5,0

k = 1,2
44,7 m

4,0
Altura de prato H, mm

34,9 m
3,0

O efeito do
2,0

22,6 m
1,0 E. Majors, J. Chromatogr. Sci.,
13,2 m
1973, v. 11, p. 92. Reproduzido
8,8 m
6,1 m do Journal of Chromatographic
0 Science
0 1,0 2,0 3,0 4,0
Velocidade linear, cm/s Preston Industries, Inc.)

recheios na faixa de tamanho de 3 a 10

consideravelmente mais complexo e caro do que aquele encontrado em outros tipos de cromatografia. A

de CLAE.

1 Para uma discuss o detalhada sobre os sistemas CLAE, ver L. R. Snyder e J. J. Kirkland, Introduction to Modern Liquid Chromatography, 3. ed.
Nova York: Wiley, 1996; S. Lindsay, High Performance Liquid Chromatography. Nova York: Wiley, 1992; R. P. W. Scott, Liquid Chromatography
for the Analyst. Nova York: Marcel Dekker, 1995.
 Aumento da polaridade

Insol vel em gua Sol vel em gua

N o-polar I nico
Polar n o-i nico

Parti o
102
Adsor o Troca
(Parti o i nica
em fase (Parti o
reversa) normal)

103
Peso molecular

104

Exclus o

(Permea o em gel) (Filtra o em gel)

105

106

Aplica es da cromatografia l quida. Observe que os tipos de

cromatografia direita do diagrama s o mais adequados para os compostos polares.
As t cnicas na parte de baixo do diagrama s o mais adequadas para as esp cies de alta
massa molecular. (De D. L. Saunders, in Chromatography, 3. ed., E. Heftmann, Ed.,
p. 81. Nova York: Van Nostrand Reinhold, 1975.)

Fonte de
h lio regulada

V lvula de controle
de sa da

Para o
descarte
Amortecedor
de pulsos

Reservat rios V lvula de V lvula de

de solvente Filtro controle drenagem
Sparger de Bomba de entrada
entrada

Seringa de prepara o inicial

V lvula de mistura proporcional

Para o detector
Coluna Regulador de Filtro
Transdutor
contrapress o
de press o

V lvula de inje o

Diagrama de blocos mostrando os componentes t picos de um sistema

para CLAE. (Cortesia da Perkin Elmer Corp. Norwalk, CT.)
Um instrumento moderno de CLAE equipado com um ou mais reservat rios de vidro, cada um deles tendo
500 mL ou mais de um solvente. Freq entemente s o tomadas medidas para a remo o de gases dissolvidos
e de part culas presentes nos l quidos. Os primeiros produzem bolhas na coluna causando, assim, um alarga-
mento de banda; al m disso, as bolhas e os particulados interferem no desempenho da maioria dos detectores.
Os desgaseificadores podem ser constitu dos por sistemas de aplica o de v cuo, sistemas de destila o, um
dispositivo de aquecimento e agita o ou, como mostrado na Figura 32-3, um sistema de sparging, no qual
os gases dissolvidos s o arrastados para fora da solu o por pequenas bo-
lhas de um g s inerte que n o sol vel na fase m vel.
Uma elui o com um nico solvente ou com uma mistura de sol-
ventes de composi o constante . Na ,
dois (e s vezes mais) sistemas solventes que diferem significativamente
em polaridade s o empregados. A raz o entre os dois solventes varia em
uma forma pr -programada durante a separa o, algumas vezes de forma
cont nua e por vezes em etapas. Como exposto na Figura 32-4, a elui o
por gradiente geralmente melhora a efici ncia da separa o, da mesma
forma que a programa o de temperatura o faz na cromatografia gasosa.
Os instrumentos modernos de CLAE s o equipados com v lvulas que
introduzem l quidos a partir de dois ou mais reservat rios em propor es
que podem ser variadas continuamente (ver Figura 32-3).
9

(a) Elui o por gradiente

7 10
Identidade dos picos

1. Benzeno
2. Monoclorobenzeno
1 8 3. Ortodiclorobenzeno
4. 1,2,3-triclorobenzeno
2 5. 1,3,5-triclorobenzeno
6. 1,2,4-triclorobenzeno
5 7. 1,2,3,4-tetraclorobenzeno
6 8. 1,2,4,5-tetraclorobenzeno
3 9. Pentaclorobenzeno
4 10. Hexaclorobenzeno

7
1

3
5 9 (b) Elui o isocr tica

4 6 8
10 Melhoria na
efici ncia de separa o por elui o
por gradiente. (De J. J. Kirkland, Ed.,
Modern Practice of Liquid
Chromatography, p. 88. Nova York:
0 5 10 15 20 25 30
Tempo de reten o, min Interscience, 1971.)
Os requisitos para as bombas de cromatografia l quida incluem (1) habilidade de gerar press es de at
6.000 psi (libras/polegadas quadradas), (2) sa da livre de pulsa o, (3) vaz es na faixa de 0,1 a 10 mL/min,
(4) reprodutibilidade relativa da vaz o de 0,5% ou melhor e (5) resist ncia corros o por uma grande va-
riedade de solventes. As altas press es geradas pelas bombas de cromatografia l quida n o representam
risco de explos o porque os l quidos n o s o muito compress veis. Assim, a ruptura de um componente
resulta somente em vazamento do solvente. Contudo, esse vazamento pode constituir um risco de inc ndio
ou para o ambiente, dependendo do tipo de solvente.
H tr s tipos principais de bomba: a de seringa acionada por rosca, a bomba rec proca e a bomba
pneum tica de press o constante. As bombas de seringa produzem uma sa da livre de pulsa o cuja vaz o
pode ser controlada facilmente; no entanto, elas apresentam pequena capacidade ( 250 mL) e se tornam
inconvenientes quando preciso trocar o solvente. A Figura 32-5 exibe o tipo de bomba mais amplamente
empregado, a bomba rec proca. Esse dispositivo consiste em uma c mara pequena cil ndrica que
preenchida e esvaziada pela movimenta o de ida e vinda de um pist o. O movimento da bomba produz
um fluxo pulsado que deve ser atenuado posteriormente. As vantagens das bombas rec procas incluem o
volume interno pequeno, alta press o de sa da (at 10.000 psi), pronta adapta o elui o por gradiente
e vaz es constantes, as quais s o bastante independentes da queda de press o imposta pela coluna e da
viscosidade do solvente. A maioria dos cromat grafos comerciais modernos emprega bombas rec procas.
Alguns instrumentos usam bombas pneum ticas, que, na sua forma mais simples, consistem em um
reservat rio male vel de solvente inserido em um vaso que pode ser pressurizado por um g s comprimido.
As bombas desse tipo s o simples, de baixo custo e livres de pulsa o; por m, elas apresentam capacidade
e press o de sa da limitadas e as vaz es s o dependentes da viscosidade do solvente. Al m disso, elas n o
podem ser adaptadas para elui o por gradiente.

O m todo mais empregado de introdu o da amostra em cromatografia l quida baseado em um sistema

com al a de amostragem como aquele mostrado na Figura 32-6. Esses dispositivos s o partes integradas
de alguns equipamentos de cromatografia l quida. Freq entemente as al as intercambi veis est o
dispon veis para permitir a escolha do volume da amostra de 5 a 500 L. A repetibilidade relativa das
inje es com uma al a de amostragem de poucos d cimos por cento. Muitos instrumentos de CLAE
incorporam auto-amostradores que operam em conjunto com injetores autom ticos. Esses dispositivos
podem injetar volumes vari veis.

