Universidade Federal de Goiás – UFG

Teste de Patogenicidade, Reisolamento e Observação de

Reisolamento

Eduardo Chagas Pereira

Goiânia (GO) - 18/07/2022

Sumário

1- Introdução.................................................................................................3
2- Materiais....................................................................................................5
3- Métodos....................................................................................................6
3.1- Teste de Patogenicidade...................................................................6
3.1.1- Inoculação da Couve Manteiga...................................................6
3.1.2- Inoculação da Batata...................................................................7
3.1.3- Inoculação do Limão....................................................................8
3.2- Reisolamento.....................................................................................9
3.2.1- Isolamento indireto.......................................................................9
3.2.1- Isolamento direto........................................................................10
3.3- Observação do Reisolamento..........................................................11
3.3.1- Observação do Penicillium digitatum..........................................11
3.3.2-Teste de Gram da Xanthomonas campestris pv.
campestris...............................................................................................11
4- Resultados..............................................................................................11
5- Referências.............................................................................................13

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1- Introdução

Esse relatório trata das práticas realizadas na aula de fitopatologia 2.

Foram realizadas 3 aulas práticas: teste de patogenicidade, reisolamento
e observação de reisolamento. Essas práticas foram baseadas nos
postulados de Koch, que são uma sequência de procedimentos utilizadas
para estabelecer a relação causal entre um microrganismo e uma doença.
Os postulados são os seguintes: Associação constante do patógeno-
hospedeiro; Isolamento do patógeno; Inoculação do patógeno e
reprodução dos sintomas; Reisolamento do patógeno.
A primeira prática foi de teste de patogenicidade, e tinha como
objetivo inocular plantas por meio de diferentes métodos de inoculação e
observação dos sintomas. Vale lembrar que patogenicidade é o termo
aplicado a um patógeno capaz de causar doenças infecciosas no corpo,
e a patogenicidade de um organismo é frequentemente chamada de
virulência. Nessa aula primeiro se inoculou a Couve manteiga (Brassica
oleracea), com uma bactéria necrotrófica, que é uma bactéria que vai
degradar com enzimas a parede celular e a membrana celular da planta
para poder se nutrir. A bactéria utilizada foi a Xanthomonas campestris
patovar campestris, que causa a podridão negra das crucíferas, que é
uma doença comum da couve, e o sintoma mais comum é o aparecimento
de lesões amareladas, que com a evolução da doença as folhas ficam
amareladas, podendo apresentar necrose e em casos severos podem
ocorrer murcha, queda prematura de folhas e apodrecimento das plantas
atacadas. A planta foi inoculada na parte abaxial da folha com o método
de infiltração, que consiste em pressionar a folha e injetar a suspensão.
Ainda na primeira prática foi inoculada também a batata comum
(Solanum tuberosum), com a Pectobacterium chrysanthemi, que é agente
causal da podridão mole, que tem como sintomas a podridão mole das
hastes, que desprende um odor fétido característico, a murcha
generalizada e a morte da planta.

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Essa inoculação foi feita com auxílio de um palito contaminado que
perfurou a batata causando um ferimento, assim permitindo a entrada da
bactéria. Outra inoculação realizada foi a do limão (Citrus spp.), com um
fungo necrotrófico, o Penicillium digitatum, que é o agente causal do bolor
verde. Vale ressaltar que esse fungo é um parasita fraco e necessita de
ferimentos para entrar no hospedeiro, e sabendo disso o fruto foi
inoculado com auxílio de uma agulha contaminada que perfurou o fruto.

A segunda prática foi de reisolamento, que tinha como objetivo

verificar se os métodos de inoculação foram eficientes, observar e
descrever os sintomas e reisolar os patógenos em meio de cultivo. Foi
realizado um isolamento indireto da Xanthomonas campestris patovar
campestris, onde foi observado os sintomas e coletada as partes
contaminadas da folha de couve para maceração e posteriormente
colocando a solução macerada em placa de petri com meio de cultura
para a bactéria se desenvolver. Depois foi realizado o isolamento direto
com o fungo, onde se coletou o fungo presente no limão e já colocou ele
na placa com o meio de cultivo, sem fazer maceração.

