ANALÍTICA AVANÇADA – 2S 2011

Aulas 5 e 6

Espectrofotometria no UV
UV--Vis

Prof. Rafael Sousa

Departamento de Química - ICE

rafael.arromba@ufjf.edu.br

Notas de aula: www.ufjf.br/baccan

 ESPECTROFOTOMETRIA
ABSORÇÃO molecular no UV
UV--Vis

FLUORESCÊNCIA molecular no UV
UV--Vis

Plano de aula:
aula:
- Definição de “espectrofotometria”
- Aspectos conceituais da ABSORÇÃO MOLECULAR
- Medidas de absorção e análises quantitativas
- Instrumentos para análises espectrofotométricas
- Aspectos práticos
- A quimioluminescência
- Espectrofluorimentria (princípios e aplicações)
- Instrumentação para espectrofluorimetria
 Bibliografia

“Análise Instrumental”
F Cienfuegos, D Vaitsman; 2000

“Vogel - Análise Química Quantitativa”

GH Jeffrey e col., 6a ed., Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2002

“Análise Química Quantitativa”

D. Harris; 7a ed., 2008

“Principles of Instrumental Analysis”

Analysis”
DA Skoog, FL Holler, TA Nieman; 5th ed., 1998

Tutoriais dos fabricantes de espectrofotômetros

 Espectrofotometria - DEFINIÇÃO

Espectrofotometria:
Espectrofotometria:
Medida da luz que é absorvida ou emitida por uma espécie química

Espectro obtido para o Β-caroteno Espectro obtido para Ag coloidal

Espectrofotometria - APLICAÇÕES
 ANALITOS ORGÂNICOS

Alguns exemplos:
Compostos nitrogenados
Fármacos (àc
(àc.. acetil salicílico)
Fenóis
Gorduras (colesterol)

 ANALITOS INORGÂNICOS

Alguns exemplos:
Íon cloreto
amônia, fosfato, nitrato e sulfaTO
Elementos metálicos em geral, As e B
ASPECTOS CONCEITUAIS
LUZ  O espectro eletromagnético

(nm)
 Aspecto ondulatório da radiação eletromagnética

 Relação entre comprimentos de onda e energia

 Ondas com dif. “comprimentos de onda” (λ)  dif. cores (Vis)

 Análises instrumentais: medidas de “frações” específicas de luz

(visível ou não)  MÁXIMOS DE ABSORÇÃO
Aspecto ondulatório da radiação eletromagnética

Relação entre comprimentos de onda (λ) e energia (E)

Modelo matemático

h= constante de Planck (6,63 10-34 Js) hc

E=hν=
c= veloc. luz no vácuo (2,99 108 ms-1) λ

 E é inversamente proporcional ao λ
Na espectrofotometria os “máximos de absorção” são a principal
diferença que se observa no espectro de substâncias diferentes:
fenômeno “menos energético”

Espectro obtido para o Β-caroteno Espectro obtido para Ag coloidal

O que faz a absorção da luz
ser diferente ?
 As substâncias absorverem radiação por causa dos
Grupos Cromóforos
Cromóforos

Grupos cromóforos:
São grupos funcionais que apresentam absorção característica na região do
ultra--violeta ou do visível
ultra

Ex: Carboxila (- COOH):

Ex: COOH): 200 – 210 nm

Absorve em vários
comprimentos de onda diferentes
(vários grupos funcionais)
As substâncias absorverem radiação por causa dos
Grupos Cromóforos
Outros grupos cromóforos:

Carboxila (-
(- COOH): 200 – 210 nm

Aldeído (-(-CHO): 210; 280 – 300

Amino (-NH2): 195
Brometo (- (-Br
Br):
): 208
Dissulfeto (-S-S-): 194; 255  Substâncias diferentes
Éster (-
(-COOR): 205
Éter (-
(-O-): 185  Diferentes grupos funcionais
Nitro (-
(-NO2): 210
Nitroso (-(-NO): 302
Tiocarbonila (=C=S
(=C=S--): 205
Tioeter (-S-): 194; 215
Tiol (-
(-SH): 195
As substâncias absorverem radiação por causa dos
Grupos Cromóforos
Processo de absorção da radiação: diferentes tipos de transições eletrônicas

