Departamento Acadmico de Qumica

Curso Tcnico Integrado Disciplina: Microbiologia Industrial Relatrio de Aulas Prticas

Alunos: Maria Luiza Andrade Aquino Mariana Gabriela de Oliveira Ruslam Romaine Eleutrio Subturma: T3 Professora: Fernanda Badotti

COLORAO DE GRAM
1. Introduo A colorao de Gram foi desenvolvida em 1884 por Hans Christian Joachim Gram, mdico bacteriologista dinamarqus. um procedimento de colorao diferencial, pois no cora todos os tipos de clulas igualmente; e muito til, pois classifica as bactrias em dois grandes grupos: gram-positivas e gram-negativas, de acordo com diferenas na parede celular das bactrias. Consiste no tratamento sucessivo do esfregao bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, iodo, etanol - acetona e fucsina bsica. Os diferentes tipos de bactrias reagem de modo diferente colorao de Gram, porque diferenas estruturais em suas paredes celulares afetam a reteno ou liberao de uma combinao de violeta de genciana e iodo, denominada complexo violeta-iodo (CV-I). Entre outras diferenas, as bactrias gram-positivas tm uma parede celular mias espessa de peptideoglicana (dissacardeos e aminocidos) que as bactrias gram-negativas. Alm disso, as bactrias gramnegativas contm uma camada de lipopolissacardeos (lipdeos e polissacardeos) como parte de sua parede celular. Quando aplicada a clulas gram-positivas e gram-negativas, a violeta de genciana e o iodo penetram facilmente nas clulas. Dentro as mesmas, a violeta de genciana e o iodo se combinam para formar o CV-I. Esse complexo maior que a molcula CV que entrou na clula e, devido ao seu tamanho, no pode ser removido da camada intacta de peptideoglicano das clulas gram-positivas pelo lcool. Nas clulas gram-negativas o lcool rompe a camada lipopolissacardica e o complexo removido atravs da camada fina de peptideoglicano, que no consegue reter o complexo. Como resultado, as clulas gram-positivas retm o corante e permanecem de cor prpura. As clulas gram-negativas no retm o corante e ficam incolores at serem contracoradas com um corante vermelho, aps o que adquirem cor rosa. O mtodo de Gram uma das mais importantes tcnicas de colorao em microbiologia mdica. Porm, os resultados da colorao de Gram no so universalmente aplicveis, pois algumas clulas bacterianas coram-se fracamente ou no adquirem cor. A reao de Gram mais consistente quando usada em bactrias jovens, em crescimento.

A reao de Gram de uma bactria pode fornecer informaes valiosas para o tratamento de uma doena j que bactrias gram-positivas tendem a ser mortas facilmente por penicilinas e cefalosporinas e as bactrias gram-negativas geralmente so mias resistentes, pois os antibiticos no podem penetrar na camada de lipopolissacardeos. O mtodo de colorao de Gram consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio slido ou lquido, com um corante primrio, o cristal violeta, seguido de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactrias gram-positivas quanto gram-negativas absorvem de maneira idntica o corante primrio e o fixador, adquirindo uma colorao violeta devido formao de um complexo cristal violeta-iodo, insolvel, em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgnico, o etanol-acetona. O solvente dissolve a camada lipdica das membranas externas das bactrias gram-negativas, deixando tambm pequenos buracos na fina camada de peptideoglicana pelos quais o complexo CV-I se espalha , decorando as clulas. Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactrias gram-positivas e provoca a contrao dos poros do peptideoglicano, tornando-as impermeveis ao complexo; o corante primrio retido e as clulas permanecem coradas. A etapa da descolorao crtica, pois a exposio prolongada ao solvente ir provocar a remoo do cristal violeta dos dois tipos de bactrias, podendo produzir resultados falsos. A reteno ou no do corante primrio , portanto, dependente das propriedades fsicas e qumicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura, densidade, porosidade e integridade. Em seguida, a amostra tratada com um corante secundrio, a fucsina bsica. Como as bactrias gram-negativas ficam incolores aps a lavagem com lcool, a adio do contracorante colore as clulas. Ao microscpio, as clulas gram-positivas aparecero coradas em violeta e as gram-negativas em rosa. Em clulas de bactrias gram-positivas velhas, mortas ou com envelopes danificados por agentes fsicos ou qumicos, tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as clulas coradas como gram-negativas. Portanto, o uso de amostra nova importante. Por outro lado, resultados do tipo "falso gram-positivo" s so obtidos se o tratamento com etanolacetona for omitido. O corante cristal violeta pode ser substitudo, com os mesmos resultados, pelo azul de metileno e a fucsina bsica pode ser substitudo pelo corante vermelho safranina. A fucsina cora muitas bactrias gram-negativas mais intensamente que a safranina, que por sua vez no cora prontamente algumas espcies de bactrias. O solvente etanol-acetona pode ser substitudo por lcool 95%.

