar restos mortais ou realizar percias criminais. Revista do Biomdico. n. 65, p. 22-23, 2005. GRIFFITHS, A. J. F. et al. Introduo gentica. 8 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006. KASHYAP, V.K.; SITALAXIMI T.; CHATTOPADHYAY P.; TRIVEDI R. DNA Profiling Technologies in Forensic Analysis. Int. J. Hum. Genet, v. 4, n. 1, p 11 - 30, 2004. KOCH, A.; ANDRADE, F. M. A utilizao de tcnicas de biologia molecular na gentica forense: uma reviso. RBAC. v. 40, n. 1, p. 17-23, 2008. NUSSBAUM, R. L., MCINNES, R. R., WILLARD, H. F. Thompson & Thompson: Gentica mdica. 7 ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2008.

PARADELA, R. E.; FIGUEIREDO, S. L. O DNA vai ao tribunal: o impacto das tipagens genticas. Direito Mdico. Escritrio On-line, 2006. Disponvel em: <http://www.dnaforense.com.br> Acesso em: 08 mar. 2010. PENA, S. D. J. O DNA como (nica) testemunha em determinao de paternidade. Biotica. v. 5. n. 02, p. 231-241, 1997. PEREZ-SWEENEY, B. M., RODRIGUES, F. P. & MELNICK, D. J. 2003. Metodologias moleculares utilizadas em gentica da conservao. In: CULLEN JR, L., RUDRAN, R. & VaLLADARESPADUA, C. (Eds.) Mtodos de estudos em biologia da conservao e manejo da vida silvestre. Editora UFPR, Fundao O Boticrio de Proteo Natureza, Curitiba, Paran, Brasil. 343-380 pp. SNUSTAD, D. P.; SIMMONS, M. J. Fundamentos de gentica. 4 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2008. p.11.

13