Cada transição eletrônica vem “acompanhada” de uma transição rotacional e

vibracional  Espectros na forma de banda

Níveis de energia
vibracional

Níveis de energia
eletrônicos
As substâncias absorverem radiação por causa dos
Grupos Cromóforos

Exemplificando as diferenças entre as substâncias:

substâncias:
Composto Orbitais envolvidos na λ máx (nm)
transição eletrônica
CH4 σσ* 122
CH3Cl nσ* 173
CH2=CH2 ππ* 162
Me2C=O ππ* 185
nπ* 277
H2C=CH-CH=CH2 ππ* 180
ππ* 200
ππ* 255

Essas transições eletrônicas ocorrem entre níveis de energia que

diferem de 10 a 100x em energia
As substâncias absorverem radiação por causa dos
Grupos Cromóforos
 Processo de absorção da radiação envolvem:
 Transições eletrônicas (UV
(UV--Vis
Vis))
 Transições vibracionais (Infravermelho
(Infravermelho médio e próximo)
próximo)

Envolvem diferenças
energéticas menores

Cada nível de
ENERGIA VIBRACIONAL (e
(en):
Subníveis de
ENERGIA ROTACIONAL

Envolvem diferenças
energéticas ainda menores
ENTRETANTO átomos no estado gasoso também podem absorver
radição no UV
UV--Vis
Exemplos de medidas ESPECTROSCÓPICAS

EspectroMETRIA
EspectroMETRIA ATÔMICA

EspectroFOTO
EspectroFOTOMETRIA
METRIA MOLECULAR
ENTRETANTO átomos no estado gasoso também podem absorver
radição no UV
UV--Vis
Representação das transições eletrônicas que podem ocorrer no átomo de sódio

 NaCl
Representação genérica para os elétrons que sofrem
transições em medidas espectroscópicas:

 NA PRÁTICA, a região do UV-

UV-Vis importante para a
espectrofotometria no UV-
UV-Vis vai de 180 a 780 nm
 PARA “CASA”
1) Explicar porque os espectros abaixo apresentam perfis diferentes,
considerando que os espectros de absorção moleculares são geralmente bandas
e não picos estreitos.
O processo de absorção da luz no laboratório

1ª etapa:
etapa:
excitação eletrônica da molécula “M”

M + hv  M*

2ª etapa:
etapa:
relaxação

M*  M + calor

M*  M´ + M´´ (fotodecomposição
fotodecomposição))

M*  M + hv´
hv´ (luminescência)
Característica dos processos de absorção na região do visível

 A cor de uma espécie em solução é a cor complementar

àquela do comprimento de onda que absorve:

Solução verde-
verde-amarelada absorve violeta
amarela violeta--azul
violeta
laranja azul
vermelha azul--verde
azul
púrpura verde
violeta verde
verde--amarelo
violeta--azulado
violeta amarelo
azul laranja
azul--esverdeado
azul vermelho
verde púrpura

 A região que contem o λ de máxima absorção de uma espécie de

interesse pode ser prevista se a solução da amostra for colorida...
 Medida de absorção e análise quantitativa

Medidas de absorção (A):

- Obtidas a partir de medidas de transmitância (T)

- Quanto maior a transmitância,

menor a absorbância

A= - log T= log P0/P

A absorbância aumenta com a conc. da espécie absorvedora
- depende da substância (absortividade molar)
- depende do espaço físico ocupado pela amostra (caminho óptico)
 Medida de absorção e análise quantitativa

Representação gráfica para soluções de KMnO4 em λ = 545 nm e um caminho

óptico de 1 cm.

a) Em %Transmitânci
%Transmitânciaa versus c

a) b) Em Absorbância versus c
Relação entre absorção e concentração = ANÁLISE QUÍMICA
(Lei de Lambert-
Lambert-Beer
Beer))

Johann Heinrich Lambert (1728 – 1777 1777)) observou que

a intensidade da luz transmitida por um meio absorvedor
era proporcional à espessura do meio pelo qual a luz passava