2. Objetivos Desenvolver habilidades para executar as tcnicas de preparao de esfregaos e para o mtodo de colorao de Gram, sabendo diferenciar e classificar as bactrias de acordo com a colorao obtida e relacionando-as composio qumica da parede celular das mesmas. Desenvolver a

habilidade, tambm, para utilizar o microscpio ptico, observando as bactrias aps a colorao de Gram.

3. Materiais necessrios 3.1 Reagentes: gua lcool Cristal violeta Lugol Safranina 3.2 Materiais Ala de Platina Lminas de vidro Pipetas de Pasteur Suporte para colorao das lminas Placa com crescimento bacteriano: E.coli e S.aureus Tubo de ensaio 3.3 Equipamentos Microscpio ptico Bico de Bunsen

4. 1 etapa: Preparao da atividade prtica

4.1 Preenchimento da Ficha Formativa de Reagentes (Tabela 01)

Nomes Meios de cultura/ reagentes

Composi o Qumica

Descrio Fsicoqumica
Solubilidade em gua: 20 g/L (20 C) Ponto de fuso: 189 - 194 C Massa molar: 407.99 g/mol Densidade: 1.19 g/cm3 (20 C) pH: 2.5 - 3.5 (10 g/l, H2O, 20 C)

Riscos sade/ impacto ambiental

Manuseio

Estocagem

Referncia bibliogrfica

- C25H30ClN3

Cristal Violeta

Suspeito de provocar cancro. Nocivo por ingesto. Provoca leses oculares graves. Muito txico para os organismos aquticos com efeitos duradouros.

- Pipetas de pasteur - uso de jaleco

Ver referncias bibliogrficas (Item 5.1.4)

- Iodeto de potssio Lugol - Cristais de iodo - gua destilada

- Solvel em gua 20 C - Densidade 1,01 g/cm a 20 C - pH: 3,5 (H2O, 20 C) - Ponto de ebulio: 100 C

- No perigoso para a gua

- Pipetas de pasteur - uso de jaleco

Armazenar de 15C a 25C

Ver referncias bibliogrficas (Item 5.1.4)

Safranina

- C20H19ClN4

Solubilidade em gua:

50 g/L (20 C)
Massa molar:
350.85 g/mol - pH: 10 (10 g/l, H2O, 20 C)

- Forte contaminante de gua

- Pipetas de pasteur - uso de jaleco

5. 2 etapa Execuo da atividade principal

5.1 Procedimentos/metodologia I) Colorao e esfregao Utilizando-se da rea estril em volta do bico de Bunsen ou a capela de fluxo laminar, retirar, com o auxlio da ala de platina, uma pequena poro da bactria desejada (j inoculada em placa petri). Colocar uma gota de gua destilada em um lmina, esfregar a ponta da ala de platina com a bactria na gota, fazendo um crculo. Secar a gua com o auxlio do bico de bunsen. Corar com Cristal violeta por 60 segundos. Lavar com esguicho de gua destilada Corar com Lugol por 60 segundos. Lavar com esguicho de gua destilada.

Passar lcool acetona at que no haja mais desprendimento de corante. Lavar com esguicho de gua destilada. Corar com fucsina por 30 segundos. Lavar com esguicho de gua destilada e esperar secar. II) Microscpio Ligar o microscpio na tenso adequada. Acoplar a lmina mesa (platina) do microscpio. Focalizar utilizando o parafuso macromtrico, ajustar o foco com o parafuso micromtrico. No caso da lente de maior aumento, colocar leo de imerso, imergir a lente no leo, focar utilizando o parafuso macromtrico e ajustar com ajuda do micromtrico. Aps o trmino da visualizao, retirar a lmina e limpar a objetiva que imergiu no leo com um papel absorvente.