As colunas cromatogr ficas s o geralmente constru das de tubos de a o inoxid vel, embora tubos de vidro
ou Tygon sejam algumas vezes empregados em aplica es de baixa press o ( 600 psi). A maioria das

Coluna

Amortecedor
Motor de pulsos
Veda o
V lvulas de
controle
Pist o rec proco do fluxo

Uma bomba rec proca

para CLAE. Solvente
colunas apresenta comprimento na faixa de 10 a 30 cm e possuem Carregamento
di metros internos entre 2 e 5 mm. Os recheios das colunas tipicamente da amostra

apresentam part culas de di metros entre 3 e 10 m. As colunas desse

Al a
tipo fornecem entre 40.000 e 60.000 pratos m 1. Recentemente, as
microcolunas tornaram-se dispon veis com di metros internos de 1 a
4,6 mm e comprimentos de 3 a 7,5 cm. Essas colunas, as quais s o re-
cheadas com part culas de 3 a 5 m, cont m cerca de 100.000 pratos Para a
coluna
1
m e apresentam vantagens quanto velocidade e consumo m nimo
de solventes. Essa ltima vantagem de import ncia significativa, pois Da bomba
Sa da
os solventes de alt ssima pureza necess rios cromatografia l quida alternativa
custam muito caro, tanto para ser adquiridos como para ser descartados Inje o da
ap s o uso. A Figura 32-7 ilustra a velocidade com a qual a separa o amostra
pode ser realizada nesse tipo de coluna. Nesse caso, oito componentes
de diversos tipos s o separados em cerca de 15 s. A coluna de 4 cm
de comprimento e possui um di metro interno de 4 mm, sendo rechea- Al a
da com part culas de 3 m.
O tipo mais comum de recheio para a cromatografia l quida Para a
coluna
preparado a partir de part culas de s lica, as quais s o sintetizadas
aglomerando-se part culas de s lica de tamanho submicrom trico sob Da bomba
condi es que levam forma o de part culas maiores com di metros Sa da
alternativa
altamente uniformes. As part culas resultantes s o geralmente recober- Sistema com al a
tas com filmes org nicos, os quais s o quimicamente ou fisicamente li- de amostragem para a cromatografia
gados superf cie. Outros materiais de recheio incluem as part culas de l quida. (Cortesia da Beckman
alumina, de pol meros porosos e resinas de troca i nica. Coulter, Fullerton, CA.)

Com freq ncia, uma coluna curta de prote o posicionada frente da coluna anal tica com a finalidade
de aumentar a vida til desta ltima, removendo o material particulado e os contaminantes dos solventes.
Al m disso, em cromatografia l quida, a coluna de prote o serve para saturar a fase m vel com a fase esta-
cion ria de forma que as perdas de fase estacion ria na coluna anal tica sejam minimizadas. A composi o
da coluna de prote o deve ser similar quela da coluna anal tica; o tamanho de part cula, contudo, nor-
malmente maior para minimizar a queda de press o.

Para muitas aplica es, um controle rigoroso da temperatura n o necess rio e as colunas operam tem-
peratura ambiente. Freq entemente, contudo, obt m-se melhores cromatogramas mantendo-se a coluna
temperatura constante dentro de poucos d cimos de graus Celsius. A maioria dos instrumentos comerciais
est equipada com aquecedores que controlam a temperatura da coluna com toler ncia de poucos d cimos

Separa o isocr tica de alta

2 velocidade. Dimens es da coluna: comprimento de
4 cm, di metro interno de 0,4 cm; recheio:
Resposta do registrador
em unidades arbitr rias

3
5 6 spherisorb 3 m; fase m vel: 4,1 % de acetato de
1 7 8
4 etila em n-hexano. Compostos: (1) p-xileno, (2)
anisol, (3) acetato de benzila, (4) ftalato de dioctila,
(5) ftalato de dipentila, (6) ftalato de dibutila, (7)
ftalato de dipropila, (8) ftalato de dietila. (De R. P.
W. Scott, Small Bore Liquid Chromatography
Columns: Their Properties and Uses, p. 156. Nova
York: Wiley, 1984. Material utilizado com permiss o
0 5 10 15 de Wiley-Liss, Inc., uma subsidi ria da John Wiley
Tempo (s) & Sons, Inc.)
de graus desde a temperatura pr xima ambiente at 150 C. As colunas podem tamb m ser munidas de
uma camisa de termostatiza o pela qual flui a gua de um banho termost tico de forma a promover um
controle preciso da temperatura.

CH3

Modelo molecular do p-xileno. Existem tr s CH3

is meros do xileno: orto, meta e para. O paraxileno
utilizado na produ o de fibras artificiais.
O xilol uma mistura dos tr s is meros e
empregado como solvente.

Os detectores em CLAE devem apresentar um volume morto pequeno de forma a minimizar o alarga-
mento de banda extra coluna. O detector deve ser pequeno e compat vel com a vaz o de l quido. Nenhum
sistema de detec o universal de alta sensibilidade, como aqueles encontrados para a cromatografia
gasosa, est dispon vel para a cromatografia l quida de alta efici ncia. Assim, o detector a ser emprega-
do vai depender da natureza da amostra. A Tabela 32-1 lista alguns dos detectores comuns e suas pro-
priedades.
Os detectores mais amplamente empregados em cromatografia l quida s o baseados na absor o
da radia o ultravioleta ou vis vel (Figura 32-8). Os fot metros e os espectrofot metros projetados
especificamente para uso com colunas cromatogr ficas est o dispon veis comercialmente. O primeiro
geralmente faz uso das linhas a 254 nm e 280 nm de uma fonte de merc rio, porque muitos grupos fun-
cionais org nicos absorvem nessa regi o. As fontes de deut rio ou de filamento de tungst nio com fil-

em Massa Faixa Linear

Absorb ncia Sim 10 pg 3 4

Fluoresc ncia Sim 10 fg 5
Eletroqu mico Sim 100 pg 4 5
ndice de refra o Sim 1 ng 3
Condutividade Sim 100 pg 1 ng 5
Espectrometria de massas Sim 1 pg 5
FTIR Sim 1 g 3
Espalhamento de luz Sim 1 g 5
Atividade ptica N o 1 ng 4
Seletivo a elementos N o 1 ng 4 5
Fotoioniza o N o 1 pg 4

*Do manual do fabricante, Handbook of Instrumental Techniques for Analytical Chemistry, F. Settle, Ed. Upper Saddle River, NJ:
Prentice-Hall, 1997; E. S. Yeung and R. E. Synovec, Anal. Chem., 1986, v. 58, p. 1237A.
Limites de detec o (LD) expressos em massa s o dependentes do composto, instrumento e condi es da CLAE; os valores fornecidos
s o t picos de sistemas comerciais, quando dispon veis.
Valores t picos extra dos da fonte citada.
tros de interfer ncia fornecem um meio simples de detectar as es- Da coluna
p cies absorventes. Alguns dos instrumentos modernos s o equipados
com discos que cont m v rios filtros de interfer ncia, os quais podem
ser rapidamente trocados. Os detectores espectrofotom tricos s o Janelas de
consideravelmente mais vers teis que os fot metros e s o ampla- quartzo
mente empregados nos instrumentos de alto desempenho. Os instru- Fonte UV Detector
mentos modernos usam arranjos lineares de fotodiodos que podem
adquirir um espectro completo medida que o analito deixa a coluna.
O uso de uma combina o de CLAE com detector de espectrometria
de massas est atualmente tornando-se bastante popular. Esses sis-
temas de cromatografia l quida/espectrometria de massas podem Para o descarte
identificar os analitos que deixam a coluna de CLAE,2 como discuti- Um detector
do no Destaque 32-1. UV-vis vel para CLAE.

