UNESP FACULDADE DE CINCIA E TECNOLOGIA FCT Campus de Presidente Prudente

Unesp

Relatrio de Bioqumica
FOTOCOLORIMETRIA E ESPECTROCOLORIMETRIA:
FRACIONAMENTO DAS PROTENAS DO LEITE E SUA DOSAGEM PELO MTODO DO BIURETO

Discentes: Gabriela Bitto de Oliveira Jos Carlos de Oliveira Junior Tamara Murisugi de Oliveira Docente: Profa. Dra. Maria de Lourdes Corradi C. Da Silva Disciplina: Bioqumica Curso: Engenharia Ambiental 2 ano

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ndice
1. Introduo ..........................................................................................................................2 1.1. Mtodos Fotocolormetros ................................................................................................2 1.2.Curva padro ......................................................................................................................4 1.3. Procedimento para montagem de uma curva padro ........................................................4 1.4. Mtodos para quantificao de protenas totais ................................................................4 1.5.Mtodo do Biureto para determinao de protenas ..........................................................5 1.6. Protenas presente no leite ................................................................................................5 2. Objetivos .............................................................................................................................6 3. Matrias Utilizados ............................................................................................................7 3.1.Precipitao Isoeltrica da Casena ...................................................................................7 3.2. Diluio do leite para a dosagem de protenas .................................................................7 4. Metodologias ......................................................................................................................7 4.1. Precipitao Isoeltrica da Casena ..................................................................................7 4.2. Diluio do leite para a dosagem das protenas totais ......................................................8 4.3. Curva de calibrao e dosagem de protena .....................................................................8 5. Resultados e Discusses ...................................................................................................11 6. Concluso ..........................................................................................................................12 7. Bibliografia ......................................................................................................................13

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1. INTRODUO 1.1. Mtodos Fotocolormetros A fotocolorimetria e a Espectrofotometria podem ser conceituadas como um procedimento analtico atravs do qual se determina a concentrao de espcies qumicas mediante a absoro de energia radiante (luz). A fotocolorimetria um mtodo biofsico de anlise de substncias largamente utilizado em laboratrios de anlises clnicas e em laboratrios de pesquisa, tendo como principal objetivo a determinao da concentrao de solues. Esse mtodo baseia-se na relao existente entre a absoro de radiaes eletromagnticas e a concentrao da substncia em questo. O equipamento utilizado para a realizao da prtica de fotocolorimetria, o fotocolormetro, composto pelos seguintes itens: fonte de luz, filtro, cubeta, fotoclula e miliampermetro. O aspecto externo do fotocolormetro bastante caracterstico e composto por: seletor de filtro, que serve para a escolha do comprimento de onda do feixe de luz que incidir sobre a cubeta, sendo o aparelho dotado de cinco filtros (410nm, 480nm,520nm,580nm e 660nm); porta-cubetas, que o local onde se coloca a cubeta;botes de calibrao; mostrador de leitura, que apresenta as duas grandezas que podem ser medidas pelo fotocolormetro: a absorbncia e a transmitncia. Os mtodos espectroscpicos baseiam-se na absoro e/ou emisso de radiao electromagntica por muitas molculas, quando os seus electres se movimentam entre nveis energticos. A espectrofotometria baseia-se na absoro da radiao nos comprimentos de onda entre o ultravioleta e o infravermelho. Um espectrofotmetro um aparelho que faz passar um feixe de luz monocromtica atravs de uma soluo, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa soluo. Usando um prisma o aparelho separa a luz em feixes com diferentes comprimentos de onda (tal como acontece no arco-ris com a separao das cores da luz branca). Pode-se assim fazer passar atravs da amostra um feixe de luz monocromtica (de um nico comprimento de onda, ou quase). O espectrofotmetro permite-nos saber que quantidade de luz absorvida a cada comprimento de onda. Fotometria uma tcnica de anlise quantitativa que envolve a medida de intensidade de absoro de luz monocromtica de um composto qumico em soluo. Ou seja, analisa a absorvncia (capacidade que tem uma soluo de absorver uma certa quantidade de energia do feixe de luz incidente) Serve para identificar o comprimento de onda caracterstico para cada composto e para quantificao do composto atravs de 1) absoro direta e 2) atravs de mtodo colorimtrico. Essa
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intensidade de absoro depende: 1) do comprimento de onda escolhido (normalmente usa o mx - onde o composto absorve mais luz), 2) do percurso que o feixe de luz percorrer na soluo e 3) da concentrao do composto nessa soluo. A lei de Lambert-Beer estabelece que a absorbncia diretamente proporcional concentrao da espcie absorvente. A frao de luz que passa por uma amostra (a transmitncia = It/I0) est relacionada logaritmicamente, e no linearmente, com a concentrao da amostra. A lei de Lambert-Beer relaciona esses trs fatores e estabelece que: A = .l.c onde: A = absorbncia definida pela reao seguinte: A = - log It/I0, que por ser uma razo, no possui unidade (Io intensidade de luz incidente; It intensidade de luz transmitida); = absortividade molar (caracterstico de cada substncia), em L.(mol.cm)-1; l = caminho ptico (percurso da luz monocromtica na soluo), em cm; c = concentrao da substncia em mol/L.