August Beer (1825 – 1863

1863)) observou que a intensidade da
luz transmitida por um meio absorvedor era proporcional à
concentração da espécie absorvedora
 Relação entre absorção e concentração = ANÁLISE QUÍMICA
(Lei de Lambert-
Lambert-Beer
Beer))

 A=abC
a= absortividade molar (ε
(ε: L mol -1cm-1)
b= caminho óptico (cm)
C= concentração em (mol L-1)
α=ab

Concentração

Relação linear entre A e Conc. se as medidas são feitas em

condição de caminho óptico constante 

 APLICAÇÕES DA equação da reta: A = α C

- Concentrações desconhecidas
- OU determinar o valor de a para se obter o de ε
 Determinação da Concentração
1) PREPARAR PADRÕES DE CALIBRAÇÃO  TÉCNICA INSTRUMENTAL

PADRÕES: Soluções semelhante à solução de amostra

PADRÕES:
(ANALITO))
com concentração conhecida da espécie de interesse (ANALITO

AMOSTRA ou SOLUÇÃO DE AMOSTRA ?

Geralmente a amostra é analisada na forma de uma solução aquosa

Ex: Determinação de Fe3+ em tecido animal

Ex:

amostra preparo (ou tratamento) solução de amostra

laboratorial da amostra
 Determinação da Concentração
2) Calcular os limites de detecção (LD) e de quantificação:
Menor quantidade que pode ser detectada com razoável certeza para um dado
procedimento analítico (IUPAC)

y = ybco + 3xSdbco ⇒ em termos de sinal

LD = (C
(Cbco + 3xSdbco)/S ⇒ em termos concentração

LQ = (C
(Cbco + 10xSdbco)/S ⇒ em termos concentração

LD = limite de detecção

LQ = limite de quantificação (o INMETRO recomenda usar o primeiro ponto da curva analítica de calibração)

y = menor sinal medido

ybco = sinal do branco

Cbco = concentração do branco (considerado = zero)

Sdbco = desvio padrão do branco (n= 10 no mínimo)

S = Sensibilidade do método (coef

(coef.. angular da curva analítica (α
(α))
 Determinando a Concentração de Misturas
(Dois analitos
analitos:: M e N: ADITIVIDADE DA LEI DE BEER)

A´  ε’s devem ser conhecidos em

(λ’ e λ’’)
todos os comp. onda (λ
A´´

Considerar as espécies
independemente (não existe interação)

A’ = ε’M . b . cM + ε’N . b . cN

A’’ = ε’’M . b . cM + ε’’N . b . cN

Resultado  cálculos matemáticos (resolução de sistemas ou Quimiometria)

Quimiometria)
OUTROS ASPECTOS DA LEI DE LAMBERT
LAMBERT--BEER

Válida para:
para:

- Soluções diluídas (C < 0,01 mol L-1)

- Radiação monocromática
- Meio homogênio e estável

 Todas as medidas (padrões e amostras) : celas o mais “parecidas” possíveis

Para compensar perdas de potência da radiação incidente por reflexão e espalhamento
 Desvios da Lei de Lambert-
Lambert-Beer ...

1) Interações entre os centros absorvedores e instabilidade química

 DESVIO REAL DA LEI DE BEER

Ex de instabilidade química
química::

equilíbrio entre os ânions dicromato e cromato

Cr2O72- + H2O 2H+ + 2CrO

CrO42-
350 nm 373 nm

 Espécies que podem participar de equilíbrio químico em solução

devem ser analisadas em um meio onde apenas uma espécie predomine
 PARA “CASA”

2) Suponha que a análise de um fármaco deva ser feita em triplicata, por um

método espectrofotométrico e que a espécie absorvedora apresenta um máximo de
absorbância que varia com o pH da solução de amostra. Descreva
Descreva,, resumidamente,
como essa análise deveria ser feita, considerando desde o preparo da amostra até a
obtenção do resultado final.
 Desvios da Lei de Lambert-
Lambert-Beer
2) Influência de erros instrumentais
(λ inadequado, radiação policromática ou espúria)
 DESVIO APARENTE

Ex de erro instrumental
instrumental::

I
II
I II

A A

Comprimento de onda Concentração

Instrumentação (ESPECTROFOTOMETRIA = TÉCNICA INSTRUMENTAL)

