UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA

QUI 0089- ANÁLISE INSTRUMENTAL APLICADA

PROFESSOR: EDGAR PERIN MORAES

ALUNO: EMANUEL BRUNO COSTA

Quantificação de isoorientina e flavonóides totais em polpa de

frutos de Passiflora edulis por HPLC-UV/DAD

O estudo de caso se trata de um trabalho que utiliza HPLC-UV/DAD

(cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por arranjo de fotodiodos)
para realizar a quantificação de isoorientina e flavonoides na poupa de um fruto
chamado Passiflora edulis conhecida popularmente como maracujá. O trabalho
visou realizar essas quantificações utilizando métodos de adição de padrão para
a isoorientina, e para os flavonoides, utilizar o método de padrão externo.
O trabalho relata o desenvolvimento e validação de um método para
quantificação de flavonoides na polpa de maracujá utilizando HPLC-UV/DAD,
pois o autor relata a inexistência de um método para tal fim. O autor relata que
para a análise quantitativa foram utilizadas duas estratégias, a primeira ficando
na determinação de flavonoides totais utilizando rutina padrão, com o intuito de
aplicá-la em análises de rotina de flavonoides totais em P. edulis. O segundo
procedimento utilizado se tratava de um método específico para quantificação
de isoorientina, que se trata de um composto utilizado como variável dependente
na otimização de extração de flavonoides por metodologia de desenho
experimental.
No preparo das amostras, o autor relata que foram realizados
experimentos para avaliar a influência e interação do solvente (metanol ou
etanol), porcentagem de solvente em H2O (100% ou 60%) e os intervalos de
tempo de extração (1,5 ou 3,0 min) na extração. Para calcular os efeitos e traçar
o gráfico foi utilizado o software STATISTICA 7.0. As análises de HPLC-UV/DAD,
o autor relata que foram realizadas em um cromatógrafo líquido Waters Alliance
2695 (Milford, MA, EUA) conectado a um arranjo de diodos modelo 2996 (DAD)
controlado pelo software Waters Empower. A coluna utilizada foi uma C18
Symmetry (250 mm de comprimento x 4,6 mm de diâmetro interno; 5μm),
precedida por uma coluna de guarda (2,0 cm de comprimento x 4,0 mm de
diâmetro interno; 5 μm), que possuía a mesma fase estacionária.
As amostras foram injetadas automaticamente (10μL). A coluna e a coluna
de guarda foram ajustadas termostaticamente a 40 °C e uma taxa de fluxo de
0,8 mL .min-1 foi aplicada, utilizando um gradiente linear de 0,2% de ácido fórmico
em água (solvente A) e 0,2% de ácido fórmico em acetonitrila (solvente B). Os
gradientes otimizados empregados em extratos de maracujá foram: 0–10 min,
12%–16% B em A e 10–30 min, 16–20% B em A. O cromatograma foi monitorado
a 330 nm e os espectros UV de cada picos foram registrados na faixa de 200-
400 nm.
As análises LC-MS/MS foram realizadas em um espectrômetro de massa
triplo quadrupolo Waters Micromass Quattro Última Platinum acoplado a um
cromatógrafo líquido Alliance 2690 (Waters, Milford, MA, EUA). A coluna e a
condição cromatográfica foram as mesmas usadas para a análise por HPLC. O
efluente de LC foi dividido usando um divisor T para produzir um fluxo de 0,2 mL
minÿ1. O espectrômetro de massa foi equipado com uma fonte Z-spray para
ionização por eletrospray (ESI) no modo negativo. A energia de colisão foi de 18
eV. As voltagens capilares e de cone foram ajustadas em 3,2 kV e 50 V,
respectivamente, e a fonte de temperatura foi mantida em 125°C enquanto a
temperatura de dessolvatação foi mantida em 250°C. O nitrogênio foi usado
como cone e gás de dessolvatação a uma taxa de fluxo de 88 L hÿ1 e 502 L hÿ1,