Onde: T= tranmisso ou transmitncia; Io= intensiadade do feixe luminoso incidente; It= intensidade de feixe luminoso transmitido ou emergente; a= coeficiente decdico de absoro ou extino; c= concentrao da soluo; I= espessuara da soluo. Desta forma, mantendo-se o caminho ptico constante, a absorbncia torna-se diretamente proporcional concentrao da substncia no respectivo mx. Nestas condies, podemos utilizar uma soluo de concentrao conhecida do composto a ser analisado (ou outra substncia de caractersticas qumicas semelhantes) para construir um diagrama de absorbncia em funo da concentrao da substncia em questo. Com este diagrama,
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denominada curva padro, podemos medir a quantidade do composto em amostras de concentrao desconhecida, pela simples medida de suas absorbncias desde que, estas estejam nas mesmas condies utilizadas para a construo da curva padro (mesmos reagentes, mesma temperatura, etc). 1.2. Curva padro Devido existncia de uma proporcionalidade direta entre a concentrao das solues e a quantidade de luz absorvida em comprimentos de onda especficos, a espectrofotometria e a fotocolorimetria podem ser usadas como um mtodo quantitativo de identificao de substncias. Contudo, faz se necessrio, a obteno de uma relao entre absorbncias registradas em experimentos para diferentes concentraes de solues, elaborando-se retas de calibrao, ou seja, curvas padres . Experimentalmente possvel conhecer os valores de absorbncia de solues conhecidas e assim, utilizando-se as curvas padres, podem-se determinar matematicamente as concentraes destas. 1.3. Procedimento para montagem de uma curva padro (Lehninger, 1984). Quando escolhido um mtodo de dosagem, prepara-se uma soluo padro de concentrao rigorosamente conhecida. Mede-se ento com pipetas de preciso, diferentes volumes desta soluo, completando-se com solvente a um volume final determinado. calculado e anotado a concentrao de cada uma das amostras e ento so feitas duplicatas destas amostras e estas so ento processadas pelo mtodo de dosagem. Um volume igual de solvente processado pelo mesmo mtodo, para servir de branco nesta dosagem (eliminado da leitura o erro causado pela absoro de luz pela cuba, solvente, reagente e impurezas). 1.4. Mtodos para quantificao de protenas totais As protenas desempenham papis extremamente importantes, na maioria dos processos biolgicos, por isso, o desenvolvimento de metodologias para determinar esses compostos tem, cada vez mais, se tornado de fundamental relevncia em vrias reas do conhecimento (Zaia, 1998). So encontrados na literatura, diferentes mtodos para a quantificao de protenas. A maioria desses mtodos tem como base: a) na propriedade intrnseca das protenas para absorver luz no UV, b) na formao de derivados qumicos, e c) na capacidade que as protenas tm de se
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unir a certos corantes. Os mtodos para a determinao da concentrao de protenas totais so muito variados, no entanto, as metodologias mais utilizadas so as espectrofotomtricas no ultravioleta e no visvel. Ao longo dos anos, muitos mtodos espectrofotomtricos, tm sido propostos para a determinao de protenas totais, porm no existe uma metodologia considerada de uso universal para todos os meios. Os mtodos geralmente mais utilizados so o do Biureto, de Lowry, de Bradford, de Smith e de absoro de protenas no ultravioleta (Zaia, 1998): 1.5. Mtodo do Biureto para determinao de protenas Um dos mtodos utilizados para dosagem de protena chamado de mtodo do Biureto. Esse mtodo faz uso da propriedade de ons Cu2+ em meio alcalino de formar ligaes com o nitrognio das ligaes peptdicas., que reage de modo quantitativo com as protenas. Desta reao (reao de biureto) resulta uma colorao prpura intensa, que absorve fortemente a radiao a 540 nm. Este fato pode ser explorado para se determinar por colorimetria a quantidade de protena de uma soluo. A cor desenvolvida numa reao de ons de Cu2+ em meio alcalino com estas protenas deve-se exclusivamente s ligaes peptdicas e a sua intensidade proporcional a quantidade de tais ligaes. A absorbncia detectada no espectrofotmetro ou fotocolormeto. 1.6. Protenas presente no leite O leite essencial numa dieta bem balanceada e composto de diversos nutrientes e substncias fisiologicamente ativas. O leite composto por 87,5% de gua, 3,6% de gordura, 4,5% de lactose, 0,8% de sais minerais e 3,6% de protenas, h trs tipos de protenas diferentes: 7-12% de -Lactoalbumina, 2-5% de - Lactoglobulina e o restante de casena. O ponto isoeltrico da caseina 4.6. o ponto de pH em que ela precipita (coagulao cida). A protena purificada insolvel em gua. Enquanto insolvel em solues salinas neutras, prontamente se dispersa em meio alcalino diludo e em solues salinas tais como oxalato de sdio e acetato de sdio. Alm disso, a casena faz muito bem sade.