FOTÔMETROS
(COLORÍMETROS) ESPECTROFOTÔMETROS

Visível Ultra-violeta e visível

Ultra-
-Filtros ópticos (380 – 780 nm)
nm) - Monocromadores (200 – 1000 nm)
nm)

Componentes básicos (duas configurações: a e b):

Seletor de Detector Processador

Fonte de Amostra Comprimento a
Luz de Onda hν Fotométrico 0.102 UA

Seletor de Detector Processador

Fonte de Comprimento Amostra b
Luz de Onda hν hν Fotométrico 0.102 UA
Instrumentação
1) FONTE DE LUZ

REGIÃO DO ULTRA-
ULTRA-VIOLETA REGIÃO DO VISÍVEL

200 nm 390 nm 800 nm

• Lâmpadas de Deutério • Lâmpadas de filamento de Tungstênio

• Lâmpadas de Hidrogênio
320 – 2500 nm
160 – 375 nm podem ser halógenas (W-I2)
- maior durabilidade

• LEDs
(diodos emissores de luz)

• Lâmpadas de Xenônio
FONTE DE LUZ

Emissões, por comprimento de onda, das principais lâmpadas

para espectrofotometria
Instrumentação
2) SELETOR DE COMPRIMENTOS DE ONDA

 Isolar faixas estreitas de comprimentos de onda

 Diferentes dispositivos - Filtros

complexidade e largura da faixa de λ - Monocromadores

FILTROS:

- Constituídos por uma ou mais substâncias

- Isola bandas com no mín. 50 nm de largura
- Usado na região do visível
- Baixo custo
Instrumentação
SELETOR DE COMPRIMENTOS DE ONDA
FILTROS:

 Fluoreto de cálcio ou magnésio

 Constituído por várias camadas

Dielétrico com espessura de
mesma ordem do λ desejado
- Passa apenas 1 λ e seus múltiplos
- Isola bandas com até 10 nm de largura
- Pode ser usado tanto no UV como no visível
- Custo maior que o filtro de absorção
t= espessura do dielétrico
η= índice de refração
n= ordem de interferência
Instrumentação
SELETOR DE COMPRIMENTOS DE ONDA

FILTROS

os de interferência são mais eficientes:

(larguras a meia altura)

 Filtros servem para faixas específicas de λ

 Monocromadores: isolam bandas estreitas ao longo do espectro

- Mais versáteis
- Custo mais elevado que os filtros
Instrumentação
SELETOR DE COMPRIMENTOS DE ONDA

MONOCROMADORES: PRISMAS E REDES (GRADES) DE DIFRAÇÃO

Diferenças entre os índices de refração Fenômeno da interferência

nλ = d(sen
d(sen i + d sen r)

 300 – 2000 ranhuras

 ângulo de incidência
FORMA DE USO

1) Prisma (instrumentos mais antigos)

2) Grade (custo menor, espectrofotômetros mais compactos)
Instrumentação
SELETOR DE COMPRIMENTOS DE ONDA

MONOCROMADORES: PRISMAS E REDES (GRADES) DE DIFRAÇÃO

 Dependendo dos demais componentes ópticos: largura de banda de 1 – 20 nm

POSICIONAMENTO DA FENDA DE SAÍDA

Isolar o comprimento de onda separado
Ex:
Ex:

 Monocromador de Czerny-Turner
Instrumentação
3) COMPARTIMENTO (OU SUPORTE) DA AMOSTRA
CELAS OU CUBETAS DE QUARTZO (UV-
UV-Vis
Vis)) face para
CELAS OU CUBETAS DE VIDRO (Vis) “manipulação”
CELAS OU CUBETAS DE ACRÍLICO (Vis)

 FACES PLANAS E PERPENDICULARES À RADIAÇÃO

INCIDENTE

 CILÍNDRICAS
menor custo mas que conferem menor repetibilidade

CAMINHOS ÓPTICOS VARIÁVEIS

mais comum: 1 cm

LIMPEZA:
1- água e detergente diluído
2- enxague com água purificada e, depois, com a própria amostra
Instrumentação
4) DETECTORES (TRANSDUTORES) DE SINAL