A combina o da cromatografia l quida com a es-
pectrometria de massas poderia ser vista como a
fus o ideal entre a separa o e a detec o. Assim
como na cromatografia gasosa, o espectr metro de
massas poderia identificar as esp cies medida
que elas fossem elu das da coluna cromatogr fica.
Contudo, existem dois problemas principais no
acoplamento dessas duas t cnicas. Uma amostra
no estado gasoso necess ria para a espectrome-
tria de massas, enquanto a sa da de uma coluna de
CL constitu da por um soluto dissolvido em um
solvente. Em uma primeira etapa, o solvente deve
ser evaporado. Quando vaporizado, contudo, o sol-
vente da CL produz um volume de vapor que
cerca de 10 a 1.000 vezes maior que o volume do
g s de arraste em cromatografia gasosa. Portanto, a
maior parte do solvente deve tamb m ser removi-
mL/min, as quais s o t picas da CLAE conven-
cional. As fontes de ioniza o mais comuns s o a
ioniza o por eletrospray e a ioniza o qu mica
press o atmosf rica (ver Se o 31A-4). A combi-
na o de CLAE e espectrometria de massas pro-
porciona uma alta seletividade, uma vez que picos
n o-resolvidos podem ser isolados monitorando-se
somente um valor de massa selecionado. A t cnica
de CL-MS pode fornecer uma impress o digital de
um eluato em particular em vez de recorrer ao
tempo de elui o, como na CLAE convencional. A
combina o tamb m pode fornecer a massa molar
e informa o estrutural e uma an lise quantitati-
va exata.3
Sistema Fonte Analisador Detector
CLAE de ons de massas de ons

da. Diversos dispositivos t m sido desenvolvidos Sistema de v cuo

para resolver esse problema de remo o do sol-
vente e para o interfaceamento da coluna de CL.
Hoje em dia, a abordagem mais popular usar a Sistema
t cnica de ioniza o press o atmosf rica de baixa de dados

vaz o. O diagrama de blocos de um sistema t pico

CL-MS (ou LC-MS, do ingl s Liquid Chromato-
graphy-Mass Specrometry) mostrado na Figura
32D-1. O sistema de CLAE tipicamente um sis-
tema capilar de CL em nanoescala com vaz es na
faixa de L/min. Alternativamente, algumas inter-
faces permitem vaz es t o altas como de 1 a 2
Diagrama de blocos de um sistema
CL-MS. O efluente da coluna de CL introduzido em uma
fonte de ioniza o press o atmosf rica como um sistema
de eletrospray ou ioniza o qu mica. Os ons produzidos
s o selecionados pelo analisador de massas e detectados
pelo detector de ons.
(continua)

2 Ver R. Willoughby, E. Sheehan, S. Mitrovich, A Global View of LC/MS. Pittsburgh: Global View Publishing, 1998; W. M. A. Niessen, Liquid
Chromatography-Mass Spectrometry, 2 ed. Nova York: Dekker, 1999.
3 Para uma revis o sobre os sistemas comerciais CL/MS, ver B. E. Erickson, Anal. Chem., 2000, v. 72, p. 711A.
 Para algumas misturas complexas, a combi-
na o da CL com MS n o fornece uma reso-
lu o suficiente. Nos anos mais recentes, tornou-
se fact vel o acoplamento de dois ou mais ana-
lisadores de massas em conjunto em uma t cni-
ca conhecida como espectrometria de massas
tandem.4 Quando se combina a CL com a espec-
trometria de massas tandem, o instrumento
recebe o nome de CL-MS-MS (ou LC-MS-
MS).5 Os espectr metros de massas tandem s o
do tipo de triplo quadrupolo (a c lula de colis o
tamb m um quadrupolo) ou espectr metros
com quadrupolo e armadilha de ons. Um sis-
tema de triplo quadrupolo de espectrometria de
massas mostrado na Figura 32D-2. Nesse caso,
o primeiro quadrupolo age como um filtro de
massas selecionando o on de interesse. Esse on
ent o fragmentado por colis o com um g s
inerte em uma c lula de colis o. O sistema
quadrupolo final analisa os fragmentos produzi-
dos. O sistema de triplo quadrupolo pode operar
em outros modos. Por exemplo, se o primeiro
quadrupolo for operado como um filtro largo de
massas de forma a transmitir ampla faixa de ons
e se nenhum g s de colis o estiver presente na
c lula de colis o, o instrumento est operando
como um sistema CL-MS. O instrumento pode
ser operado, varrendo-se um ou ambos os
quadrupolos para produzir espectros de massas
dos fragmentos dos ons selecionados pelo
primeiro quadrupolo medida que aquele qua-
drupolo varrido.
Para se obter maior resolu o que a que
poderia ser obtida com um quadrupolo, o anali-
sador de massas final em um sistema MS tandem
pode ser um espectr metro de massas de tempo
de v o. Os espectr metros de massas de setor
tamb m podem ser combinados para gerar sis-
temas tandem. A resson ncia ciclotr nica de ons
e os espectr metros com armadilha de ons po-
dem ser operados de forma a prover n o somente
dois est gios, mas n est gios de an lise de massa.
Esses sistemas MSn promovem as etapas de
an lise sequencialmente com um nico analisador
de massas. Esses t m sido combinados com sis-
temas CL em instrumentos CL-MSn.

Quadrupolo de Quadrupolo
Fonte C lula de Detector
filtro analisador
de ons colis o de ons
de massas de massas
Sistema de v cuo

Entrada
Um sistema de espectrometria de massas tandem. Os ons
produzidos na fonte s o filtrados no primeiro quadrupolo de forma que somente o
on selecionado passe para a c lula de colis o. Um g s de colis o promove a
fragmenta o do on selecionado. Os fragmentos s o selecionados pelo quadrupolo
analisador de massas e detectados. Geralmente, a c lula de colis o tamb m um
quadrupolo operado de forma que os fragmentos de ons sejam dirigidos para o
analisador de massas.

Outro tipo de detector, que tem encontrado uma consider vel aplica o, baseado na mudan a de
ndice de refra o do solvente causada pelas mol culas do analito. Em contraste com a maioria dos outros
detectores listados na Tabela 32-1, o detector de ndice de refra o de uso geral em vez de seletivo e
responde presen a de todos os solutos. A desvantagem desse detector est em sua sensibilidade limitada.
Muitos detectores eletroqu micos baseados em medidas potenciom tricas, condutim tricas e voltam tricas
foram tamb m desenvolvidos. Um exemplo de detector amperom trico encontra-se na Figura 32-9.

4 Para uma descri o de espectr metros de massas tandem comerciais, ver D. Noble, Anal. Chem., 1995, v. 67, p. 265A.
5 Para desenvolvimentos recentes em CL/MS/MS, ver R. Thomas, Spectroscopy, 2001, v. 16, p. 28.
 Para os eletrodos de
refer ncia e
contra-eletrodos Para coluna

Blocos de Kel-F Espa ador

usinados de Teflon

Eletrodo de trabalho

C lula amperom trica de camada

fina para CLAE. 1 cm

O tipo de CLAE mais utilizado a , na qual

a fase estacion ria um segundo l quido que imisc vel com o l quido
da fase m vel. A cromatografia por parti o pode ser subdividida em
e
da. A diferen a entre as duas est na forma com a qual a fase estacion ria
imobilizada nas part culas de suporte do recheio. O l quido imobi-
lizado por adsor o f sica em cromatografia l quido-l quido, enquanto
retido por meio de liga es qu micas na cromatografia l quida com fase
ligada. Inicialmente a cromatografia por parti o era exclusivamente do
tipo l quido-l quido; atualmente, contudo, os m todos de fase ligada pre-
dominam por causa de sua maior estabilidade. Os recheios do tipo l qui-
do-l quido est o hoje em dia relegados a certas aplica es especiais.

