Cromatografia líquida

de alta eficiência
O que é cromatografia líquida?

 A cromatografia fundamenta-se na migração

diferencial dos componentes de uma mistura, o que ocorre devido
a diferentes interações entre duas fases imiscíveis, sendo uma
fase fixa que tem uma grande área superficial chamada fase
estacionária, e a outra um fluido que se move através da fase
estacionária sendo chamada de fase móvel. Na cromatografia
líquida a fase móvel é líquida! (LANÇAS, 1993; DEGANI; CASS;
VIEIRA, 1998).
 Principio da cromatografia líquida

AMOSTRA SOLVENTE

Coluna
Ação da
contendo fase
gravidade!
estacionária.

Tempo
Tipos de cromatografia líquida:

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

PLANAR COLUNA

CCD CP HPLC CONVENCIONAL

ADOSRÇÃO PARTIÇÃO IÔNICA EXCLUSÃO

Primeiro, o que é HPLC?
•HPLC – É uma abreviação do nome em inglês : High Performance (Pressure)
Liquid Cromatography.

•Historia da HPLC:
- Década de 60 : O começo da HPLC como High pressure LC!
- Década de 70 : Com a melhora do material da coluna e da
instrumentação, HPLC passa a ser High Performance LC!
- Década de 80: A partir dessa década houve um “boom” do HPLC
- 2006- Evolução da técnica: UPLC, RRLC, UFLC...
Vantagens da HPLC
 FE é utilizada inúmeras vezes.

 Versatilidade: Único requisito é a solubilidade na FM.

 Tempo reduzido de análise.

 Alta resolução.

 Análise qualitativa: tR , espectro de absorção no UV (DAD), MS.

 Análise quantitativa: desvios menores do que 5%.

 Boa detectabilidade:

Absorção de UV-Vis de comprimento de onda variável 10-10 g;

Fluorescência: 10-12 g;

 Automatização
Limitações da HPLC
 Alto custo do instrumento

 Alto custo de manutenção

 Alto custo de operação

 Falta de detector universal sensível

Índice de refração: baixa detectabilidade (10-6 g), pouco estável.

Espectrômetro de massas: ~US$ 150.000,00

 Necessidade de experiência no seu manuseio

Como é um HPLC comercial?
Reservatórios dos
solventes e
sistema de
degaseificação.

Bomba.

Injetor.

Coluna.

Detector.
Instrumentação para HPLC
Instrumentação para HPLC
Reservatório para a fase móvel

• Filtro do reservatório :
Captar a fase móvel e evitar que partículas suspensas na FM obstruam
os capilares ou contaminem a bomba.

• Filtros de 10 a 40 um

Limpeza periódica!!
 Características da fase móvel
 Ser de alto grau de pureza ou fácil purificação

 Dissolver a amostra sem decompor seus componentes

 Não decompor ou dissolver a fase estacionária

 Ter baixa viscosidade

 Compatível com o tipo de detector

 Polaridade adequada para permitir a separação dos componentes da amostra.

 Degaseificação da FM:

Garanti a reprodutibilidade da vazão

Estabilidade da linha base.

Métodos de degaseificação

• Ultrassom: Muito lento, pouco eficiente, requer agitação, em geral o

pior método quando usado sozinho

• Vácuo + ultrassom: Rápido, eficiente, refazer a cada 12 hrs.

• Purga com Hélio: Contínuo, hélio é razoavelmente caro, leva a

aumento de vazamentos, maior custo operacional .

• Degaseificador on-line: Contínuo, remove o ar logo antes de entrar

na bomba, investimento alto inicial (melhor opção a longo prazo)
Instrumentação para HPLC
Sistema de bombeamento
“Têm por finalidade enviar um fluxo constante e reprodutível de FM para o
sistema cromatográfico”

REQUISITOS:

 Ser de material inerte

 Pressões de até 6000 psi (~400 atm)

 Vazão contínua, sem pulsos (ou, se pulsando, com amortecedor de pulsos)

 Vazões de 0,1 a 10 ml/min (aplicações analíticas)

 Controle de vazão e reprodutibilidade melhor que 1 %

Sistema de bombeamento

 Tipos de bombas:

 Pneumática

 Deslocamento

 Recíproca
Bomba pneumática

 Vantagens:

 Baixo custo

 Livre de pulsações

 Desvantagens:

 Baixa pressão (até 2000 psi)

 Baixo volume

 Não permite gradiente

 Vazão depende da pressão de retorno e viscosidade da fase móvel

 Bomba de deslocamento

 Vantagens:

 Vazão independe da pressão de retorno e viscosidade da fase móvel

 Livre de pulsações

 Desvantagens:

 Baixo volume

 Não permite gradiente

 Bomba recíproca
 Vantagens:

 Pressão elevada (até 10 000 psi)

 Pequeno volume interno (35 a 400 µL)

 Permite gradiente

 Desvantagem:

 Fluxo pulsado

 Alto custo
Sistema de bombeamento
 Isocrático :
+ A composição da fase móvel permanece constante ao longo da
análise.
+ Capaz de separa um número limitado de analitos.