 CONVERSÃO DA RADIAÇÃO EM SINAL ELÉTRICO

- Intensidade da corrente é proporcional à intensidade da radiação

- Fototubos
Fototubos,, fotomultiplicadoras e semicondutores de silício
Junção pn

e- Anodo _ _
+ +

Catodo Feixe de Fótons + + _ _

Amplificador
- +

+ _
90 V DC
_ + + _

p n

 Fototubo < Sensibilidade que os semicondutores < Fotomultiplicadora

Instrumentação
DETECTORES (TRANSDUTORES) DE SINAL

Espectrofotômetro com arranjo linear de diodos

Instrumentação
 O FEIXE DE RADIAÇÃO UTILIZADO PARA A MEDIDA DO “BRANCO” E DA AMOSTRA”
DEVEM TER A MESMA INTENSIDADE

INSTRUMENTOS “FEIXE
“FEIXE ÚNICO”
ÚNICO” E “DUPLO
“DUPLO FEIXE”
FEIXE”

cela do
solvente
ajuste 100% T
%T

a. fotômetro de feixe
único

lâmpada de espelho semi-prateado detector

filtro
tungstênio

b. Fotômetro de feixe duplo

cela do
solvente

detector

%T detector de zero
 ESPECTROFOTOMETRIA NO UV-
UV-Vis
CONSIDERAÇÕES GERAIS

 Instrumentos atuais operam em transmitância ou absorbância

 Quando são utilizados outros solventes além de água os mesmos devem ser
de grau espectroscópio e inerte no meio

 Análises de rotina: utilizar sistema de análise por injeção em fluxo (FIA)

Pequenas quantidades de amostras e reagentes

= Menor custo e geração de resíduos
Maior precisão (repetibilidade
(repetibilidade)) e velocidade analítica

 Pode ser combinada com outras técnicas analíticas, instrumentais ou não,

geralmente como ferramenta de detecção

 Pode ser utilizada em análises não quantitativas e diretamente sobre sólidos

(reflectância difusa em produtos acabados)
 ESPECTROFOTOMETRIA NO UV-
UV-Vis

ANÁLISE DE SÓLIDOS POR REFLECTÂNCIA DIFUSA NA REGIÃO DO UV-

UV-Vis

- Utilizada para materiais opacos

• Papéis
• Plásticos
• Pigmentos para tintas
• Filmes poliméricos
• Medicamentos
• Alimentos (leite em pó)
• ...

- Princípio: a radiação não absorvida é refletida e detectada na forma

de um espectro

- Equipamentos de laboratório e portáteis

 REFLECTÂNCIA DIFUSA

Aplicações importantes no setor de tintas para determinação de

parâmetros de qualidade:

DETERMINAÇÃO DE OUTROS PARÂMETROS:

- Índice de brancura e amarelamento: ASTM E- E-313-

313-73
- Índice de brancura: ASTM E-
E-313-
313-CIE modification
- Índice de brancura: ASTM D-
D-1925
- Índice de amarelamento: ASTM E-E-313-
313-98
 REFLECTÂNCIA DIFUSA

Tipos de equipamentos

Portáteis De “bancada”

Análise de materiais/ produtos acabados

Análise quantitativas também são possíveis a partir de calibração

 PARA “CASA”

3) Ao “desenhar a curva analítica” de um método espectrofotométrico o analista

atribuiu ao branco (reagentes utilizados em água) o valor de transmissão
100%. Você concorda com esta atribuição? Justifique.

4) Em termos de configuração instrumental, comente sobre as vantagens de se

utilizar um espectrofotômetro com um detector do tipo “arranjo de diodos”.
 Bibliografia utilizada

“Principles of Instrumental Analysis
Analysis””
DA Skoog, FL Holler, TA Nieman; 5th ed., 1998

“Análise Instrumental”
F Cienfuegos, D Vaitsman; 2000

“Vogel - Análise Química Quantitativa”

GH Jeffrey e col., 6a ed., Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2002

“Análise Química Quantitativa”

D. Harris; 7a ed., 2008

Tutoriais de fabricantes de espectrofotômetros

Slides didáticos fornecidos pelo Prof. Dr. Júlio C. J. Silva (UFJF)

Figuras da Apostila didática da disciplina QA 581, do IQ - Unicamp