A maioria dos recheios com fase ligada s o preparados pela rea o de um organoclorosilano com os gru-
pos OH formados na superf cie das part culas de s lica por hidr lise a quente em cido clor drico dilu -
do. O produto um organosiloxano. A rea o para um s tio SiOH sobre a superf cie de uma part cula pode
ser escrita como
CH3 CH3
Si OH Cl Si R Si O Si R
CH3 CH3

em que R geralmente um grupo octil ou octadecil de cadeia aberta. Outros grupos funcionais org nicos
que t m sido ligados s superf cies de s lica incluem as aminas alif ticas, teres e nitrilas, bem como hidro-
carbonetos arom ticos. Assim, as fases estacion rias est o dispon veis com muitas polaridades diferentes.
Os recheios com fases ligadas apresentam como vantagem uma estabilidade muito maior que as fases
estacion rias imobilizadas fisicamente. Com essas ltimas, o recobrimento peri dico das superf cies do s li-
do necess ria porque a fase estacion ria dissolvida gradualmente pela passagem da fase m vel. Al m
disso, a elui o por gradiente n o vi vel com recheios tipo l quido-l quido, novamente por causa das per-
das por solubiliza o na fase m vel. A maior desvantagem dos recheios com fase ligada est na sua capa-
cidade de amostra limitada (somente pequenas quantidades de amostra podem ser admitidas na coluna).
Dois tipos de cromatografia por parti o podem ser distinguidos com base nas polaridades relativas da fase
estacion ria e m vel. Os trabalhos iniciais em cromatografia l quida foram baseados em fases estacion rias
altamente polares como o trietileno glicol ou gua; um solvente relativamente n o-polar, como o hexano ou
o ter i-prop lico, servia, ent o, como fase m vel. Por raz es hist ricas,
esse tipo de cromatografia atualmente chamado cromatografia de fase
normal. Na cromatografia de fase reversa, a fase estacion ria n o-
polar, geralmente um hidrocarboneto, e a fase m vel corresponde a um
solvente relativamente polar (como gua, metanol, acetonitrila ou tetrai-
drofurano).6
Na cromatografia de fase normal, o componente menos polar elu do primeiro; o aumento da polari-
dade da fase m vel diminui o tempo de elui o. Em contraste, na cromatografia de fase reversa, o compo-
nente mais polar elui primeiro e o aumento da polaridade da fase m vel eleva o tempo de elui o.
Na cromatografia de fase Foi estimado que mais de tr s quartos de todas as separa es feitas
normal, o analito menos polar por CLAE s o atualmente realizadas em fase reversa com recheios com
elu do primeiro. Na cromatografia fase ligada contendo octil ou octadecil siloxano. Com o uso dessas
de fase reversa, por ltimo. prepara es, os grupos hidrocarbonetos de cadeia longa encontram-se
alinhados de forma paralela uns aos outros e perpendicular superf cie
da part cula, gerando uma superf cie n o-polar que se assemelha a uma escova. A fase m vel empregada
com esses recheios normalmente uma solu o aquosa contendo v rias concentra es de solventes como
metanol, acetonitrila ou tetra-hidrofurano.
A um subgrupo da cromatografia
em fase reversa no qual as esp cies facilmente ioniz veis s o sepa-
radas em colunas de fase reversa. Nesse tipo de cromatografia, um sal
inorg nico contendo um contra- on org nico de tamanho grande, como
um on de am nio quatern rio ou um sulfonato alqu lico, adicionado
fase m vel como um reagente formador de par i nico. Dois mecan-
ismos de separa o s o postulados. No primeiro, o contra- on forma
um par i nico n o carregado com um on do soluto de carga oposta na
fase m vel. Esse par i nico particiona-se na fase n o-polar esta-
cion ria, gerando uma reten o diferencial dos solutos com base na
afinidade do par i nico pelas duas fases. Alternativamente, o contra-
on retido fortemente pela fase estacion ria, normalmente neutra,
atribuindo carga a essa fase. A separa o de ons do soluto org nico de
carga oposta ocorre por forma o de complexos de pares i nicos, os
solutos mais retidos formam os complexos mais fortes com a fase esta-
Modelo molecular do octadecil- cion ria. Algumas separa es excepcionais de compostos i nicos e
siloxano
n o-i nicos presentes na mesma amostra podem ser realizadas com
essa forma de cromatografia por parti o. A Figura 32-10 ilustra a separa o de compostos i nicos e
n o-i nicos utilizando sulfonatos alqu licos com cadeias de v rios comprimentos como agentes de for-
ma o de pares i nicos. Observe que a mistura de sulfonatos alqu licos C5 e C7 produz os melhores
resultados para a separa o.

O sucesso da cromatografia por parti o requer um equil brio adequado entre as for as intermoleculares
existentes entre os tr s participantes no processo de separa o o analito e as fases m vel e estacion ria.

6 Para
uma discuss o detalhada sobre CLAE em fase reversa, ver A. M. Krstulovic e P. R. Brown, Reversed-Phase High-Performance Liquid
Chromatography. Nova York: Wiley, 1982.
Essas for as intermoleculares s o descritas qualitativamente em termos A ordem de polaridade dos
da polaridade relativa de cada um dos tr s componentes. Em geral, as solventes comuns utilizados como
fases m veis gua > acetonitrila
polaridades dos grupos funcionais org nicos na ordem crescente s o: > metanol > etanol
hidrocarbonetos alif ticos olefinas < hidrocarbonetos arom ticos tetraidrofurano propanol
haletos sulfetos teres compostos nitro steres alde dos ce- cicloexano hexano.
tonas < alco is aminas sulfonas sulf xidos amidas cidos car-
box licos gua.
Como regra, a maioria das separa es cromatogr ficas realizada
igualando-se a polaridade do analito com aquela da fase estacion ria;
uma fase m vel de polaridade consideravelmente diferente ent o
empregada. Esse procedimento mais bem-sucedido que outro no
qual as polaridades do analito e da fase m vel s o igualadas, sendo
diferentes daquela da fase estacion ria. Nesse caso, a fase estacion ria
Modelo molecular da acetonitrila. A
geralmente n o consegue competir com sucesso pelos componentes da acetonitrila (CH3C N) amplamente
amostra; os tempos de reten o tornam-se muito curtos para permitir empregada como solvente org nico. Seu
sua aplica o pr tica. No outro extremo est a situa o na qual as uso como fase m vel em CL vem do
polaridades do analito e da fase estacion ria s o muito parecidas; fato de que ela mais polar que o
metanol, por m menos polar que a gua.
assim, os tempos de reten o tornam-se indesejavelmente longos.

2
2.4 2

1
1
4
Inje o
Inje o

3
Inje o

4 3 3
1

0 5 10 15 20 0 5 10 0 5 10
Tempo, min Tempo, min Tempo, min

Coluna: -Bondapak C18 Coluna: -Bondapak C18 Coluna: -Bondapak C18

(4 mm 30 cm) (4 mm 30 cm) (4 mm 30 cm)
Solvente: MeOH/H2O com Solvente: MeOH/H2O com Solvente: MeOH/H2O com
Sulfonato de alquila C7 Sulfonato de alquila C5 mistura (50/50)
Sulfonatos de alquila C5 /C7

(a) (b) (c)

Cromatogramas ilustrando as separa es de misturas de compostos i nicos e

n o-i nicos por cromatografia por par i nico. Compostos: (1) niacinamida, (2) pirodoxina, (3) riboflavina,
(4) tiamina. Em pH 3,5 a niacinamida est fortemente ionizada, enquanto a riboflavina n o-i nica. A
piridoxina e a tiamina est o fracamente ionizadas. Coluna: -Bondapak, C18, 4 mm 30 cm. Fase m vel:
(a) MeOH/H2O com sulfonato de alquila C7; (b) MeOH/H2O com sulfonato de alquila C5; (c) MeOH/H2O
com uma mistura 1:1 de sulfonato de alquila C5 e C7 . (Cortesia da Waters Corp., Milford, MA.)
A Figura 32-11 ilustra algumas aplica es t picas da cromatografia por parti o em fase ligada para sepa-
rar os aditivos de bebidas refrigerantes e inseticidas organofosforados. A Tabela 32-2 ilustra a variedade de
amostras para as quais a t cnica pode ser aplicada.

Identifica o dos picos

1. Metil parathion
2. Ciodrin
3. Parathion
4. Dyfonato
5. Diazinon
6. EPN
3 7. Ronnel
8. Trithion

6
1 4 8
Identifica o dos picos
Aplica es t picas da 1. Vitamina C 5
1 2
cromatografia com fase ligada. (a) 2 2. Sacarina
Aditivos em refrigerantes. Coluna: 4,6 3
3. Cafe na
250 mm recheada com material com fase 4. Benzoato de s dio
7
ligada polar (nitrila). Elui o isocr tica
com 6% HOAc/94% H2O. Vaz o: 1,0
mL/min. (Cortesia de BTR Separations, 4
uma afiliada da DuPont ConAgra.) (b)
Inseticidas organofosforados. Coluna
4,5 250 mm recheada com part culas de
5 m com fase ligada de C8. Elui o por
gradiente: 67% CH3OH/33% H2O at
80% CH3OH/20% H2O. Vaz o: 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10
2 mL/min. Ambas aplica es empregaram
(a) Tempo, min (b) Tempo, min
detectores UV a 254 nm.

