Aplicações da Citometria de Fluxo

no diagnóstico oncohematológico
Dra. Nydia Strachman Bacal
Hematologista e Patologista Clínica
Aplicações da Citometria de Fluxo no diagnóstico
oncohematológico

Dra. Nydia Strachman Bacal

Hematologista e Patologista Clínica
Essas partículas estão suspensas em meio líquido
 CÂMERA DE FLUXO

FOCO HIDRODINÂ
HIDRODINÂMICO

LASER

Orifício
Orifíciocom
com
Diâmetro:
Diâmetro:5050aa250
250µm
µm

Sistema que gera um fluxo contínuo laminar de partículas,

que passam uma a uma frente a um feixe de laser
 Fotomultiplicadores

FSC Sensor

Impulsos elétricos
Sinais analógicos

Freq
Sinais digitais
Fluorescence

Distribuição por frequência Detector de Fluorescência

(FL1,FL2, FL3 e FL4)
Histogramas (tubos fotomultiplicadores)
 Lasers - Fluorocromos
Fluorocromo Laser (nm) Emissão (nm)
FITC 488 525
R-PE (PE) 488 575
Pe-Cy5 (TC1) 488 667
PerCP (BD2) 488 675
PerCP/Cy5.5 (BD) 488 695
7-AAD 488 655
Iodeto de propidium 488 570

Texas Red 595 615

APC 633, 635 660

Cy5 633, 635 667
 Citometria de Fluxo
Imunofenotipagem
• Análise da expressão antigênica das células através
da ligação antígeno – anticorpo - fluorocromo

Anticorpos monoclonais
designados “CDs”
Clusters of differentiation
ligam-se as células nos
determinantes antigênicos
ou epítopos em sua
membrana,
citoplasma e
intranuclearmente.
Citometros de Fluxo - Fluorocromos

FITC PE PE-TR PE-Cy5 PE-Cy5.5 PE-Cy7 APC/Cy5 APC-Cy7 Alexa405 Alexa450

CYAN 1 2 3 4 4 5 6 7 8 9

FACScan 1 2 3 3 3

FACSalibur 1 2 3 3 3 4

FACSCanto 1 2 3 4 5 6

FC500 1 2 3 4 4 5 6

XL 1 2 3 4 4 4
 ALGUMAS APLICAÇÕES CLÍNICAS ATUAIS

• Análise do conteúdo de DNA

• Quantificação de reticulócitos
• Análise da Subpopulação Linfocítica
• Diagnóstico e acompanhamento de Leucemias e Linfomas
• Diagnóstico e acompanhamento de Mieloma Multiplo
• Mielodisplasia / Doenças Mieloproliferativas
• Diagnóstico de Hemoglobinúria Paroxística Noturna
• Detecção de Anticorpos Antiplaquetários
• Disfunção plaquetária
• Quantificação de células progenitoras (stem cell)
• Detecção de Células Neoplásicas não hematopoéticas
• Monitoramento Quimioterapia / Doença Residual Mínima
• Avaliação imunológico de paciente transplantado e de infusão linfocitária

Outras aplicações : Estudos da função celular, Apoptose, MDR (Múltipla

Resistência à Drogas) , Procedimentos em Hemoterapia (Detecção de Anticorpo
em Anemia Auto-imune, Detecção de hemorragia feto materna, Controle de
Qualidade de Leucodepleção, etc...) , HLA-B27, Teste de Antígeno Leucocitário
(HLA) e Cross Match.
Análise da Subpopulação Linfocítica
IMUNODEFICIÊNCIA ADQUIRIDA

Anti-CD3 PerCP

Anti-CD8 PE

Anti-CD4FITC

Anti-CD3 PerCP

Anti-CD16 /CD56PE

Anti-CD19 FITC
Aplicações:

Monitorar Imunodeficiência Adquirida (AIDS)

Imunofenotipagem de Linfomas
Imunofenotipagem de Leucemias
Monitorar transplantes
Monitorar sistema imunológico
Função plaquetária
Estratégia de Gates
janelas