 Gradiente
+ A composição da fase móvel varia durante a análise.
+ Sistema aplicado com a polaridade dos compostos presentes
na amostra , é muito diferente.
+ Separação de amostras complexas.
 Separação isocrática e por gradiente

A eluição isocrática é feita com um único solvente (ou mistura de

solventes). Se um solvente não propiciar uma eluição suficientemente
rápida de todos os componentes, então pode ser utilizada uma eluição
por gradiente.
Com base nas eluições isocráticas foi elaborado o gradiente a seguir.
Instrumentação para HPLC
 Sistema de Injeção
 INJEÇÃO MANUAL
- As amostras são introduzidas com seringas.
- Após virar a alça, a amostra é carregada pela fase móvel até o início
da coluna.

 AMOSTRADOR AUTOMÁTICO
- As amostras são postas em um frasco localizado
dentro do amostrador.
- O amostrador automático :
1- Mede o volume correto para injeção.
2- Injeta a amostra.
3 – Prepara o injetor para uma próxima amostra
Sistema de Injeção
Injetor Rheodyne – Diagrama de fluxo
Bomba

Coluna

LOAD Bomba

Coluna
 Sobrecarga de Volume da amostra
Para aproveitar de todos os pratos que uma
colina possui, não se deve injetar um volume
maior que 1% do volume da coluna vazia.
𝑉𝑚𝑎𝑥 (µL)=π(raio)2(comprimento)(0,01)
Instrumentação para HPLC
Coluna
 Geralmente em aço inox ( mais popular, maior pressão)
+ Coluna de vidro reforçado (até 600 psi, utilizada para biomoleculas)
+ PEEK polímero ( biocompatível e quimicamente inerte com a maioria
dos solventes)
+ Preço: > US$ 200.00
 Tipos de colunas
+ Analíticas : diâmetro interno (i.d) 1,0-4,6 mm, comprimento 15 - 250
mm.
+ Preparativas: i.d ˃ 4,6 mm, comprimento 50 -250 mm.

A escolha de uma coluna apropriada é o ponto crítico para o sucesso

da análise.
 Pré-coluna

 Localizada entre o injetor e a coluna

 Colunas de 2 a 5 cm, i.d igual ao da coluna.

 Mesma FE da coluna de separação.

 Protege a coluna

 Custo reduzido

Pré-coluna!
Coluna
 Fase estacionária.
+ As colunas são “recheadas” com partículas porosas com diâmetro
de 1,8 – 5 μm.

+ Estas partículas porosas na coluna têm geralmente uma fase ligada

quimicamente sobre a sua superfície, que interage com os componentes da
amostra para separá-los um do outro.
Condicionamento da Coluna

Necessário para que haja um perfeito equilíbrio

da FM e da FE.

 Coluna nova: 4- 8 horas

 Coluna parada há alguns dias: 2 horas
 Coluna de uso diário: 15 minutos.
Lembre-se: a coluna deve ser
guardada em solvente orgânico.
LC com fase quimicamente ligada
Síntese da FE.
Modos de HPLC

HPLC

Adsorção Partição Iônica Exclusão

Tipos de cromatografia líquida:
 Adsorção:
O mecanismo de separação: competição entre moléculas da
amostra e da fase móvel em ocupar os sítios ativos da fase estacionária,
sólido. (Sílica)
Fase estacionária (polar) é afetada com frequência pela
retenção de moléculas de alta polaridade como álcoois, água.

