Sistema Rh e suas complexidades

Dra Lilian Castilho

Sistema Rh

Sistema complexo





49 antgenos
muitos fentipos
no mnimo 200 alelos
um fentipo pode gerar vrios gentipos

Principais antgenos
 D; C/c; E/e
 8 hapltipos: Dce(R1),Ce(r), DcE(R2),
cE(r), Dce(R0), ce(r), DCE(RZ), CE(ry)

Sistema Rh
:Terminologia
Rh:Terminologia
Rh no Rhesus
Sistema ISBT: 004
Smbolo ISBT: RH
Fentipo: D+C+E-c+e+
RH:1,2-3,4,5
Dce/ce ou Dce/dce=R1r

Provvel gentipo: DCE/ce, RH*1,2,5/RH*4,5
ou R1r

Expresso das protenas RhD e RhCE

RHD

RHCE

RHAG

Genes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

mRNAs

(A)n

(A)n

C/c
103

E/e
226

(A)n

Protenas
1

417 1

417 1

409

RHD e RHCE

RHD

Rh
1
box

RHCE

8 9 10

Rh SMP1 10 9 8
box

69Kb, 10 exons
Protena transmembrana 30-32kDa
95% identidade (nt e aa)
49 ags definidos sorolgicamente
RHD flanqueado por 2 caixas Rhesus
SMP= Simple Membrane Protein
WAGNER e FLEGEL, 2000

Genes Rh:
D-positivo/D-negativo
RHD
D+ (D/D)

D+ (D/d)

D- (d/d)

RHCE

Rh:
Genes, Protenas, Antgenos
P

X Deletado X

SMP1

ce, Ce, cE, CE

Rh-positivo

SMP1

ce, Ce, cE, CE

Rh-negativo

RhCE

RhD

N
H
2

COOH

N
H
2

COOH

Bases moleculares das

variantes RH

Mutaes missenses com troca de um nico
aminocido ou mutaes dispersas

Rearranjos gnicos com produo de genes
hbridos

Proximidade dos genes RHD e RHCE e
orientaes opostas no cromossomo podem
aumentar a chance de trocas genticas

Teoria: formao de hair pin

Produ
o de genes RH h
bridos
Produo
hbridos
RHD

RHD-CE(4-7)-D

SMP1

RHCE

RHCE

Wagner & Flegel, 2000

Mosaic nature of the Rh0 factor of

human blood

Em 1948 foi relatado que durante a rotina pr-natal da primeira
gestao, uma gestante foi tipada como RhD-negativo e seu
soro analisado no demonstrou presena de anticorpos

Durante a rotina pr-natal da segunda gestao e das

gestaes subsequentes, a gestante foi tipada como Rhpositivo. Assim, o relato de 1948 foi considerado um erro devido
a pobre qualidade dos anti-soros de tipagem Rh daquele tempo.

Wiener e colbs. Experimental Medicine and Surgery, 1957;15:75-81

Porque a tipagem RhD

algumas vezes problem
tica?
problemtica?
Grande nmero de variveis nos testes sorolgicos
1. Mltiplos Mtodos Tubo, Microplaca, Gel
Alguns realizam teste da AGH para D fraco, outros no
Rotina de doadores- Automao
2. Variedade de Reagentes Contm diferentes clones
Podem reagir diferentemente com D fraco e D parcial
Maioria reatividades com DIV, DVa, e DVI
Discrepncias na tipagem Rh
3.

Variabilidade na expresso da protena RhD

( ~120 diferentes genes = variaes)

Ocorrem por alteraes na sequncia do gene RHD

D fraco - 53 mutaes diferentes
D Parcial ~ 50

Del
~ 8

outras ~ 18

Variao na expresso do antgeno RhD

D Fraco
- incidncia- 0.2-3% - diferenas populacionais
- requer teste indireto da AGH para ser detectado (depende do
reagente utilizado)
- mutaes de nico polimorfismo (SNP) no gene

- efeito na quantidade da protena, mas no nos eptopos de D

geralmente no desenvolvem anti-D

Variao na expresso do antgeno RhD

Del
- expresso muito fraca do antgeno RhD : sempre

expresso

fenotipado como D negativo

- detectado por eluio
- mutaes de nico polimorfismo (SNP) no gene
- mutaes em stios de splice
- impedem a integrao com a membrana

- DEL RHD(K409K) encontrado nos raros Asiticos D

negativos e so C+ (28% dos Japoneses D-neg)

Variao na expresso do antgeno RhD

D Parcial
- tipagem D-positivo
- SNPs- extracelular
- OU muitos genes hbridos- regies do gene
RHD substitudas por RHCE