1. FS x SSC
tamanho x granularidade

2.CD45 x SSC

3. Gates sequenciais
•CD19
•CD3
•CD138
•CD34
EXPRESSÃO DO CD45 em Leucemia
Aguda
Diagnóstico e acompanhamento de
Leucemias, Linfomas e Mieloma

• Leucemias agudas
• Linfóides x Mielóides

• Leucemias Crônicas
• Linfocítica, Mielomonocítica
• Linfomas leucemizados
• Discrasia de Células Plasmáticas
 Diferenciação Granulocítica – MO normal
Painéis de anticorpos monoclonais

I II III IV V

Mieloblasto Pro- Mielócito Meta- Neutrófilo

mielócito mielócito
Bastão
CD34
CD117 CD117
HLA-DR
CD13+forte CD13+forte CD13+fraco CD13+ CD13+forte
CD33+forte CD33+forte CD33+fraco CD33+fraco CD33+fraco
CD15 CD15 CD15 CD15
CD11b CD11b CD11b+forte
CD16 CD16+forte

CD34/CD117/CD45/CD13.33

CD16/CD13/CD45/CD11b
Dra.Silvia Ines Pires Ferrreira – Hemosc/ Sta Luzia -SC
 LMA M3

CD45xSS CD2xCD45

HLA-DRxCD45 CD34xCD45 MPO(c)xCD45 CD56xCD45

CD33xCD45 CD13xCD45 CD117xCD45 CD71xCD45

 Diferenciação Linfóide B – MO Normal
Painéis de anticorpos monoclonais
I II III IV V

Pró B Pré-pre-BI Pré-pre-BII Pré-pre-BIII Madura Plasmática

CD34 CD34 imatura B IV
TdT TdT (TdT)
CD10+forte CD10+forte CD10+fraco
CD19 CD19 CD19 CD19 CD19
CD22 CD22 CD22 CD22 CD22+forte
CD45+fraco CD45+fraco CD45 CD45+forte CD45-/+
CD20+fraco CD20 CD20+forte
Cit Igµ Cit Igµ Cit Igµ
IgM sup. IgM sup.

TdT/CD20/CD19/CD10

CD34/CD22/CD19/CD45
Marcações Alternativas

sIgĸ/sIgλ/CD20/CD10 Cit Igµ/ Igµ sup /CD20/CD10

Dra. Silvia Ines Pires Ferrreira – Hemosc/ Sta Luzia - SC
 LLA B MADURA
LINFOMA DE BURKITT

TdTxCD19
CD45xSS

CD34xCD45 CD20xCD45 CD22xCD45 KAPPA(sup)xCD19

CD19xCD45 HLA-DRxCD45 CD10xCD45 IgM (sup)xCD19

ASF, 28a – LMA M0

P.O. 32a – LMA M0

LLC- B: Células linfóides B com restrição de cadeia leve monoclonal para kappa
baixa expressão e expressão antigênica de CD5+ e CD20+ baixa expressão
Leucemia de Células Cabeludas - Hairy cell
Mieloma Múltiplo
 Mieloma Múltiplo

Histograma de Tamanho x Complexidade Histograma CD138 x Complexidade

 Mieloma Múltiplo

Histograma de Monoclonalidade em Kappa intracitoplasmática

 Mieloma Múltiplo

CD56 x CD138 CD19 (-) nas células CD138 (+)

 Mieloma Múltiplo

Histograma CD45 x CD138 Histograma HLA-DR x CD138

 Mieloma Múltiplo

Histograma de Conteúdo de DNA com

Hiperdiploidia
 Mielodisplasia
• PAPEL DA IMUNOFENOTIPAGEM POR
CITOMETRIA DE FLUXO

• Técnica complementar / análise dentro de

um contexto
• Quantificar blastos de forma exata
• Discriminar Mieloblastos de Promielócitos e dos
Pró-monócitos
• Estudo de mudanças fenotípicas na MDS
M.O normal
Normal: CD34:2%

MO nl
 SÍNDROME MIELODISPLÁSICA
FENÓTIPO ALTERADO QUALITATIVAMENTE

Expressão antigênica assincrônica

CD34/CD15/HLA-DR(-)
Expressão antigênica diminuída ou aumentada
CD45 fraca em Monócitos
CD33 intenso / HLA-DR(+) em Neutrófilos
Coexpressão aberrante
CD56 em monócitos /CD2 ou CD19 em linhagem granulocítica