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2. OBJETIVOS Elaborar curvas de calibrao e estabelecer a sensibilidade de um mtodo fotocolorimtrico. Relacionar os mtodos fotocolorimtricos s situaes onde podero ser aplicados, tendo como exemplo a dosagem de protenas do leite pelo mtodo da reao do biureto. Resolver problemas especficos: clculos das diluies e de concentraes.

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3. MATERIAIS 3.1. Precipitao Isoeltrica da Casena a) Soluo padro de protena a 5,0mg/mL; b)HCl a 2% v/v; c) reagente do biureto: sulfato de cobre cristalizado (pentaidratado) 1,5g; tartarato duplo de sdio e potssio 6,0g; 500mL de gua destilada. Adicionar 300 mL de NaOH a 10g% (p/v) com constante agitao e completar para 1 litro com gua destilada; d) papel indicador de pH; e) leite desnatado longa vida (0% gordura). 3.2. Diluio do leite para a dosagem de protenas a) leite desnatado; b) gua destilada. 4. METODOLOGIA 4.1. Precipitao Isoeltrica da Casena a) Colocou-se 10mL de leite com 10mL de gua destilada morna em um bquer de 50mL; b) foram acrescentados 2mL de soluo de cido clordrico a 2%, gota a gota, com constante agitao at atingir o ponto isoeltrico da casena, que corresponde ao pH 4.6, no qual o leite coagula; c) o pH foi medido com o auxlio de um papel indicador universal; d) anotou-se o volume de HCl 2% gasto; e) aps sedimentao do precipitado, filtrou-se o material por papel; f) o filtrado foi utilizado para a dosagem de protena que no precipitaram nas condies acima descritas.