5.1.1 Leitura e interpretao dos resultados Os microorganismos roxos, com forma de cocos, vistos no microscpio eram gram-positivos (Staphylococcus aureus), enquanto os de colorao rosa com forma de bastonetes eram gram-negativos (Escherichia coli). Essa diferena de cor ocorre, pois as bactrias grampositivas possuem uma densa camada de peptideoglicano em sua parede celular, enquanto as gram-negativas possuem uma fina camada desse composto e uma membrana externa, constituda por lipopolisacardeos. Ao corar as bactrias com cristal violeta e lugol, o complexo de cristal violeta-iodo absorvido por ambas, porm, ao serem tratadas com lcool, as espessas paredes celulares das bactrias gram-positivas so desidratadas, provocando a contrao dos poros do peptideoglicano, tornando-as impermeveis ao complexo; enquanto a poro lipdica das membranas externas das bactrias gramnegativas se dissolve, deixando o complexo ser removido. Ao corar ambas com a safranina, as gram-negativas absorvem esse contracorante por estarem incolores, diferentemente das gram-positivas, que no absorvem por j estarem coradas. Foi possvel a observao de bactrias descoradas em ambos esfragaos (Staphylococcus aureus e Escherichia coli); e tambm algumas bactrias do tipo Staphylococcus aureus

com uma cor mais roseada e outras do tipo Escherichia coli em um tom mais roxeado em comparao com as outras do mesmo esfregao. Isso pode ter ocorrido por causa de uma m colorao ou at mesmo devido ao tipo de cultura das bactrias. A etapa de descolorao na Colorao de Gram uma das mais importantes. Isso, porque se for muito prolongado o tempo de exposio ao solvente (lcool), o complexo cristal violeta-iodo pode ser removido de ambos tipos de bactrias (gram-positivas e gram-negativas) e ambas serem coradas pelo contracorante (safranina) na prxima etapa do procedimento, o que explica a cor roseada de algumas gram-positivas, e se o tempo for curto, pode no haver remoo do complexo cristal violeta-iodo das bactrias gram-negativas, o que explica a colorao roxeada de algumas delas no esfregao. A descorao das bactrias pode ser explicada pela reteno ou no do corante, j que depende das propriedades fsicas e qumicas das paredes celulares bacterianas, tais como densidade, espessura, porosidade e integridade. Outras explicaes para esses resultados adversos podem estar ligadas a clulas velhas, clulas mortas ou clulas com envelopes danificados por agentes qumicos ou fsicos, tais como o aquecimento no bico de bunsen, utilizado para a secagem do esfregao. Outro problema nas etapas de colorao pode ser o quanto espesso um esfregao, j que mais difcil descora-las e at mesmo permitir a observao no microscpio. Por esses motivos, a Colorao de Gram nunca deve ser utilizada como um diagnstico definitivo para a classificao de bactrias e sim como um ponto de partida. Visto isto, a Colorao de Gram somente ser um recurso rpido e til quando corretamente realizada e interpretada e com o uso de culturas em que se saiba, pelo menos, o tempo de incubao.

5.1.2 Apresentao de propostas de minimizao, reutilizao, tratamento e descarte dos resduos gerados

Os meios utilizados podem ser reaproveitados transformando estes em alimentos para animais e adubos. Para a produo dos alimentos e adubos seria necessrio o tratamento dos produtos gerados pela degradao do meio e pelo metabolismo das bactrias. Porm, no foram encontradas pesquisas nessa rea. O tratamento existente consiste na combusto dos meios, o que gera muita poluio por gs carbnico e resduos slidos no identificados. (concertar)

5.1.3 Concluso

5.1.4 Bibliografia

- MICHAEL J. PELCZAR JR. & E.C.S. CHAN & NOEL R. KRIEG. Microbiologia: Conceitos e Aplicaes - vol. 1. 2 Ed. - TORTORA, Gerard J., FUNKE, Berdell R. e CASE, Christine L. Roberta Marchiori Martins. Microbiologia. Porto Alegre: Artmed, 2005. MERCK CHEMICALS Brazil. Disponvel em: http://www.merck-chemicals.com.br/is-

bin/INTERSHOP.enfinity/WFS/Merck-BR-Site/pt_BR/. Acessado em: 15 de maio de 2010.