FENÓTIPO COM ALTERAÇÕES NUMÉRICAS

Linhagem celular ou maturação

Aumento de células CD34(+) - mielóide, aumento de células monocíticas e
eritróides e diminuição de neutrófilos
M.C.DelCanizo et al Immunophenotypic analysis of myelodysplastic syndromes
Haematologica/Journal of hematology vol.88(04):april 2003
 MYELOBLAST PROMYELOCYTE MYELOCYTE META- BAND/
MYELOCYTE NEUTROPHIL

CD13

CD13
103 CD15
CD11b
CD33

CD35

102

CD65 CD64
CD10
101

CD16

CD34
CD117 CD54
HLA-DR

Dr Alberto Orfao - Contribuição dos Estudos Imunofenotípicos na caracterização

das Síndromes Mielodisplásicas – Florianópolis - Setembro de 2004
 MYELOBLAST PROMYELOCYTE MYELOCYTE META- BAND/
MYELOCYTE NEUTROPHIL

CD13

CD13
103 CD15
CD11b
CD33

CD35

102

CD65 CD64
CD10
101

CD16

CD34
CD117 CD54
HLA-DR

Dr Alberto Orfao - Contribuição dos Estudos Imunofenotípicos na caracterização

das Síndromes Mielodisplásicas – Florianópolis - Setembro de 2004
 HPN - Hemácias

Ausência de expressão antigênica Ausência de expressão antigênica

do CD59 em 34,9% das células do CD55 em 46,5% das células
identificadas por Glicoforina A identificadas por Glicoforina A
 HPN - Neutrófilos

Controle normal: CD55(+) = 99,8% Ausência de expressão antigênica do

CD55 em 97,7% dos neutrófilos.
 HPN - Neutrófilos

Controle normal: CD59 (+) = Ausência de expressão antigênica de

100,0% CD59 em 82,7% das células
identificadas pelo CD13.
 HPN - Monócitos

Controle normal: CD14(+) = 99,8% Ausência de expressão do CD14 em

98,3% das células CD 64 (+)
 Pesquisa de Anticorpo Anti-plaquetas
Método Direto
Total de casos 115 pacientes com plaquetopenia.
Amostra: 10 ml de sangue em EDTA.
Equipamento: Citômetro de Fluxo – EPICS XL-MCL da Beckman Coulter
Material:
- Anti-Human IgG FITC conjugate SIGMA (F-1641)
- CD41 ou CD61 PE Immunotech (PN – IM1416)
- Tampão PBS-EDTA
Método:
As Plaquetas separadas do sangue total coletada em EDTA, são
lavadas e marcadas com CD41PE e IgG FITC e analisadas no Citômetro de
Fluxo.
João Carlos C. Guerra, MD, Ruth H Kanayama, PhD, Sonia S.Nozawa, PhD, Márcia R. Ioshida, PhD, Irina Y Takiri, PhD, Robson J. Lazaro, PhD, Nelson
Hamerschlak, MD, Luiz Gastão M. Rosenfeld, MD, Celso Carlos C. Guerra MD and Nydia S. Bacal, MD. Low Platelet Counts: Diagnosis Using Flow
Cytometry and Anti Platelet Antibody – Blood (ASH Annual Meeting Abstracts) 2006 108: abstract 3966.
Controle Negativo CSM, 20 anos ,masc.
CSM
Plaquetas – 375.000/mm³ Plaquetas – 65.000/mm³

0.114

1.47
AVS

AVS, 31 anos, fem.