Farmac utico Antibi ticos, sedativos, ester ides, analg sicos

Bioqu mico Amino cidos, prote nas, carboidratos, lip deos
Produtos aliment cios Ado antes artificiais, antioxidantes, aflotoxinas, aditivos
Industrial qu mico Arom ticos condensados, tensoativos, propelentes, corantes
Poluentes Pesticidas, herbicidas, fen is, bifenilas policloradas (PCBs)
Qu mico forense Drogas, venenos, lcool no sangue, narc ticos
M dico cl nico cidos b licos, metab litos de drogas, extratos de urina, estr genos

O trabalho pioneiro em cromatografia foi baseado na adsor o dos analitos em uma superf cie s lida. A
fase estacion ria, nesse caso, a superf cie de um s lido polar finamente dividido. Nesse tipo de recheio,
o analito compete com a fase m vel pelos s tios da superf cie do recheio
e a reten o resulta das for as de adsor o.
A s lica finamente dividida e a alumina s o as nicas fases estacion rias empregadas extensivamente em
cromatografia por adsor o. A s lica preferida para a maioria (mas n o todas) das aplica es por causa
da sua alta capacidade de amostra e das suas v rias formas teis. As caracter sticas de adsor o das duas
subst ncias s o paralelas entre si. Para ambas, os tempos de reten o tornam-se mais longos medida que
a polaridade do analito aumenta.
Na cromatografia por adsor o, a nica vari vel que afeta o coefi- Na cromatografia por adsor o,
ciente de distribui o dos analitos a composi o da fase m vel (con- a fase m vel constitu da
trastando com a cromatografia de parti o, na qual a polaridade da fase geralmente por um solvente
org nico ou por uma mistura de
estacion ria tamb m pode ser variada). Felizmente, uma varia o solventes org nicos; a fase
enorme na reten o, e assim na resolu o, acompanha as varia es no estacion ria composta por
sistema solvente, sendo, portanto, raro n o se dispor de uma fase m vel part culas finamente divididas de
adequada. s lica ou alumina.

Atualmente, CLAE l quido-s lido utilizada extensivamente para a separa o de compostos relativamente
n o-polares insol veis em gua e com massas molares menores que cerca de 5.000. Uma vantagem em par-
ticular da cromatografia por adsor o, que n o compartilhada por outros m todos, est na sua habilidade
de resolver as misturas isom ricas como aquelas de derivados para e metassubstitu dos do benzeno.

Na Se o 30D, descrevemos algumas das aplica es das resinas trocadoras de ons em separa es anal ti-
cas. Al m disso, esses materiais s o teis como fases estacion rias para a cromatografia l quida, na qual
s o empregados para separar esp cies carregadas.7 Na maioria dos casos, medidas de condutividade s o
empregadas para detectar as esp cies elu das.
Atualmente h dois tipos de cromatografia de ons em uso: baseada em supressor e de .
Elas diferem no m todo utilizado para prevenir que a condutividade dos eletr litos eluentes interfiram com
a medida das condutividades dos analitos.

Os detectores de condutividade apresentam muitas propriedades de um detector ideal. Eles podem ser alta-
mente sens veis, s o universais para as esp cies carregadas e, como regra, respondem de uma forma pre-
vis vel s altera es na concentra o. Al m disso, esses detectores s o
de opera o simples, de baixo custo de constru o e de manuten o, O detector de condutividade
muito adequado para a
f ceis de serem miniaturizados e, geralmente, operam por longos per o- cromatografia por troca i nica.
dos sem necessitar de manuten o.A nica limita o no uso de detec-
tores de condutividade, que atrasou a difus o da sua aplica o em cromatografia de ons at a metade da
d cada de 1970, foi a alta concentra o de eletr lito necess ria para a elui o da maioria dos ons dos ana-
litos em um tempo razo vel. Em conseq ncia, a condutividade dos componentes da fase m vel tendem a
se sobrepor dos ons dos analitos, reduzindo, assim, a sensibilidade do detector.
Em 1975, o problema criado pela alta condut ncia dos eluentes foi resolvido pela introdu o de uma
coluna supressora do eluente logo ap s a coluna trocadora de ons.8 A coluna do supressor recheada

7 Para uma revis o curta sobre a cromatografia de ons, ver J. S. Fritz, Anal. Chem., 1987, v. 59, p. 335A; P. R. Haddad, Anal. Chem., 2001, v. 73,
p. 266A. Para uma descri o detalhada do m todo, ver H. Small, Ion Chromatography. Nova York: Plenum Press, 1989; D. T. Gjerde e J. S. Fritz,
Ion Chromatography, 3. ed. Nova York: A. Heuthig, 2000.
8 H. Small, T. S. Stevens e W. C. Bauman, Anal. Chem., 1975, v. 47, p. 1801.
 ppm
com uma segunda resina trocadora de ons que converte efetivamente os
1. Li +
0,5 ons do solvente de elui o para esp cies moleculares de ioniza o limi-
2. Na+ 2 tada sem afetar a condutividade dos ons dos analitos. Por exemplo,
3. NH4+ 3
4. K+ 3 quando se pretende separar e determinar c tions, o cido clor drico
5. Morfolina 30 selecionado como reagente eluente e a coluna de supress o constitu -
6. Cicloexilamina 10
7. Mg2+ 1 da por uma resina trocadora de ons na forma hidr xida. O produto da
8. Ca2+ 2 rea o na coluna de supress o a gua. Isto
9. Sr2+ 10
2
7 H (aq) Cl (aq) resina OH (s) resina Cl (s) H2O
1 8
Os c tions do analito n o s o retidos por essa segunda coluna.
4 6 9
Na separa o de nions, o recheio supressor est na forma cida de
3
uma resina trocadora de c tions e o agente de elui o constitu do por
bicarbonato ou carbonato de s dio. A rea o no supressor

5 Na (aq) HCO 3 (aq) resina H (s) resina Na (s) H2CO3(aq)

O cido carb nico pouco dissociado n o contribui significativamente

Auto-ajuste
para a condutividade.
0 4 8 12 16 20 24 Uma inconveni ncia associada com as colunas supressoras origi-
Tempo, min
nais era a necessidade de regener -las periodicamente (tipicamente a
Cromatograma de
ons de uma mistura de c tions.
cada 8 ou 10 horas) para reconverter o recheio para a sua forma cida
(Cortesia da Dionex, Sunnyvale, CA.) ou b sica. Recentemente, contudo, os supressores com micromem-
branas que operam continuamente tornaram-se dispon veis.9 Por exem-
plo, quando o carbonato ou bicarbonato de s dio devem ser removidos, o eluente passa sobre uma s rie de
membranas ultrafinas de trocadoras de c tions que os separam de uma corrente de solu o cida de regene-
ra o que flui continuamente na dire o oposta. Os ons s dio do eluente s o trocados com os ons
hidrog nio na superf cie interna da membrana trocadora e ent o migram para outra superf cie para serem
trocados com os ons hidrog nio do reagente regenerador. Os ons
1. SiO 23 2 ppm hidrog nio da solu o regeneradora migram na dire o inversa preser-
2. F 0,4 ppm
3. Formiato 1 ppm
vando, assim, a neutralidade el trica.
4. Cl 2 ppm As Figuras 32-12 e 32-13 mostram as aplica es da cromatografia
5. NO2 2 ppm de ons baseadas em uma coluna supressora e na detec o condu-
6. Br 2 ppm
7. NO3 4 ppm tom trica. Nessas aplica es, os ons est o presentes na faixa de partes
por milh o; o volume da amostra foi de 50 L em um caso e de 20 L
3 4
no outro. O m todo particularmente importante para a an lise de
2 nions porque n o existe outro m todo r pido e conveniente para
5
7 resolver as misturas desse tipo.
1

Recentemente, a instrumenta o comercial para a cromatografia de

ons, que n o requer nenhuma coluna supressora, tornou-se dispon vel.
Essa abordagem depende da pequena diferen a de condutividade entre
0 5 10 15 20
Tempo, min os ons da amostra e os ons prevalentes do eluente. Para amplificar
Cromatograma de essas diferen as, trocadores de baixa capacidade s o empregados per-
ons de uma mistura de nions. mitindo a elui o com solu es com baixas concentra es de eletr litos.
(Cortesia da Dionex, Sunnyvale, CA.)
Al m disso, eluentes de baixa condutividade s o selecionados.10

9 Para uma descri o desse dispositivo, ver G. O. Franklin, Amer. Lab., 1985, v. 3, p. 71.
10 Ver R. M. Becker, Anal. Chem., 1980, v. 52, p. 1510; J. R. Benson, Amer. Lab., 1985, v. 6, p. 30; T. Jupille, Amer. Lab., 1986, v. 5, p. 114.
 A cromatografia de ons com coluna nica oferece a vantagem de
n o requerer equipamentos especiais para a supress o. Contudo, um
m todo um pouco menos sens vel para determinar os nions que
os m todos que empregam as colunas supressoras.