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4.2. Diluio do leite para a dosagem das protenas totais a) Diluiu-se 0,5mL de leite em 9,5mL de gua destilada temperatura ambiente (proporo 1:20); OBS.: Neste trabalho PF refere-se a protenas do filtrado; PT, protenas totais e (PT-PF) quantidade de casena. 4.3. Curva de calibrao e dosagem de protena a) Curva de calibrao
Tubos n Padro de protena 5 m/ml (ml) Amostra (PF ou PT) (ml) gua destilada Reagente Biureto do

PF 4 5 6 7

PT 8 -1,0 --

1 0 -1,0

0,2 (1mg) 0,4 (2mg) 0,6 (3mg) 0,8 (4mg) 1,0 (5mg) --0,8 -0,6 -0,4 -0,2 --1,0 --

Adicionar em todos os tubos 5 ml Tabela 4.1- Dosagens para curva de calibrao

b) Agitou-se todos os tubos, deixando-os em repouso durante 10 minutos; c) a absorbncia dos tubos foi analisada no fotocolormetro 540 nm, sendo o aparelho zerado com o tubo n 1 (branco = concentrao zero de protenas). d) Utilizou-se duas cubetas em que umas delas continha o material do tubo 1 e a outra para as demais solues. Obs.: necessria a limpeza externa da cubeta que recebe as solues do tubo 2 ao tubo 8 usando papel higinico, a fim de no afetar o valor da absorbncia registrada pelo fotocolormetro. A partir do tubo 6 necessrio lavar as cubetas. Alm disso, a troca das cubetas deve ser instantnea para o aparelho no se descalibrar.

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5. RESULTADOS E DISCUSSES Misturando-se o cido clordrico soluo de leite formou-se um precipitado branco aps a adio de 2mL do cido. Segundo a anlise feita com o papel indicador, o pH da amostra ficou entre 4 e 5. Tal precipitado corresponde casena, protena do leite. Enquanto que a parte superior composta pelas outras duas protenas tambm importantes ao leite: lactoalbumina e lactoglobulina. O cido clordrico foi adicionado ao leite com o intuito de diminuir o pH da soluo e, consequentemente, atingir o ponto isoeltrico da casena (pI=4,6). A amostra foi filtrada para obterse o PF: lquido translcido levemente amarelado. Em seguida, diluiu-se 0,5mL de leite em 9,5mL de gua destilada para diminuir a concentrao do leite j que lei de Beer-Lambert vlida somente para solues relativamente diludas, uma vez que acima de certas concentraes a relao entre a absorvncia e a concentrao deixa de ser linear. Tornando vivel a anlise da absorbncia das PTs no fotocolormetro (tubo 8). O tubo 1(branco), contendo apenas gua e a soluo do biureto, possua uma colorao azulada e foi utilizado para calibrar o fotocolormetro. Do tubo 2 ao 6, o aumento da concentrao de protenas, fez com que a colorao tendesse gradativamente ao violeta. Os tubos 7 e 8 apresentaram colorao violeta intermediria s coloraes dos tubos 2 ao 6. Analisando as Densidades pticas obtidas, mostradas no Grfico 5.1 e na Tabela 5.1, foi possvel observar uma certa relao entra a absorbncia e a concentrao de protenas de acordo com o esperado, ou seja, uma relao diretamente proporcional.

Tubo mg/ml Luz absorvida

1 0,0

2 0,04

3 0,07

4 0,10

5 0,14

6 0,18

7 0,09

8 0,09

Tabela 5.1- resultados obtidos no fotocolormetro Lembrando que o tubo 7 contm o material solvel restante aps a precipitao da casena e que primeiramente o leite foi diludo para 20mL (o dobro do volume inicial), a concentrao encontrada para esta amostra ( Tabela 5.1 ) deve ser multiplicada por 2 para se ter a quantidade real. Cmg/mL = 2 x C7 Cmg/mL = 2 x 2.7 Cmg/mL = 5.4 mg/mL. Onde: Cmg/ml = Concentrao real das PFs; C7 = Concentrao do tubo 7.