Plaquetas – 16.000/mm³
O antígeno está ausente ou presente em baixa expressão em pacientes com
Síndrome de Bernard-Soulier é identificado pelo anticorpo CD42b que é
específico para a glicoproteina plaquetária GPIb
Essa glicoproteina plaquetária serve como receptor para o Fator Von Willebrand
e tem alta afinidade ao receptor de trombina.
CD42a(GPIX), CD42d(GPV) raramente utilizadas.
CD41 (GPIIb) and CD61 (GPIIIa) – Trombastenia de Glanzmann
Quantificação de células progenitoras
CD34 (+) - Citometria de Fluxo

Protocolo “ISHAGE”
Plataforma dupla

Sangue periférico
Medula Óssea
Aférese
Cordão Umbilical
Marcação fluorescente ligada ao
cálcio permite o estudo de
ativação celular
 Imunofenotipagem – Paineis
Proliferativos - utilizados no HIAE
1. Leucose Aguda :
• MPO, CD79a, CD3intra e/ou
• CD45 x SS
• Primeiro passo : 2 CD por linhagem
CD2-CD7 / CD10-CD19 / CD13-CD33 /CD4-CD14(My4) e
CD34 / HLA-DR
• Conforme linhagem segue com outros Atc específicos :
– CD20, CD22, IgM intra, Kappa e Lambda intra e/ou sup.
– CD 3sup., CD38, CD5, CD8
– raramente TdT
– CD11b, CD14(MO2), CD15, CD41,CD64, CD71, Glicoforina A, CD117
 Imunofenotipagem – Painéis Proliferativos
utilizados no HIAE
2. Doenças Linfoproliferativas B
„ CD19 (+) ou CD20(+) ou CD138 :
„ CD5, CD10, CD11c, CD22,CD23,CD25, FMC- 7; IgM,
„ Kappa e Lambda intra ou sup.,CD103, IgG,CD38,
„ CD56 e HLA-DR

„ 3. Doenças Linfoproliferativas T
„ -CD2, CD3intra e sup., CD4, CD5, CD7, CD8,
„ -CD11b, CD16, CD25, CD38, CD56, CD71 e HLA-DR,

„ Outros CD disponíveis:
„ -CD30, CD1-A, CD79b, IgG, IgD e IgA, TCRαβ/TCRγλ,
„ Ti -gamma.
 LEUCEMIA AGUDA
Painel inicial
FITC PE PE-Cy5
MPO c CD79a c CD3 c
CD15 CD33 CD45
CD2 CD7 CD45
HLADR CD34 CD45
CD10 CD19 CD45
IgG1FITC IgG1PE CD45PE-Cy5

LLA-B LMA LLA T

FITC PE PE-Cy5 FITC PE PE-CY5 FITC PE PE-Cy5
CD22 CD20 CD45 CD14 CD45 CD5 CD1a CD45
kappa CD19 CD15 CD13 CD45 TCR g//d TCR al/b CD45
Lambda CD19 CD71 glicofor. CD45 CD8 CD4 CD3
IgM c CD41 CD117 CD45
CD38 CD56 CD45
CD22c ? CD64 CD11b CD45
CD4 CD45
Doenças Linfoproliferativas Crônicas
Painel inicial

FITC PE PE Cy-5
HLA DR CD20 CD19
CD2 CD7 CD3
IgG IgG IgG

linoproliferativa B linfoprolifertativa T Plasmocitária

FITC PE PE Cy-5 FITC PE PE Cy-5 FITC PE PE-Cy5
kappa CD19 CD8 CD4 CD3 CD138 CD117 CD19
Lambda CD19 CD16 CD56 CD3 CD38 CD56 CD19
CD5 CD20 CD19 CD25 CD56 CD3 CD138 CD56 CD117
CD22 CD23 CD19 CD5 HLADR CD3 CD138 CD38 CD117
FMC7 CD11c CD19
CD79b CD38 CD19
CD103* CD25* CD19* *somente p/ HCL
IgM
IgD
IgG

CD30 CD15
CD15

** Para suspeita de Linfoma de Hodgkin ou Linfomas agressivos

de grandes células, marcar com CD30 e CD15.
 IMUNOFENOTIPAGEM PAINEL PROLIFERATIVO
NOVEMBRO/1991 A JULHO/2007

PATOLOGIAS N° DE CASOS

LEUCEMIAS AGUDAS 1954 (31,3%)

LMA 1084 (17,4%)
LLA 854 (13,7%)
L. Bifenotipica 16 (0,2%)