- novos antgenos e eptopos D alterados

podem desenvolver anti-D

Eptopos de D expressos na protena Rhce

DHAR, Crawford

RHD

RHCE
1

GENE RHD AUSENTE

10

Crawford
W16C

Q233E L245V

GENE RHD AUSENTE

exon D

Africanos

RoHAR DHAR
Caucasianos

Amino cido(s) D-especifico(s) na protena Rhce

causam reatividade com alguns anti-D monoclonais

Principais causas de discrepncias na tipagem RhD

Diferenas na reatividade de hemcias DHar

e Crawford+ com alguns reagentes anti-D
REAGENTE

Monoclonal IgM

IgG

DHar

Crawford

GAMA401

F8D8 monoclonal

POS

POS

Immucor Series 4

MS201

MS26 monoclonal

POS

NEG

Immucor Series 5

Th28

MS26 monoclonal

POS

NEG

Ortho BioClone

MAD2

Policlonal-humano

NEG

NEG

Diamed Gel

MS201

MS26 monoclonal

POS

NEG

Gammaclone

Hemcias DHar e Crawford+ so no-reativas com anti-D policlonal

Discrepncias na tipagem RhD ocorrem mais
com os reagentes monoclonais

Counts

1000

Quimeras D+/D- em indivduos ccee

10

2
10

10

10

0
0

Counts

1000

95% D neg + 5% D pos

Counts

1000

10

BMC Genet 2(2001)10

Fenotipados como D neg, genotipagem

indicada
Imungenicidade estabelecida
Todos os pacientes D neg que receberam quimeras
D+/D- desenvolveram anti-D

Tipagem RhD
Em doadores de sangue:
sangue
Objetivo: rotular as hemcias que apresentam o antgeno RhD como
RhD-positivo
Problemas:
D Fraco - alguns no so identificados mesmo com o teste da AGH
Del
- todos so tipados como RhD negativo

Estes fentipos podem estimular a produo de anti-D em

pacientes RhD-negativo
Importante: todos os Del e a maioria dos D fracos so herdados com C+ ou
E+, portanto podem ser removidos do pool de doadores RhD-negativo
realizando-se a fenotipagem dos antgenos C e E.

Tipagem RhD
Em pacientes e gestantes:
Objetivo: detectar todos que apresentam risco de desenvolver anti-D
Maioria dos D fracos- no apresentam risco de desenvolver anti-D
(raras excees)
D parcial risco de desenvolver anti-D, mas os fenotipados como
D positivo no so detectados
- mulheres em idade frtil e gestantes devem ser consideradas
RhD-negativo para fins transfusionais e profilaxia Rh
Problemas:
Testes sorolgicos no distinguem D fraco de D parcial
Mutaes de D fraco tambm podem alterar eptopos

Casos enviados ao nosso

laboratrio (2006)
RHD

Nmero

Discrepncias
D fraco tipo 2
D fraco tipo 1
D fraco tipo 4

Del (M295I)
DAU-2

4
16
17
1
2

40
D+ com anti-D
DAR
DIIIa
DIVa type 1
DIVb
DVI
DHMi

6
1
4
1
6
2

20

Aloimunizao anti-D por doadores

classificados como D neg.

D fraco tipo 2

 RHD(IVS5-38del4)
 1 imunizao

 1 imunizao
 Transfusion, 2000

D fraco tipo 1
 1 imunizao
 Vox Sang, 2004

D fraco tipo 26
 1 imunizao
na gestao

Fentipo DEL

 Transfusion, 2005

RHD (K409K)
 Tipo DEL mais prevalente
 1 imunizao secundria
 Transfusion, 2005

 Transfusion , 2005

Editorial na Transfusion 45(2005)466

Tipos de D fraco entre receptores

de sangue com anti-D

31 observaes desde 1998

D fraco: auto anti-D
n=24
D fraco tipo 4.0: auto anti-D *
n=3, baixo ttulo
D fraco: alo anti-D
n=4
D fraco tipos 4.2, 11 e 15


Blood 95(2000)2699
http://www.uni-ulm.de/~wflegel/RH/RIR/#title

Recomendao para a
tipagem RhD

Pacientes e gestantes

 2 anticorpos monoclonais IgM

 que nao detectam DVI

Doadores

 Anticorpo policlonal ou monoclonal IgG DVI+ ou

blend (IgM+IgG)
 teste da AGH em gel

Reagentes anti-D na deteco de D

fraco e D parcial (Policlonais: tubo/gel)
Amostras

Tipos de D fraco e
D parcial

Graus de aglutinao
Anti-D/AGH
(tubo)