A cromatografia por exclus o por tamanho ou em gel o mais recente

dos procedimentos cromatogr ficos. Ela se constitui em uma t cnica
poderosa particularmente aplicada s esp cies de alta massa molar.11

Os recheios para a cromatografia por exclus o por tamanho consistem

em part culas pequenas ( 10 m) de s lica ou pol meros contendo uma
rede de poros uniformes dentro dos quais as mol culas do soluto e do
solvente podem difundir. Enquanto est o ocupando os poros, as
mol culas est o efetivamente presas e removidas do fluxo da fase
m vel. O tempo de resid ncia m dio das mol culas do analito depende
do seu tamanho efetivo. As mol culas que s o muito maiores que o
tamanho m dio dos poros do recheio s o exclu das e assim n o sofrem
nenhuma reten o; isto , elas se deslocam atrav s da coluna na veloci-
dade da fase m vel. As mol culas que s o apreciavelmente menores que
os poros podem penetrar por meio do labirinto dos poros e s o assim
retidos por tempos mais longos; elas s o as ltimas a ser elu das. Entre
esses dois extremos est o as mol culas de tamanho intermedi rio cuja
penetra o m dia nos poros do recheio depende dos seus di metros. O
fracionamento que ocorre dentro desse grupo est diretamente rela-
cionado com o tamanho molecular e, em alguma extens o, com a forma
da mol cula. Observe que as separa es por exclus o por tamanho
diferem de outros tipos de cromatografia sob o aspecto de que nenhuma
intera o f sica ou qu mica entre os analitos e a fase estacion ria est Cranberry
envolvida no processo. De fato, todos os esfor os s o dirigidos no sen- Abacaxi
Ma
tido de se evitar essas intera es, pois elas levam a uma degrada o da Laranja
G F S
Padr es
S G
S F
efici ncia da coluna. F
Muitos recheios para a exclus o por tamanho est o no mercado. G
G
Alguns s o hidrof licos para ser empregados com fases m veis aquosas; G F
F S
outros s o hidrof bicos e empregados junto a solventes n o-polares
org nicos. A cromatografia baseada em recheios hidrof licos s vezes
denominada , ao passo que as t cnicas baseadas em
4 8 4 8 4 8 4 8 4 8
recheios hidrof bicos s o chamadas . Para ambos os Tempo, min
tipos de recheio, muitos di metros de poros est o dispon veis. Cromatograma por
Geralmente, um dado recheio pode acomodar uma faixa que vai de 2 a filtra o em gel para glicose (G),
2,5 d cadas de massa molar. A massa molar m dia adequada para um frutose (F) e sacarose (S) em sucos
enlatados. (Cortesia da BTR
dado recheio pode ser t o pequena como poucas centenas ou t o grande Separations, uma afiliada da
como v rios milh es de Daltons. DuPont ConAgra.)

11 Paramonografias sobre esse assunto, ver Size Exclusion Chromatography, B. J. Hunt e S. R. Holding, Eds. Nova York: Chapman and Hall, 1988;
Handbook of Size Exclusion Chromatography, C. S. Wu, Ed. Nova York: Dekker, 1995; Column Handbook for Size Exclusion Chromatography,
C. S. Wu, Ed. San Diego: Academic Press, 1999.
 n=1

Permea o total
n=3 As Figuras 32-14 e 32-15 ilustram aplica es t picas da cromatografia
n=4
n=2 de exclus o por tamanho. Nos cromatogramas mostrados na Figura
n=5
32-14, um recheio hidrof lico foi utilizado para excluir as massas mola-
Inje o

n=6
n=7
res maiores que 1.000. Muitos a cares presentes em suco enlatado pu-
deram ser separados. O cromatograma da Figura 32-15 foi obtido com
4 min um recheio hidrof bico e o eluente foi o tetraidrofurano. A amostra era
Separa o dos
de uma resina ep xi comercial na qual cada unidade do mon mero tinha
componentes de uma resina ep xi
por permea o em gel. (Cortesia da uma massa molecular de 280 (n n mero de unidades do mon mero).
BTR Separations, uma afiliada da Outra aplica o importante da cromatografia por exclus o por tama-
DuPont ConAgra.) nho est na determina o r pida da massa molecular ou da distribui o de
massas moleculares de pol meros de cadeia longa ou de produtos naturais. A chave para essas determina es
est na calibra o exata da massa molecular. As calibra es podem ser realizadas pelo uso de padr es de
massa molecular conhecida (m todo da posi o do pico) ou pelo m todo universal de calibra o . Esse lti-
mo est baseado no princ pio de que o produto da viscosidade molecular intr nseca e a massa molecular
proporcional ao volume hidrodin mico (volume efetivo, incluindo a camada de solvata o). Idealmente, as
mol culas s o separadas por cromatografia por exclus o por tamanho de acordo com o volume hidrodin mi-
co. Portanto, uma curva de calibra o universal pode ser obtida plotando-se um gr fico log [ ] versus o
volume de reten o, Vr, em que Vr tr F. Alternativamente, uma calibra o pode ser realizada empre-
gando-se um detector sens vel massa molar como o detector de espalhamento de luz a baixo ngulo.
O Destaque 32-2 ilustra como a cromatografia por exclus o por tamanho pode ser empregada na se-
para o de fulerenos.

Nossas id ias a cerca da natureza da mat ria s o

com freq ncia profundamente influenciadas por
descobertas feitas ao acaso. Nenhum evento de
mem ria recente tomou a imagina o dos cientis-
tas e do p blico tanto quanto a descoberta inespe-
rada em 1985 da mol cula C60, em forma de bola
de futebol. Essa mol cula, ilustrada na Figura
32D-3, a sua prima C70 e outras mol culas simi-
lares descobertas desde 1985 s o denominadas
fulerenos ou, mais comumente, buckyballs.12 Os
compostos s o assim chamados em considera o a Buckminster fulereno, C60.
um famoso arquiteto, R. Buckminster Fuller, que
projetou muitos edif cios com c pulas geod sicas A prepara o das buckyballs quase trivial.
apresentando a mesma estrutura hexagonal/pen- Quando um arco ca formado entre dois eletrodos
tagonal como os buckyballs. Desde a sua desco- de carbono em um fluxo de atmosfera de h lio, a
berta, milhares de grupos de pesquisa em todo o fuligem coletada rica em C60 e C70. Embora a
mundo t m estudado v rias propriedades f sicas e prepara o seja simples, a separa o e a purifi-
qu micas dessas mol culas muito est veis. Elas ca o de mais do que poucos miligramas de C60
representam uma terceira forma alotr pica do car- mostram-se demoradas e de alto custo. Quanti-
bono, al m do grafite e do diamante. dades relativamente grandes de buckyballs t m