NEOPLASIAS DE CÉLULAS B MADURAS 1441 (23,1%)

DLPC-B/LNH-B 1238 (19,9%)
NEOPLASIAS DE CÉLULAS PLASMÁTICAS 203 (3,2%)
DLPC-T / NK 83 (1,3%)

DOENÇAS MIELOPROLIFERATIVAS CRÔNICAS 55 (0,9%)

SMD e LMMoC 79 (1,3%)

Linfoma de Hodgkin 1 (0,02%)
MO SEM DOENÇAS ONCOHEMATOLOGICAS, CONTROLES 2589 (41,5%)
PÓS TRATAMENTOS, MO NORMAL e OUTRAS PATOLOGIAS
HEMATOGONIAS 30 (0,49%)
6232 (100%)
 Imunofenotipagem de Doenças
Oncohematológicas – nov/91 a julho/07
Nº total de casos analisados: 6 234
Diagnósticos acima de 60 casos entre os 6234
casos nov/91 a julho/07
OBRIGADA PELA ATENÇÃO !
Nydia S. Bacal

nsbacal@einstein.br

Grupo de Citometria de Fluxo do

Laboratório Clínico HIAE - 2007

Ana Claudia Miranda Brito

Alexandra M.P. Cavalcante
João Carlos de C. Guerra
Sonia Tsukasa Nozawa
Ruth Hissae Kanayama
 Citometro de Fluxo- nova geração

FC – 500 – Beckman Coulter

HIAE: 35%

Laboratórios

1991 - 1ª geração Epics Profile II Externos: 65%

1994 - 2ª geração Epics XL – MCL

2007 - 3ª geração FC – 500
• Imunofenotipagem Linfocitária
• Imunofenotipagem em doenças
oncohematológicas
• Quantificação de células CD34+
• Pesquisa de HPN
• Avaliação de disfunção e ativação plaquetária
• Analise do conteúdo de DNA
Fotomultiplicadores captam a fluorescência Impulsos elétricos/
Sinais analógicos

Sinais digitais

Distribuição por frequência/

Histogramas

R1
 Fenotipos alterados Síndrome Mielodisplásica
Dr Alberto Orfao - Contribuição dos Estudos Imunofenotípicos na caracterização
das Síndromes Mielodisplásicas – Florianópolis - Setembro de 2004

Anormalidades Stetler-Stevenson et al Wells et al

Imunofenotípicas Blood, 2001 Blood, 2003

Mieloblastos
Números anormais 24/42 (53%) 72/115 (62%)
CD2+ 12/45 (27%) NR

Maturação de neutrófilos:
SSC anormal 35/45 (84%) 9/115 (8%)
CD45Be NR 4/115 (3%)
Padrão anormal CD13/CD16 21/27 (78%) 27/115 (23%)
Relação anormal HLADR/CD11b NR 6/115 (5%)
Padrão anormal CD11b/CD16 19/27 (70%) NR
Desvio à esquerda assincrônico NR 26/115 (23%)
CD56+ 7/33 (21%) 18/115 (16%)
CD33- NR 6/115 (5%)
CD34+ NR 7/115 (6%)
Presença de Ags linfóides 17/45 (38%) 4/115 (3%)
 Fenotipos alterados Síndrome Mielodisplásica
Dr Alberto Orfao - Contribuição dos Estudos Imunofenotípicos na caracterização
das Síndromes Mielodisplásicas – Florianópolis - Setembro de 2004

Anormalidades Stetler-Stevenson et al Wells et al

Imunofenotípicas Blood, 2001 Blood, 2003

Células Monocíticas
SSC anormal NR 1/115 (1%)
CD13- ou CD16- NR 1/115 (1%)
Relação anormal HLADR/CD11b NR 5/115 (4%)
CD56+ 11/33 (33%) 19/115 (17%)
CD33- or CD14- NR 3/115 (3%)
CD34+ NR 14/115 (12%)
Presença de Ags linfóides NR 38/115 (33%)

Células Eritróides
CD71 alterado, GphA ou CD45 34/44 (77%) NR

Células Megacariocíticas
Número aumentado 26/44 (59%) NR