Anti-D/AGH
(gel)

Densidades
antignicas

DF1

2+

3+

1273

DF2

1+

462

DF3

1+

3+

1936

13

DF4

2+

4+

2184

DAR

(+)

988

DHMi

1+

1112

DVI

1+

1050

DF1/DHMi

(+)

2+

1577

DF4/DAR

(+)

2+

1432

Reagentes anti-D na deteco de D

fraco e D parcial (Monoclonais: tubo/gel)
Amostras

D Fraco/ D
parcial

Clones de Anti-D IgM

Clones de Anti-D IgG/AGH

Densidades
antignicas

56

DF1

1273

15

DF2

462

28

DF3

1936

44

DF4

2184

DAR

988

DHMi

1112

DVI

1050

DAU-2

431

Clones IgM: MS201, P3X61, HM10, BS232, LDM3, MIMA 36

Clones IgG:ESD1, HM16, P3X35, P3X290, MS26, 175-2

D parcial

Anticorpos monoclonais IgM




Anticorpos monoclonais IgG







que nao detectam DVI

DII, DIII, DVI, DVa

que detectam DVI

DVI, DFR, DBT, RoHAR

Identificao em gel
Painel com 6 soros
monoclonais
HAR
DVII, DFR, DBT, R0

(DII, DIII, DIVa, DIVb, DV,

Painel com 12 HAR

soros monoclonais
DVII, DFR, DBT, R0

, DAR, DCS, DOL)

(DII, DIII, DIVa, DIVb, DV,

Implicaes Clnicas

Transfus
o de sangue RhD
+ em pacientes que apresentam
Transfuso
RhD+
os tipos de D fraco mais frequentes (DF1
-DF4) possibilta
(DF1-DF4)
um melhor aproveitamento dos estoques de sangue RhD
RhD-negativo
Gestantes com os tipos de D fraco mais frequentes n
o
no
necessitam de IgRh ((melhor
melhor utiliza
o da profilaxia Rh
utilizao
Rh,,
menor custo
custo))
Detec
o da maioria dos D fracos e D parciais em doadores
Deteco
de sangue aumentam a seguran
a transfusional e reduzem
segurana
os risco de aloimuniza
o
aloimunizao

Bases moleculares dos

fen
tipos RhD
-negativo
fentipos
RhD-negativo

Deleo do gene RHD: mais comum em
populaes Europias

Gene RHD intacto mas no expresso: comum
em populaes Orientais

Genes hbridos

Mutaes que geram stop codon prematuro

Inseres e delees que levam a altero no
quadro de leitura

Mutaes em stios de splice

RhD-negativo
Maioria dos Ingleses, 18% Africanos, 63% Japoneses, 80%
Brasileiros

RHD

RHCE

Rh SMP1
10 9 8 7 6
67% Africanos, 11% Brasileiros box

RHD

RHD

Rh
box

Rh SMP1
10 9 8 7 6
3 4 5 6 7 8 9 10
box

1
(C)ce
(C)cess

15% Africanos, 3% Brasileiros, 2% Japoneses

RHD em D neg
400 doadores de sangue brasileiros
RHD-

RHD
deletado

RHD+

D Fraco =4 (%)

DF1

377

D Parcial=6 (%)

DEL

DF2

DF5

DAR

DHMi

DVI

RHD(IVS3
+1(G>A)

dCes

RHD

Variantes RHCE
Problemas na fenotipagem do antgeno C
Em Africanos, Hispnicos, e grupos tnicos
mistos com um gene hbrido D-CE-D especfico
RHD

RHCE
ces
W16C

15 % D/Ce/D hbrido: D-negativo

L245V

Variante ce

C-positivo
Fentipo C positivo; desenvolve anti-C
Gene hbrido D-CE-D associado a variante e; desenvolve anti-e

Este hapltipo RH frequente em pacientes falciformes

aproximadamente 22% Africanos

Variantes RHCE
Problemas na fenotipagem do antgeno e
Em Africanos, Hispnicos, e grupos tnicos mistos
ce convencional

Muitos genes diferentes, todos com expresso alterada do antgeno e

ces
W16C

L245V

G336C

ceMO
W16C

V223F

ceEK
W16C

W16C

M238V R263G M267K

M238V L245V R263G M267K I306V

ceAR
ceBI

W16C

M238V A273V

L378V

Fentipo e-positivo
Desenvolvem anti-e e/ou anti-ce

Frequentes em pacientes falciformes

Reaes de monoclonais anti-e com

variantes e
Variante

Variante

MS16

MS16

MS21
MS21

MS63
MS63

MS69

MS69

MS70

MS70

hrs
(ceMO)