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Com o tubo 8 tambm houve um processo de diluio. No entanto, a proporo de diluio no foi de 1:2 como no tubo 7, e sim de 1:20. Portanto o valor obtido na Tabela 5.1 dever ser multiplicado por 20. Logo C'mg/mL = 20 x C8 C'mg/mL = 20 x 2.7 C'mg/mL = 54mg/mL. Onde: C'mg/mL = Concentrao real das PTs; C8 = concentrao no tubo 8. Enfim, a concentrao da casena a subtrao da C'mg/ml menos a Cmg/mL Ccasena = C'mg/mL Cmg/mL Ccasena = 54.0 5.4 Ccasena = 48.6 mg/mL. Sendo assim, encontra-se facilmente a porcentagem de casena no leite fazendo a razo da concentrao da casena com a concentrao PTs real, multiplicando esse valor por 100 %Casena = (Casena / C'mg/mL ) x 100 %Caseina = (48.6 / 54.0) x 100 %Casena = 90% Esperava-se obter um resultado entorno de 85% de casena, como est escrito na literatura. Supe-se que o esperado no ocorreu devido a um erro de pipetagem, onde, ao se adicionar o cido HCl 2% em excesso, o pH ficou mais cido do que o necessrio, fazendo com que o ponto isoeltrico da lactoalbumina que entre 4,2 e 4,5, fosse atingido tambm, e esta, ento, estaria presente no precipitado juntamente com a casena que possui seu ponto isoeltrico muito prximo (pI = 4,6). O mesmo j no ocorre com a lactoglobulina que contm o pI aproximadamente igual a 5,2.

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Grfico 5.1 - Grfico obtido atravs da curva de calibrao

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6. CONCLUSO

Visto que a fotocolorimetria e a espectrofotometria so tcnicas analticas que permitem determinar a concentrao das solues atravs da medida da intensidade de luz absorvida ou transmitida pelas mesmas, percebeu-se que com uma maior concentrao de protenas, h o aumento no valor da absorbncia (medida no fotocolormetro) e, portanto, a quantidade de luz transmitida (medida no espectrofotmetro) tende a reduzir/diminuir. As curvas de calibrao so determinadas atravs dos resultados obtidos por esses aparelhos. Onde inicialmente h sempre um soluo, considerada o branco, onde no est diludo nele o material em estudo, no caso as protenas, e as demais solues aumentam gradativamente a concentrao deste material, gerando assim um grfico de conc. (mg/ml) X absorvncia, formado por uma reta, j que diretamente proporcional o aumento das variveis. Os clculos apresentados tem como objetivo final mostrar a concentrao de casena presente no material de estudo que foi retirada inicialmente na forma de um precipitado, que ocorre devido adio de cido. Tal calculo se baseia em uma relao entre as protenas totais presente no tubo 8 menos as protenas filtradas presente no tubo 7. Por tratar-se de um experimento que inclui ou aborda mtodos quantitativos, a mensurao de cada material a ser utilizado tem influncia direta nos resultados obtidos. Por exemplo, segundo a literatura, quando se realiza a dosagem de protenas do leite, a porcentagem de casena encontrada de 85% no coincidindo com/ contrariando, de certo modo, o observado nessa (aula) prtica, em que se obteve, algebricamente, uma porcentagem de 90% de casena. Tal desigualdade pode ter ocorrido em funo de erros grosseiros na dosagem dos materiais, variando assim, suas concentraes.

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7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS GUEDES, HELMA VENTURA & PERIN, LIAMARA. Quantificao de Protenas Totais de Bactrias Diazotrficas Crescidas em Meio de Cultivo Semi-Slido. Embrapa, Seropdica RJ. Julho de 2007. Fotocolorimetria. <http://www.proacad.ufpe.br/congrad/2002/cd/pdf/337.PDF>. Acessado em: 29 de maro de 2010. LIMA, CAROLINA & SAGIO, SOLANGE. Curvas padres para determinao de acares redutores, acares solveis totais, protenas e aminocidos. Universidade Federal de Lavras, departamento de biologia. Lavras MG, agosto de 2007. SANTOS, GERALDO T. & SOUZA, LUCIMAR G. Valores Nutricionais do Leite de Vaca. Curitiba PR, 2002. Teoria e Prtica da espectrofotometria quantitativa. "Photographic Chemistry 2076-302 Laboratory: 5 Spectrophotometry and Beer's Law": <http://www.rit.edu/~bekpph/Chemistry/5_Spectrophotometry.html > Acessado em: 29 de maro de 2010. TIBRCIO, H.M. Controle interno da qualidade analtica, 1aed.maro/1995. ULRICH, ALEXANDER HENNING & ARMELIN, HUGO AGUIRRE. Apostila de Bioqumica QBQ220N. Universidade de So Paulo, Instituto de Qumica, 2006.

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