12 R. F. Curl e R. E. Smalley, Sci. Am., 1991, v. 265 n. 4, p. 54.

 sido separadas por cromatografia por exclus o por
tamanho.13 Os fulerenos s o extra dos da fuligem,
preparada como descrito anteriormente, e injetados
em uma coluna de 199 mm 30 cm, 500
Ultrastyragel (Waters Corp., Milford, MA), em-
pregando-se o tolueno como fase m vel e detec o
ultravioleta/vis vel, ap s a separa o. Um cro-
matograma t pico mostrado na Figura 32D-4. Os
picos no cromatograma est o rotulados com suas
identifica es e tempos de reten o.
Observe que o C60 elui antes do C70 e dos
fulerenos superiores. Isso vai contra o esperado; a

C 60 C70
(16,4 min) (17,5 min)
Absorb ncia

Fulerenos superiores

Separa o de
fulerenos. Tempo

C60 C70

C70
10,46
6,19

10,32

C76
C2v C78
D3 C78
17,60

C84
15,00

Cromatogramas
16,24

18,76

do extrato total de fuligem (a) e da

fra o contendo os fulerenos
superiores (b) obtidos com uma
X C60
coluna polim rica ODS e com fase S
C76 X
m vel constitu da de C84 X
acetonitrila:tolueno. (Reproduzido X
com permiss o de F. Diederich e R. L.
Whetten, Acc. Chem. Res., 1995,
v. 25, p. 121. Copyright da Tempo de reten o, min Tempo de reten o, min
American Chemical Society.) (a) (b)

(continua)

13 M. S. Meier e J. P. Selegue, J. Org. Chem., 1992, v. 57, p. 1924; A. Gugel e K. Mullen, J. Chromatogr., 1993, v. 628, p. 23.
 mol cula menor, C60, deveria ser retida mais
intensamente que a C70 e os fulerenos superiores.
Tem sido sugerido que a intera o entre as
mol culas, o soluto e o gel acontece na superf cie
deste em vez de ocorrer nos poros. Uma vez que
o C70 e os fulerenos superiores apresentam reas
superficiais maiores que o C60, os fulerenos supe-
riores s o retidos mais fortemente na superf cie
do gel e, assim, s o elu dos ap s o C60. Com um
instrumento autom tico, esse m todo de sepa-
ra o pode ser empregado na prepara o de
v rios gramas de C60 com pureza igual a 99,8% a
partir de 5 a 10 g de uma mistura de C60 a C70 em
um per odo de 24 horas. Essas quantidades de C60
podem ser ent o usadas para estudar a qu mica e
a f sica de derivados dessas formas do carbono
interessantes e raras.
Atualmente, tem-se empregado extensiva-
mente a fase estacion ria ligada de s lica octadecil
(SOD) na separa o de fulerenos por CLAE.14 As
fases monom ricas e polim ricas SOD t m sido
empregadas, produzindo maior seletividade quando
comparada a outras fases. A Figura 32D-5 mostra
uma separa o preparativa a partir do extrato total
de fuligem e da fra o contendo os fulerenos supe-
riores em uma coluna de SOD polim rica. Essas
est o entre as primeiras separa es dos fulerenos
superiores individuais. Observe a excelente reso-
lu o quando comparada com a separa o por
exclus o por tamanho da Figura 32D-4.

A cromatografia por afinidade envolve a liga o covalente de um reagente denominado ligante de afinidade
a um suporte s lido.15 Os ligantes de afinidade t picos s o anticorpos, inibidores enzim ticos ou outras
mol culas que se ligam reversivamente e seletivamente com as mol culas do analito na amostra. Quando uma
amostra passa atrav s da coluna, somente as mol culas que se ligam seletivamente ao ligante de afinidade s o
retidas. As mol culas que n o se ligam passam pela coluna juntamente com a fase m vel. Ap s a remo o
das mol culas indesejadas, os analitos retidos podem ser elu dos alterando-se as condi es da fase m vel.
A fase estacion ria para a cromatografia por afinidade um s lido como a agarose ou microesferas de
vidro poroso no qual o ligante de afinidade imobilizado. A fase m vel em cromatografia por afinidade
desempenha dois pap is distintos. Primeiro, ela deve permitir uma forte liga o das mol culas do analito
com o ligante. Segundo, uma vez que as esp cies indesej veis tenham sido removidas, a fase m vel deve
enfraquecer ou eliminar a intera o entre o analito e o ligante de forma que o analito possa ser elu do.
Geralmente as altera es no pH ou na for a i nica s o empregadas para se alterar as condi es de elui o
durante os dois est gios do processo.
A cromatografia por afinidade apresenta uma extraordin ria seletividade como sua vantagem princi-
pal. O seu principal uso no isolamento de biomol culas durante a etapa preparativa.

Um avan o enorme tem sido realizado nos ltimos anos em rela o separa o de compostos que s o ima-
gens especulares n o-sobrepon veis um do outro, os chamados compostos quirais. Essas imagens especu-
lares s o denominadas . Os aditivos na fase m vel ou fases estacion rias quirais
16
s o requeridos para essas separa es. A complexa o preferencial entre o agente de resolu o quiral (adi-
tivo ou fase estacion ria) e um dos is meros resulta na separa o dos enanti meros. O
quiral deve apresentar por si um car ter quiral para reconhecer a natureza quiral do soluto.

14 K. Jinno, H. Ohta e Y. Sato, in Separation of Fulerenes by Liquid Chromatography, K. Jinno, Ed. Ch. 3. Londres: Royal Society of Chemistry, 1999.
15 Para detalhes sobre a cromatografia por afinidade, ver R. R. Walton, Anal. Chem., 1985, v. 57, p. 1097A; Handbook of Affinity Chromatography,
T. Kline, Ed. Nova York: Dekker, 1993; Analytical Affinity Chromatography, I. M. Chaiken, Ed. Boca Raton, FL: CRC Press, 1987.
16 Chiral Separations: Aplications and Technology, S. Ahuja, Ed. Washington: American Chemical Society, 1996; S. Ahuja, Chiral Separations by

Chromatography, Nova York: Oxford University Press, 2000.

 As fases estacion rias quirais t m recebido maior aten o.17 Nesse
caso, um agente quiral imobilizado sobre a superf cie de um suporte
s lido. V rias formas diferentes de intera o podem ocorrer entre o
agente de resolu o quiral e o soluto.18 Em uma das formas, a intera o
d -se em virtude de for as de atra o como aquelas existentes entre as
liga es , liga es de hidrog nio ou dipolos. Em outro tipo, o soluto pode se ajustar em cavidades quirais
na fase estacion ria para formar complexos de inclus o. N o importando como, a habilidade de separar
esses compostos muito semelhantes entre si de extrema import ncia em muitas reas. A Figura 32-16
mostra a separa o de uma mistura rac mica de um ster em uma fase estacion ria quiral. Observe a exce-
lente resolu o obtida para os enanti meros R e S.

R-1

Cromatograma de
uma mistura rac mica de ster 1 de
N-(1-Naftil)leucina em uma fase
estacion ria quiral de dinitrobenzeno-
leucina. Os enanti meros R e S s o
S-1 muito bem separados. Coluna:
4,6 50 mm; fase m vel, 20% 2-
propanol em hexano; vaz o: 1,2
mL/min; detector UV a 254 nm.
(Reproduzido com permiss o de L. H.
Bluhm, Y. Wang e T. Li, Anal. Chem.,
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
2000, v. 72, p. 5201. Copyright da
Tempo de reten o, min
American Chemical Society.)

A Tabela 32-3 fornece uma compara o entre a cromatografia l quida de alta efici ncia e a cromatografia
g s-l quido. Quando ambas podem ser aplicadas, a cromatografia g s-l quido oferece a vantagem da veloci-
dade e simplicidade do equipamento. Por outro lado, a cromatografia l quida de alta efici ncia pode ser apli-
cada a subst ncias n o-vol teis (incluindo os ons inorg nicos) e a materiais termicamente inst veis,
enquanto a cromatografia g s-l quido n o pode. Geralmente os dois m todos s o complementares.