(+)

(+)

hrs
(ceAR)

1+

1+

(+)

1+

hrB
(ceEK)

1+

1+

1+

1+

1+

hrB
(ceS)
Cys16
(ce)
RN

1+

1+

1+

1+

1+

(+)

nt

(+)

(+)

Variantes RHCE
Fenotipagem E+ com anti-E
Categoria

Categoria

Mecanismo
Mecanismo

EI

Met167Lys (Ew+)

EII

RHCE(1)-RHD(2,3)-RHCE(4-10)

EIII

Gln333Glu e Met238Val em cE

EIV

Arg201Tyr em cE

Casos enviados ao nosso laboratrio

Variantes RHCE
RHCE

Nmero

Discrepncias e
ceMO hrsces
Cys16

1
4
6

Discrepncias C
(C)ces hrB-

Discrepncias E
E cat I

Aplicaes clnicas
Genotipagem RH

Pacientes com fentipos D fraco



Gestantes



D fracos mais frequentes devem ser transfundidos

com hemcias RhD pos (3 a 6% das unidades RhDneg so preservadas)
Diagnstico pr natal (genotipagem RHD fetal)
IgRh na gestao (D fraco tipos raros e D parcial)

Doadores de sangue


Triagem para DEL, D fraco e D+/D- quimeras entre

doadores sorolgicamente D neg (preveno da
aloimunizao)

Aplicaes clnicas
Genotipagem RH

Anti D e planejamento familiar

 Gentipo paterno para zigozidade RHD , se
me possue anti D (indicao da genotipagem
RHD fetal)
Variantes RHCE em pacientes e doadores
 Alteraes na expresso de C, e, E
 Alo anti-C, -e, E na presena dos respectivos
ags
 Ausncia de um ag de alta frequncia
(preveno da aloimunizao e RTH)

CASO CLINICO
 Paciente masculino descendente de Africanos
 64 anos
 Portador de anemia falciforme, politransfundido
 Solicitado 2 unidades de sangue
 PAI positiva/Autocontrole negativo
 Anticorpos identificados no soro: antianti-Jkb
 Fenotipagem: R1R2, KK-, Fy(aFy(a-b-),Jk(a+b),Jk(a+b-)
 Provas de compatibilidade:
hemcias R1R2, Jk(bJk(b-)

incompatveis

com

CASO CLINICO
 Identificado antianti-D, -C (auto, alo??)
 Paciente D+, C+
 Encaminhado para genotipagem

RH*D, RH*cc,
RH*Ee, KEL*2/KEL*2, FY*B/FY*B GATA
mutado, JK*A/JK*A

 Gentipo

do

paciente:

 Genotipagem complementar

GENOTIPAGEM COMPLEMENTAR

I4
C
c

VS+

VS-VS

RHD-CE-D

RH*D, RH*cc

Ex7

(C)ces (rs)

100 pb

GENOTIPAGEM COMPLEMENTAR

425 pb
294 pb
131 pb

DIIIa

GENOTIPAGEM COMPLEMENTAR

rs
V-VS+
L245V

G336C

L245V

DIIIa
602C>G
455A>C

667T>G

G336C

CONCLUSO

 Genotipagem do paciente: RH*DRH*D-CECE-Ds, RH*DIIIa

 Fenotipagem do paciente: B, D+C+E+c+e+, VS+
(R2rs), D parcial categoria IIIa
 Paciente aloimunizado com antianti-C, antianti-D, antianti-Jkb,
anti--hrB?
anti
 Sangue selecionado para a transfuso: rr, Jk(bJk(b-)

Mosaic nature of the Rh0 factor of

human blood

Com a publicao de inmeros relatos descrevendo novas
especificidades de anticorpos Rh-Hr, a sorologia e
nomenclatura destes tipos sanguneos esto se tornando cada
vez mais complexas.

O nmero de fatores sanguneos caracterizando cada
aglutingeno Rh-Hr parece estar limitado principalmente pelo
custo e ingenuidade na procura e identificao de novos
anticorpos (Wiener, 1957)

Wiener e colbs. Experimental Medicine and Surgery, 1957;15:75-81

Perspectivas futuras

Futuro


Genotipagem em larga escala, ex.chips RHD,

RHCE incluindo variantes

Limitaes



Muitas regies do gene devem ser analisadas

Necessrio estudos populacionais principalmente
em populaes miscigenadas
Algortimo complexo para interpretao

Perspectivas futuras
Gen
Gentipo

Fen
Fentipo

+
aglutinao

DNA