 Partição: (CLL ou CFL)

CLL: O mecanismo de separação: baseia-se nas diferentes
solubilidades que apresentam os componentes da amostra na fase
móvel e na fase estacionária.(sílica purificada)
O maior inconveniente desta técnica é a solubilidade da fase
estacionária na fase móvel.
CFL: A fase estacionária está imobilizada por meio de ligações
químicas. (Normal ou Reversa)
Fase normal x Fase reversa
 Fase normal:
 fase estacionária polar;

 fase móvel apolar (n-alcanos, clorofórmio, acetato de etila);

 solutos neutros;

 polaridade soluto  t. retenção;

 mecanismo retenção: adsorção

 Fase reversa:
 fase estacionária apolar;

 fase móvel polar (tampões, água, metanol, acetonitrila, THF);

 solutos apolares, não-iônicos;

 polaridade f. móvel  t. retenção;

 mecanismo retenção: interações apolares com radicais da coluna.

Fase Normal
Si-OH + R3SiCl Si-O-Si-(CH3)2R + HCl

••
OH Ciano (-C2H4CN)

Si R= Diol (-C3H6OCH2CHOHCH2OH)
silanol livre
Amina (–C3H6NH2)
 CROMATOGRAFIA DE FASE
NORMAL
Polaridade do soluto: •Nos trabalhos pioneiros usou-se
a > b > c fases altamente polares, como
Polaridade da fase móvel

água e trietilenoglicol
adsorvidos sobre sílica ou
alumina e solventes apolares,
c b a
como hexano ou éter
isopropílico, eram usados como
tempo fase móvel; por razões históricas,
este tipo de cromatografia é
chamado de fase normal

c b a
tempo
•Em fase normal, o componente menos polar elui primeiro, devido a sua
maior solubilidade na fase móvel; aumentando a polaridade da fase móvel tem
o efeito de diminuir o tempo de eluição
Fase reversa
 CROMATOGRAFIA DE FASE
REVERSA
Polaridade do soluto: a > b > c
•Na cromatografia de fase reversa, a
Polaridade da fase móvel

fase estacionária é apolar, um

hidrocarboneto por exemplo (C18), e a
fase móvel é relativamente polar
a b c (água, metanol, acetonitrila, etc)

tempo

a b c
tempo
•Em fase reversa, o componente mais polar elui primeiro, devido a sua maior
solubilidade na fase móvel; aumentando-se a polaridade da fase móvel aumenta-se
o tempo de eluição
Efeito do comprimento da cadeia na
retenção.
Tipos de cromatografia líquida:
 Iônica:
A fase estacionária é, normalmente, uma resina de poliestireno e
divinilbenzeno, a qual são ligados grupos iônicos, como por exemplo,
-SO-3 trocadores fortes de cátion
-CO-2 trocadores fracos de cátion
-NR+3 trocadores fortes de ânions
-NH2R+ trocadores fracos de ânions

Os grupos iônicos têm um contra-íon (com carga oposta) que pode

ser deslocado pelos íons da fase móvel de carga similar a ele.

 Exclusão:
A separação é efetuada de acordo com o tamanho efetivo das
moléculas.
A coluna é recheada com matéria inerte cujos poros têm tamanho
controlado. Onde, as moléculas menores penetram a maioria dos poros.
Instrumentação para HPLC
 Características de um detector

 Sensibilidade e seletividade adequada

 Ampla faixa linear

 Baixo volume interno

 Resposta Rápida

 Boa estabilidade e reprodutibilidade

 Não destruir a amostra

 Características de um detector

 Baixo volume interno

 O volume do detector é a região do fluxo cromatográfico ao qual o detector
responde.
 Grande volume  alargamento dos picos registrados.

 Resposta Rápida

 O sistema de detecção deve idealmente apresentar um sinal que represente

um exato instante de uma porção do caminho (volume do detector).

 Detector lento  picos deformados (baixo e largo) e com cauda longa.

 Características de um detector
 Boa estabilidade e reprodutibilidade

 Alta confiabilidade e facilidade de uso

 Não destruir a amostra para:

 Permite coletar o eluato

 Utilizar um segundo tipo de detector

 Detector por espectrofotometria UV-
visível
Um feixe de luz ultravioleta é dirigido através de uma célula de fluxo e um sensor
mede a luz que passa através da célula.

Quando um composto que absorve a energia da luz elui da coluna, ocorrerá uma
alteração na quantidade de energia que incide sobre o sensor.

Essa alteração da quantidade de energia é amplificada e dirigida para um

sistema de registro de dados.