A terceira e última prática foi a de observação do reisolamento, que

tinha como objetivo preparar lâmina de Penicillium digitatum, e confirmar
a etiologia, através de características morfológicas do bolor verde, e
também observar as características culturais da Xanthomonas campestris
patovar campestris reisolada e confirmar a etiologia da podridão, além de
fazer teste de Gram com essa bactéria. O Penicillium digitatum foi
colocado em lâmina para observação no microscópio e a Xanthomonas
campestris patovar campestris foi colocada em lâmina para realizar o
teste de Gram com o KOH 3%. O teste de Gram permite diferenciar os
dois principais grupos de bactérias, Gram-positivas e Gram-negativas.
Bactérias Gram-negativas evidenciam a dissolução da parede celular,
liberando o DNA bacteriano e formando o fio viscoso, enquanto as Gram-
positivas não, pois a parede é mais resistente.

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 2- Materiais
Os materiais utilizados foram:

- Bactéria Xanthomonas campestris patovar campestris;

- Fungo Penicillium digitatum;

- Bactéria a Pectobacterium chrysanthemi;

- Plantas de Couve, limões, batata comum (inglesa);

- Álcool 70%;

- Pinça;

- Agulha;

- Hipoclorito 1%;

- Água destilada estéril;

- Palito de dente estéreis;

- Enlermeyer com água destilada estéril;

- Água destilada em um borrifador;

- Aspersor;

- Alça de Drigalski;

- Lamparina;

- Fósforo;

- Seringa sem agulha;

- Placa de petri com meio de cultivo (BDA e NA);

- Sacos plástico para fazer câmera úmida;

- Lâmina;

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- Copinho de 50 ml;

- Almofariz e pistilo;

- Eppendorfs;

- Pinça;

- Alça bacteriana;

- Microscópio;

- Corante Azul de algodão;

- Plástico filme;

- KOH 3%;

- Lamínulas.

3- Métodos

3.1 – Teste de Patogenicidade

3.1.1- Inoculação da Couve Manteiga

A primeira inoculação foi com a couve. Antes de tudo foi marcado

duas folhas distintas, uma sendo testemunha e outra inoculada. Após
isso, primeiro se faz com a folha de testemunha, que serve para verificar
como vai ser a folha que não vai receber o patógeno. Para isso coloca
água destilada na seringa (2ml) e aí aplica na folha. Para a água infiltrar,
coloca o dedo embaixo de onde vai realizar a pressão com a seringa e aí
a água infiltra na folha. Depois de fazer a folha teste foi feita a folha que
sofreria a inoculação do patógeno. Primeiro pegou a placa de petri que
continha a Xanthomonas campestris patovar campestris, e com a alça
bacteriana se raspou a bactéria da placa e colocou ela em um Erlenmeyer
com água estéril, e mexeu até a solução ficar turva, e após isso, com a

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seringa, fez a inoculação por infiltração, igual havia sido feito na folha
teste, só que dessa vez com solução bacteriana e não só água. Vale
lembrar que a inoculação em ambas as folhas foi feita na parte de baixo
(abaxial) da folha.

3.1.2- Inoculação da Batata

Para fazer a segunda inoculação se marcou dois pontos

equidistantes na batata, um inocular e outro testemunha. O ponto
testemunha foi perfurado com um palito de dente estéril sem bactéria, e
foi deixado lá. O ponto inocular foi perfurado com um palito de dente
estéril, só que esse tinha coletado massa bacteriana de Pectobacterium
chrysanthemi, e então após essa coleta, ele foi perfurado e deixado lá
também.

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 3.1.3- Inoculação do Limão

A última inoculação foi com o limão e no caso foram utilizados dois

limões, um para servir de testemunha e outro que foi inoculado, então
primeiro marcou qual limão era qual com caneta. Depois pegou-se uma
agulha e flambou ela com o auxílio da lamparina para esterilizar. Depois
se esperou um pouco para agulha esfriar, e então passou ela na placa de
petri de Penicillium digitatum, e fez um furo no limão que vai ser inoculado
e o outro não recebeu o furo, só passou a agulha encima para ser
testemunha.