respectivamente.
No procedimento foram realizados procedimentos de calibração, como a
determinação da linearidade, de precisão, de limite de detecção (LOD) e limite
de quantificação (LOQ). O LOD e o LOQ foram determinados experimentalmente
pela injeção em triplicata de soluções padrão de isoorientina e rutina diluídas em
etanol 80% até que a relação sinal-ruido para os padrões atingisse uma relação
de 3:1 para LOD e de 10:1para LOQ.
Com relação a quantificação da isoorientina na polpa do maracujá, a
quantificação ocorreu utilizando o método de adição de padrão, utilizando curvas
analíticas construídas a partir de amostras enriquecidas com uma solução
estoque de isoorientina (300,0 mg Lÿ1 em metanol 80%) para atingir uma
concentração final na faixa de 5,0 a 80 mg. L-1. O procedimento foi repetido em
triplicata e a quantidade de isoorientina foi calculada com base no pico em ÿ=
330 nm.
Já os flavonoides totais foram determinados pelo método do padrão
externo, utilizado rutina como referência. As soluções padrão (50 a 250 mg. Lÿ-1)
foram preparadas em metanol 80%. O conteúdo total de flavonoides de cada
amostra de polpa foi determinado pela soma das áreas em ÿ = 330 nm de todos
os picos identificados por UV/DAD como sendo flavonoides, portanto, a
concentração correspondente de flavonoides foi calculada com base na curva
analítica, repetindo o procedimento em triplicata.
No processo de quantificação dos flavonoides, foi realizado um processo
de otimização das condições da HPLC, o que o autor relata que foi uma tarefa
difícil, logo, foram utilizadas diferentes programações de gradiente, vazão (0,8;
1,0;1,2 ml. Minÿ-1) e temperatura (35; 40; 45 °C) foram testadas. A detecção em
ÿ = 330 nm provou alta sensibilidade para a maioria dos flavonoides do maracujá.
Os picos de flavonoides foram identificados pelos seus respectivos
espectros de UV/DAD devido ao padrão espectral UV característico (Banda I,
ÿmax em torno de 300-350 nm e Banda II, ÿmax em torno de 230-280 nm). O
autor relata que o padrão utilizado é de suma importância e permite seleção dos
picos usando software para análise quantitativa, não se fazendo necessário um
detector de massa.
A confirmação da presença da isoorientina foi confirmada utilizando
HPLC-UV/DAD e LC-MS/MS. De acordo com o autor, íons de fragmentos
característicos de flavonas C-glicosídeos foram observados nos espectros de
MS/MS da isoorientina . A quantificação da isoorientina foi realizada pelo método
de adição de padrão, uma vez que a polpa do maracujá é uma matriz amostral
complexa. Para a rutina foi utilizado o método do padrão externo.
Os resultados obtidos sugerem que o método de HPLC proposto é
suficientemente sensível para determinar flavonoides na polpa do maracujá. Os
dados quantitativos indicaram que o principal flavonoide, a isoorientina
representou 19% dos falvonoides na polpa do maracujá, já o conteúdo total de
flavonoides encontrados na polpa do maracujá foi bastante significativo (~0,16
mg flavonóide mLÿ1 de polpa) quando comparada com outras bebidas que são
fontes de flavonoides, como suco de laranja e caldo de cana.
 Como conclusão do trabalho, o autor conclui que a análise de HPLC-
UV/DAD se mostrou adequado e confiável para análise quantitativa de
isoorientina, bem como a quantificação de flavonoides totais da polpa de P.
edulis. Os parâmetros avaliados no trabalho mostraram que os métodos
oferecem boa especificidade, linearidade, exatidão, e precisão dentro dos limites
aceitáveis, enquanto o LOD e o LOQ confirmam a eficiência das metodologias
em quantificar baixas concentrações de flavonoides.