Como resposta, um espectro de UV é obtido, o que pode ajudar na identificação

de alguns compostos.
Detector por espectrofotometria UV-
visível
Detector por espectrofotometria
UV-visível
Detector por arranjo de diodos
Detector por arranjo de diodos
 Detector por espectrofotometria UV-
visível

Princípio de operação Absorvância de luz na faixa UV-visível

tipo Seletivo, depende de propriedades do
composto
Min. quanti. detectável 10-9
(g/mL)
Sensib. a temperatura Baixa
Sensib. a vazão da f. móvel Não
Útil com gradientes Sim
Aplicabilidade Compostos que absorvem no  selecionado
Detector por fluorescência
Em comparação com detectores de UV-Vis, os detectores de
fluorescência oferecem uma maior sensibilidade e seletividade, que
permite quantificar e identificar compostos e impurezas em matrizes
complexas em níveis extremamente baixos.

Os detectores de fluorescência detectam apenas substâncias que

apresentam fluorescência.
Detector por fluorescência
 Detector por fluorescência

Excitação com luz produz emissão

Princípio de operação
fluorescente
tipo Altamente seletivo
Min. quanti. detetável (g/mL) 10-9 (excitação a laser: 10-12)
Sensib. a temperatura Baixa
Sensib. a vazão da f. móvel Não
Útil com gradientes Sim
Aplicabilidade Compostos ou derivados que fluorescem
Detector por índice de refração
A capacidade de um composto ou solvente para desviar a luz, fornece uma
maneira de detectá-lo.

O IR é uma medida da capacidade de uma molécula em desviar a luz em

uma fase líquida.

A quantidade de deflexão é proporcional à concentração.

O detector IR é considerado universal porém, pouco sensível e sofre com a

variação da temperatura.
Detector por índice de refração
 Detector por índice de refração

Princípio de operação Mudança no índice de refração da fase móvel

Universal, depende de propriedade da f.

tipo
móvel
Min. quanti. detetável (g/mL) 10-7
Sensib. a temperatura alta
Sensib. a vazão da f. móvel Não
Útil com gradientes Não
Aplicabilidade Geral
 Detector eletroquímico

Princípio de operação Oxidação ou redução em potencial fixo

Seletivo, depende de propriedades do

tipo
composto
Min. quanti. detetável (g/mL) 10-12
Sensib. a temperatura Média
Sensib. a vazão da f. móvel Sim
Útil com gradientes Não
Aplicabilidade Espécies que oxidam ou reduzem
Detector por condutividade elétrica
 Detector por condutividade elétrica

Condutividade elétrica devida a presença de

Princípio de operação
íons
Seletivo, depende de propriedades do
tipo
composto
Min. quanti. detetável (g/mL) 10-8
Sensib. a temperatura Média
Sensib. a vazão da f. móvel Sim
Útil com gradientes Não
Aplicabilidade Soluções aquosas com compostos iônicos
E aqui termina a aula,
!!!!!
 Referências bibliográficas

 http://hplc.chem.shu.edu/NEW/HPLC_Book/index.html

 SKOOG, D. A., HOLLER, F. J., NIEMAN, T. A.

Princípios de análise instrumental. 5ª. Ed., 2002.

 COLLINS, C. H., BRAGA, G. L., BONATO, P. S.

Introdução a métodos cromatográficos.
 WESTON, A., BROWN, P. R. HPLC and CE - principles
and practice. 1997.
 POLARIDADE DO SOLUTO
ESCOPO DA
CROMATOGRAFIA A
insolúvel em água solúvel em água
LÍQUIDO
não-polar iônico
•espécies MM>104: cromatografia polar não-iônico
por exclusão
102
•espécies iônicas de baixa MM: ADSORÇÃO PARTIÇÃO TROCA
cromatografia por troca iônica IÔNICA
fase fase
•espécies pequenas e polares, 103 reversa normal
mas não-iônicas: métodos de massa molecular
partição (série homóloga)
•espécies não-polares: 104
cromatografia por adsorção permeação
em gel
(isômeros estruturais,
hidrocarbonetos alifáticos) 105 EXCLUSÃO

filtração
em gel
106
aplicações
Figura 28-1 Skoog p642 vp
 HPLC x GC
Comparação entre as características de GC e HPLC
Fator GC HPLC
volátil e termicamente
Requisito p/ amostra solúvel na fase móvel
estável
Tipos de amostra gases, líquido e sólidos líquidos e sólidos
Quantidade mínima
10-12 g (ECD) 10-9 g (UV)
detectável
minutos até poucas minutos até muitas
Tempo de análise
horas horas
Pratos teóricos por
2.000-300.000 500-25.000
coluna
Capacidade analítica até 200 componentes até 50 componentes
Tempo de treinamento
cerca de 3 meses pelo menos 6 meses
do operador
 (a) (b)

(c) (d)