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 Depois de tudo pegou-se dois sacos plásticos, um para cobrir a couve
e outro para colocar a batata e os limões. Em ambos os sacos foram
borrifados água para fazer uma câmera úmida, com o objetivo de fornecer
um ambiente agradável para o patógeno.

3.2- Reisolamento

3.2.1- Isolamento indireto

Para essa prática pegou-se a folha inoculada e cortou 4 pedaços

pequenos de 1 cm. Após isso, flambou a pinça com o a lamparina, e
depois pegou os pedaços da folha e colocou eles 30 segundos no álcool,
depois 3 minutos em NaClO e depois lavou em água. Lembrando que
passou as folhas de um para o outro com pinça e flambou a pinça para
esterilizar ela. Após isso a colocou-se os pedaços no eppendorf, que tinha
água destilada estéril para macerar com auxílio do pistilo. Posterior a
maceração, pegou-se, com auxílio da alça bacteriana, a solução
macerada e colocamos na placa de petri com meio de cultura Ágar
nutriente. Aplicou a solução macerada na placa fazendo o método de
estrias.

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 3.2.2- Isolamento direto
O isolamento direto não tem maceração, então pega-se uma pinça
e flambou ela para esterilizar, e depois pegou os esporos presente no
limão e colocou na placa de petri, que tinha meio de cultivo BDA, batata
dextrose ágar.

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 3.3 – Observação do Reisolamento

3.3.1- Observação do Penicillium digitatum

Primeiro se prepara a lâmina, então limpa-se ela e depois pinga

uma gota de azul de algodão. Após isso flamba a agulha no fogo e depois
colhe com a agulha o Penicillium digitatum na placa de petri e passa na
lâmina, e por fim coloca a lamínula em cima do azul de algodão com o
material da placa, e olha no microscópio para observar os resultados.

3.3.2- Teste de Gram da Xanthomonas campestris pv.

campestris

Após a observação no microscópio foi realizado o teste de Gram para

saber se a bactéria Xanthomonas campestris pv. campestris era Gram
positiva ou negativa. Para realizar o teste pegou-se uma lâmina e pingou
uma gota de KOH 3%. Depois colheu a massa bacteriana da placa de
petri com auxílio da alça bacteriana e colocou ela na lâmina com gota de
KOH 3%. Por fim ficou mexendo a massa bacteriana no KOH por uns 30
segundos, e então verificou se tinha formação de viscosidade ou não.

4- Resultados

Pode-se concluir que a prática foi um sucesso, já que todas as

inoculações funcionaram. Com a inoculação da Xanthomonas campestris
pv. campestris a ouve apresentou buracos com pequenas necroses e
amarelecimento do tecido. Na couve a folha teste acabou se
contaminando também. Na batata o furo com Pectobacterium
chrysanthemi, fez com que a batata apodrecesse e ficasse mole e com
um odor forte.

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O limão que foi inoculado com ferimento apresentou sintomas, ficando
coberto de poros brancos e verdes, já o limão que não sofreu furo não
apresentou nenhum sintoma.
Na observação do Penicillium digitatum foi possível observar hifas
septadas com alguns conídios ramificados.

No teste de Gram da Xanthomonas campestris pv. campestris, foi

possível observar a formação de viscosidade da bactéria, comprovando
que ela é gram negativa, já que houve dissolução da parede celular,
liberando o DNA bacteriano e formando o fio viscoso.

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5- Referências

- O que é patogenicidade? - Spiegato

- Bolor verde (Penicillium digitatum) (agrolink.com.br)
- Podridão-do-colmo (Pectobacterium chrysanthemi) (agrolink.com.br)
- Podridão negra (Xanthomonas campestris pv. campestris)
(agrolink.com.br)
- COUVE MANTEIGA DA GEORGIA (Brassica oleracea.)
(sitiodamata.com.br)
- Aulas de fitopatologia.

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