Caracter sticas de ambos os m todos

Eficientes, altamente seletivos, amplamente aplicados
Necessitam de uma pequena quantidade de amostra
Podem ser n o destrutivos da amostra
Prontamente adaptados an lise quantitativa
Vantagens da CLAE
Pode separar compostos n o-vol teis e termicamente inst veis
Pode ser aplicada de forma geral a ons inorg nicos
Vantagens da CG
Equipamento simples e de baixo custo
R pida
Resolu o incompar vel (com colunas capilares)
F cil de ser interfaceada a espectr metros de massas

17 Para uma revis o atual sobre as fases estacion rias quirais, ver D. W. Armstrong e B. Zhang, Anal. Chem., 557A.
18 Para uma revis o sobre as intera es quirais, ver M. C. Ringo e C. E. Evans, Anal. Chem., 1998, v. 70, p. 315A.
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32. Encontre a conex o com a revista LC-GC. A partir da p gina inicial da
LC-GC, procure por artigos sobre LC/MS. Encontre um artigo, escrito em
2001, que compare os analisadores de massas para aplica es de LC/MS.
Quais s o as fontes de ioniza o mais empregadas para LC/MS? Descreva
as diferen as na faixa de massas e na resolu o entre os analisadores de
massas do tipo quadrupolo, tempo de v o e aprisionamento de ons (trans-
formada de Fourier). Esses analisadores mostram diferen as com rela o
ao uso em an lises qualitativas e quantitativas?

32-1. Liste os tipos de subst ncias para as quais os
seguintes m todos cromatogr ficos s o mais
adequados
*(a) g s-l quido.
(b) parti o em l quido.
*(c) troca i nica.
(d) adsor o em l quido.
*(e) permea o em gel.
(f) filtra o em gel.
*(g) g s-s lido.
32-2. Defina
*(a) elui o isocr tica.
(b) elui o por gradiente.
*(c) inje o com parada de fluxo.
(d) recheio de fase reversa.
*(e) recheio de fase normal.
(f) cromatografia por pares de ons.
*(g) cromatografia de ons.
(h) coluna supressora do eluente.
*(i) filtra o em gel.
( j) permea o em gel.
32-3. Indique a ordem pela qual os seguintes
compostos dever o ser elu dos de uma co-
luna de CLAE contendo um recheio de
fase reversa:
*(a) benzeno, ter diet lico, n-hexano.
(b) acetona, dicloroetano, acetamida.
32-4. Indique a ordem de elui o para os seguintes
compostos e uma coluna de fase normal de
CLAE:
*(a) acetato de etila, cido ac tico, dimeti-
lamina.
(b) propileno, hexano, benzeno, dicloro-
benzeno.
*32-5. Descreva a diferen a fundamental entre as
cromatografias por adsor o e por parti o.
32-6. Descreva a diferen a fundamental entre as
cromatografias por troca i nica e por ex-
clus o por tamanho.
*32-7. Descreva a diferen a entre as cromato-
grafias por permea o em gel e por fil-
tra o em gel.
32-8. Quais esp cies podem ser separadas por
CLAE, mas n o podem ser separadas
por CG?
*32-9. Descreva os diversos tipos de bombas em-
pregados em cromatografia l quida de alta
efici ncia. Quais s o as vantagens e des-
vantagens de cada um?
32-10. Descreva as diferen as entre as croma-
tografias de ons de coluna nica e com
coluna de supress o.
*32-11. A espectrometria de massas constitui um
sistema de detec o extremamente vers til
para a cromatografia gasosa. Contudo, o
interfaceamento de um sistema CLAE com
um espectr metro de massas uma tarefa
muito mais dif cil. Descreva as raz es prin-
cipais pelas quais mais dif cil combinar a
CLAE com a espectrometria de massas do
que a CG com a espectrometria de massas.
32-12. Quais detectores para CG listados na Tabela
31-1 s o adequados para a CLAE? Por que
alguns deles s o inadequados para a CLAE?
*32-13. O detector ideal para CG descrito na Se o
31A-4. Quais das oito caracter sticas de um
detector ideal para CG se aplicam aos de-
tectores para a CLAE? Que caracter sticas
adicionais deveriam se adicionadas para des-
crever um detector ideal para a CLAE?
32-14. Embora a temperatura n o exer a um gran-
de efeito sobre as separa es em CLAE
como em CG, ela tamb m pode exercer um
papel importante. Discuta como a tempe-
ratura pode ou n o influenciar as seguintes
separa es:
(a) uma separa o de ester ides por cro-
matografia de fase reversa.
 (b) uma separa o de uma mistura de 32-17. Problema Desafiador. Suponha por sim-
is meros bastante semelhantes por cro- plicidade que a altura de prato em CLAE,
matografia por adsor o. H, possa ser dada pela Equa o 30-27 como
*32-15. Em uma separa o por CLAE, dois compo- B B
nentes apresentam tempos de reten o que H C Eu CMu Cu
u u
diferem por 15 s. O primeiro pico elui ap s em que C CE CM.
9,0 min e as larguras dos picos s o aproxi- (a) Empregando-se os c lculos para encon-
madamente iguais. O tempo morto tM de trar o valor m nimo para H, mostre que a
65 s. Empregue uma planilha de c lculo velocidade u t pode ser expressa como
para encontrar o n mero m nimo de pratos
te ricos necess rio para obter os seguintes B
u t
valores de resolu o, Rs: 0,50; 0,75; 0,90; C
1,0; 1,10; 1,25; 1,50; 1,75; 2,0; 2,5. Como (b) Mostre que isso leva a um valor m ni-
os resultados iriam ser alterados se a largura mo da altura de prato Hmin, dado por
do pico 2 fosse duas vezes a do pico 1? Hmin 2 BC
32-16. Um m todo de CLAE foi desenvolvido
para a separa o e determina o de ibupro- (c) Sob certas condi es cromatogr ficas,
fen em amostras de plasma de rato como CE desprez vel quando comparado
parte de um estudo do tempo de perman n- com CM. Para as colunas recheadas de
cia da droga em animais de laborat rio. CL, CM dado por
V rios padr es foram cromatografados e d 2p
os seguintes resultados obtidos: CM
DM
em que uma constante adimen-
Ibuprofen g/mL do Pico
sional, dp o tamanho das part culas do
0,5 5,0 recheio da coluna e DM o coeficiente
1,0 10,1
2,0 17,2 de difus o na fase m vel. O coeficien-
3,0 19,8 te B pode ser expresso como
6,0 39,7 B 2 DM
8,0 57,3
10,0 66,9 em que tamb m uma constante adi-
15,0 95,3 mensional. Expresse u t e Hmin em
termos de DM, dp e das constantes adi-
Depois, uma amostra de 10 mg/kg de mensionais e .
ibuprofen foi administrada por via oral a (d) Se as constantes adimensionais forem
um rato de laborat rio. As amostras de pr ximas da unidade, mostre que u t e
sangue foram retiradas a v rios intervalos Hmin podem ser expressos como
de tempo ap s a administra o da droga e
DM
analisadas por CLAE. Os seguintes resul- u t e Hmin dp
tados foram obtidos: dp
(e) A partir das condi es na parte (d),
como a altura de prato poderia ser
0 0 reduzida de um ter o? O que aconte-
0,5 91,3 ceria com a velocidade tima sob essas
1,0 80,2 condi es? O que aconteceria com o
1,5 52,1
2,0 38,5 n mero de pratos te ricos N para
3,0 24,2 o mesmo comprimento da coluna?
4,0 21,2 (f) Para as condi es na parte (e), como
6,0 18,5 voc manteria o mesmo n mero de
8,0 15,2 pratos te ricos mesmo reduzindo sua
altura de um ter o?
Encontre a concentra o de ibuprofen no (g) A discuss o anterior assume que o
plasma sang neo para cada intervalo de alargamento de banda ocorre dentro da
tempo e fa a um gr fico da concentra o coluna. Indique duas fontes de alarga-
versus tempo. Em bases porcentuais, em mento de banda extracoluna que podem
qual per odo de meia hora (1o, 2o, 3o etc.) a contribuir tamb m para a largura total
maior parte do ibuprofen perdida? dos picos em CL.